KR20220129035A - 변성 에폭시 수지 고정화 효소, 제조 방법 및 응용 - Google Patents

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Abstract

변성 에폭시 수지 고정화 효소, 제조 방법 및 응용에 있어서, 상기 제조 방법은, 에폭시 수지를 변성시키고, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식한 다음, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정화하여 변성 에폭시 수지 고정화 효소를 획득하는 단계를 포함한다. 에폭시 수지를 변성시키고, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식하며, 수지의 알데히드기와 폴리에틸렌이민의 아미노기를 각 효소에 공유 결합시킨 다음, 이관능성 시약인 글루타르알데하이드를 통해 활성화시킨다. 이러한 방식을 통해 공간 수지 암을 증가시켜 망상 구조를 형성하고, 공유 결합을 통해 효소를 보다 쉽게 결합시킬 수 있으며, 공간 억제가 감소되어 효소 부하도 개선될 수 있다.

Description

변성 에폭시 수지 고정화 효소, 제조 방법 및 응용
본 발명은 생체 촉매 작용 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로, 변성 에폭시 수지 고정화 효소, 제조 방법 및 응용에 관한 것이다.
다양한 산업 공정에서 생체 촉매로 널리 사용되는 효소는 화학 촉매에 비해 높은 활성, 강한 선택성 및 높은 특이성 장점을 가지고 있다. 효소는 매우 온화한 반응 조건에서 복잡한 화합물을 생성할 수 있으므로 보다 지속 가능한 공정의 개발을 가능하게 하여 효소의 촉매 작용에 의한 공정이 신흥 플랫폼으로 되고 있다. 효소는 생물학적 유래이기 때문에 일반적으로 산업 공정에 필요한 작동 특성과는 다른 작동 특성을 갖는다.
생체 촉매는 효소의 종류와 용도에 따라 살아있는 세포, 죽은 세포, 조효소 또는 정제된 효소를 사용하여 생산할 수 있다. 효소의 확장 가능한 생산과 단백질 공학의 발전으로 생체 촉매는 상업적으로 적용 가능하고 경제적 가치가 높다.
독특한 공정 및 비용 이점으로 인해 효소는 산업 공정에서 점점 더 많이 적용되므로, 효소의 고정화 형태에 대한 요구도 점점 더 높아지고 있다. 일반적으로 "생체 촉매"라고 하는 고정화 효소는 산업용 유기 합성 및 생체 변환에 널리 사용된다.
생명공학 과정에서 효소를 성공적으로 사용하기 위한 가장 유용한 전략 중 하나는 효소를 고정화하는 것이다. 적절한 효소 고정화는 격렬한 반응 조건(예를 들어, pH 및 온도가 생리학적 범위에서 멀리 떨어져 있음)에 대한 내성, 향상된 효소 활성, 재활용 성능, 연속 사용 성능 및 개선된 기질 특이성, 거울상 이성질체 특이성 또는 생성물 선택성과 같은 효소 성능을 향상시키는 강력한 수단이다.
신규 고정화 플랫폼의 출현으로 고정화 효소를 연속 흐름 생체 촉매 작용에 완벽하게 통합할 수 있다. 효율적인 신규 효소의 발견과 진화, 생체 촉매 작용을 강조하는 신규 역합성 방법, 재조합 단백질의 비용 절감 및 효소 고정화 전략 등은 모두 연속 합성에서 생체 촉매 작용을 적용하기 위한 양호한 기초이다.
효소 기반 아미노산 측쇄의 작용기의 독특한 특징은 가역적 결합(예를 들어, 반데르발스힘, 소수성 또는 이온 결합) 및 비가역적 화학 결합(예를 들어, 공유 결합)을 통해 담체 표면에 흡착시키는 방식으로 담체에 고정할 수 있는 것이다(Sheldon 등 2013).
공유 결합은 생체 촉매와 담체를 비가역적으로 결합시키므로, 효소 누출을 방지하고 효소의 회수 가능성을 효과적으로 향상시킬 수 있다. 공유 결합 담체 중에서, 에폭시 활성화 담체는 실험실 및 산업 규모에서 단백질을 매우 쉽게 고정시키기 위한 거의 이상적인 기질이다(Hannibal-Friedrich et al 1980; Hernaiz et al 2000; Calleri et al 2004; Podgornik, H.et al 2002). 이러한 담체는 활성화된 형태로 존재한다. 이 밖에, 이러한 담체는 중성 수성 매체에 현탁된 경우에도 보관 및 운송 과정에서 매우 안정하여, 장기적인 고정에 사용할 수 있으며, 효소가 지지 표면을 완전히 덮을 수 있도록 허용한다. 매우 온화한 실험 조건(예를 들어, pH 7.0)에서 에폭시 활성화 담체와 단백질의 반응은 단백질(2차 아민, 티오에테르 및 에테르)의 매우 작은 화학적 수식을 촉진할 수 있다.
일반적으로, 가용성 단백질은 중성 pH에서 에폭시기와 거의 반응하지 않는다. 에폭시 수지 담체의 이러한 낮은 반응성으로 인해 효소는 다음과 같은 두 단계 메커니즘을 통해 이러한 담체에 고정되는 바, 먼저, 담백질을 담체에 신속하고 부드럽게 흡착시키고; 다음, 흡착된 단백질과 인접한 에폭시기 사이에서 공유 결합 반응을 일으키도록 한다[Wheatley et al 1999; Bauer-Arnaz et al 1998].
이러한 메커니즘으로 인해 단백질을 고정하는데 사용되는 상업용 에폭시 수지 담체는 높은 이온 강도(소수성 상호 작용을 통해)로 배양될 때 단백질을 흡착하기 위해 상당히 소수성이다. 경우에 따라 소수성 담체를 사용하면 외부 층에 위치한 내부 소수성 아미노산의 비정상적인 구조가 안정화되어 단백질 구조의 잘못된 접힘이 촉진될 수 있다(Fitzpatrick PA et al 1993). 이 밖에, 일반적으로 고농도의 염을 사용하면 상이한 효소의 활성을 상실시킬 수 있는데, 특히 서브유닛 사이에 이온력에 의해 연결된 다량체 효소의 활성을 상실시킬 수 있다(Fernandez-Lafuente et al 2009). 에폭시 수지 담체는 매우 중요한 고정화 플랫폼이지만 새로운 효소, 특히 진화된 중합효소의 출현으로 에폭시 수지 담체에 대한 전반적인 개선 및 새로운 고정화 과정이 필요하다.
Bolivar 등(2007)은 에폭시 수지, 아미노 에폭시 수지, 글리옥살(에폭시 수지), 및 글루타르알데하이드로 처리하여 아민화된 담체에 흡착된 효소를 사용하여 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 유래 포름산 탈수소효소를 고정화하는 상이한 고정화 전략을 평가하였다. 여기서, 아미노 에폭시 수지 담체(가용성 효소 대비 12배 인자) 및 에틸렌글리콜 기반 아가로스 담체(150배 인자)의 사용은 최적의 안정성을 나타내었다. 그러나, 활성 회복은 두 경우 모두 15 %보다 조금만 높았다.
Truppo 등(2012)은 유기 용매에 고정화 효소를 사용하기 위해 미쓰비시(Mitsubishi)의 다양한 고분자 기반 수지(SEPABEADS)를 사용하여 Januvia 트랜스아미나제(CDX0117, Codexis)의 고정화를 평가하였다. 선택된 수지는 공유 결합 고정을 위한 3가지 에폭시드 기능화된 담체(EC-EP, EC-HFA/S 및 EXE119), 및 소수성 상호 작용을 통해 고정하기 위한 2가지 흡착 담체(EXA252 및 EXE120)를 포함한다. 테스트한 많은 담체가 활성을 나타내었지만, 높은 소수성을 갖는 옥타데실 기능화 폴리메타크릴레이트 수지인 SEPABEAD EXE120(흡착 담체)이 가장 높은 비활성(specific activity)을 보였다. 고정화 동안 첨가된 효소 활성의 45 %만큼이나 EXE120 수지에서 회수되어 수지에서의 트랜스아미나제 로딩량이 4 wt%(고체 담체 1 g당 40 mg의 트랜스퍼라제)가 되었다. 고정화 조건에서, 에폭시 수지 담체 EC-EP는 낮은 효소 결합 및 발현을 보였는데, 이는 에폭시 수지 담체에 의해 효소가 변성되었기 때문일 수 있다.
Hui Ren 등(2016)은 공유 결합을 통해 고생물(Archaeoglobus fulgidus) 유래의 호열성 에스테라제 AFEST를 에폭시 수지 담체 Sepabeads EC-EP에 고정한 다음 고정화 효소를 중합 반응("-카프로락톤")의 생체 촉매로 사용하는 것을 보고하였다. p-니트로페닐 옥타노에이트를 기질로 사용하여 80℃에서 고정화 효소의 효소 로딩량 및 회수 활성을 측정한 결과 각각 72 mg/g 및 10.4 U/mg이였다. 고정화 효소는 반복 사용성이 양호하며, 15회의 회분식 반응에서 단량체 전환율이 75 %를 초과하였다.
Ana I.Benitez-Mateos 등 (2018)은 보조 인자 PLP에 결합하여 자급식 고정화 트랜스아미나제 개발을 위한 다공성 담체의 사용을 보고하였다. 이 연구에서 Halomonas elongata 유래의 ω-트랜스아미나제는 폴리에틸렌이민으로 코팅된 다공성 메타크릴레이트 기반 금속 킬레이트 담체에 PLP와 함께 고정되었다. 모델 아민(α-메틸벤질아민)의 거울상 선택적 탈아미노화를 위해 충전층 반응기를 1.45 mL Х min-1에서 50컬럼 부피로 연속적으로 실행하여 보조 인자의 외인성 첨가 없이 모든 사이클에서 > 90%의 전환율을 달성했다. 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) 및 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 유래의 트랜스아미나제로 유사한 방법을 수행한 결과 유사한 활성을 보였다. 그러나 이러한 방법은 긍정적인 것으로 보이지만 효소의 안정성에 대해 보고된 전체 최장 작동 시간은 133분이다.
고정화 효소에 대한 보고가 일부 있었지만 표 1에 나열된 효소에 대한 고정화 효소에 대한 보고는 매우 적거나 없다.
Figure pct00001
선행기술에 보고된 효소를 고정화하는 방법의 경우, 표 1의 효소의 산업적 응용에 적합하지 않으므로, 이들의 안정성을 보다 향상시킬 필요가 있다.
본 발명은 효소의 재활용 안정성을 향상시키기 위한 변성 에폭시 수지 고정화 효소, 제조 방법 및 응용을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 구현하기 위한 본 발명의 일 측면에 따르면, 변성 에폭시 수지 고정화 효소의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은, 에폭시 수지를 변성시키고, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식한 다음, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정화하여 변성 에폭시 수지 고정화 효소를 획득하는 단계를 포함한다.
진일보로, 에폭시 수지를 변성시키는 것은, 과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시키거나 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시키는 것을 포함한다.
진일보로, 에폭시 수지를 변성시키는 것이 과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시키는 것인 경우, 과요오드산나트륨을 첨가하기 전에 먼저 아세트산을 사용하여 에폭시 수지를 처리하고, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정화한 후, 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 첨가하여 2차 가교를 수행하는 단계를 더 포함한다.
진일보로, 에폭시 수지를 변성시키는 것이 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시키는 것인 경우, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식한 후, 금속 이온 용액을 첨가하여 처리하는 단계를 더 포함하고, 고정대상인 효소는 his 태그를 가지며; 바람직하게는, 금속 이온 용액은 염화코발트, 황산코발트, 염화니켈, 황산구리, 염화제일철, 황산제일철 중 하나 또는 복수 개로부터 선택되고; 바람직하게는, 금속 이온 용액의 농도는 5 내지 100 mmol/L이며, 바람직하게는 10 내지 50 mmol/L이다.
진일보로, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드의 첨가 순서는 순차적으로 고정대상인 효소, 글루타르알데하이드 또는 글루타르알데하이드, 고정대상인 효소이다.
진일보로, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식하는 단계는 보조인자를 첨가하는 단계를 더 포함하고, 보조인자는 NAD+, NADP+ 또는 PLP이며; 바람직하게는, 폴리에틸렌이민은 폴리에틸렌이민 수용액의 형태로 반응에 참여하고, 폴리에틸렌이민 수용액에서 보조인자의 최종 농도는 1 내지 10 mg/mL이며, 바람직하게는 3 내지 6 mg/mL이고; 바람직하게는, 상기 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 사용하기 전에, PEG로 가교제를 수식하는 단계를 더 포함하고, PEG로 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 수식하는 것은, 물로 가교제를 용해시킨 다음 PEG를 첨가하고, 20 내지 30℃에서 1 내지 6 시간 동안 교반하는 것을 포함하며, PEG는 PEG400 내지 PEG2000로부터 선택되고, PEG와 가교제의 질량비는 1 : 1 내지 10 : 1이며, 더 바람직하게는 2 : 1 내지 4 : 1이다.
진일보로, 아세트산으로 에폭시 수지를 처리함에 있에서, 사용된 아세트산은 아세트산 용액이고, 아세트산 용액 중 아세트산의 농도는 0.5 내지 3 M이며, 바람직하게는 1 내지 2 M이고; 아세트산 용액과 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이며, 바람직하게는 10 내지 15 : 1이고; 바람직하게는, 과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시킬 때 사용하는 과요오드산나트륨 용액 중 과요오드산나트륨의 농도는 50 내지 500 mM이며, 바람직하게는 100 내지 200 mM이고; 과요오드산나트륨 용액과 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이며, 바람직하게는 5 내지 15 : 1이고; 바람직하게는, 폴리에틸렌이민의 분자량은 3 KDa 내지 70 KDa이며, 폴리에틸렌이민 수용액의 농도는 0.5 % 내지 3 %이고, 바람직하게는 1 % 내지 2 %이며; 폴리에틸렌이민 수용액의 pH는 6 내지 11이고, 더 바람직하게는 7 내지 10이며; 바람직하게는, 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드의 부피/질량 최종 농도는 0.1 % 내지 3 %이고, 바람직하게는 0.3 % 내지 2 %이며; 바람직하게는, 효소와 변성 에폭시 수지의 질량비는 0.05 내지 0.3 : 1이고; 바람직하게는, 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시킴에 있에서, 사용된 이미노디아세트산은 이미노디아세트산 수용액이며, 이미노디아세트산 수용액의 농도는 0.5 내지 3 M이고, 바람직하게는 1 내지 2 M이며, 이미노디아세트산 수용액과 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이고, 바람직하게는 10 내지 15 : 1이며; 이미노디아세트산 수용액의 pH는 6.0 내지 10.0이고, 바람직하게는 7.0 내지 9.0이다.
진일보로, 아세트산과 에폭시 수지를 혼합한 후의 처리 시간은 6 내지 24시간이고, 바람직하게는 10 ~ 15시간이며; 바람직하게는, 과요오드산나트륨 용액과 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 1 내지 6시간이고, 바람직하게는 2 내지 3시간이며; 바람직하게는, 폴리에틸렌이민 수용액과 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 1 내지 20시간이고, 바람직하게는 3 내지 6시간이며; 바람직하게는, 효소와 변성 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 2 내지 24시간이고, 바람직하게는 15 내지 20시간이며; 바람직하게는, 가교제를 첨가한 후, 반응 시간은 10 내지 120분이고, 바람직하게는 20 내지 60분이며; 바람직하게는, 이미노디아세트산 수용액과 에폭시 수지를 혼합한 후의 작용 시간은 0.5 내지 6시간이고, 바람직하게는 1 내지 2시간이며; 바람직하게는, 폴리에틸렌이민 수용액과 담체를 혼합한 후의 작용 시간은 1 내지 20시간이고, 진일보로 3 내지 6시간이며; 금속 이온을 첨가한 후, 작용 시간은 1 내지 6시간이고, 진일보로 1 내지 3시간이며; 효소액과 담체를 혼합한 후의 작용 시간은 4 내지 48시간이고, 진일보로 작용 시간은 15 내지 20시간이다.
진일보로, 에폭시 수지는 Purolite®LifetechTMECR8285, ECR8204, ECR8209, SEPLITE®LX1000EA, LX1000EP, LX103B, EP200, LX1000HFA, HFA001, LX107S, LX1000SW, LX1000SD, HECHENG®ES1, ES103, ES105, ES108 및 ES109로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 복수 개이다.
진일보로, 고정대상인 효소는 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제, Aspergillus fumigatus 유래 트랜스아미나제, Vibrio fluvialis strain JS17 유래 트랜스아미나제, Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제, Candida macedoniensis AKU4588 유래 케토리덕타제, Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, Brachymonas petroleovorans 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, Rhodococcus ruber-SD1 유래 모노옥시게나제, photorhabdus luminescens 유래 암모니아 리아제, Solenostemon scutellarioides 유래 암모니아 리아제, Saccharomyces cerevisiae 유래 엔-리덕타제, ChrySEQbacterium sp.CA49 유래 엔-리덕타제, Streptomyces sp 또는 Bacillus cereus 유래 이민 리덕타제, Bacillus cereus 유래 류신 탈수소효소, Bacillus sphaericus 유래 페닐알라닌 탈수소효소, Aspergillus niger CBS 513.88 유래 니트릴라제 및 Neurospora crassa OR74A 유래 니트릴라제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 복수 개이고; Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 2의 서열 또는 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는 돌연변이체이며; Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 5의 서열 또는 SEQ ID NO: 6의 서열을 갖는 돌연변이체이고; Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제는 SEQ ID NO: 8의 서열 또는 SEQ ID NO: 9의 서열을 갖는 돌연변이체이며; Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO: 11의 서열 또는 SEQ ID NO: 12의 서열을 갖는 돌연변이체이고; Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO: 14의 서열 또는 SEQ ID NO: 15의 서열을 갖는 돌연변이체이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 변성 에폭시 수지 고정화 효소를 제공한다. 상기 고정화 효소는 상기 어느 하나의 제조 방법을 통해 제조된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 수성 완충액 반응 시스템 또는 유기 용매 반응 시스템에서 변성 에폭시 수지 고정화 효소의 응용을 제공한다.
진일보로, 수성 완충액 반응 시스템 또는 유기 용매 반응 시스템은 충전층 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기에서 반응한다.
본 발명의 기술적 해결수단을 적용하면, 에폭시 수지를 변성시키고, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식하며, 수지의 알데히드기와 폴리에틸렌이민의 아미노기를 각 효소에 공유 결합시킨 다음, 이관능성 시약인 글루타르알데하이드를 통해 활성화시킨다. 이러한 방식을 통해 공간 수지 암(resin arm)을 증가시켜 망상 구조를 형성하고, 공유 결합을 통해 효소를 보다 쉽게 결합시킬 수 있으며, 이는 공간 억제가 감소되어 효소 부하도 개선될 수 있다.
설명해야 할 것은, 본 발명의 실시예 및 실시예의 특징은 충돌이 없는 한 서로 조합될 수 있다. 이하, 실시예와 함께 본 발명을 상세하게 설명한다.
명사 해석 및 약어:
IDA: I minodiacetic acid disodium salt hydrate,이미노디아세트산 이나트륨염 수화물.
GA: Glutaraldehyde, 글루타르알데하이드
PEI: polyethyleneimine, 폴리에틸렌이민
PEG: polyethylene glycol, 폴리에틸렌글리콜
대부분의 경우, 생체 촉매 작용은 효율적인 생체 촉매에 의존할 수 있다. 효소는 높은 입체 선택성과 영역 선택성 및 높은 전환율을 갖는 다기능적 생체 촉매이다. 그러나, 유리 효소는 상대적으로 민감하고 불안정하며 효율적으로 회수하여 반복 사용할 수 없다. 이러한 한계를 극복하고 적용 가능성을 확장하기 위해 유리 효소는 일반적으로 사용 전에 고정화 작용을 통해 불활성 불용성 물질에 연결된다.
리파아제, 아실트랜스퍼라제 등과 같은 다양한 효소를 고정화하는데 사용되는 에폭시 수지는 고정화 공정이 매우 간단하고 조작이 쉽지만, 양호한 회복 활성을 얻으려면 고정화 전에 효소를 정제해야 하나 그럼에도 불구하고 회복 활성이 여전히 다른 담체 고정화 방안이나 순수 효소를 사용하는 것에 못 미친다. 이에, 본 발명은 다음과 같은 기술적 해결수단을 제안한다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 변성 에폭시 수지 고정화 효소의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은, 에폭시 수지를 변성시키고, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식한 다음, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정화하여 변성 에폭시 수지 고정화 효소를 획득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 기술적 해결수단을 적용하면, 에폭시 수지를 변성시키고, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식하며, 수지의 알데히드기와 폴리에틸렌이민의 아미노기를 각 효소에 공유 결합시킨 다음, 이관능성 시약인 글루타르알데하이드를 통해 활성화시킨다. 이러한 방식을 통해 공간 수지 암을 증가시켜 망상 구조를 형성하고, 공유 결합을 통해 효소를 보다 쉽게 결합시킬 수 있으며, 공간 억제가 감소되어 효소 부하도 개선될 수 있다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에서, 에폭시 수지를 변성시키는 것은, 과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시키거나 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시키는 단계를 포함함으로써, 성능이 개선된 에폭시 수지를 얻는다. 바람직하게는, 에폭시 수지를 변성시키는 것이 과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시키는 것인 경우, 과요오드산나트륨을 첨가하기 전에 먼저 아세트산을 사용하여 에폭시 수지를 처리하고, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정화한 후, 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 첨가하여 2차 가교를 수행하는 단계를 더 포함함으로써, 고정화를 더 강화시킨다.
본 발명에서, 이미노디아세트산 및 금속을 사용한 에폭시 수지의 변성을 수정하였다. 에폭시 수지와 이미노디아세트산을 반응시킨 후, PEI를 첨가하고 이온 부착을 통해 수지와 결합시킨 다음, 적절한 금속으로 처리한다. 그 다음, His 태그가 붙은 효소를 첨가한 다음 글루타르알데하이드 가교를 수행하여 부착을 더 강화시킨다. PEI는 이미노디아세트산보다 더 강한 금속에 결합될 수 있고, 글루타르알데하이드와 가교될 수도 있으므로, 효소 누출이 훨씬 적어지도록 한다. 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 에폭시 수지를 변성시키는 것이 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시키는 것인 경우, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식한 후, 금속 이온 용액을 첨가하여 처리하는 단계를 더 포함하고, 고정대상인 효소는 히스(his) 태그를 가지며; 바람직하게는, 금속 이온 용액은 염화코발트, 황산코발트, 염화니켈, 황산구리, 염화제일철, 황산제일철 중 하나 또는 복수 개로부터 선택되고; 바람직하게는, 금속 이온 용액의 농도는 5 내지 100 mmol/L이며, 바람직하게는 10 내지 50 mmol/L이다.
바람직하게는, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드의 첨가 순서는 순차적으로 고정대상인 효소, 글루타르알데하이드 또는 글루타르알데하이드, 고정대상인 효소이다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식하는 단계는 보조인자를 첨가하는 단계를 더 포함하고, 보조인자는 NAD+, NADP+ 또는 PLP이며; 바람직하게는, 폴리에틸렌이민은 폴리에틸렌이민 수용액의 형태로 반응에 참여하고, 폴리에틸렌이민 수용액에서 보조인자의 최종 농도는 1 ~ 10 mg/mL이며, 바람직하게는 3 ~ 6 mg/mL이고; 바람직하게는, 상기 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 사용하기 전에, PEG로 가교제를 수식하는 단계를 더 포함하고, PEG로 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 수식하는 것은, 물로 가교제를 용해시킨 다음 PEG를 첨가하고, 20 내지 30℃에서 1 내지 6시간 동안 교반하는 것을 포함하며, PEG는 PEG400 내지 PEG2000로부터 선택되고, PEG와 가교제의 질량비가 1 : 1 내지 10 : 1이면, 반복 사용성이 좋으며, 더 바람직하게는 2 : 1 내지 4 : 1이다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 아세트산으로 에폭시 수지를 처리함에 있에서, 사용된 아세트산은 아세트산 용액이고, 아세트산 용액 중 아세트산의 농도는 0.5 내지 3 M이며, 바람직하게는 1 내지 2 M이고; 아세트산 용액과 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이며, 바람직하게는 10 내지 15 : 1이고; 바람직하게는, 과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시킬 때 사용하는 과요오드산나트륨 용액 중 과요오드산나트륨의 농도는 50 내지 500 mM이며, 바람직하게는 100 내지 200 mM이고; 과요오드산나트륨 용액과 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이며, 바람직하게는 5 내지 15 : 1이고; 바람직하게는, 폴리에틸렌이민의 분자량은 3 KDa 내지 70 KDa이며, 폴리에틸렌이민 수용액의 농도는 0.5% 내지 3%이고, 바람직하게는 1% 내지 2%이며; 폴리에틸렌이민 수용액의 pH는 6 내지 11이고, 더 바람직하게는 7 내지 10이며; 바람직하게는, 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드의 부피/질량 최종 농도는 0.1% 내지 3%이고, 바람직하게는 0.3% 내지 2%이며; 바람직하게는, 효소와 변성 에폭시 수지의 질량비는 0.05 내지 0.3 : 1이고; 바람직하게는, 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시킴에 있에서, 사용된 이미노디아세트산은 이미노디아세트산 수용액이며, 이미노디아세트산 수용액의 농도는 0.5 내지 3M이고, 바람직하게는 1 내지 2 M이며, 이미노디아세트산 수용액과 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이고, 바람직하게는 10 내지 15 : 1이며; 이미노디아세트산 수용액의 pH는 6.0 내지 10.0이고, 바람직하게는 7.0 내지 9.0일 경우, 안정성이 가장 좋다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 아세트산과 에폭시 수지를 혼합한 후의 처리 시간은 6 내지 24시간이고, 바람직하게는 10 내지 15 시간이며; 바람직하게는, 과요오드산나트륨 용액과 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 1 내지 6 시간이고, 바람직하게는 2 내지 3 시간이며; 바람직하게는, 폴리에틸렌이민 수용액과 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 1 내지 20 시간이고, 바람직하게는 3 내지 6시간이며; 바람직하게는, 효소와 변성 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 2 내지 24시간이고, 바람직하게는 15 내지 20 시간이며; 바람직하게는, 가교제를 첨가한 후, 반응 시간은 10 내지 120 분이고, 바람직하게는 20 내지 60 분이며; 바람직하게는, 이미노디아세트산 수용액과 에폭시 수지를 혼합한 후의 작용 시간은 0.5 내지 6 시간이고, 바람직하게는 1 내지 2 시간이며; 바람직하게는, 폴리에틸렌이민 수용액과 담체를 혼합한 후의 작용 시간은 1 내지 20 시간이고, 진일보로 3 내지 6 시간이며; 금속 이온을 첨가한 후, 작용 시간은 1 내지 6 시간이고, 진일보로 1 내지 3시간이며; 효소액과 담체를 혼합한 후의 작용 시간은 4 내지 48 시간이고, 진일보로 작용 시간은 15 내지 20 시간이다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 에폭시 수지는 Purolite®LifetechTMECR8285, ECR8204, ECR8209, SEPLITE®LX1000EA, LX1000EP, LX103B, EP200, LX1000HFA, HFA001, LX107S, LX1000SW, LX1000SD, HECHENG®ES1, ES103, ES105, ES108 및 ES109로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 복수 개이다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 고정대상인 효소는 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제, Aspergillus fumigatus 유래 트랜스아미나제, Vibrio fluvialis strain JS17 유래 트랜스아미나제, Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제, Candida macedoniensis AKU4588 유래 케토리덕타제, Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, Brachymonas petroleovorans 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, Rhodococcus ruber-SD1 유래 모노옥시게나제, photorhabdus luminescens 유래 암모니아 리아제, Solenostemon scutellarioides 유래 암모니아 리아제, Saccharomyces cerevisiae 유래 엔-리덕타제, ChrySEQbacterium sp.CA49 유래 엔-리덕타제, Streptomyces sp 또는 Bacillus cereus 유래 이민 리덕타제, Bacillus cereus 유래 류신 탈수소효소, Bacillus sphaericus 유래 페닐알라닌 탈수소효소, Aspergillus niger CBS 513.88 유래 니트릴라제 및 Neurospora crassa OR74A 유래 니트릴라제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 복수 개이고; Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 2의 서열 또는 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는 돌연변이체이며; Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 5의 서열 또는 SEQ ID NO: 6의 서열을 갖는 돌연변이체이고; Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제는 SEQ ID NO: 8의 서열 또는 SEQ ID NO: 9의 서열을 갖는 돌연변이체이며; Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO: 11의 서열 또는 SEQ ID NO: 12의 서열을 갖는 돌연변이체이고; Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO: 14의 서열 또는 SEQ ID NO: 15의 서열을 갖는 돌연변이체이다.
상기 효소가 반응에 참여하는 화학적 과정을 간략히 설명하면 다음과 같다.
Figure pct00002
Figure pct00003
상기 반응식에서 R, R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아르알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬로부터 선택되거나, R1은 이에 연결된 헤테로 고리와 함께 축합 고리 시스템을 형성할 수 있다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 변성 에폭시 수지 고정화 효소를 제공한다. 상기 고정화 효소는 상기 어느 하나의 제조 방법을 통해 제조된다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에 따르면, 수성 완충액 반응 시스템 또는 유기 용매 반응 시스템에서 변성 에폭시 수지 고정화 효소의 응용을 제공한다. 바람직하게는, 수성 완충액 반응 시스템 또는 유기 용매 반응 시스템은 충전층 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기에서 반응한다.
본 발명의 대표적인 일 실시형태에서, 에폭시 수지(예를 들어, 표 2에 나타낸 에폭시 수지이고, Epoxy는 에폭시기임)를 변성시켜 에폭시 수지 고정화 효소의 반복 사용성을 향상시킨다.
Figure pct00004
대표적으로, 과요오드산나트륨으로 에폭시 수지를 산화시키거나 이미노디아세트산으로 에폭시 수지를 변성시켜 에폭시 수지의 성능을 변경시킨다. 구체적인 설명은 다음과 같다.
1. 과요오드산나트륨으로 산화시킨 에폭시 수지에서 효소의 고정화
과요오드산나트륨으로 산화시킨 후, PEI(폴리에틸렌이민) 또는 PEI 및 다른 보조인자로 진일보로 수식하여, 에폭시 수지를 산화시키고, 수지의 알데히드기와 PEI의 아미노기로 각 효소에 공유 결합시킨 다음, 이관능성 시약인 글루타르알데하이드를 통해 활성화시키되, 이러한 방식을 통해 공간 수지 암을 증가시켜 망상 구조를 형성하고, 공유 결합을 통해 효소를 보다 쉽게 결합시킬 수 있으며, 공간 억제가 감소되어 효소 부하도 개선될 수 있다. 고정화를 더 강화시키기 위해, 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드와 같은 별도의 링커(linker)를 첨가하여 2차 가교를 수행할 수 있다.
효소는 또한 이온 흡착을 통해 PEI 변성 산화 에폭시 수지에 결합된 다음, 가교제를 첨가하여 효소, PEI 및 수지 사이의 가교를 수행하여 망상 구조와 강한 결합을 형성할 수 있다.
2. 이미노디아세트산으로 변성시킨 에폭시 수지에서 효소의 고정화
이전에 His 태그가 붙은 효소를 금속 변성 에폭시 수지에 고정화하는 것으로 보고되었는 바, 먼저, 에폭시 수지와 이미노디아세트산을 반응시켜 담체 표면의 부분적 에폭시드를 전환시킨 다음, 적절한 금속 이온 용액으로 처리하여 수지에 착물화되도록 한다. 그 다음, His 태그가 붙은 효소를 첨가하여 His 태그와 금속 사이의 선택적 상호 작용이 신속한 착물화를 허용하도록 한 다음, 단백질 표면의 친핵성 잔기(Lys, Cys 또는 Ser)와 담체의 미반응 에폭시 잔기 사이에서 반응을 일으키도록 하여 공유 결합을 완료한다. 그 다음, EDTA 용액으로 세척하여 금속 이온을 제거한다. 반응성 에폭시드가 남지 않도록 하기 위해, 마지막으로 캡핑제로서 글리신을 사용하여 담체를 처리한다. 효소는 수지에 특이적으로 결합될 수 있지만, 안정성이 여전히 좋지 않으며, 6 사이클 후 잔류 활성은 10% 미만이다. 금속 및 이미노디아세트산 변성 수지의 착물화의 강도가 충분하지 않으므로, 효소가 매우 쉽게 누출된다.
본 발명에서, 이미노디아세트산 및 금속을 사용한 에폭시 수지의 변성을 수정하였다. 에폭시 수지와 이미노디아세트산을 반응시킨 후, PEI를 첨가하고 이온 부착을 통해 수지와 결합시킨 다음, 적절한 금속으로 처리한다. 그 다음, His 태그가 붙은 효소를 첨가한 다음 글루타르알데하이드 가교를 수행하여 부착을 더 강화시킨다. PEI는 이미노디아세트산보다 더 강한 금속에 결합될 수 있고, 글루타르알데하이드와 가교될 수도 있으므로, 효소 누출이 훨씬 적어지도록 한다.
해당 방안이 His 태그가 없는 효소에 적용될 수 있도록, PEI 수식 후 금속을 사용하지 않고, 글루타르알데하이드를 첨가하여 글루타르알데하이드와 PEI가 공유 결합을 형성하고 에폭시 수지 표면에 히드록실 잔류물이 남도록 한 다음 효소를 첨가하여 공유 결합시킨다.
2가지 방법에서, 효소는 또한 글루타르알데하이드를 첨가하기 전에 첨가되어 PEI와의 이온 흡착 및 금속 이온과의 친화 흡착의 2가지 방식으로 담체와 결합되도록 한 다음, 가교제를 첨가하여 효소, PEI 및 수지 사이의 가교를 수행하여 망상 구조와 강한 결합을 형성할 수 있다.
이하, 실시예와 함께 본 발명의 유익한 효과를 진일보로 설명한다.
이하 실시예에서 사용되는 효소 및 이의 유래는 표 3 내지 표 8에 나타낸 바와 같다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 1
과요오드산나트륨으로 산화시킨 에폭시 수지에서 효소의 고정화
5g의 에폭시 수지 ECR8285 또는 LX1000EP를 20 mL의 1M 아세트산에 각각 첨가하고, 실온에서 12시간 동안 부드럽게 교반하며, 아세트산으로 처리된 담체를 20 mL의 증류수로 3회 세척하고, 처리된 담체를 20 mL의 50 mM 과요오드산나트륨에 현탁시키며, 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하고, 여과하며 증류수로 세척하였다.
5g의 변성 에폭시 수지를 0.1M 인산 완충액으로 재현탁시키고, PEI를 최종 농도가 1%로 되도록 첨가하며, pH를 pH 7.0으로 조절하고, 2시간 동안 부드럽게 교반한 후, 50 내지 100 mM 글루타르알데하이드를 첨가하며, 실온에서 1 내지 2 시간 동안 부드럽게 교반하였다. 그 다음, 담체인 수지를 여과하고 10 mL의 물로 세척하였다. 세척된 담체를 효소 용액(10 mL의 효소이고, 5 mg/mL의 보조 인자를 함유하며, 40 mL의 100 mM 인산염 완충액에 용해되고, pH 7.0임)에 첨가하고, 10 내지 25 ℃에서 4시간 동안 교반하며, 냉장고에 밤새 넣어두었다. 밤새 방치한 후, 효소를 여과하고, 0.1M PB 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 선택적으로, 밤새 방치한 후, 과량의 글루타르알데하이드(20 내지 50 mM) 또는 덱스트란 알데히드(10 내지 50 mM)를 용액에 첨가하고, 10 내지 25 ℃에서 1시간 동안 부드럽게 교반한 다음, 여과하고 0.1M PB 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다.
실시예 2
과요오드산나트륨으로 산화시킨 에폭시 수지에서 효소의 고정화
5g의 에폭시 수지 비드를 50mL의 1M 아세트산에 첨가하고, 실온에서 12시간 동안 부드럽게 교반하며, 아세트산으로 처리된 담체를 50mL의 증류수로 3회 세척하되, 매 회 10분 동안 부드럽게 교반하고, 처리된 담체를 100mL의 과요오드산나트륨에 현탁시키며, 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하고, 여과하며 증류수로 세척하였다.
5g의 변성 에폭시 수지를 0.1M 인산 완충액으로 재현탁시키고, PEI를 최종 농도가 1%로 되도록 첨가하며, pH를 pH 7.0으로 조절하고, 2시간 동안 부드럽게 교반하였다. 그 다음, 담체를 여과하고 10mL의 물로 세척하였다. 세척된 담체를 효소 용액(10 mL의 효소이고, 5 mg/mL의 보조 인자를 함유하며, 40 mL의 100 mM 인산염 완충액에 용해되고, pH 7.0임)에 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하며, 냉장고에 밤새 넣어두었다. 밤새 방치한 후, 20 내지 100 mM 글루타르알데하이드를 용액에 첨가하고, 10 내지 25 ℃에서 1시간 동안 부드럽게 교반한 다음, 여과하고 0.1M PB 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다.
실시예 3
이미노디아세트산으로 변성시킨 에폭시 수지에서 효소의 고정화
4 g의 담체를 8 mL의 담체 수식 완충액(0.1M 붕산나트륨, 1M 이미노디아세트산, pH 8.5)에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕하였다. 2시간 후, 담체를 여과하여 담체 수식 완충액을 제거하고 재증류수로 세척한 다음, 인산염 완충액으로 재현탁시키고, PEI를 PEI의 최종 농도가 1%로 되도록 첨가하며, pH를 8.0 내지 11.0으로 조절하고, 3시간 동안 부드럽게 교반하였다. 담체를 여과하고 30mL의 물로 3회 세척한 다음, 20mL의 인산 완충액으로 재현탁시키고, 금속 이온의 농도가 10 내지 30mM로 되도록 첨가하였다. 금속 이온은 CoCl2, NiCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, FeCl2 또는 FeCl2로부터 선택된다.
실온에서 2시간 동안 흔들었다. 수지를 재증류수로 재차 헹구고 0.1M PB 완충액(pH 8.0)으로 세척하였다. 50mM 글루타르알데하이드가 함유된 완충액(0.1 M PB, pH=8.0)으로 다시 재현탁시키고(각 효소에 따라 보조 인자로 전처리함), 실온에서 1시간 동안 부드럽게 교반하였다. 여과하고 0.1M PB(pH=7.0)로 3회 세척하였다.
전처리된 수지를 16 mL의 0.1M PB(pH=7.0)로 재현탁시키고, 4 내지 8 mL의 효소 용액(50 내지 100 mg/mL의 단백질 함량, 3 내지 10 mg/mL의 보조 인자)을 첨가하여 30분 동안 지속적으로 부드럽게 교반하고, 하룻밤 지난 후 여과하였다. 20mL의 0.05M PB 완충액(pH 7.5, 0.05M EDTA 및 0.5M NaCl이 함유됨)으로 2회 세척하되, 매 회 10분 동안 부드럽게 교반하였다. 그 다음, 20mL의 물로 3회 세척한 다음 0.1M PB 완충액(pH 7.5)으로 세척하였다.
실시예 4
이미노디아세트산으로 변성시킨 에폭시 수지에서 효소의 고정화
4g의 담체를 8mL의 담체 수식 완충액(0.1M 붕산나트륨, 1M 이미노디아세트산, pH 8.5)에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕하였다. 2시간 후, 담체를 여과하여 담체 수식 완충액을 제거하고 재증류수로 세척한 다음, 인산염 완충액으로 재현탁시키고, PEI를 PEI의 최종 농도가 1%로 되도록 첨가하며, pH를 8.0 내지 11.0으로 조절하고, 3시간 동안 부드럽게 교반하였다. 담체를 여과하고 30mL의 물로 3회 세척한 다음, 20mL의 인산 완충액으로 재현탁시키고, 금속 이온의 농도가 10 내지 30 mM로 되도록 첨가하였다. 금속 이온은 CoCl2, NiCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, FeCl2 또는 FeCl2로부터 선택된다.
실온에서 2시간 동안 흔들었다. 수지를 재증류수로 재차 헹구고 0.1M PB 완충액(pH 8.0)으로 세척하였다. 16 mL의 완충액(0.1 M PB, pH=8.0)으로 다시 재현탁시키고, 4 내지 8 mL의 효소 용액(50 내지 100 mg/mL의 단백질 함량, 3 내지 10 mg/mL의 보조 인자)을 첨가하여 30분 동안 지속적으로 부드럽게 교반하고, 하룻밤 지난 후 여과하였다. 20 mL의 0.05M PB 완충액(pH 7.5, 0.05M EDTA 및 0.5M NaCl이 함유됨)으로 2회 세척하되, 매 회 10분 동안 부드럽게 교반하였다. 그 다음, 20 mL의 물로 3회 세척한 다음 0.1M PB 완충액(pH 7.5)으로 세척하였다.
실시예 5
이미노디아세트산으로 변성시킨 에폭시 수지에서 효소의 고정화
4 g의 담체를 8 mL의 담체 수식 완충액(0.1 M 붕산나트륨, 1 M 이미노디아세트산, pH 8.5)에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕하였다. 2시간 후, 담체를 여과하여 담체 수식 완충액을 제거하고 재증류수로 세척한 다음, 인산염 완충액으로 재현탁시키고, PEI를 PEI의 최종 농도가 1%로 되도록 첨가하며, pH를 8.0 내지 11.0으로 조절하고, 현탁시켜 3시간 동안 부드럽게 교반하였다. 담체를 여과하고 30 mL의 물로 3회 세척한 다음, 20 mL의 인산 완충액으로 재현탁시키고, 금속 이온의 농도가 10 내지 30 mM로 되도록 첨가하였다. 금속 이온은 CoCl2, NiCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, FeCl2 또는 FeCl2로부터 선택된다.
담체를 여과하고 30 mL의 물로 3회 세척한 다음, 16 mL의 PB 완충액(0.1 M, pH=8.0)에 재현탁시키고, 4 내지 8 mL의 효소 용액(50 내지 100 mg/mL의 단백질 함량, 3 내지 10 mg/mL의 보조 인자)을 첨가하여 30분 동안 지속적으로 부드럽게 교반하며, 하룻밤 지난 후 여과하였다. 16 mL의 0.1 M PB(pH=8.0), 5 mg/mL의 보조 인자 및 50 mM 글루타르알데하이드를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들었다. 20 mL의 0.05 M PB 완충액(pH 7.5, 0.05 M EDTA 및 0.5 M NaCl이 함유됨)으로 2회 세척하되, 매 회 10분 동안 부드럽게 교반하였다. 그 다음, 20 mL의 물로 3회 세척한 다음 0.1 M PB 완충액(pH 7.5)으로 세척하였다.
실시예 6
이미노디아세트산으로 변성시킨 에폭시 수지에서 효소의 고정화
4 g의 담체를 8 mL의 담체 수식 완충액(0.1 M 붕산나트륨, 1 M 이미노디아세트산, pH 8.5)에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 진탕하였다. 2시간 후, 담체를 여과하여 담체 수식 완충액을 제거하고 재증류수로 세척한 다음, 인산염 완충액으로 재현탁시키고, PEI를 PEI의 최종 농도가 1%로 되도록 첨가하며, pH를 8.0 내지 11.0으로 조절하고, 3시간 동안 부드럽게 교반하였다. 담체를 여과하고 30 mL의 물로 3회 세척한 다음, 20 mL의 인산 완충액으로 재현탁시키고, 금속 이온의 농도가 10 내지 30 mM로 되도록 첨가하였다. 금속 이온은 CoCl2, NiCl2.6H2O, CuSO4.5H2O, FeCl2 또는 FeCl2로부터 선택된다.
담체를 여과하고 30 mL의 물로 3회 세척한 다음, 전처리된 담체를 16 mL의 PB 완충액(0.1 M, pH=8.0)에 재현탁시키고, 4 내지 8 mL의 효소 용액(50 내지 100 mg/mL의 단백질 함량, 3 내지 10 mg/mL의 보조 인자)을 첨가하여 30분 동안 지속적으로 부드럽게 교반하며, 하룻밤 지난 후 여과하였다. 16 mL의 0.1 M PB(pH=8.0), 5 mg/mL의 보조 인자 및 50 mM 글루타르알데하이드를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들었다. 20 mL의 0.05 M PB 완충액(pH 7.5, 0.05 M EDTA 및 0.5 M NaCl이 함유됨)으로 2회 세척하되, 매 회 10분 동안 부드럽게 교반하였다. 그 다음, 20 mL의 물로 3회 세척한 다음 0.1 M PB 완충액(pH 7.5)으로 세척하였다.
또는, 전처리된 수지를 16 mL의 0.1 M PB(pH=7.0)로 재현탁시키고, 4 내지 8 mL의 효소 용액(50 내지 100 mg/mL의 단백질 함량, 3 내지 10 mg/mL의 보조 인자)을 첨가하여 30분 동안 지속적으로 부드럽게 교반하며, 하룻밤 지난 후 여과하였다. 20 mL의 0.05 M PB 완충액(pH 7.5, 0.05 M EDTA 및 0.5 M NaCl이 함유됨)으로 2회 세척하되, 매 회 10분 동안 부드럽게 교반하였다. 그 다음, 20 mL의 물로 3회 세척한 다음 0.1 M PB 완충액(pH 7.5)으로 세척하였다.
실시예 7
글루타르알데하이드를 PEI-수식 글루타르알데하이드로 변경하고, PEG 분자량이 6000 Da이며, PEG와 글루타르알데하이드의 질량비가 1 : 1인 것을 제외하고 실시예 2와 동일하다.
실시예 8
글루타르알데하이드를 알데히드 덱스트란으로 변경하는 것을 제외하고 실시예 1과 동일하다.
실시예 9
글루타르알데하이드를 PEI-수식 글루타르알데하이드로 변경하고, PEG 분자량이 6000 Da이며, PEG와 글루타르알데하이드의 질량비가 1 : 1인 것을 제외하고 실시예 5와 동일하다.
실시예 10
고정화 트랜스아미나제의 전환 및 반복 사용 시험
Figure pct00011
10 mL의 반응 플라스크에 0.3 mL의 MeOH를 넣고, 0.1 g의 주원료 1 또는 주원료 2를 용해시키며, 4 eq의 이소프로필아민 염산염 및 1.0 mg의 PLP(피리독살 5'-포스페이트)를 첨가하고, 반응액의 최종 부피가 1 mL로 되도록 0.1 M PB(pH 7.0)를 추가한 다음, 5 mg의 효소 분말, 또는 20 mg의 효소 분말로 제조된 가교 효소 응집체인 습식 효소 또는 가교 효소 응집체인 동결건조 분말을 첨가하며, 30℃에서 16 내지 20시간 동안 교반하였다. HPLC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 9와 같다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
IDA*-에폭시 담체는 IDA 및 금속 이온에 의해 수식된 후, 친화 흡착에 의해 효소에 결합된다.
IDA1-에폭시 담체는 IDA에 의해 수식된 후, PEI 및 금속 이온에 의해 진일보로 수식되고, 효소를 첨가하기 전에 가교제에 의해 수식된다.
IDA2-에폭시 담체는 IDA에 의해 수식된 후, PEI 및 금속 이온에 의해 진일보로 수식되고, 효소에 결합된 후 가교제에 의해 가교된다.
IDA3-에폭시 담체는 IDA에 의해 수식된 후, PEI 및 금속 이온에 의해 진일보로 수식되고, 효소를 첨가하기 전에 PEG로 처리된 가교제에 의해 수식된다.
IDA4-에폭시 담체는 IDA에 의해 수식된 후, PEI 및 금속 이온에 의해 진일보로 수식되고, 효소에 결합된 다음 PEG로 처리된 가교제에 의해 가교된다.
SP1-에폭시 담체는 과요오드산나트륨에 의해 산화되고, PEI에 의해 진일보로 수식되며, 효소를 첨가하기 전에 가교제에 의해 가교된다.
SP2-에폭시 담체는 과요오드산나트륨에 의해 산화되고, PEI에 의해 수식된 다음, 글루타르알데하이드에 의해 수식되고, 효소를 첨가한 다음 가교제에 의해 가교된다.
SP3-에폭시 담체는 과요오드산나트륨에 의해 산화되고, PEI에 의해 수식되며, 효소를 첨가한 후 가교제에 의해 진일보로 가교된다.
SP4-에폭시 담체는 과요오드산나트륨에 의해 산화된 후, PEI 및 금속 이온에 의해 진일보로 수식되고, 효소에 결합된 다음 PEG로 처리된 가교제에 의해 진일보로 가교된다.
실시예 11
고정화 케토리덕타제의 전환 및 반복 사용 시험
Figure pct00015
10 mL의 반응 플라스크에 0.5 mL의 이소프로판올(IPA)을 넣고, 0.1 g의 주원료 3 또는 주원료 4를 용해시키며, 0.5 mL의 0.1 M PB(pH 7.0) 및 1 내지 10 mg의 NAD+를 첨가한 다음, 5 mg의 효소 분말, 또는 10 mg의 효소 분말로 제조된 고정화 효소를 첨가하고, 30℃에서 16 내지 20시간 동안 교반하였다. GC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 10과 같다.
Figure pct00016
실시예 12
고정화 CHMOs의 전환 및 반복 사용 시험
CHMO 에폭시 담체 고정화 효소의 활성은 하기 기질 5를 이용하여 반응시켜 검출하였다.
Figure pct00017
0.3 mL의 이소프로판올을 10 mL의 반응 플라스크에 넣은 다음 100 mg의 기질 5, 5 mg의 NADP+가 함유된 3 mL의 0.1 M PB(pH 8.0)를 첨가한 다음, 2 mg의 알코올 탈수소효소 ADH-Tb 유리 효소 및 20 mg의 시클로헥사논 모노옥시게나제 유리 효소, 50 mg의 유리 효소로 제조된 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16 내지 20시간 동안 반응시키고, 전환율을 테스트하며, 1회의 반응이 종료된 후마다 고정화 효소를 분리하여 다음 회 반응에 재사용하고, 반복 사용 횟수를 조사하였다. GC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 11과 같다.
Figure pct00018
실시예 13
고정화 ERED의 전환 및 반복 사용 시험
ERED 에폭시 담체 고정화 효소의 활성은 하기 기질 6을 이용하여 반응시켜 검출하였다.
Figure pct00019
3 mL의 0.1 M PB(pH 7.0 내지 8.0)를 10 mL의 반응 플라스크에 넣은 다음 100 mg의 기질 6을 첨가하고, 이어서 10 mg의 NAD(P)+, 80 mg의 포름산암모늄, 2 mg의 FDH 및 10 mg의 ERED 유리 효소, 또는 30 mg의 유리 효소로 제조된 고정화 효소를 첨가하였다. 30
Figure pct00020
에서 16 내지 20시간 동안 반응시키고, 전환율을 테스트하며, 1회의 반응이 종료된 후마다 고정화 효소를 분리하여 다음 회 반응에 재사용하고, 반복 사용 횟수를 조사하였다. GC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 12와 같다.
Figure pct00021
실시예 14
고정화 NITs의 전환 및 반복 사용 시험
NIT 아미노 담체 고정화 효소의 활성은 하기 기질 7을 이용하여 반응시켜 검출하였다.
Figure pct00022
2 mL의 0.1 M PB 완충액(pH 7.0 내지 8.0)을 10 mL의 반응 플라스크에 넣고, 100 mg의 상기 기질 7을 넣은 다음, 20 mg 의 NIT 유리 효소가 함유되거나 30 mg의 유리 효소로 제조된 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 검출하고, 1회의 반응이 종료된 후마다 고정화 효소를 분리하여 다음 회 반응에 재사용하고, 반복 사용 횟수를 조사하였다. GC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 13과 같다.
Figure pct00023
실시예 15
고정화 IRED의 전환 및 반복 사용 시험에서, 하기 기질 8을 통해 검출하였다.
2 mL의 0.1 M PB 완충액(pH 7.0 내지 8.0)을 10 mL의 반응 플라스크에 넣은 다음 100 mg의 기질 8, 10 mg의 NAD+, 60 mg의 포름산암모늄, 10 mg의 FDH 및 10 mg의 IRED 유리 효소, 또는 30 mg의 유리 효소로 제조된 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 검출하고, 1회의 반응이 종료된 후마다 고정화 효소를 분리하여 다음 회 반응에 재사용하고, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
Figure pct00024
HPLC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 14와 같다.
Figure pct00025
실시예 16
고정화 PAL의 전환 및 반복 사용 시험
고정화 효소의 활성 및 반복 사용 횟수는 하기 기질 9를 이용하여 반응시켜 검출하였다.
Figure pct00026
8 mL의 4 M 암모늄 카바메이트 수용액(pH 9.0 내지 9.5)을 10 mL의 반응 플라스크에 넣고, 100 mg의 상기 기질 9를 첨가한 다음, 10 mg의 암모니아 리아제 유리 효소, 또는 40 mg의 유리 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16 내지 20시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 검출하고, 1회의 반응이 종료된 후마다 고정화 효소를 분리하여 다음 회 반응에 재사용하며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
HPLC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 15와 같다.
Figure pct00027
실시예 17
고정화 AADH의 전환 및 반복 사용 시험
Figure pct00028
10 mL의 반응 플라스크에 5 mL의 0.1 M Tris-Cl 완충액(pH 8.0 내지 9.0)을 넣고, 100 mg의 주원료 10, 주원료 11 또는 주원료 12를 용해시키며, 108 mg의 염화암모늄을 첨가하고, pH를 7.5 내지 8.0로 조절한 다음, 10 ~ 50 mg의 NAD+, 150 mg의 포도당 및 5 mg의 GDH, 10 mg의 AADH, 또는 30 mg의 유리 효소로 제조된 고정화 AADH를 첨가하였다. 30℃에서 16 내지 20시간 동안 교반하였다. HPLC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 16과 같다.
Figure pct00029
실시예 18
고정화 FDH의 전환 및 반복 사용 시험
10 mL의 반응 플라스크에 5 mL의 0.1 M Tris-Cl 완충액(pH 8.0 내지 9.0)을 넣고, 100 mg의 주원료 12를 용해시키며, 108 mg의 염화암모늄, 80 mg의 암모늄염을 첨가하고, pH를 7.5 내지 8.0로 조절한 다음, 10 내지 50 mg의 NAD+, 100 mg의 AADH-Bc 유리 효소 및 5 mg의 FDH, 또는 10 mg의 유리 효소로 제조된 고정화 FDH를 첨가하였다. 30℃에서 16 내지 20시간 동안 교반하였다. HPLC를 통해 시스템의 전환율을 검출하고, 반응 데이터는 하기 표 17과 같다.
Figure pct00030
실시예 19
충전층 연속 반응에서 트랜스아미나제 아미노 담체 고정화 효소의 응용
실시예에서 트랜스아미나제 TA-Cv-V1을 담체 ECR8285에 고정화하되, IDA1의 방식을 통해 고정화하며, 얻은 고정화 효소를 컬럼 부피가 120 mL인 컬럼 반응기에 충전하며, 고정화 효소 사용량은 72g이다.
500g의 기질 1을 1.5 L의 메탄올로 용해시키고, 4 eq의 이소프로필아민 염산염(1.8 L의 6 M 이소프로필아민 염산염 수용액) 및 5g의 PLP를 첨가하며, PB 완충액(0.1 M,pH 8.0)을 첨가하지 않고 5L의 정적(constant volume)으로 만들었다.
유속을 0.6 mL/min, 즉 머무름 시간을 200분으로 설정하고, 연속 반응을 수행하여 출구단 유출액의 전환율을 검출한 결과 전환율＞98%이며, 260시간 동안 지속적으로 수행하여도 전환율이 감소되지 않았고, 280시간 동안 수행하면 전환율이 90%로 감소된다. 구체적으로 표 18과 같다.
Figure pct00031
실시예 20
연속 교반 탱크 반응에서 트랜스아미나제 고정화 효소의 응용
실시예 1과 동일한 고정화 효소 TA-Ac-V1을 사용하고, 담체는 LX1000HFA이며, SP2의 방식을 통해 고정화하였다. 200 mL의 반응기에 50g의 트랜스아미나제 TA-Ac-V1의 고정화 효소를 넣고, 150 mL의 인산 완충액을 첨가하였다.
500g의 기질 1에 3.2L의 PB(0.1M,pH 7.0), 1.8 L의 이소프로필아민 염산염 수용액(6 M) 및 5g의 PLP를 첨가하고, 슬러리화하여 현탁액으로 제조하였다.
0.4 mL/min의 속도로 반응 플라스크에 기질 현탁액을 연속적으로 첨가하고(즉 머무름 시간이 500분임), 동시에 동일한 유속으로 출구로부터 반응 시스템을 펌핑하였다(파이프 말단에 필터 헤드를 추가하여 고정화 효소가 펌핑되는 것을 방지함). 상기 조건에서, 전환율은 90% 이상에 도달할 수 있고, 2000시간 동안 연속적으로 수행하여도 전환율이 거의 감소되지 않았다. 결과는 표 19와 같다.
Figure pct00032
실시예 21
암모니아 리아제 PAL-Ss 고정화 효소를 사용하고, 담체는 HFA001이며, IDA4의 방식을 통해 고정화하였다. 6g의 얻은 고정화 효소를 10 mL의 컬럼 반응기에 충전하였다.
500g의 기질 9를 4.5 L의 암모늄 카바메이트 수용액(4 M, pH 9.0 ~ 9.5)으로 용해시켰다.
유속을 0.03 mL/min, 즉 머무름 시간을 330분으로 설정하고, 연속 반응을 수행하여 출구단 유출액의 전환율을 검출한 결과, 전환율이 80%이며, 300시간 동안 지속적으로 수행하여도 전환율이 감소되지 않았고, 310시간 동안 수행하면 전환율이 70%로 감소된다. 구체적으로 표 20과 같다.
Figure pct00033
실시예 22
실시예에서 제조된 케토리덕타제 KRED-Ac-V1 고정화 효소를 사용하고, 담체는 LX1000EP이며, IDA4의 방식을 통해 고정화하였다. 6g의 얻은 고정화 효소를 10 mL의 컬럼 반응기에 충전하였다.
100g의 기질 3을 0.3L의 이소프로판올로 용해시키고, 0.7L의 PB 완충액(0.1 M,pH 7.0)을 첨가하여 용해시킨 다음 0.1g의 NAD+를 첨가하였다.
유속을 0.05 mL/min, 즉 머무름 시간을 200분으로 설정하고, 연속 반응을 수행하여 출구단 유출액의 전환율을 검출한 결과 전환율＞90%이며, 200시간 동안 지속적으로 수행하여도 전환율이 감소되지 않았고, 210시간 동안 수행하면 전환율이 80%로 감소된다. 구체적으로 표 21과 같다.
Figure pct00034
실시예 23
과요오드산나트륨으로 산화시킨 에폭시 수지 고정화의 각 매개변수 조사
아세트산의 농도 및 사용량, 과요오드산나트륨의 농도 및 사용량, 및 가교제의 농도를 조사하였다.
실시예 4의 방법으로 FDH를 LX1000HFA 담체에 고정화하고, 이미노디아세트산(IDA)의 농도를 0.2 내지 3 mol/L, IDA 용액과 담체의 부피/질량비를 2 내지 25 : 1로 설정하고, 금속 이온의 농도를 5 내지 100 mmol/L로 설정하여 가교제인 덱스트란 알데히드(DA)의 범위를 조사하였다. 여기서, 최적의 IDA의 농도는 1 내지 2 mol/L이고, 최적의 담체와의 부피/질량비는 10 내지 20 : 1이며; 금속 이온의 농도가 10 내지 100 mmol/L일 때 활성이 모두 좋고, 비용을 고려하면, 10 내지 50 mmol/L의 농도를 사용할 수 있으며; 가교제 DA는 0.5% 내지 2%의 범위 내에서 가장 좋다. 구체적인 매개변수 및 결과는 표 22와 같다.
Figure pct00035
아세트산의 농도, 아세트산 용액과 담체의 부피/질량비, 과요오드산나트륨의 농도, 과요오드산나트륨 용액과 담체의 부피/질량비, 및 가교제 GA의 농도를 조사하였다.
실시예 3과 동일한 방법으로 FDH를 담체 HFA에 고정화하고, 아세트산의 농도, 아세트산 용액과 담체의 부피/질량비, 과요오드산나트륨의 농도, 과요오드산나트륨 용액과 담체의 부피/질량비, 및 가교제 GA의 농도를 서로 다르게 설정하였다. 결과로부터 알 수 있는 바, 최적의 아세트산의 농도는 1 내지 2 mol/L이고; 최적의 아세트산 용액과 담체의 부피/질량비는 10 내지 15 : 1이며; 최적의 과요오드산나트륨의 농도는 0.1 내지 0.2mol/L이고, 담체와의 부피 질량비가 5 내지 25일 때 효과가 모두 좋으며, 비용 절약을 고려하면, 5 내지 15 : 1이 바람직할 수 있고; 가교제의 농도가 0.5% 내지 2%일 때 모두 좋다. 구체적인 매개변수 및 결과는 표 23과 같다.
Figure pct00036
PEI의 사용량의 조사
실시예 2(IDA4) 및 실시예 5(SP3)와 동일한 방법으로 FDH를 담체 ECR8285에 고정화하고, 분자량이 다른 PEI를 선택하며, PEI의 농도를 서로 다르게 설정하여 PEI의 적절한 사용량을 조사하고, 고정화 효소에 대한 서로 다른 pH의 영향을 조사하였다. 결과로부터 알 수 있는 바, PEI의 분자량이 3 Kda 내지 70 Kda일 때 모두 유사한 효과를 나타내고, PEI의 가장 적절한 농도 범위는 1% 내지 2%이며; pH 6.0 내지 10.0는 고정화 효소 활성에 대해 거의 영향을 미치지 않고, pH가 7 내지 9일 경우, 안정성이 가장 좋다. 구체적인 매개변수 및 결과는 표 24와 같다.
Figure pct00037
PEG로 수식한 가교제의 비율의 조사
실시예 7(SP4) 및 실시예 9(IDA4)와 동일한 방법으로 FDH를 담체 ECR8285에 고정화하여, PEG로 글루타르알데하이드를 수식하는 방법에서 PEG의 범위, 및 PEG와 GA의 비율을 조사하였다. 결과로부터 알 수 있는 바, PEG200, PEG2000, PEG6000은 모두 글루타르알데하이드를 수식할 수 있고, PEG와 GA의 비율이 1 : 1 내지 10 : 1의 범위 내에 있을 때 효소의 반복 사용성이 좋으며, 2 : 1 내지 4 : 1의 범위 내에 있을 때 가장 좋다. 구체적인 매개변수 및 결과는 표 25와 같다.
Figure pct00038
상술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐 본 발명을 제한하지 않으며, 당업자에게 있어서 본 발명이 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음은 자명한 것이다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 이루어진 임의의 수정, 등가적 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 속해야 한다.
<110> Jilin Asymchem Laboratories Co., Ltd. <120> Modified Epoxy Resin Immobilized Enzyme, and Preparation Method thereof and Use thereof <130> IP-2815-CN <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 459 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chromobacterium violaceum DSM30191 <400> 1 Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly 20 25 30 Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu 35 40 45 Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val 50 55 60 Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu 65 70 75 80 Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val 85 90 95 Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp 100 105 110 Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile 115 120 125 Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys 130 135 140 Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly 145 150 155 160 Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro 165 170 175 Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly 180 185 190 Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu 195 200 205 Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val 210 215 220 Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu 245 250 255 Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe 260 265 270 Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys 290 295 300 Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe 305 310 315 320 Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val 325 330 335 Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile 340 345 350 Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu 355 360 365 His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu 370 375 380 Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile 385 390 395 400 Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg 405 410 415 Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg 420 425 430 Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu 435 440 445 Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala 450 455 <210> 2 <211> 1344 <212> PRT <213> Arthrobacter citreus <400> 2 Met Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Gly Leu 1 5 10 15 Asn Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Ala Ser Asn Thr Arg Pro Gly Leu Gly 20 25 30 Leu Asn Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Thr Arg Pro Ala Ser Pro 35 40 45 Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Leu Glu Met Glu Thr Ala Arg 50 55 60 Gly Thr His Arg Pro His Glu Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Asn 65 70 75 80 Ala Ser Asn Gly Leu Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Pro Arg Val Ala Leu 85 90 95 Pro Arg Ile Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Gly 100 105 110 Leu Tyr Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Leu Glu Ile Leu Glu Thr His Arg 115 120 125 Pro Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Arg Gly Leu Glu 130 135 140 Leu Glu Ala Ser Pro Pro His Glu Pro His Glu Ala Ser Asn Gly Leu 145 150 155 160 Asn Leu Glu Cys Tyr Ser Cys Tyr Ser Val Ala Leu Ala Ser Asn Leu 165 170 175 Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Asn 180 185 190 Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ile 195 200 205 Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ala Ser Pro Ala 210 215 220 Arg Gly Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu Val Ala Leu Thr Arg 225 230 235 240 Pro Ala Ser Pro Thr His Arg Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Thr His Arg 245 250 255 Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ala 260 265 270 Leu Ala Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Leu Glu Ile Leu 275 280 285 Glu Gly Leu Ala Ser Pro Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Ser 290 295 300 Pro Gly Leu Ala Ser Pro Thr Arg Pro Pro Arg Gly Leu Tyr Leu Tyr 305 310 315 320 Ser Val Ala Leu Ala Arg Gly Pro His Glu Val Ala Leu Ser Glu Arg 325 330 335 Thr His Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Ala Leu Ala Val Ala 340 345 350 Leu Gly Leu Thr His Arg Ala Leu Ala Leu Glu Ala Ser Asn Ile Leu 355 360 365 Glu Ala Leu Ala Ala Arg Gly Leu Glu Thr Tyr Arg Thr His Arg Ala 370 375 380 Ser Asn Ala Arg Gly Pro Arg Leu Glu Val Ala Leu Val Ala Leu Thr 385 390 395 400 His Arg Ala Arg Gly Gly Leu His Ile Ser Ala Ser Pro Thr Tyr Arg 405 410 415 His Ile Ser Gly Leu Tyr Thr Arg Pro Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly 420 425 430 Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Thr His Arg Val Ala Leu Thr His 435 440 445 Arg Ala Arg Gly Leu Glu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Pro His Glu Ala 450 455 460 Arg Gly Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Leu Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr 465 470 475 480 Gly Leu Ala Ser Asn Ser Glu Arg Gly Leu Ser Glu Arg Pro His Glu 485 490 495 Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ile Leu Glu Pro Arg Gly Leu 500 505 510 Tyr Ser Glu Arg Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg 515 520 525 Ala Leu Ala Val Ala Leu Leu Glu Met Glu Thr Ala Leu Ala Pro Arg 530 535 540 Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Ser Asn Thr His Arg Pro His Glu Gly 545 550 555 560 Leu Asn Ala Ser Pro Ser Glu Arg Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala Ser 565 570 575 Asn Thr Tyr Arg Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Gly Leu Ala Ser 580 585 590 Asn Gly Leu Tyr Gly Leu Leu Glu Leu Glu Ser Glu Arg Val Ala Leu 595 600 605 Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Thr His Arg Ala Arg Gly Ala Arg Gly Met 610 615 620 Glu Thr Ile Leu Glu Gly Leu Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr 625 630 635 640 Pro Arg Gly Leu Gly Leu Asn Val Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala 645 650 655 Val Ala Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Gly Leu Val Ala Leu Ser Glu 660 665 670 Arg Gly Leu Asn Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ser Glu Arg 675 680 685 Thr His Arg Met Glu Thr Pro Arg Pro Arg Thr Tyr Arg Gly Leu Thr 690 695 700 Tyr Arg Val Ala Leu Pro Arg Gly Leu Asn Ile Leu Glu Ala Arg Gly 705 710 715 720 Leu Tyr Ser Met Glu Thr Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Glu 725 730 735 Gly Leu Tyr Val Ala Leu Leu Glu Thr Arg Pro Ile Leu Glu Ser Glu 740 745 750 Arg Ala Ser Pro Gly Leu Val Ala Leu Leu Glu Thr His Arg Gly Leu 755 760 765 Tyr Pro His Glu Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Thr His Arg Gly Leu Tyr 770 775 780 Leu Tyr Ser Thr Arg Pro Pro His Glu Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Gly 785 790 795 800 Leu Asn His Ile Ser Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu 805 810 815 Asn Pro Arg Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ile Leu Glu Thr His Arg Met 820 825 830 Glu Thr Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Leu Glu Ser Glu Arg 835 840 845 Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala 850 855 860 Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Val Ala Leu Val Ala Leu Val Ala Leu Ser 865 870 875 880 Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Ile Leu Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ala 885 890 895 Pro His Glu Met Glu Thr Ala Ser Pro Leu Tyr Ser His Ile Ser Ala 900 905 910 Arg Gly Thr Arg Pro Gly Leu Ser Glu Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg 915 920 925 Thr His Arg Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr His Ile Ser Pro 930 935 940 Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala Met Glu Thr Ala Leu Ala Ala Leu Ala 945 950 955 960 Val Ala Leu Cys Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser Asn Leu Glu Gly Leu 965 970 975 Val Ala Leu Met Glu Thr Met Glu Thr Gly Leu Gly Leu Ala Ser Asn 980 985 990 Leu Glu Val Ala Leu Gly Leu Gly Leu Asn Ala Leu Ala Leu Tyr Ser 995 1000 1005 Ala Ser Asn Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Thr Tyr Arg Ile Leu 1010 1015 1020 Glu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Gly Leu Leu Glu 1025 1030 1035 1040 Leu Glu Gly Leu Asn Gly Leu Leu Tyr Ser His Ile Ser Leu Tyr Ser 1045 1050 1055 Ser Glu Arg Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Pro His Glu Ala 1060 1065 1070 Ser Pro Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Thr 1075 1080 1085 Arg Pro Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Ile Leu Glu Val Ala 1090 1095 1100 Leu Ala Ser Asn Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Thr His Arg Leu Tyr Ser 1105 1110 1115 1120 Thr His Arg Pro Arg Thr Tyr Arg Val Ala Leu Leu Tyr Ser Leu Glu 1125 1130 1135 Ala Ser Pro Ala Arg Gly Ala Ser Asn Pro His Glu Ala Arg Gly His 1140 1145 1150 Ile Ser Gly Leu Tyr Met Glu Thr Ala Ser Asn Pro Arg Ala Ser Asn 1155 1160 1165 Gly Leu Asn Ile Leu Glu Pro Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Ile Leu 1170 1175 1180 Glu Ile Leu Glu Met Glu Thr Gly Leu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Leu 1185 1190 1195 1200 Glu Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Val Ala Leu Leu Glu Ile Leu 1205 1210 1215 Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Met Glu Thr Pro Arg Ala 1220 1225 1230 Ser Asn Thr His Arg Met Glu Thr Ala Arg Gly Ile Leu Glu Gly Leu 1235 1240 1245 Tyr Ala Leu Ala Ser Glu Arg Leu Glu Ala Ser Asn Val Ala Leu Ser 1250 1255 1260 Glu Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ala Ser 1265 1270 1275 1280 Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Met Glu Thr Ala Ser Pro Ala Leu Ala 1285 1290 1295 Leu Glu Ala Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Leu Glu Ala Ala 1300 1305 1310 Ser Pro Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Gly Leu Ala Ser Glu Arg Gly Leu 1315 1320 1325 Tyr Gly Leu Ala Thr Arg Pro Gly Leu Asn Gly Leu Asn Ser Glu Arg 1330 1335 1340 <210> 3 <211> 721 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Acetobacter sp. CCTCC M209061 <400> 3 Met Glu Thr Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Leu Tyr Ser Val Ala Leu Ala Leu Ala Ile Leu Glu Val Ala 20 25 30 Leu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ser Asn 35 40 45 Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Thr 50 55 60 His Arg Ala Leu Ala Gly Leu Asn Leu Glu Leu Glu Ala Leu Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Val Ala Leu 85 90 95 Val Ala Leu Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Leu Glu Leu Tyr 100 105 110 Ser Gly Leu Gly Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Tyr 115 120 125 Ser Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Leu Glu Leu 130 135 140 Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu 145 150 155 160 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Val Ala Leu Leu Tyr Ser Leu 165 170 175 Glu Ala Ser Asn Val Ala Leu Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Ala 180 185 190 Leu Ala Ala Leu Ala Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Leu 195 200 205 Ala Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Thr His Arg Leu Glu Leu 210 215 220 Tyr Ser Leu Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Leu Glu Ala 225 230 235 240 Ser Pro Ile Leu Glu Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Ser Asn Ala Ser 245 250 255 Asn Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Ala Ser Asn Thr Tyr Arg 260 265 270 Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Ser Glu 275 280 285 Arg Thr His Arg Ser Glu Arg Leu Glu Gly Leu Ala Ser Pro Thr Arg 290 295 300 Pro Ala Arg Gly Ala Arg Gly Val Ala Leu Gly Leu Asn Ser Glu Arg 305 310 315 320 Ile Leu Glu Ala Ser Asn Leu Glu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala 325 330 335 Leu Pro His Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Asn Val 340 345 350 Ala Leu Ala Leu Ala Ile Leu Glu Gly Leu Ala Leu Ala Met Glu Thr 355 360 365 Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly 370 375 380 Leu Tyr Ser Glu Arg Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Leu Glu 385 390 395 400 Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ile Leu Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Leu 405 410 415 Glu Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Pro Arg Met Glu Thr Leu 420 425 430 Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala 435 440 445 Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ala 450 455 460 Arg Gly Leu Glu Pro His Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Ser Glu Arg 465 470 475 480 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Leu Glu His Ile Ser Cys Tyr Ser Ala Leu 485 490 495 Ala Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser 500 505 510 Ile Leu Glu Ala Arg Gly Val Ala Leu Ala Ser Asn Ser Glu Arg Val 515 520 525 Ala Leu His Ile Ser Pro Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Ile Leu Glu 530 535 540 Thr Arg Pro Thr His Arg Pro Arg Met Glu Thr Val Ala Leu Ala Leu 545 550 555 560 Ala Gly Leu Tyr Leu Glu Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Ser 565 570 575 Pro Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Arg Gly Gly Leu Asn 580 585 590 Leu Tyr Ser Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Leu Glu His Ile Ser 595 600 605 Pro Arg Ile Leu Glu Gly Leu Tyr His Ile Ser Leu Glu Gly Leu Tyr 610 615 620 Gly Leu Pro Arg Ala Ser Asn Ala Ser Pro Ile Leu Glu Ala Leu Ala 625 630 635 640 Thr Tyr Arg Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Leu Glu Thr Tyr Arg Leu Glu 645 650 655 Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ala Ser Pro Gly Leu Ser Glu Arg Leu Tyr 660 665 670 Ser Pro His Glu Val Ala Leu Thr His Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg 675 680 685 Gly Leu Ala Leu Glu Ala Val Ala Leu Ile Leu Glu Ala Ser Pro Gly 690 695 700 Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Thr His Arg Ala Leu Ala Gly Leu 705 710 715 720 Asn <210> 4 <211> 1522 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhodococcus sp. Phi1 <400> 4 Met Glu Thr Thr His Arg Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ile Leu Glu Ser 1 5 10 15 Glu Arg Pro Arg Thr His Arg Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Pro 20 25 30 Ala Leu Ala Val Ala Leu Val Ala Leu Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Ala 35 40 45 Leu Ala Gly Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ile Leu 50 55 60 Glu Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Val Ala Leu His Ile Ser Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Glu His Ile Ser Ala Ser Asn Gly Leu Gly Leu Asn Gly Leu Tyr 85 90 95 Leu Glu Thr His Arg Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Pro His 100 105 110 Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser Pro Gly Leu Tyr 115 120 125 Pro Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Thr His Arg Thr Arg Pro Thr Tyr 130 135 140 Arg Thr Arg Pro Ala Ser Asn Ala Arg Gly Thr Tyr Arg Pro Arg Gly 145 150 155 160 Leu Tyr Ala Leu Ala Leu Glu Ser Glu Arg Ala Ser Pro Thr His Arg 165 170 175 Gly Leu Ser Glu Arg His Ile Ser Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Arg Gly 180 185 190 Pro His Glu Ser Glu Arg Pro His Glu Ala Ser Pro Ala Arg Gly Ala 195 200 205 Ser Pro Leu Glu Leu Glu Gly Leu Asn Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Thr 210 215 220 His Arg Thr Arg Pro Leu Tyr Ser Thr His Arg Thr His Arg Thr Tyr 225 230 235 240 Arg Ile Leu Glu Thr His Arg Gly Leu Asn Pro Arg Gly Leu Ile Leu 245 250 255 Glu Leu Glu Gly Leu Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg Val 260 265 270 Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser Pro Ala Arg Gly Pro His Glu Ala Ser 275 280 285 Pro Leu Glu Ala Arg Gly Ala Arg Gly His Ile Ser Pro His Glu Ala 290 295 300 Arg Gly Pro His Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Val Ala Leu 305 310 315 320 Thr His Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Ile Leu Glu Thr Tyr Arg Leu 325 330 335 Glu Gly Leu Ala Ser Pro Gly Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Arg Pro 340 345 350 Gly Leu Val Ala Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Leu Tyr 355 360 365 Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Ala 370 375 380 Leu Ala Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Ser 385 390 395 400 Asn Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Tyr Leu Glu Leu Glu Ser Glu 405 410 415 Arg Ala Leu Ala Ile Leu Glu Ala Ser Asn Pro His Glu Pro Arg Ala 420 425 430 Ser Pro Leu Glu Pro Arg Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Ser Pro Thr His 435 440 445 Arg Pro His Glu Gly Leu Gly Leu Tyr Gly Leu Thr His Arg Ile Leu 450 455 460 Glu His Ile Ser Thr His Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Thr Arg Pro 465 470 475 480 Pro Arg Gly Leu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Glu Ala 485 490 495 Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Val Ala Leu Gly Leu 500 505 510 Tyr Val Ala Leu Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Tyr 515 520 525 Ser Glu Arg Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Asn Val 530 535 540 Ala Leu Ile Leu Glu Thr His Arg Ala Leu Ala Leu Glu Ala Leu Ala 545 550 555 560 Pro Arg Gly Leu Val Ala Leu Gly Leu His Ile Ser Leu Glu Thr His 565 570 575 Arg Val Ala Leu Pro His Glu Val Ala Leu Ala Arg Gly Thr His Arg 580 585 590 Pro Arg Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro Arg 595 600 605 Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Ala Arg Gly Pro Arg Val Ala 610 615 620 Leu Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Leu Asn Ile Leu Glu Ala 625 630 635 640 Ser Pro Ala Leu Ala Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ala Ser 645 650 655 Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Pro 660 665 670 Ala Ser Pro Ser Glu Arg Val Ala Leu Leu Tyr Ser Leu Tyr Ser Ser 675 680 685 Glu Arg Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Leu Ala Pro His Glu Gly Leu 690 695 700 Tyr Pro His Glu Gly Leu Gly Leu Ser Glu Arg Thr His Arg Leu Glu 705 710 715 720 Pro Arg Ala Leu Ala Met Glu Thr Ser Glu Arg Val Ala Leu Ser Glu 725 730 735 Arg Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Ala Arg Gly 740 745 750 Ile Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Asn Gly Leu Ala Leu Ala Thr Arg 755 760 765 Pro Ala Ser Pro His Ile Ser Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr 770 775 780 Pro His Glu Ala Arg Gly Pro His Glu Met Glu Thr Pro His Glu Gly 785 790 795 800 Leu Tyr Thr His Arg Pro His Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Ile Leu 805 810 815 Glu Ala Leu Ala Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Ala Leu Ala Ala 820 825 830 Leu Ala Ala Ser Asn Gly Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala 835 840 845 Ser Glu Arg Pro His Glu Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Leu 850 855 860 Tyr Ser Ile Leu Glu Ala Leu Ala Gly Leu Ile Leu Glu Ile Leu Glu 865 870 875 880 Gly Leu Ala Ser Pro Pro Arg Gly Leu Thr His Arg Ala Leu Ala Ala 885 890 895 Arg Gly Leu Tyr Ser Leu Glu Met Glu Thr Pro Arg Thr His Arg Gly 900 905 910 Leu Tyr Leu Glu Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ala Arg Gly 915 920 925 Pro Arg Leu Glu Cys Tyr Ser Ala Ser Pro Ala Ser Asn Gly Leu Tyr 930 935 940 Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Gly Leu Val Ala Leu Thr Tyr Arg Ala Ser 945 950 955 960 Asn Ala Arg Gly Pro Arg Ala Ser Asn Val Ala Leu Gly Leu Ala Leu 965 970 975 Ala Val Ala Leu Ala Leu Ala Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Ala 980 985 990 Ser Asn Pro Arg Ile Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Val Ala Leu Thr 995 1000 1005 His Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Val Ala Leu Val Ala 1010 1015 1020 Leu Thr His Arg Gly Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Leu 1025 1030 1035 1040 Glu His Ile Ser Gly Leu Leu Glu Ala Ser Pro Val Ala Leu Leu Glu 1045 1050 1055 Val Ala Leu Pro His Glu Ala Leu Ala Thr His Arg Gly Leu Tyr Pro 1060 1065 1070 His Glu Ala Ser Pro Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Ser Pro Gly Leu 1075 1080 1085 Tyr Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ile Leu Glu 1090 1095 1100 Gly Leu Ile Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Ala Ser 1105 1110 1115 1120 Asn Gly Leu Tyr Leu Glu His Ile Ser Ile Leu Glu Ala Ser Asn Ala 1125 1130 1135 Ser Pro His Ile Ser Thr Arg Pro Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Gly Leu 1140 1145 1150 Asn Pro Arg Thr His Arg Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Leu Glu Gly Leu 1155 1160 1165 Tyr Val Ala Leu Thr His Arg Thr His Arg Ala Leu Ala Ala Ser Asn 1170 1175 1180 Pro His Glu Pro Arg Ala Ser Asn Thr Arg Pro Pro His Glu Met Glu 1185 1190 1195 1200 Thr Val Ala Leu Leu Glu Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ser Asn Gly Leu 1205 1210 1215 Tyr Pro Arg Pro His Glu Thr His Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro Arg 1220 1225 1230 Pro Arg Ser Glu Arg Ile Leu Glu Gly Leu Thr His Arg Gly Leu Asn 1235 1240 1245 Val Ala Leu Gly Leu Thr Arg Pro Ile Leu Glu Ser Glu Arg Ala Ser 1250 1255 1260 Pro Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala Thr Tyr Arg Ala Leu Ala 1265 1270 1275 1280 Gly Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Gly Leu Ile Leu Glu Ala Arg Gly 1285 1290 1295 Ala Leu Ala Ile Leu Glu Gly Leu Pro Arg Thr His Arg Pro Arg Gly 1300 1305 1310 Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly Leu Gly Leu Thr Arg Pro Thr His Arg 1315 1320 1325 Gly Leu Asn Thr His Arg Cys Tyr Ser Thr His Arg Ala Ser Pro Ile 1330 1335 1340 Leu Glu Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Leu Ala Thr His Arg Leu Glu 1345 1350 1355 1360 Pro His Glu Thr His Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Ser 1365 1370 1375 Glu Arg Thr Arg Pro Ile Leu Glu Pro His Glu Gly Leu Tyr Ala Leu 1380 1385 1390 Ala Ala Ser Asn Val Ala Leu Pro Arg Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Leu 1395 1400 1405 Tyr Ser Pro Arg Ser Glu Arg Val Ala Leu Leu Glu Pro His Glu Thr 1410 1415 1420 Tyr Arg Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Gly Leu 1425 1430 1435 1440 Tyr Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Ala Ser Asn Val Ala Leu 1445 1450 1455 Leu Glu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Val Ala Leu Val Ala Leu Ala 1460 1465 1470 Leu Ala Ala Ser Pro Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Gly Leu 1475 1480 1485 Tyr Pro His Glu Gly Leu Ala Leu Glu Ala Leu Tyr Ser Ser Glu Arg 1490 1495 1500 Ala Leu Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Val Ala Leu Thr His Arg Ala 1505 1510 1515 1520 Leu Ala <210> 5 <211> 1700 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rhodococcus ruber-SD1 <400> 5 Met Glu Thr Thr His Arg Thr His Arg Ser Glu Arg Ile Leu Glu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ala Arg Gly Gly Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ala Arg Gly Ala 20 25 30 Arg Gly Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Gly Leu Ala 35 40 45 Arg Gly Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala Arg 50 55 60 Gly Pro Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Ala Ser Pro Gly 65 70 75 80 Leu Asn Thr Tyr Arg Ile Leu Glu Ala Arg Gly Leu Glu Ala Ser Pro 85 90 95 His Ile Ser Val Ala Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Thr Arg Pro Ser 100 105 110 Glu Arg His Ile Ser Ala Ser Pro Pro Arg Thr Tyr Arg Met Glu Thr 115 120 125 Pro Arg Ile Leu Glu Thr His Arg Pro Arg Ala Arg Gly Gly Leu Pro 130 135 140 Arg Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ser Pro His Ile Ser Val Ala Leu Thr 145 150 155 160 His Arg Pro His Glu Ala Leu Ala Pro His Glu Ile Leu Glu Gly Leu 165 170 175 Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Pro His Glu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr 180 185 190 Leu Glu Val Ala Leu Thr His Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Arg 195 200 205 Gly Leu Glu Ala Arg Gly Gly Leu Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Val Ala 210 215 220 Leu Gly Leu Ser Glu Arg Val Ala Leu Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ile 225 230 235 240 Leu Glu Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ser 245 250 255 Pro Pro His Glu Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Thr Arg Pro 260 265 270 Thr Tyr Arg Thr Arg Pro Ala Ser Asn Ala Arg Gly Thr Tyr Arg Pro 275 280 285 Arg Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Met Glu Thr Cys Tyr Ser Ala Ser Pro 290 295 300 Thr His Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Met Glu Thr Val Ala Leu Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Met Glu Thr Pro Arg Leu Glu Leu Glu Gly Leu Gly Leu Thr 325 330 335 His Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Met Glu Thr Pro Arg Thr His Arg 340 345 350 Gly Leu Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Ala Leu Ala His Ile Ser Gly Leu 355 360 365 Tyr Pro Arg Gly Leu Ile Leu Glu Leu Glu Gly Leu His Ile Ser Cys 370 375 380 Tyr Ser Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Leu Tyr 385 390 395 400 Ser His Ile Ser Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Leu Glu Thr Tyr Arg Ala 405 410 415 Ser Pro Ala Ser Pro Ala Leu Ala Leu Glu Pro His Glu His Ile Ser 420 425 430 Thr His Arg Gly Leu Val Ala Leu Thr His Arg Ala Ser Pro Leu Glu 435 440 445 Val Ala Leu Thr Arg Pro Gly Leu Asn Gly Leu His Ile Ser Ala Ser 450 455 460 Pro Gly Leu Asn Ala Arg Gly Thr Arg Pro Ala Arg Gly Ile Leu Glu 465 470 475 480 Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Ser Asn Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Ala 485 490 495 Ser Pro His Ile Ser Pro His Glu Thr His Arg Ala Leu Ala Gly Leu 500 505 510 Asn Pro His Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Met Glu Thr Gly Leu Tyr 515 520 525 Thr His Arg Gly Leu Tyr Pro Arg Leu Glu His Ile Ser Val Ala Leu 530 535 540 Ala Leu Ala Gly Leu Asn Leu Glu Pro Arg Gly Leu Tyr Ile Leu Glu 545 550 555 560 Pro Arg Gly Leu Tyr Ile Leu Glu Gly Leu Ser Glu Arg Pro His Glu 565 570 575 Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Pro His Glu His 580 585 590 Ile Ser Thr His Arg Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr Arg Pro Ala Ser 595 600 605 Pro Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Thr His Arg Gly Leu Tyr 610 615 620 Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Leu 625 630 635 640 Ala Pro Arg Met Glu Thr Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Leu 645 650 655 Ala Ala Ser Pro Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Val Ala Leu Ala Leu Ala 660 665 670 Val Ala Leu Ile Leu Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Tyr Ala 675 680 685 Leu Ala Thr His Arg Ala Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Asn Cys Tyr 690 695 700 Ser Val Ala Leu Pro Arg Gly Leu Leu Glu Ala Leu Ala Leu Tyr Ser 705 710 715 720 Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Gly Leu Leu Glu Thr Tyr Arg 725 730 735 Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Thr His Arg Pro 740 745 750 Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala Val Ala Leu Ala Ser Pro Gly Leu Ala 755 760 765 Arg Gly Gly Leu Tyr Ala Ser Asn His Ile Ser Pro Arg Ile Leu Glu 770 775 780 Ala Ser Pro Gly Leu Leu Tyr Ser Thr Arg Pro Pro His Glu Ala Leu 785 790 795 800 Ala Gly Leu Asn Ile Leu Glu Ala Leu Ala Thr His Arg Pro Arg Gly 805 810 815 Leu Tyr Thr Arg Pro Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Thr Arg 820 825 830 Pro Leu Glu Ala Ser Pro Ser Glu Arg Pro His Glu Thr His Arg Ala 835 840 845 Leu Ala Ile Leu Glu Thr Arg Pro Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala 850 855 860 Leu Leu Glu Thr His Arg Ala Ser Pro Pro Arg Ser Glu Arg Gly Leu 865 870 875 880 Leu Glu Ala Leu Ala Ile Leu Glu Gly Leu His Ile Ser Gly Leu Ala 885 890 895 Ser Pro Leu Glu Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Ser Pro Gly Leu Tyr 900 905 910 Thr Arg Pro Thr His Arg Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Gly Leu 915 920 925 Asn Ala Arg Gly Met Glu Thr Ala Arg Gly Ala Leu Ala Ala Leu Ala 930 935 940 Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Val Ala Leu Pro Arg Ile Leu 945 950 955 960 Glu Gly Leu Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Pro Arg Gly Leu 965 970 975 Ala Ser Asn Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Arg Gly Ala Leu Ala Leu 980 985 990 Glu Gly Leu Gly Leu Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ala Ser Pro Gly Leu 995 1000 1005 Gly Leu Asn Met Glu Thr Gly Leu Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala Arg 1010 1015 1020 Gly Ala Leu Ala Ala Arg Gly Val Ala Leu Ala Ser Pro Gly Leu Ile 1025 1030 1035 1040 Leu Glu Val Ala Leu Thr His Arg Ala Ser Pro Pro Arg Ala Leu Ala 1045 1050 1055 Thr His Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asn Leu Glu Leu Tyr 1060 1065 1070 Ser Ala Leu Ala Thr Arg Pro Pro His Glu Ala Arg Gly Gly Leu Asn 1075 1080 1085 Met Glu Thr Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Pro Arg Cys Tyr 1090 1095 1100 Ser Pro His Glu His Ile Ser Ala Ser Pro Ala Ser Pro Thr Tyr Arg 1105 1110 1115 1120 Leu Glu Pro Arg Ala Leu Ala Pro His Glu Ala Ser Asn Ala Arg Gly 1125 1130 1135 Pro Arg Ala Ser Asn Thr His Arg His Ile Ser Leu Glu Val Ala Leu 1140 1145 1150 Ala Ser Pro Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Gly 1155 1160 1165 Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Ala Arg Gly Ile Leu Glu Thr His Arg 1170 1175 1180 Gly Leu Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Val Ala Leu Val Ala Leu Val Ala 1185 1190 1195 1200 Leu Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Gly 1205 1210 1215 Leu Val Ala Leu Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Ile Leu Glu Val Ala Leu 1220 1225 1230 Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu Gly 1235 1240 1245 Leu Pro His Glu Leu Glu Gly Leu Tyr Thr His Arg Gly Leu Tyr Thr 1250 1255 1260 Tyr Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Ala Arg Gly Ala Leu Ala Gly Leu 1265 1270 1275 1280 Tyr Pro His Glu Ala Ser Pro Pro Arg Thr His Arg Gly Leu Tyr Ala 1285 1290 1295 Arg Gly Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Leu Tyr Ser Leu Glu 1300 1305 1310 Ser Glu Arg Gly Leu His Ile Ser Thr Arg Pro Ala Leu Ala Gly Leu 1315 1320 1325 Asn Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Leu Glu His 1330 1335 1340 Ile Ser Gly Leu Tyr Met Glu Thr His Ile Ser Thr His Arg Thr Tyr 1345 1350 1355 1360 Arg Gly Leu Tyr Pro His Glu Pro Arg Ala Ser Asn Leu Glu Pro His 1365 1370 1375 Glu Val Ala Leu Leu Glu Gly Leu Asn Leu Glu Met Glu Thr Gly Leu 1380 1385 1390 Asn Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Leu Tyr Ser 1395 1400 1405 Glu Arg Ala Ser Asn Ile Leu Glu Pro Arg His Ile Ser Ala Ser Asn 1410 1415 1420 Pro His Glu Val Ala Leu Gly Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Arg 1425 1430 1435 1440 Gly Val Ala Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ile Leu Glu 1445 1450 1455 Val Ala Leu Ala Ser Pro His Ile Ser Val Ala Leu Leu Glu Ser Glu 1460 1465 1470 Arg Thr His Arg Gly Leu Tyr Thr His Arg Ser Glu Arg Ser Glu Arg 1475 1480 1485 Val Ala Leu Gly Leu Thr His Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu 1490 1495 1500 Ala Leu Ala Gly Leu Gly Leu Asn Ala Leu Ala Thr Arg Pro Val Ala 1505 1510 1515 1520 Leu Gly Leu Asn Leu Glu Leu Glu Leu Glu Ala Ser Pro His Ile Ser 1525 1530 1535 Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Pro Arg Leu Glu Gly Leu Tyr Ala Ser Asn 1540 1545 1550 Pro Arg Gly Leu Cys Tyr Ser Thr His Arg Pro Arg Gly Leu Tyr Thr 1555 1560 1565 Tyr Arg Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Gly Leu Tyr 1570 1575 1580 Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Leu Ala Gly Leu Ala Leu Glu Ala Leu Tyr 1585 1590 1595 1600 Ser Ala Ser Pro Ala Arg Gly Leu Glu Ala Ala Ser Asn Val Ala Leu 1605 1610 1615 Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ser 1620 1625 1630 Glu Arg Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro His Glu Pro His Glu Ala Arg 1635 1640 1645 Gly Met Glu Thr Met Glu Thr Ala Ser Pro His Ile Ser Thr Arg Pro 1650 1655 1660 Leu Glu Ala Ala Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Pro 1665 1670 1675 1680 His Glu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Thr His Arg Pro His 1685 1690 1695 Glu Ala Arg Gly 1700

Claims (13)

  1. 변성 에폭시 수지 고정화 효소의 제조 방법으로서,
    에폭시 수지를 변성시키고, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식한 다음, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정화하여 상기 변성 에폭시 수지 고정화 효소를 획득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 에폭시 수지를 변성시키는 것은,
    과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시키거나 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 에폭시 수지를 변성시키는 것이 과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시키는 것인 경우, 과요오드산나트륨을 첨가하기 전에 먼저 아세트산을 사용하여 상기 에폭시 수지를 처리하고, 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드를 첨가하여 고정화한 후, 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 첨가하여 2차 가교를 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 에폭시 수지를 변성시키는 것이 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시키는 것인 경우, 변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식한 후, 금속 이온 용액을 첨가하여 처리하는 단계를 더 포함하고, 상기 고정대상인 효소는 his 태그를 가지며;
    바람직하게는, 상기 금속 이온 용액은 염화코발트, 황산코발트, 염화니켈, 황산구리, 염화제일철, 황산제일철 중 하나 또는 복수 개로부터 선택되고;
    바람직하게는, 상기 금속 이온 용액의 농도는 5 내지 100 mmol/L이며, 바람직하게는 10 내지 50 mmol/L인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 고정대상인 효소 및 글루타르알데하이드의 첨가 순서는 순차적으로 상기 고정대상인 효소, 글루타르알데하이드 또는 글루타르알데하이드, 상기 고정대상인 효소인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    변성 에폭시 수지에 폴리에틸렌이민을 첨가하여 진일보로 수식하는 단계는 보조인자를 첨가하는 단계를 더 포함하고, 상기 보조인자는 NAD+, NADP+ 또는 PLP이며;
    바람직하게는, 상기 폴리에틸렌이민은 폴리에틸렌이민 수용액의 형태로 반응에 참여하고, 상기 폴리에틸렌이민 수용액에서 상기 보조인자의 최종 농도는 1 ~ 10 mg/mL이며, 바람직하게는 3 ~ 6 mg/mL이고;
    바람직하게는, 상기 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 사용하기 전에, PEG로 가교제를 수식하는 단계를 더 포함하고, 상기 PEG로 상기 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드를 수식하는 것은, 물로 가교제를 용해시킨 다음 PEG를 첨가하고, 20 내지 30℃에서 1 내지 6시간 동안 교반하는 것을 포함하며, PEG는 PEG400 내지 PEG2000로부터 선택되고, PEG와 가교제의 질량비는 1 : 1 내지 10 : 1이며, 더 바람직하게는 2 : 1 내지 4 : 1인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 아세트산으로 에폭시 수지를 처리함에 있에서, 사용된 아세트산은 아세트산 용액이고, 상기 아세트산 용액 중 아세트산의 농도는 0.5 내지 3M이며, 바람직하게는 1 내지 2M이고; 상기 아세트산 용액과 상기 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이며, 바람직하게는 10 내지 15 : 1이고;
    바람직하게는, 상기 과요오드산나트륨을 사용하여 에폭시 수지를 산화시킬 때 사용하는 과요오드산나트륨 용액 중 과요오드산나트륨의 농도는 50 내지 500 mM이며, 바람직하게는 100 내지 200 mM이고; 상기 과요오드산나트륨 용액과 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이며, 바람직하게는 5 내지 15 : 1이고;
    바람직하게는, 상기 폴리에틸렌이민의 분자량은 3 KDa 내지 70 KDa이며, 상기 폴리에틸렌이민 수용액의 농도는 0.5% 내지 3%이고, 바람직하게는 1% 내지 2%이며; 상기 폴리에틸렌이민 수용액의 pH는 6 내지 11이고, 더 바람직하게는 7 내지 10이며;
    바람직하게는, 가교제인 글루타르알데하이드 또는 덱스트란 알데히드의 부피/질량 최종 농도는 0.1% 내지 3%이고, 바람직하게는 0.3% 내지 2%이며;
    바람직하게는, 효소와 상기 변성 에폭시 수지의 질량비는 0.05 내지 0.3 : 1이고;
    바람직하게는, 상기 이미노디아세트산을 사용하여 에폭시 수지와 반응시킴에 있에서, 사용된 이미노디아세트산은 이미노디아세트산 수용액이며, 상기 이미노디아세트산 수용액의 농도는 0.5 내지 3M이고, 바람직하게는 1 내지 2M이며, 상기 이미노디아세트산 수용액과 에폭시 수지의 부피 질량비는 5 내지 20 : 1이고, 바람직하게는 10 내지 15 : 1이며; 상기 이미노디아세트산 수용액의 pH는 6.0 내지 10.0이고, 바람직하게는 7.0 내지 9.0인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 아세트산과 상기 에폭시 수지를 혼합한 후의 처리 시간은 6 내지 24시간이고, 바람직하게는 10 내지 15시간이며;
    바람직하게는, 상기 과요오드산나트륨 용액과 상기 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 1 내지 6시간이고, 바람직하게는 2 내지 3시간이며;
    바람직하게는, 상기 폴리에틸렌이민 수용액과 상기 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 1 내지 20시간이고, 바람직하게는 3 내지 6시간이며;
    바람직하게는, 상기 효소와 상기 변성 에폭시 수지를 혼합한 후의 반응 시간은 2 내지 24시간이고, 바람직하게는 15 내지 20시간이며;
    바람직하게는, 가교제를 첨가한 후, 반응 시간은 10 내지 120분이고, 바람직하게는 20 내지 60분이며;
    바람직하게는, 상기 이미노디아세트산 수용액과 상기 에폭시 수지를 혼합한 후의 작용 시간은 0.5 내지 6시간이고, 바람직하게는 1 내지 2시간이며;
    바람직하게는, 상기 폴리에틸렌이민 수용액과 담체를 혼합한 후의 작용 시간은 1 내지 20시간이고, 진일보로 3 내지 6시간이며; 금속 이온을 첨가한 후, 작용 시간은 1 내지 6시간이고, 진일보로 1 내지 3시간이며; 효소액과 담체를 혼합한 후의 작용 시간은 4 내지 48시간이고, 진일보로 작용 시간은 15 내지 20시간인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 에폭시 수지는 Purolite®LifetechTMECR8285, ECR8204, ECR8209, SEPLITE®LX1000EA, LX1000EP, LX103B, EP200, LX1000HFA, HFA001, LX107S, LX1000SW, LX1000SD, HECHENG®ES1, ES103, ES105, ES108 및 ES109로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 복수 개인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 고정대상인 효소는 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제, Aspergillus fumigatus 유래 트랜스아미나제, Vibrio fluvialis strain JS17 유래 트랜스아미나제, Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제, Candida macedoniensis AKU4588 유래 케토리덕타제, Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, Brachymonas petroleovorans 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, Rhodococcus ruber-SD1 유래 모노옥시게나제, photorhabdus luminescens 유래 암모니아 리아제, Solenostemon scutellarioides 유래 암모니아 리아제, Saccharomyces cerevisiae 유래 엔-리덕타제, ChrySEQbacterium sp.CA49 유래 엔-리덕타제, Streptomyces sp 또는 Bacillus cereus 유래 이민 리덕타제, Bacillus cereus 유래 류신 탈수소효소, Bacillus sphaericus 유래 페닐알라닌 탈수소효소, Aspergillus niger CBS 513.88 유래 니트릴라제 및 Neurospora crassa OR74A 유래 니트릴라제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 복수 개이고;
    바람직하게는, 상기 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 2의 서열 또는 SEQ ID NO: 3의 서열을 갖는 돌연변이체이며; 상기 Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO: 5의 서열 또는 SEQ ID NO: 6의 서열을 갖는 돌연변이체이고; 상기 Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제는 SEQ ID NO: 8의 서열 또는 SEQ ID NO: 9의 서열을 갖는 돌연변이체이며; 상기 Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO: 11의 서열 또는 SEQ ID NO: 12의 서열을 갖는 돌연변이체이고; 상기 Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO: 14의 서열 또는 SEQ ID NO: 15의 서열을 갖는 돌연변이체인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 제조 방법을 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 변성 에폭시 수지 고정화 효소.
  12. 수성 완충액 반응 시스템 또는 유기 용매 반응 시스템에서 제11항에 따른 변성 에폭시 수지 고정화 효소의 응용.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 수성 완충액 반응 시스템 또는 유기 용매 반응 시스템은 충전층 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기에서 반응하는 것을 특징으로 하는 응용.
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