ITMI20071951A1 - Processo per la produzione di 7-metossi-3-desacetilcefalotina - Google Patents
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Description
Descrizione di un brevetto di invenzione
La presente invenzione si riferisce ad un metodo per la produzione di 7-metossi-3-desacetilcefalotina (I),
un intermedio di sintesi del cefoxitin, secondo un procedimento innovativo che prevede l'uso di un biocatalizzatore.
Il cefoxitin appartiene alla classe delle cefamicine, antibiotici β-lattamici caratterizzate dalla presenza di un gruppo metossilico in posizione 7 sull’anello cefalosporanico.
Tale antibiotico è descritto nel brevetto US 4297488, dove si illustrano diverse vie di sintesi che prevedono la carbamoilazione su vari intermedi desacetilati, con vari agenti, usando diversi gruppi protettivi sul carbossile e/o sul gruppo amminico. Si descrive anche il passaggio di idrolisi enzimatica per produrre alcuni dì questi derivati, utilizzando acetil-esterasi da buccia di agrumi, seppure con reazioni molto lente (6-15 ore) e senza accennare alla qualità dei prodotti ottenuti. Un procedimento analogo è descritto dagli stessi autori anche in Tetrahedron Lett 46, 4653-6 (1973), utilizzando intermedi protetti come p-nitrobenzil esteri, sui quali si esegue una deprotezione ed un'idrolisi enzimatica, ottenendo quindi la 7-metossi-3-desacetil cefalotina in forma di acido carbossilico. Il prodotto viene poi trattato con clorosulfonìl isocianato per ottenere cefoxitin .
Le vie di sintesi generalmente usate su scala industriale nella chimica moderna producono cefoxitin otticamente puro, utilizzando come materia prima il 7-ACA (acido 7-amminocefalosporanico) e comprendono quattro step principali, preferibilmente eseguiti nell'ordine seguente:
1. acilazione del gruppo amminico in posizione 7 2. introduzione del gruppo metossilico in posizione 7α
3. rimozione del gruppo acetilico in posizione 3 4. carbamoilazione del gruppo ossidrilico in 3 ottenuto nello step precedente.
Lo step 1 corrisponde alla sintesi della cef alotina, una cefalosporina. Quest'ultima viene trasformata nella corrispondente cefamicina per metos silazione a dare l’intermedio II (step 2);
e successivamente desacetilata a dare il composto I.
Sebbene altre sequenze siano possibili, quella sopra riportata è vantaggiosa perché non prevede l'uso di gruppi protettivi né per il gruppo amminico né per quello carbossilico e permette quindi di minimizzare il numero dì operazioni necessarie, nonché permette un risparmio sulle materie prime.
Ad esempio in WO2004/083217A1 (pag. 6) si descrive la saponificazione dell'intermedio II, effettuata con idrossido di sodio, in miscela acqua-metanolo raffreddando a -45°C; tale temperatura viene man-tenuta per l'intera durata dell'idrolisi, è possibile alzare la temperatura solo al termine della reazione, dopo aver neutralizzato con acido.
Il composto I viene poi isolato come sale di benzatina, dopo aver rimosso il metanolo per distillazione a temperatura moderata; è quindi evidente che l'uso del metanolo è giustificato con la necessità di raggiungere temperature molto basse per la reazione e che il solvente va rimosso prima dell'isolamento del prodotto.
In alternativa, il prodotto può essere estratto in solvente sia in forma indissociata, acidificando, sia come sale di una base, per es. il tetrabutilammonio, come descritto in EP 1748049A2.
Dal composto I è possibile ottenere cefoxitin mediante carbamoilazione del gruppo ossidrilico, per es. per reazione con clorosulfonil isocianato, come descritto nei brevetti sopra citati, oppure con altri isocianati, come descritto per es. in US 4120750 ed US 4292427.
In tutti ì casi, data la labilità delle strutture β-lattamiche e data la necessità di operare in condizioni estremamente basiche, la desacetilazione viene condotta a temperatura molto bassa, per evitare degradazione del prodotto; di conseguenza si utilizzano solventi organici per abbassare il punto di congelamento delle soluzioni.
Si tratta quindi di metodi che richiedono di raffreddare migliaia di litri di soluzioni fino a temperature dell'ordine dei -45°C e dì mantenere tali temperature per tutta la durata della reazione, utilizzando macchine frigorifere o fluidi refrigeranti (es. azoto liquido); ciò comporta un notevole dispendio energetico. Il solvente viene poi rimosso per distillazione sotto vuoto, riscaldando a 30/+40°C, con altro considerevole consumo di energia (sia per il riscaldamento della soluzione che per il funzionamento delle pompe da vuoto ed il raffreddamento dei condensatori).
Va inoltre considerato che l'uso di solventi come il metanolo comporta pericoli dovuti all'infiammabilità del solvente, alle possibili intossicazioni degli operatori, al rilascio dei vapori nell'am-biente, nonché gli svantaggi dovuti alla produzione di reflui acquosi contenenti metanolo, che devono essere appositamente smaltiti.
Una via più ecocompatibile è quindi fortemente desiderabile, come per esempio un'idrolisi che avvenga in sola acqua a temperatura ambiente. Per effettuare tale idrolisi in tempi ragionevoli ed evitando degradazioni dei prodotti è necessario un catalizzatore, per esempio un enzima.
Enzimi in grado di catalizzare la desacetilazione in cefalosporine (non in cefamicine) sono noti da tempo, come per es. la acetile esterasi da germe di grano descritta da Gilbert et al. nel brevetto GB1121308 (Glaxo, 1964) o quella presente nelle bucce di agrumi, descritta da Jeffery et al in Biochem. J. 81, pagg. 591-6 (1961).
Nel brevetto US 4297488 sopra citato è descritta l'idrolisi enzimatica di vari intermedi di sintesi del cefoxitin, catalizzata dall'acetile esterasi di agrumi; tuttavia il metodo ivi descritto non è applicabile su scala industriale, a causa delle scarse prestazioni del catalizzatore. Si tratta di un enzima a bassa attività specifica, il che com-porta tempi di reazione molto lunghi (descritti 6-15 ore), difficile da produrre in quanto deriva da una fonte poco riproducibile e soggetta a variazioni stagionali. Inoltre viene applicato in forma solubile, non viene riciclato, non vengono descritte la purificazione né l'immobilizzazione dell'enzima stesso. Non si descrivono le rese di desacetil-derivati ottenuti, né la loro qualità.
Altri enzimi attivi su cefalosporine (non su cefamicine) sono· stati scoperti, a partire da quelli coinvolti nella via di biosintesi della cefalosporina C in Acremonium chrysogenum (o Cephalosporium acremonium) e in Streptomyces clavuligerus; questi sono considerati come delle attività enzimatiche indesiderate, che portano alla formazione di desacetil cefalosporina C, un sottoprodotto di fermentazione. Da notare che la biosintesi di cefamicine in Nocardia lactamodurans e in Streptomyces clavuligerus non comprende l'idrolisi del gruppo acetilico su una cefamicina (P. Liras, Antonie van Leeuwenhoek 75, 1999, pagg. 109-24); l'attività acetil esterasica su cefamicine non è quindi nota neanche nei microrganismi produttori delle cefamicine stesse.
Sono stati descritte idrolisi a catalisi enzimatica del gruppo acetilico su 7-ACA o su cefalosporina C, ma non su cefamicine; in particolare:
1) una esterasi prodotta da Bacillus subtilis (Abbott e Fukuda, Antimicrob Agents Chemother 8, 3,pagg.282-8, 1975 e Appl Microbiol, 30,3, pagg.
413-8 1975) viene usata in forma immobilizzata per l'idrolisi del 7-ACA a 3-desacetil-7-ACA. L'enzima è sufficientemente attivo e stabile ma tende a staccarsi dal supporto di immobilizzazione. Altri autori (Takimoto et al. Appl Microbio 1 Technol 65, pgg. 263-7, 2004) descrivono la fermentazione dì questo enzima in Escherichia coli ricombinante, la sua purificazione ed immobilizzazione su supporto solido e l'uso per la produzione di 3-desacetil-7-ACA .
2) Il Rhodosporidium toruloides descritto da Politino et al. in Appi Environm Microbiol 63, 12, pgg. 4807-11, 1997, produce un enzima attivo su 7-ACA, che può essere impiegato come catalizzatore in questa reazione sia in forma di biomassa non fermentante (resting cells) che come enzima isolato e purificato. L'attività idrolitica manifestata da questo enzima su cefalotina tuttavia è bassa, solo il 34% di quella su 7-ACA; non si descrive l'idrolisi su cefamicine. Lo stesso enzima viene impiegato anche da Chìang et al. (US 2002/0048781 BMS, 2002) che descrivono un ceppo di Acremonium crysogenum ricombinante, in grado di esprimere la acetil esterase da Rhodosporidium, utilizzato per la produzione di desacetilcefalosporina C direttamente nei brodi di fermentazione.
3) Un'altra acetile esterasi è descritta da Venturi et al. in Appl Environ Microbiol 64, 2, pagg. 789-92, 1998: si tratta di una xìlano-esterasi prodotta da Bacillus pumilus, un enzima connesso con la degradazione degli xilani, che mostra attività anche su 7-ACA e su cefalosporina C; in altre pubblicazioni sì descrive l'espressione in coli dello stesso enzima. Non si descrive attività su cefamicine .
Allo stato dell'arte risulta quindi che l'idrolisi enzimatica del gruppo acetilico delle cefamicine non è mai stata applicata su scala industriale; inoltre, nonostante l'ampia letteratura disponibile sull'analoga reazione nelle cefalosporine, non è stato descritto un enzima sufficientemente attivo e stabile da poter essere impiegato sulle cefamicìne.
Obbiettivo della presente invenzione è un metodo per la preparazione del composto di formula I in cui un composto di formula II viene sottoposto ad idrolisi del gruppo acetilico, caratterizzato dal fatto che tale idrolisi è effettuata in acqua in presenza dì un biocatalizzatore costituito da almeno un enzima avente attività acetil idrolasica, ad una temperatura compresa tra -10°C e 45°C, a pH compreso tra 5 e 9, ed infine separando l'enzima dal mezzo di reazione mediante tecniche note.
In particolare tale biocatalizzatore può essere ottenuto da microrganismi scelti dal gruppo costituito da Rhodosporidium toruloides , Bacillus pumilus , Escherichia coli, Acremonium chrysogenum, e Streptomyces clavuligerus, e può presentarsi in forma di proteina libera oppure immobilizzata su supporto solido, o anche essere costituito dalle cellule microbiche stesse. A fine reazione il biocatalizzatore può essere separato e riutilizzato, mentre il composto I può essere isolato dalla soluzione acquosa per precipitazione come sale dì una base organica o mediante estrazione in solvente.
Rispetto allo stato dell'arte il nuovo metodo presenta diversi vantaggi così riassumibili:
- maggiore sicurezza sul lavoro, in quanto si evita l'uso dì solventi nocivi (es. metanolo) e di soluzioni fortemente caustiche (es sodio idrossido),
un notevole risparmio energetico, perché si lavora a temperatura ambiente, evitando l'imponente consumo energetico necessario per raggiungere e mantenere le basse temperature generalmente usate in questi casi (es. inferiori a —45°C)
- una maggiore produttività del processo, in quanto evita la distillazione sotto vuoto del solvente, una fase di lavorazione che richiede parecchio tempo .
Se ne ottiene un prodotto di qualità pari o superiore a quello ottenibile secondo le procedure finora note.
Descrizione dettagliata
L'intermedio II può essere preparato a partire da cefalotina, una materia prima disponibile commercialmente con buona qualità e basso prezzo; la stessa cefalotina può essere prodotta da 7-ACA secondo tecniche note. La reazione di metossilazione viene condotta a temperatura molto bassa, utilizzando un agente clorurante e sodio metossido ed operando secondo tecniche note. A fine reazione il composto II può essere isolato come sale, sia di metalli alcalini sia di basi organiche, oppure può essere estratto in acqua in forma di carbossilato. Una via conveniente di sintesi è descritta in WO2004/083217, esempio 1 step i.
Per la desacetilazione enzimatica sono stati usati diversi catalizzatori, preparati secondo tecniche note o come descritto in seguito negli esempi.
Il prodotto di reazione (composto I) è stato isolato come sale di benzatina, come descritto in WO2004/083217A1, oppure estratto in solvente organico, sìa a) come acido, in forma indissociata, sia b) come sale dì tetradutilammonio, seguendo la procedura descritta in EP 1748049A2.
Dal composto I è stato ottenuto il cefoxitin per reazione con clorosulfonil isocianato, operando secondo tecniche note, ottenendo un prodotto di buona qualità adatto all'impiego come farmaco.
Il processo viene illustrato nei seguenti esempi, che tuttavia sono da intendersi come non limitanti .
Esempio 1
Sintesi chimica di 7-metossi-3-desacetilcefalotina Ad una miscela di 1,0 litri di acqua e 1,15 litri di metanolo si aggiungono 300 g di 7-metossi cefalofina in forma di sale di cicloesilammina (soluzione A), preparata secondo le procedure note ed avente un titolo di circa il 69% come acido, pari a 500 mmoli circa. Si raffredda a -37°C.
A parte si prepara una soluzione di 160 g di soda caustica 30% in acqua in 300 ml di acqua e si raffredda a 5°C, quindi si cola lentamente la soda nella soluzione A, mantenendo la temperatura entro -45/-35°C per circa un'ora dalla fine delle aggiunte. Si controlla la cinetica di reazione mediante analisi HPLC: quando il residuo di 7-metossi-cefalotina è inferiore a 0,7 g/1 sì interrompe la reazione aggiungendo 90 g di acido acetico 80%, mantenendo la temperatura entro -5°C. Si controlla il pH, che deve essere neutro, correggendolo a 6,8-7,0 se necessario. Si distilla sotto vuoto riscaldando a 30/+35°C fino ad ottenere una concentrazione di circa 100 g/1 di 7-metossi-3-desacetilcefalotina, quindi si decolora con carbone. Si diluisce ad un volume di circa 1,9 litri per avere una concentrazione di circa 80 g/1, quindi si aggiungono 300 mi dì etile acetato e 130 g di benzatina diacetato, aggiungendo poco prodotto solido per innescare la precipitazione. Si raffredda a 0/+5°C e sì mantiene la temperatura fino a raggiungere una concentrazione di prodotto nelle acque madri inferiore a 10 g/1, quindi sì filtra su buchner. Si lava il solido con acqua e poi con etile acetato, quindi lo si spappola in una miscela di etile acetato 85% acetone 15% per avere un prodotto anidro.
Si ottengono circa 208 g di 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina a titolo circa 70% come acido, pari a 380 mmoli, per una resa molare del 76%.
Esempio 2
Idrolisi enzimatica di 7-metossi-3-cefalotina con biomassa di Rhodosporidium toruloides
Il Rhodosporidium toruloides ATCC 10657 viene cresciuto in beuta o in fermentatore per 72 ore dall’inoculo secondo quanto descritto in letteratura, prelevando campioni di brodo intero per il controllo della quantità di acetile esterasi prodotta. L'attività enzimatica viene espressa in Unità Internazionali (UI), pari alle micromoli di substrato convertito per minuto, e viene determinata per idrolisi di 7-ACA (20 g/l in acqua); la reazione è termostatata a 25°C e controllata a pH 6,5 mediante aggiunta di NaOH 0,1 M per titolazione automatica (pH-stat, Crison Instruments SA, Barcelona, ES). Il brodo di crescita viene centrifugato a 10000 giri per 15 minuti, il pellet viene risospeso in tampone fosfato e centrifugato nuovamente, ottenendo una pasta di cellule umide con attività specifica pari a circa 6-10 UI per grammo.
Si sciolgono 40,8 g di 7-metossi cefalotina sale di cicloesilammina in circa 250 ml di acqua, correggendo il pH a 7,0 con idrossido d'ammonio 3N. Si imposta il titolatore per mantenere pH 7,0, si termostata a 20°C e si aggiungono 50 g di pasta cellulare di Rhodosporidium. Dopo circa 1 ora 30 minuti la reazione è completa, si separano le cellule per centrifugazione ottenendo circa 340 mi di soluzione di 7-metossi-3-desacetilcefalotina, che viene decolorata con carbone e filtrata su cartone. Alla soluzione limpida sì aggiungono 55 ml dì etile acetato e 17,7 g di benzatina diacetato, isolando il prodotto come descritto nell’esempio 1. Si ottengono 28 g di 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina a titolo circa 70%, pari a 51 mxnoli, resa molare 77%.
Le cellule di Rhodosporidium possono essere riutilizzate per vari cicli di idrolisi.
Esempio 3
Idrolisi enzimatica di 7-metossi-cefalotina con acetil-esterasi da Rhodosporidium toruloides
La biomassa dì Rhodosporidium toruloides ottenuta come descritto nell'esempio 1 viene per trattamento con EDTA (acido etilendiamminotetraacetico), ottenendo una soluzione acquosa contenente l'attività acetile esterasica, che viene purificata per cromatografia su carbossimetil Sepharose, seguendo le procedure note in letteratura (Politino et al, Appl . Environ . Microbiol . 63, 12, pagg. 4807-11, 1997).
Si sciolgono 870 g di 7-metossi-cefalotina sale di benzatina preparata coinè nell'esempio 1, si corregge il pH a 7,0 e si diluisce ad un volume totale di 6000 ml, quindi si aggiungono 200 ml di soluzione di acetile esterasi e si mantiene il pH a 7 per titolazione automatica con ammonio idrossido 3N. Al termine della reazione si separa l'enzima dal prodotto mediante ultrafiltrazione utilizzando l'apparecchio Millipore ProScale con membrane Nanomax a cut-off 10.000 Da. Dal permeato si ottengono circa 5 litri di soluzione di 7-metossi-3-desacetilcefalotina, che viene isolata come descritto nell'esempio 1, mentre il concentrato contenente l'enzima viene riutilizzato per il successivo ciclo di idrolisi. Il composto I viene isolato come descritto nell'esempio 1.
Esempio 4
Idrolisi enzimatica di 7-metossi-cefalotina con biomassa di Escherichia coli ricombinante
L'enzima acetil xilano esterasi da Bacillus pumilus è stata espressa in Escherichia coli ricombinante ottenuto secondo le procedure descritte da Venturi et al. in Microbiology 146, pagg. 1585-91 (2000).
L'idrolisi della 7-metossi-cefalotina è stata condotta come descritto nell'esempio 3, utilizzando 340 g di biomassa di E. coli come catalizzatore; al termine della reazione la soluzione di 7-metossi-3-desacetilcefalotina è stata separata per ultrafiltrazione, isolando il prodotto in forma di sale di benzatina come descritto nell'esempio 1. Il retentato dell'ultrafiltrazione è una sospensione di cellule parzialmente U sate di coli e di enzima libero, che può essere riutilizzato nei cicli successivi.
Esempio 5
Idrolisi enzimatica di 7-metossi cefalotina con acetil-esterasi immobilizzata su resina epossidica La xilano esterasi prodotta in coli ricombinante come descritto nell’esempio 4 è stata parzialmente purificata distruggendo le cellule con una pressa tipo Cell Disruptor (Constant System ltd.) a 1000 bar, quindi centrifugando a 20000 giri per 30 minuti. Il surnatante così ottenuto viene dializzato per ultrafiltrazione con apparecchio ProScale Millipore e membrane da 10 KDa, quindi cromatografato su resina Sepharose Q Fast Flow come descritto in letteratura (Venturi et al., Microbiology 146, pagg. 1585-91, 2000).
L'enzima parzialmente purificato è stato concentrato per ultrafiltrazione e poi diluito con 10 volumi di una soluzione 1,2 M di K2HPO4a pH 8,0, quindi immobilizzato su resina epossidica Sepabeads EC-EP (Diaion SpA, Mitsubishi) con un carico di 120 UI per grammo di resina. La sospensione di resina viene agitata per 48 ore, quindi si filtra su buchner e si lava con 10 volumi di acqua (10 mi per ogni grammo di resina); sì ottiene un catalizzatore solido avente un'attività pari a circa 70 UI per grammo.
100 g di 7-metossi-cefalotina sale di cicloesilammina vengono sciolti in acqua per un volume totale di 450 mi, quindi si effettua l'idrolisi utilizzando come catalizzatore 66 g di enzima immobilizzato, mantenendo costante il pH a 7,0 per titolazione automatica con ammonio idrossido 3 N. Dopo 2,5 ore la reazione è completa, si filtra l'enzima su imbuto a setto poroso e si isola la 7-metossi-3-desacetilcefalotina aggiungendo 50 g di benzatina diacetato ed operando come descritto nell'esempio 1.
Si ottengono 69,6 g di prodotto con titolo 70,8% come 7-rnetossi-3-desacetilcefalotina acida, per una resa molare del 78%.
Il catalizzatore può essere riutilizzato per numerosi cicli di reazione.
Esempio 6
Idrolisi enzimatica di 7-metossi-cefalotina con acetil esterasi immobilizzata su resina amminica L'enzima acetile esterasi da B. pumilus prodotto in coli ricombinante come descritto nell'esempio 4 viene purificato come descritto nell'esempio 5.
100 g di resina Sepabeads EC-HA (Diaion) vengono lavati abbondantemente con acqua, poi sospesi in 100 ml di tampone fosfato 0,2 M a pH 7. Si aggiungono 170 ml di soluzione di glutaraldeide al 25% in acqua e si lascia in agitazione per 16 ore, quindi si aggiunge la soluzione di enzima purificato per un totale di 12000 UI. Dopo 3 ore si filtra su setto poroso, lavando con abbondante acqua. Si ottiene un catalizzatore avente attività 55 UI/ grammo.
L'idrolisi viene condotta come descritto nell'esempio 5, utilizzando 84 grammi di acetilesterasi immobilizzata. Dopo tre ore di reazione si filtra l'enzima e si precipita il sale di benzatina come descritto nell'esempio 1. Il prodotto ottenuto viene sospeso in quattro volumi di isopropanolo (peso/volume)e quindi filtrato, ottenendo 68 g di 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina a titolo 70,5% pari ad una resa molare del 76%.
Il catalizzatore può essere riutilizzato per numerosi cicli di reazione.
Esempio 7
Idrolisi enzimatica di 7-metossi-cefalotina con acetil esterasi immobilizzata su resina gliossilica 100 g di resina Sepabeads EC-HG (Diaion) vengono lavati abbondantemente con acqua, quindi sì aggiungono 800 ml di soluzione 0,05 M di sodio metaperiodato; dopo 1,5 ore si filtra su setto poroso e si lava con abbondante acqua. La resina viene sospesa in 700 ml di tampone bicarbonato 50 mM a pH 10, quindi si aggiungono 12000 UI di enzima, purificato come descritto nell'esempio 5. Dopo un'ora si aggiungono 1400 ml di una soluzione 1mg/ml di sodio boroidruro in acqua, si lascia reagire per 30 minuti e poi si filtra su setto poroso, lavando con abbondante acqua. Si ottiene un catalizzatore avente attività 38 UI/ grammo.
La reazione di idrolisi viene condotta come descritto nell'esempio 5; dopo 3,5 ore si interrompe la reazione e si isola il prodotto. Si ottengono 65 g di 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina a titolo 70,8% pari ad una resa molare del 73%.
Il catalizzatore può essere riutilizzato per numerosi cicli di reazione.
Esempio 8
Idrolisi enzimatica di 7-metossi-cefalotina da soluzione metilenica
La reazione di metossilazione della cefalotina viene condotta mediante l'uso di N-clorosuccinimmide e sodio metilato in metilene cloruro e metanolo, secondo quanto descritto in WO2004/083217A1 ; effettuati i lavaggi con soluzioni acquose, si ottiene una soluzione a 82 g/l di 7-metossi-cefalotina acida in metilene cloruro.
500 mi di soluzione metilenica vengono estratti con circa 300 ml dì acqua, titolando con una soluzione di sodio carbonato 10% (p/v) in acqua per ottenere un pH finale di 8,0; si separano le fasi, si lava la fase metilenica con poca acqua e si ottengono 355 mi di soluzione acquosa a 109 g/1 di prodotto, pari ad una resa in estrazione del 94%. La fase acquosa viene sottoposta a distillazione sotto vuoto, a 25°C, per eliminare ì residui di solvente.
La fase acquosa viene sottoposta ad idrolisi con 40 grammi di enzima descritto nell'esempio 6, controllando il pH con una soluzione di sodio carbonato 10% (p/v) in acqua; dopo due ore la reazione viene interrotta e si isola il prodotto. Si ottengono 33 g di 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina a titolo 70,8%.
Il catalizzatore può essere riutilizzato per numerosi cicli di reazione.
Esempio 9
Sintesi di cefoxitin senza isolamento di intermedi La preparazione della 7-metossi-3-desacetilcefalotina viene condotta come descritto nell'esempio 8, ottenendo una soluzione acquosa a concentrazione 80 g/l che viene decolorata con 2 g di carbone; dopo filtrazione si aggiunge NaCl solido fino a saturazione e si estrae con una soluzione di tetrabutilammonio bromuro in metilene cloruro, seguendo le procedure descritte in ΕΡ1748049A2. Si effettua la carbamoilazione in tetraidrofurano con clorosulfonil isocianato, isolando cefoxitin acido che viene poi trasformato nel corrispondente sale sodico secondo quanto descritto nello stesso brevetto.
Si ottengono 13 g di Cefoxitin sodico.
Esempio 10
Isolamento di 7-metossi-3-desacetilcefalotina come acido o sale sodico
La reazione viene condotta come descrìtto nell'esempio 6; a fine idrolisi si filtra il catalizzatore, che viene riutilizzato, e si acidifica la soluzione acquosa fino ad innesco della precipitazione della 7-metossi-3-desacetilcefalotina, si lascia precipitare per 30 minuti e poi si aggiunge acido cloridrico fino a raggiungere pH 2,5, raffreddando a 4°C. Si filtra su buchner ottenendo un solido bianco di 7-metossi-3-desacetilcefalotina .
Le acque madri vengono estratte con etile acetato, si separano le fasi e si aggiunge sodio 2-etilesanoato alla fase organica, ottenendo la precipitazione del 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale sodico.
Esempio 11
Idrolisi enzimatica di 7-metossi-cefalotina in sospensione acquosa
130 g di 7-metossi-cefalotina sale di cicloesilammina vengono sospesi in 300 ml di acqua, quindi si aggiunge una soluzione di sodio carbonato 10% (p/v) in acqua fino a raggiungere pH 7; si ottiene una sospensione alla quale vengono aggiunti 100 g di enzima immobilizzato, preparato come descritto nell'esempio 6. Si effettua la reazione in condizioni di pH-stat, termostatando a 20°C; si osserva la dissoluzione completa del substrato man mano che l'idrolisi procede. Si prosegue fino ad ottenere un residuo dì 7-metossi-cefalotina inferiore a 0,5 g/l, quindi si filtra il catalizzatore e si isola il prodotto come descritto nell’esempio 1. Si ottengono 98,3 g di 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina a tìtolo 70%, per una resa molare pari a 85%.
Esempio 12
Isolamento di 7-metossi-3-desacetilcefalotina per precipitazione a caldo del suo sale di benzatina La reazione viene svolta come descritto nell'esempio 11, con l'unica differenza che si scalda la miscela acqua/etile acetato a 35°C prima di aggiungere la benzatina diacetato; una volta innescata la precipitazione della 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina si mantiene a 30/35°C per circa 30 minuti, quindi si raffredda gradualmente fino a 4°C prima di filtrare. Si ottiene una resa molare del 85% circa.
Esemplo 13
Uso di miscele di solventi per la precipitazione di 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina La reazione viene svolta come descritto nell’esem-pio 11, con l'unica differenza che sì aggiunge il 10% in volume di metanolo alla soluzione acquosa di 7-metossi desacetilcefalotina, quindi si aggiunge etile acetato, scaldando a temperatura 30/+35°C prima di aggiungere la benzatina diacetato. Si raffredda gradualmente fino a 4°C prima di filtrare. Si ottiene una resa molare del 85% circa.
Si ottengono risultati analoghi utilizzando etanolo, isopropanolo o glicerina in sostituzione del metanolo.
Esempio 14
Attività della Acetil Esterasi in funzione della temperatura
Sì prepara una soluzione di etile acetato (0,5 ml) in tampone fosfato 50 mM a pH 7 (50 ml), quindi si effettua l'idrolisi con 100 microlitri di acetil xilano esterasi da Bacillus pumilus ricombinante in E. coli, preparata con descritto nell'esempio 5, utilizzando la proteina libera non immobilizzata. Si effettuano diverse prove condotte a pH costante per titolazione automatica, a temperature da 10°C a 35°C, calcolando per ogni prova l’attività idrolitica dell’enzima in base alla velocità di aggiunta della base nei primi 10 minuti di reazione.
L'attività viene espressa in Unità Internazionali (UI) per ml di soluzione titolando con NaOH 0,1 N la quantità di acido acetico liberato dall'idrolisi dell'estere, e viene calcolata secondo la formula:
UI = [consumo medio NaOH (ml/min) * 100 * f] / volume campione (ml)
dove f = fattore di correzione del titolo della soda 0,1 N
consumo medio = consumo di NaOH 0,1 N nei primi 10 minuti di titolazione, espresso in ml/min
volume campione = volume di soluzione di acetil esterasi, espresso in ml
Riportando in grafico l'attività enzimatica espressa contro la temperatura di reazione si ottiene quanto riportato nella Figura 1.
Analoghi risultati si ottengono utilizzando la proteina immobilizzata su resina secondo quanto descritto negli esempi da 5 a 7.
Esempio 15
Attività della Acetil Esterase in funzione del pH Si opera come descritto nell'esempio 14, con soluzioni termostatate a 25°C, in condizioni di pH mantenuto costante per titolazione automatica a valori da 5 a 9. L'attività idrolitica viene calcolata come descritto nell'esempio 14, sì riporta in grafico l'attività in UI/ml in base al pH di lavoro ottenendo la curva di Figura 2,
Esempio 16
Cinetiche di idrolisi di 7-metossi-cefalotina in dipendenza di pH e temperatura
Si prepara una soluzione a 200 g/1 di 7-metossi-cefalotina e la si idrolizza con acetil xilano esterasi da B. pumilus ricombinante in E. coli come descritto nell'esempio 6, operando però a pH da 5,0 a 9,0 e temperatura da -10 a 35°C. Nel caso di temperature inferiori a 0°C si aggiunge alla soluzione acquosa il 10% in volume di glicerina .
Le reazioni vengono condotte a termine, fino ad un residuo di 7-metossi-cefalotina inferiore a 1 g/l. Si riportano in Figura 3 solo alcune delle cinetiche di reazione. Le rese e la qualità del prodotto ottenibile sono influenzate dalla possibile degradazione dei prodotti, a seconda delle condizioni dì reazione.
Esempio 17
Idrolisi di 7-metossi-cefalotina con acetil esterasi immobilizzata
Si opera come descritto nell'esempio 5, utilizzando acetil esterasi immobilizzata su resina secondo quanto descritto negli esempi da 5 a 7 ed operando a pH 5, a 35 °C. A fine reazione si ferma l'agitazione e sì lascia decantare il catalizzatore, quindi si separa la soluzione per sifonamento e si isola il composto I come descritto nell'esempio 11, ottenendo 7-metossi-3-desacetil-cefalotina a tìtolo 69%. Si ottiene un risultato analogo operando a pH 9, a -10°C, aggiungendo il 10% di glicerina alla soluzione acquosa.
Esempio 18
Sintesi di cefoxitin da 7-metossi-3-desacetilcefalotina
Due campioni dì 7-metossi-3-desacetilcefalotina sale di benzatina ottenuti secondo le procedure descritte nell'esempio 1 (campione A) e nell’esempio 12 (campione B) vengono trasformati in cefoxitin per reazione con clorosulfonil isocianato seguendo procedure note, descritte per es. in WO2004/083217A1 . Sì ottiene identica resa molare.
Claims (7)
- RIVENDICAZIONI 1 , Procedimento per la produzione del composto di formula Iin cui un composto di formula IIviene sottoposto ad idrolisi del gruppo aceti1ico, caratterizzato dal fatto che tale idrolisi è effettuata in acqua in presenza dì un catalizzatore costituito da almeno un enzima avente attività acetilidrolasica, ad una temperatura compresa tra -10°C e 45°C, a pH compreso tra 5 e 9.
- 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che detto catalizzatore è costituito da un enzima immobilizzato su supporto solido.
- 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto enzima è ottenuto da microrganismi scelti dal gruppo costituito da Rhodosporidium toruloides, Bacillus pumilus , Escherichia coli, Acremonium chrysogenum, e Streptomyces clavuligerus.
- 4. Procedimento secondo le rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto che detto composto di formula I viene isolato dal mezzo acquoso di reazione per precipitazione come sale di una base organica .
- 5. Procedimento secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dal fatto che detta base organica è la benzatina
- 6. Procedimento secondo le rivendicazioni da 1 a 3, caratterizzato dal fatto che detta temperatura di idrolisi è compresa tra 0°C e 20°C e che il pH è compreso tra 6 e 8.
- 7. Procedimento secondo le rivendicazioni da 1 a 6, caratterizzato dal fatto che il prodotto viene isolato da una soluzione acquosa in presenza di almeno un alcool avente da 1 a 4 atomi di C.
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