CN110184265B - 基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法及其应用，将多肽通过Au‑S键修饰到金纳米粒子表面，并用三氟乙醇诱导多肽在金纳米粒子表面呈现α‑螺旋结构，使催化三联体处于相应空间位置，形成电荷中继网，从分子水平实现天然水解酶的高级模拟。本发明Au‑S键的稳定性使纳米酶具有不易变性的优良性能。去除三氟乙醇后，纳米酶仍具有稳定的二级结构和优异的催化活性。本发明制备的纳米酶合成方法简单，催化效率高。本发明方法选用金纳米粒子作为刚性骨架，能很大程度提高纳米酶的稳定性，表面由构象可调节的多肽组成，具有柔性动态的二级结构。本发明提出的纳米酶的构象调节，使不具备功能的基团具备功能，是天然酶的一种高级模拟。

Description

基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种人工酶的制备方法及其应用，特别是涉及一种模拟天然酶的结构的人工纳米酶的制备方法及其应用，应用于无机金属有机杂化纳米材料及生物化学、酶催化剂技术领域。

背景技术

天然酶是生命体在不断进化的过程中产生的一种生物催化剂，具有催化效率高、反应选择性强，反应条件温和等显著优点。但是，天然酶只能在温和的水环境中进行催化，稳定性较差，且来源有限，提取困难。

模拟天然酶的结构来制备人工酶并重现其天然活性，是人工酶设计的一大策略。人工酶的制备常常采用无机材料或者高分子材料作为骨架。从一定程度上来说，人工酶已经脱离了蛋白质的范畴。因此，人工酶往往比天然酶更加稳定，其作用条件也会更加弹性，在非生理条件下，人工酶的性质更能满足工程应用。但是其催化效率仍然远远低于天然酶。纳米酶是具有酶学性质的纳米材料。作为新一代的人工模拟酶，纳米酶粒径小，比表面积大，表面能高，具有很高的化学活性。

从组装合成的纳米结构的设计上来看，目前的技术仅仅通过在表面直接连接已经具备功能的基团来体现纳米粒子简单的功能，没有形成催化三联体。或是用高分子材料为骨架，但是高分子材料空间结构复杂而庞大，活性位点暴露不明显，在一定程度上会阻碍底物与关键氨基酸的结合，从而影响关键氨基酸中间的质子交换。或是设计多肽聚合物，依靠关键氨基酸的随机组合构建活性口袋，无特定构象，形成的催化三联体催化效率较低。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法及其应用，将特定序列多肽通过Au-S键修饰到金纳米粒子表面，并用三氟乙醇诱导多肽在金纳米粒子表面呈现α-螺旋结构，使催化三联体处于正确的空间位置，形成电荷中继网，从分子水平实现天然水解酶的高级模拟。Au-S键的稳定性使本发明具有不易变性的优良性能。去除三氟乙醇后，该纳米酶仍然具有稳定的二级结构和优异的催化活性。这种方法制备的纳米酶合成方法简单，催化效率高。本发明选用金纳米粒子作为刚性骨架，能很大程度提高纳米酶的稳定性，表面由构象可调节的多肽组成，具有柔性动态的二级结构。本发明提出的纳米酶的构象调节，使不具备功能的基团具备功能，是天然酶的一种高级模拟。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，以金纳米粒子作为刚性骨架，将多肽通过Au-S键修饰到金纳米粒子表面；

所述多肽分子中含有组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，所述三种氨基酸在水解酶活性位点中心能形成催化三联体；

所述多肽分子中还含有两个半胱氨酸，半胱氨酸上的巯基与金纳米粒子生成Au-S键，使多肽两端固定在金纳米粒子表面；

在所述多肽分子中，按照α-螺旋结构中氨基酸的空间距离，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，所述多肽中的两个半胱氨酸分别i和i+7的位置，即形成两圈α-螺旋的位置；

所述多肽分子采用三氟乙醇诱导多肽呈现α-螺旋结构，将组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸位于这两圈α-螺旋上，通过这种构象调节，使催化三联体处于相应的空间构象，形成电荷中继网，模拟重建天然酶的活性位点，得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后在去除三氟乙醇后，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

作为本发明优选的技术方案，基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法包括如下步骤，所述多肽为(1)或(2)中所述的任意一种多肽：

(1)多肽由十二个氨基酸组成，序列为XCXDXXHSCXSX，其中一个S能被A替代，在氨基酸残基序列中的i和i+7位置为半胱氨酸，其巯基与金纳米粒子生成Au-S键，使多肽固定在金纳米粒子表面；采用三氟乙醇诱导后，使多肽在金纳米粒子表面形成两圈α-螺旋；所述组氨酸，丝氨酸和天冬氨酸位于这两圈α-螺旋上，这三种氨基酸残基在相应的空间位置形成一个电荷中继网络，以极化和活化亲核试剂，来攻击底物形成共价中间体，然后使中间体进行水解，再生出游离的酶；

(2)所述多肽为：所述(1)多肽的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、和/或缺失、和/或添加、和/或延长，且具有水解酶活性位点的由所述(1)多肽衍生的多肽。所述多肽能应用于人工酶设计中，并能在水解酯键上实现应用。本发明将特定序列多肽通过Au-S键修饰到金纳米粒子表面，该多肽中含有组氨酸，丝氨酸和天冬氨酸，这三种氨基酸在水解酶活性位点中心能形成催化三联体，实现协同作用。本发明通过这种构象调节，使催化三联体处于正确的空间构象，形成电荷中继网，重建天然酶的活性位点，从分子水平实现天然酶的高级模拟。Au-S键的稳定性使本发明具有不易变性的优良性能。

上述多肽由十二个氨基酸组成，优选序列为NCLDALHSCLSY、NCLDALHSCLAY、NCLDALHACLSY、NCLDALHSCLSE、NCLDALHSCLAE、NCLDALHACLSE、YNCLDALHSCLS、YNCLDALHSCLA或YNCLDALHACLS。

一种纳米酶在水解酯键上的应用，采用本发明基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法制备的基于金纳米粒子的纳米酶，作为人工酶催化剂。

本发明通过这种构象调节，使催化三联体处于正确的空间构象，形成电荷中继网，重建天然酶的活性位点，从分子水平实现天然酶的高级模拟。Au-S键的稳定性使本发明具有不易变性的优良性能。去除三氟乙醇后，该纳米酶仍然具有稳定的二级结构和优异的催化活性。本发明选用金纳米粒子作为刚性骨架，能很大程度提高纳米酶的稳定性，且其表面容易修饰且结合位点数量多，表面由构象可调节的多肽组成，具有柔性动态的二级结构。本发明提出的纳米酶的构象调节，使不具备功能的基团具备功能，是天然酶的一种高级模拟。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明方法选用金纳米粒子作为刚性骨架，能很大程度提高纳米酶的稳定性，且其表面容易修饰且结合位点数量多，表面由构象可调节的多肽组成，具有柔性动态的二级结构；

2.本发明方法采用Au-S键的强大稳定性，使本发明制备的纳米酶具有不易变性的优良性能，去除三氟乙醇后，该纳米酶仍然具有稳定的二级结构和优异的催化活性；

3.本发明方法制备纳米酶的构象调节，使不具备功能的基团具备功能，是天然酶的一种高级模拟，易于实现，具备较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例一方法制备的基于金纳米粒子的纳米酶的透射电子显微镜(TEM)照片图。

图2为本发明实施例一方法制备的基于金纳米粒子的纳米酶的动态光散射(DLS)图。

图3为本发明实施例一方法制备的基于金纳米粒子的纳米酶表面多肽的荧光光谱图。

图4为本发明实施例一方法制备的基于金纳米粒子的纳米酶在诱导前后及诱导剂中的结构对比图。

图5为本发明实施例一方法制备的基于金纳米粒子的纳米酶与对照组未诱导及去除三氟乙醇后的催化活性对比图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

实施例一：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为NCLDALHSCLSY；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

实验测试分析

测试条件如下：

1.将本实施例制备所得的基于金纳米粒子的纳米酶作为测试样品，进行诱导前后的结构测定：将纳米酶浓度调至25nM。圆二色谱的参数设置：扫描范围190～250nm，扫描速度100nm/min，每0.2nm采集一个数据点。每个样品重复20遍，连续累加得到最终的谱图。所得谱图与蛋白质二级结构的标准谱图对比能确定多肽的构象。

2.将本实施例制备所得的基于金纳米粒子的纳米酶与对照组分别进行诱导前后的活性测定：称取0.05g 2,4-二硝基乙酸苯酯，加入5mL乙腈溶解，取出100uL加入到121uL乙腈中，再加入4.201mL的超纯水。溶液中乙腈总浓度为5％。停流色谱仪的1号注射器放置PB溶液，浓度为53mM，pH为7.00，2号注射器放置纳米酶溶液，浓度为200nM，3号注射器放置DNPA，浓度为1mM。打开循环恒温水浴，温度设定37℃。1、2、3号注射器反应进样体积比为3:1:4，确保反应体系中PB浓度保持在20mM。反应总体积为402uL，流速为4.00mL/s。

图1和图2表明，本实施例制备的基于金纳米粒子的纳米酶颗粒尺寸均一，金纳米粒子的尺寸为9～15nm，平均尺寸为13nm，且具有很好的分散性；图3表明本实施例制备的基于金纳米粒子的纳米酶粒子上能构建的结合位点众多，最多能嫁接530条多肽；图4表明三氟乙醇对金纳米粒子表面多肽的结构起到调控作用。当没有三氟乙醇时，多肽在金纳米粒子表面呈现随意的无规卷曲结构，三氟乙醇诱导后，多肽在金纳米粒子表面呈α-螺旋结构。去除三氟乙醇后，多肽在金纳米粒子表面仍具有一定的α-螺旋结构。图5中的对照肽相对于NCLDALHSCLSY缺少关键氨基酸HSD中的一种或两种，该催化活性对比图说明催化三联体中，HSD缺一不可。因此，本实施例基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法制备的基于金纳米粒子的纳米酶，作为人工酶催化剂具有显著的性能优势。

本实施例方法以金纳米粒子作为刚性骨架，将多肽通过Au-S键修饰到金纳米粒子表面；多肽分子中含有组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，此三种氨基酸在水解酶活性位点中心能形成催化三联体；多肽分子中还含有两个半胱氨酸，半胱氨酸上的巯基与金纳米粒子生成Au-S键，使多肽两端固定在金纳米粒子表面；在多肽分子中，按照α-螺旋结构中氨基酸的空间距离，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，多肽中的两个半胱氨酸分别i和i+7的位置，即形成两圈α-螺旋的位置；本实施例多肽分子采用三氟乙醇诱导多肽呈现α-螺旋结构，将组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸位于这两圈α-螺旋上，通过这种构象调节，使催化三联体处于相应的空间构象，形成电荷中继网，模拟重建天然酶的活性位点，得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后在去除三氟乙醇后，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例在氨基酸残基序列中的i和i+7位置为半胱氨酸，其巯基与金纳米粒子生成Au-S键，使多肽固定在金纳米粒子表面；采用三氟乙醇诱导后，使多肽在金纳米粒子表面形成两圈α-螺旋；所述组氨酸，丝氨酸和天冬氨酸位于这两圈α-螺旋上，这三种氨基酸残基在相应的空间位置形成一个电荷中继网络，以极化和活化亲核试剂，来攻击底物形成共价中间体，然后使中间体进行水解，再生出游离的酶。

实施例二：

本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为NCLDALHSCLAY；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将上述实施例一中的多肽序列NCLDALHSCLSY换成NCLDALHACLSY。其他操作方法与实施例一相同，仍得到基于金纳米粒子的纳米酶。本实施例制备的多肽也能在金纳米粒子表面形成催化三联体，高效催化酯键水解。

实施例三：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为NCLDALHACLSY；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将上述实施例一中的多肽序列NCLDALHSCLSY换成NCLDALHACLSY。其他操作方法与实施例一相同，仍得到基于金纳米粒子的纳米酶。本实施例制备的多肽也能在金纳米粒子表面形成催化三联体，高效催化酯键水解。

实施例四：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为NCLDALHSCLSE；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将上述实施例一中的多肽序列NCLDALHSCLSY换成NCLDALHSCLSE。其他操作方法与实施例一相同，仍得到基于金纳米粒子的纳米酶。本实施例制备的多肽也能在金纳米粒子表面形成催化三联体，高效催化酯键水解。

实施例五：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为NCLDALHSCLAE；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将上述实施例一中的多肽序列NCLDALHSCLSY换成NCLDALHSCLAE。其他操作方法与实施例一相同，仍得到基于金纳米粒子的纳米酶。本实施例制备的多肽也能在金纳米粒子表面形成催化三联体，高效催化酯键水解。

实施例六：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为NCLDALHACLSE；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将上述实施例一中的多肽序列NCLDALHSCLSY换成NCLDALHACLSE。其他操作方法与实施例一相同，仍得到基于金纳米粒子的纳米酶。本实施例制备的多肽也能在金纳米粒子表面形成催化三联体，高效催化酯键水解。

实施例七：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为YNCLDALHSCLS；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将上述实施例一中的多肽序列NCLDALHSCLSY换成YNCLDALHSCLS。其他操作方法与实施例一相同，仍得到基于金纳米粒子的纳米酶。本实施例制备的多肽也能在金纳米粒子表面形成催化三联体，高效催化酯键水解。

实施例八：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为YNCLDALHSCLA；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将上述实施例一中的多肽序列NCLDALHSCLSY换成YNCLDALHSCLA。其他操作方法与实施例一相同，仍得到基于金纳米粒子的纳米酶。本实施例制备的多肽也能在金纳米粒子表面形成催化三联体，高效催化酯键水解。

实施例九：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为YNCLDALHACLS；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后将基于金纳米粒子的纳米酶混合液放置真空干燥箱中，设置温度为25℃，抽真空1小时，从而去除三氟乙醇，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将上述实施例一中的多肽序列NCLDALHSCLSY换成YNCLDALHACLS。其他操作方法与实施例一相同，仍得到基于金纳米粒子的纳米酶。本实施例制备的多肽也能在金纳米粒子表面形成催化三联体，高效催化酯键水解。

实施例十：

本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：

在本实施例中，一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，步骤如下：

a.采用由十二个氨基酸组成的多肽，多肽的序列为NCLDALHSCLSY；

b.向24mL柠檬酸盐包裹的纳米金溶液中加入到40μL浓度为0.2M的柠檬酸钠溶液，混合均匀后得到纳米金溶液；然后将4mL含有NaOH浓度为1.6mM的碱性多肽溶液逐滴加入到正在搅拌的纳米金溶液中，在室温下，控制转速为800r/min来对混合溶液实施搅拌，进行初步反应1小时；然后将初步产物溶液置于摇床中，并在室温下，控制转速为100r/min来对混合溶液实施搅拌，继续反应12小时；当反应完成后，经超滤浓缩，得到多肽产物浓缩液，使多肽产物浓缩液调节多肽浓度至400nM后，使多肽产物浓缩液与质量百分比浓度为80％的三氟乙醇在室温下进行均匀混合，多肽产物浓缩液和三氟乙醇的体积比1:1，得到多肽-三氟乙醇混合物体系溶液，在15℃下进行避光静置24小时，从而得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后采用离心分离工艺，将含有三氟乙醇的基于金纳米粒子的纳米酶混合液进行超速离心，设置转速为20000r/min，控制离心时间为10分钟，然后去除上清液，收集底层物质；在收集底层物质后，再对底层物质进行分散，再次采用离心分离工艺一次，将含有三氟乙醇的基于金纳米粒子的纳米酶混合液进行超速离心，设置转速为20000r/min，控制离心时间为10分钟，然后去除上清液，收集底层物质，从而去除三氟乙醇，得到纯化的基于金纳米粒子的纳米酶。

本实施例将实施例一中去除三氟乙醇的方法改为离心处理。一次能将至少2mL含有三氟乙醇的样品进行超速离心，设置转速为20000r/min，离心10分钟后去除上清再分散，继续离心分离，能去除三氟乙醇。

综上所述，本发明上述涉及基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，将特定序列多肽通过Au-S键修饰到金纳米粒子表面，并用三氟乙醇诱导多肽在金纳米粒子表面呈现α-螺旋结构，使催化三联体处于正确的空间位置，形成电荷中继网，从分子水平实现天然水解酶的高级模拟。Au-S键的稳定性使本发明具有不易变性的优良性能。去除三氟乙醇后，该纳米酶仍然具有稳定的二级结构和优异的催化活性。本发明方法制备的纳米酶合成方法简单，催化效率高。本发明方法选用金纳米粒子作为刚性骨架，能很大程度提高纳米酶的稳定性，表面由构象可调节的多肽组成，具有柔性动态的二级结构。本发明方法提出的纳米酶的构象调节，使不具备功能的基团具备功能，是天然酶的一种高级模拟，易于实现，具备较好的应用前景。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法及其应用的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，其特征在于：

以金纳米粒子作为刚性骨架，将多肽通过Au-S键修饰到金纳米粒子表面；在所述多肽分子中，按照α-螺旋结构中氨基酸的空间距离，每3.6个氨基酸残基螺旋上升一圈，所述多肽中的两个半胱氨酸分别i和i+7的位置，即形成两圈α-螺旋的位置；多肽由十二个氨基酸组成，序列为NCLDALHSCLSY、NCLDALHSCLAY、NCLDALHACLSY、NCLDALHSCLSE、NCLDALHSCLAE、NCLDALHACLSE、YNCLDALHSCLS、YNCLDALHSCLA或YNCLDALHACLS；

所述多肽分子中含有组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸，所述三种氨基酸在水解酶活性位点中心能形成催化三联体；

半胱氨酸上的巯基与金纳米粒子生成Au-S键，使多肽两端固定在金纳米粒子表面；

所述多肽分子采用三氟乙醇诱导多肽呈现α-螺旋结构，将组氨酸、丝氨酸和天冬氨酸位于这两圈α-螺旋上，通过这种构象调节，使催化三联体处于相应的空间构象，形成电荷中继网，模拟重建天然酶的活性位点，得到基于金纳米粒子的纳米酶混合液；然后在去除三氟乙醇后，得到纯化后的基于金纳米粒子的纳米酶。

2.根据权利要求1所述基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，所述多肽由十二个氨基酸组成，序列为XCXDXXHSCXSX，其中一个S能被A替代，在氨基酸残基序列中的i和i+7位置为半胱氨酸，其巯基与金纳米粒子生成Au-S键，使多肽固定在金纳米粒子表面；采用三氟乙醇诱导后，使多肽在金纳米粒子表面形成两圈α-螺旋；所述组氨酸，丝氨酸和天冬氨酸位于这两圈α-螺旋上，这三种氨基酸残基在相应的空间位置形成一个电荷中继网络，以极化和活化亲核试剂，来攻击底物形成共价中间体，然后使中间体进行水解，再生出游离的酶。

3.一种纳米酶在水解酯键上的应用，采用权利要求1所述基于金纳米粒子的纳米酶的制备方法制备的基于金纳米粒子的纳米酶，作为人工酶催化剂。

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