CN101418331B - 用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法 - Google Patents

用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101418331B
CN101418331B CN200810169803.4A CN200810169803A CN101418331B CN 101418331 B CN101418331 B CN 101418331B CN 200810169803 A CN200810169803 A CN 200810169803A CN 101418331 B CN101418331 B CN 101418331B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cefoxitin
methoxyl group
deacetylation
enzyme
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200810169803.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101418331A (zh
Inventor
A·R·塔格利亚尼
G·古阿斯塔勒格纳米
G·弗格利亚托
R·蒙古齐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ACS Dobfar SpA
Original Assignee
ACS Dobfar SpA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ACS Dobfar SpA filed Critical ACS Dobfar SpA
Publication of CN101418331A publication Critical patent/CN101418331A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101418331B publication Critical patent/CN101418331B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Cephalosporin Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

用于通过水解生产7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法，其在水中发生并且用酶催化。通过已知的方法，由该化合物可以获得头孢西丁。

Description

用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法
本发明涉及用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩(I)的方法，
所述7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩是头孢西丁合成的中间体，所述方法是使用生物催化剂的创新方法。
头孢西丁属于头霉素类，即β-内酰胺抗菌素类，其特征在于在头孢烷环的7位存在一个甲氧基。
在US4297488中描述了上述抗生素，其说明包含使用各种试剂的多种脱乙酰化中间体氨甲酰化的不同合成路线，所述合成路线在羧基和/或氨基上使用不同的保护基团。其还描述，尽管反应很慢(6-15小时)而且没有对于所获得产物质量的评论，使用来源于柑橘类水果皮的乙酰酯酶，经过酶促水解能产生这些衍生物中的某些。在Tetrahedron Lett46，4653-6(1973)中，该同一作者也对相似方法进行了描述，即使用保护的中间体如对硝基苄基酯，在其上进行脱保护和酶促水解反应，因此产生羧酸形式的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩。然后，用氯磺酰基异氰酸酯处理该产物获得头孢西丁。
在现代化学中，工业规模通常应用的合成路线是以7-ACA(7-氨基头孢烷酸)作为原料，生产光学纯的头孢西丁，并且所述合成路线包含四个主要步骤，并优选以下列顺序进行：
1.7位氨基的酰基化
2.在7α位引入甲氧基
3.3位乙酰基的除去
4.在先前的步骤3中获得的羟基基团的氨甲酰化
步骤1相当于一种头孢菌素、即头孢噻吩的合成。然后通过甲氧基化使其转化成相应的头孢噻啶以生成中间体II(步骤2)：
然后脱乙酰化生成化合物I。
尽管其它顺序是可能的，但是由于无需针对氨基或羧基使用保护基团，所以前述步骤是有优势的，并因此使必要的操作的数目最小化，从而使得节省了原料。
例如，WO2004/083217A1(第6页)中描述在冷却到-45℃的水-甲醇混合物中使用氢氧化钠的所述中间体II的皂化反应；在用酸碱中和后，在水解的整个过程中维持该温度，并且仅在反应结束后升高温度。
在适度的温度经蒸馏除去甲醇之后，化合物I作为二苄基乙二胺盐被分离；因此明显的是，即1)为了满足用于所述反应的极低温度的需要而使用甲醇是合理的，并且2)在分离所述产物之前，除去所述溶剂是必要的。
如EP1748049A2中所描述的，可选择地，能以经酸化作用的非解离形式或作为碱性盐、例如四丁铵在溶剂中提取所述产物。
通过如上述的专利所描述的异氰酸酯基团，或如US4292427中的实施例所描述的其它异氰酸酯基团的氨甲酰化，从化合物I中获得头孢西丁。
在所有情况下，因为β-内酰胺结构的不稳定性和在极端碱性条件下操作的需要，所以在极低温度下进行化合物I的脱乙酰化生成化合物II，以防止产物降解；因此使用有机溶剂以降低所述溶液的冰点。
因此，这些方法要求数千升的溶液冷却到-45℃量级的温度，通过 使用制冷机或制冷液(例如液氮)使这些温度在整个反应期间得以维持；这导致了大量的能源成本。然后，在真空下，通过加热到+30/+40℃蒸馏除去所述溶剂，其带有进一步的大量能源消耗(对于加热所述溶液以及所述真空泵和冷凝器制冷操作两者而言)。
由于溶剂易燃性、可能的操作者中毒、蒸汽向环境的释放以及由于产生含有甲醇的水性流出物的缺点，因此还必须考虑溶剂、例如甲醇的使用涉及危险，所述溶剂必须适当处理。
因此，更加生态相容性的路线是非常合乎需要的，例如仅在常温的水中就发生的水解反应。为了在合理的时间完成这样的水解反应，并且避免产物降解，需要催化剂，例如酶。
已经知道头孢菌素类(不是作为化合物II的头霉素类)的酶促脱乙酰化有一段时间了，并且已经描述了与不同来源的酶的反应。
例如Gilbert等在GB1121308(Glaxo，1964)中所描述的来源于麦芽的乙酰酯酶，Jeffery等在Biochem，J.81，第591-6页(1961)中所描述的存在于柑橘类果皮中的酶。
上述US4297488描述了由来源于柑橘类水果的乙酰酯酶催化的各种头孢西丁合成中间体的酶促水解；然而，因为所述催化剂的不良表现，其中描述的方法不适用于工业规模。这是一种比活度很低的酶，其涉及极长的反应时间(描述为6-15小时)，难以生产，因为其源于受季节变化影响难以再制的来源。此外，它以溶解的形式应用，不是循环的，并且既没有描述酶的纯化也没有描述酶的固定。没有描述获得的乙酰基衍生物的产率及其质量。
从Acremoniu mchrysogenum(或枝顶头孢(Cephalosporiumacremonium))以及棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)中头孢菌素C的生物合成路线中所涉及的那些开始，已经发现其它对头孢菌素类有效的酶；这些被认为是不合需要的酶活性，因其导致脱乙酰化头孢菌素C，一个发酵副产物的形成。应该注意的是，在Nocardialactamodurans和棒状链霉菌中头霉素类的生物合成不包含在头霉素上所述乙酰基的水解作用(P.Liras，Antonie van Leeuwenhoek 75， 1999，第109-24页)；因此，在头霉素类上乙酰酯酶的活性是未知的，甚至在产生头霉素的微生物中。
已经描述了在7-ACA或头孢菌素C上的乙酰基的酶催化水解，但是没有描述在头霉素类上的乙酰基的酶催化水解；特别地：
1)由枯草杆菌产生的酯酶(Abbott和Fukuda，AntimicrobAgents Chemother8，3，第282-8页，1975和Appl Microbiol，30，3，第413-8页1975)以固定的形式用于水解7-ACA为3-脱乙酰基-7-ACA。所述酶足够有效和稳定，但是倾向于从固定载体上脱离。其他作者(Takimoto等Appl Microbiol Technol65，第263-7页，2004)描述了在重组的大肠杆菌中该酶的发酵，其纯化和在固体载体上的固定及其生产3-脱乙酰基-7-ACA的应用。
2)Politino等在Appl Environm Micr obiol63，12，第4807-11页，1997中描述了红冬孢酵母产生对7-ACA有活性的酶，其可以以非发酵生物质(静息细胞)的形式或作为一个分离和纯化酶的形式在该反应中用作催化剂。但是，该酶对于头孢噻吩所表现出的水解活性是低的，仅为对于7-ACA的34％。没有描述头霉素类的水解。Chiang等(US 2002/0048781BMS，2002)也使用同样的酶，其描述了一株能表达来自红冬孢酵母属的乙酰酯酶的重组Acremonium chrysogenum用于在发酵肉汤中直接产生脱乙酰化头孢菌素C。
3)Venturi等在Appl Environ Microbiol 64，2，第789-92页，1998中描述了另一个乙酰酯酶，所述乙酰酯酶是由短小芽胞杆菌产生的木聚糖酯酶，一种与木聚糖降解有关的酶，其还显示出对7-ACA和头孢菌素C的活性；其它出版物描述了在大肠杆菌中同样酶的表达。没有描述对头霉素类的活性。
因此，在现有技术中，头霉素的乙酰基的酶促水解从来没有以工业规模应用；而且，尽管有大量可得的关于头孢菌素类中相似反应的文献，但是没有描述可用于头霉素类的足够有效和稳定的酶。
本发明的一个方面是制备式I化合物的方法，其中式II化合物经历乙酰基水解，其特征在于在pH值5-9之间(优选6-8之间)，温度 在-10℃和+45℃之间(优选0℃和+20℃之间)，在由至少一种具有乙酰基-水解活性的酶组成的生物催化剂存在下，在水中进行所述水解，且最后通过公知的方法从反应介质中分离所述酶。
特别地，该生物催化剂可从选自红冬孢酵母、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、Acremonium chrysogenum和棒状链霉菌的微生物中获得，并且可以游离蛋白或固定在固体载体上的形式存在，或由所述微生物细胞自身组成。在反应结束后，可以分离和再利用所述生物催化剂，而所述化合物I可以作为有机碱的盐通过沉淀或通过在溶剂中提取从所述水溶液中分离。优选地，已经发现，所述有机碱选自二苄基乙二胺及其盐。
与现有技术相比，新方法呈现出许多优势，可概括如下：
由于避免使用有害的溶剂(例如甲醇)和强腐蚀溶液(例如氢氧化钠)，具有更高的工作安全性，
通过在室温工作节省了大量能源，从而避免为了达到和维持通常用于这些情况中的低温(例如低于-45℃)而需要消耗的大量能源，
通过避免在真空下的溶剂蒸馏(一个需要大量时间的步骤)具有更高的生产率。
获得了与通过目前公知的方法可获得的产物质量相当或比其更好的产物。
详细描述
从市售的优品质和低价的原料头孢噻吩开始制备中间体II；可以通过已知的方法从7-ACA生产同样的头孢噻吩。通过已知的方法操作，使用氯化剂和甲醇钠，在极低温度进行甲氧基化反应。在反应结束后，可以碱性金属的盐或有机碱的盐分离所述化合物II，或可以在水中以羧酸盐的形式提取所述化合物II。在WO2004/083217实施例1步骤i描述了一条方便的合成路线。
为了所述酶的脱乙酰基化，使用各种催化剂，所述催化剂通过已知方法或如下列实施例所描述的制备。
如WO2004/083217中所描述的，反应产物(化合物I)作为二苄基乙二胺盐被分离，或依照在EP1748049A2中所描述的步骤，反应产物(化合物I)或作为a)非解离形式的酸，或b)四丁胺盐在有机溶剂中被提取。
以已知方法操作，通过与氯磺酰基异氰酸酯反应，从化合物I获得头孢西丁，从而获得适合药用的优质产物。
在下列实施例中说明所述方法，但是认为其是非限制性的。
实施例1
7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的化学合成
将通过已知步骤制备的、且作为酸具有约69％滴定度(约等于500毫摩尔)的300g环己胺盐形式的7-甲氧基头孢噻吩(溶液A)加入到1升水和1.15升甲醇的混合物中。将该混合物冷却到-37℃。
分别地，在300ml水中制备160g的30％氢氧化钠的水溶液，并冷却到+5℃，然后将其缓慢倾入溶液A，并且在加入完成之后在-45℃/-35℃之间维持温度约一个小时。通过HPLC分析监测反应动力学：当残留的7-甲氧基头孢噻吩低于0.7g/l时，加入90g的80％的乙酸中断反应，同时维持温度在-5℃之内。监测pH，其必须为中性，如有必要，并校正至6.8-7.0。在真空下将混合物加热到+30/+35℃进行蒸馏直到获得浓度约为100g/l的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩，然后用碳脱色。为了达到约为80g/l的浓度，将体积稀释至大约1.9升，然后加入300ml乙酸乙酯和130g二苄基乙二胺双乙酸盐，加入少量固体产物以触发沉淀。将混合物冷却到0/+5℃，并且维持该温度直到母液中产物浓度低于10g/l为止，然后经布氏漏斗过滤。用水、接着用乙酸乙酯洗涤固体，然后在85％乙酸乙酯/15％丙酮混合物中捣碎得到无水产物。
获得约208g7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐，作为酸其滴定度约为70％，等于380毫摩尔，摩尔产率为76％。
实施例2
使用红冬孢酵母生物质7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的酶促水解
如文献中所描述的，使红冬孢酵母ATCC10657在烧瓶或发酵罐中从接种开始生长72小时，取回全部肉汤样本用于监测产生的乙酰酯酶的量。以国际单位(IU)表示所述酶活性，其等于每分钟转化的底物的微摩尔，并且通过7-ACA(在水中20g/l)的水解确定；反应的温度控制在+25℃，通过自动滴定(pH-stat，Crison Instruments SA，Barcelona，Spain)加入0.1M NaOH使pH控制在6.5。生长肉汤在10000r.p.m.离心15分钟，将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中并再次离心，以获得具有每克约6-10IU比活性的糊状湿细胞。
将40.8g的7-甲氧基头孢噻吩环己胺盐溶解在约250ml水中，并用3N的氢氧化铵校正pH至7.0，设置滴定器以维持pH为7.0，将温度控制在+20℃，并加入50g的红冬孢酵母属细胞糊。在约1小时30分后，反应完成，通过离心分离细胞以获得约340ml的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩溶液，其用碳脱色并经纸过滤。加入55ml乙酸乙酯和17.7g二苄基乙二胺双乙酸盐，如实施例1中所述分离产物。
获得约28g7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐，作为酸其滴定度约为70％，等于51毫摩尔，摩尔产率为77％。
红冬孢酵母属细胞对于各种水解循环而言可再次利用。
实施例3
用来自红冬孢酵母的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的酶促水解
如实施例1中所述获得的红冬孢酵母生物质经EDTA(乙二胺四乙酸)处理后裂解，获得含有乙酰酯酶活性的水溶液，所述水溶液按照文献中已知的方法(Politino等Appl.Environ.Microbiol.63，12，第4807-11页，1997)，通过羧甲基Sepharose经色谱纯化。
将按照实施例1制备的870g的7-甲氧基-头孢噻吩二苄基乙二胺 盐溶解，校正pH到7.0，将体积稀释到总共为6000ml，然后加入200ml的乙酰酯酶溶液，并且用3N氢氧化铵通过自动滴定将pH维持在7。反应结束时，使用带有Nanomax膜以及10000Da截止点的MilliporeProScale仪器，通过超滤从所述产物中分离所述酶。从渗透物中获得约5升7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩溶液，如实施例1所述将其分离，含有所述酶的浓缩物用于在下一个水解循环的再次利用。如实施例1所述分离化合物1。
实施例4
用重组的大肠杆菌生物质的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的酶促水解
来自短小芽胞杆菌的酶乙酰基木聚糖酯酶在通过如Venturi等在Microbiology146，第1585-91页(2000)中所描述的方法获得的重组大肠杆菌中表达。
如实施例3中所描述的，使用340g的大肠杆菌生物质作为催化剂水解7-甲氧基-头孢噻吩；反应结束时，通过超滤分离7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩溶液，如实施例1中所述分离二苄基乙二胺盐形式的产物。
超滤截留物是部分裂解的大肠杆菌细胞和游离酶的悬浮液，其在随后的循环可再次利用。
实施例5
用固定在环氧树脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的酶促水解
通过在1000bar使用细胞破碎压榨机(Constant Systems Ltd.)破坏细胞，然后在20000r.p.m.离心30分钟，从而使如实施例4中所描述的重组大肠杆菌中产生的木聚糖酯酶部分纯化。通过用10KDa膜ProScale Millipore仪器超滤进行透析由此获得的上清液，然后如文献(Venturi et al.，Microbiology146，第1585-91页，2000) 所描述的，在Sepharose Q Fast Flow树脂上进行色谱分析。
通过超滤浓缩部分纯化的酶，然后用pH为8的10倍体积的1.2MK2HPO4溶液稀释，接着固定在环氧树脂Sepabeads EC-EP(Diaion SpA，Mitsubishi)上，每克树脂120IU的装载量。搅动所述树脂悬浮液48小时，然后经布氏漏斗过滤，并用10倍体积的水洗涤(每克树脂10ml)；获得活性约为70IU/克的固体催化剂。
将100g的7-甲氧基-头孢噻吩环己胺盐溶于总体积为450ml的水中，然后使用作为催化剂的66g固定酶进行水解，并使用3N氢氧化铵通过自动滴定维持pH恒定在7。
2.5小时后反应完成，经烧结玻璃漏斗过滤酶，通过加入50g的二苄基乙二胺双乙酸盐，并如实施例1中所述操作，分离7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩。
获得69.6g产物，其作为酸7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩滴定度为70.8％，摩尔产率为78％。
所述催化剂可以在多次反应循环中再次利用。
实施例6
用固定在氨基树脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的酶促水解
如实施例5中所描述的，将如实施例4中所述的在重组大肠杆菌中产生的来自短小芽胞杆菌的酶乙酰酯酶进行纯化。
将100g的SepabeadsEC-HA树脂(Diaion)用水充分洗涤，然后悬浮于100ml pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液中。加入170ml的25％戊二醛水溶液，并且于搅拌下放置16小时，然后加入总共12000IU的纯化酶溶液。3小时后，混合物经布氏漏斗过滤，并用水充分清洗。获得活性为55IU/克的催化剂。
如实施例5中所描述的，使用84克固定的乙酰酯酶进行水解。如实施例1中所描述的，反应3小时后，滤除所述酶并且所述二苄基乙二胺盐沉淀。获得的产物在四倍体积的异丙醇(重量/体积)中悬浮并 过滤，获得68g的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐，其滴定度为70.5％，相当于摩尔产率为76％。
所述催化剂可以在多次反应循环中再次利用。
实施例7
用固定在乙醛酰树脂上的乙酰酯酶的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的酶促水解
用水充分洗涤100g的Sepabeads EC-HA树脂(Diaion)，然后加入800ml的0.05M偏高碘酸钠溶液；在1.5小时后所述混合物经布氏漏斗过滤，并用水充分洗涤。将所述树脂悬浮于700ml pH值为10的50mM碳酸氢盐缓冲液中，然后加入如实施例5中纯化的12000IU的酶。
1小时后，加入1400ml的1mg/ml的硼氢化钠水溶液，让其反应30分钟，然后经多孔挡流板过滤，并用水充分洗涤。获得活性为38IU/克的催化剂。
如实施例5中所述进行水解反应；3.5小时后，中断反应并分离产物。获得65g的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐，其滴定度为70％，相当于摩尔产率为73％。
所述催化剂可以在多次反应循环中再次利用。
实施例8
来自二氯甲烷溶液的7-甲氧基-头孢噻吩的酶促水解
如WO2004/083217A1中所述，在二氯甲烷和甲醇中使用N-氯代-琥珀酰亚胺和甲醇钠进行头孢噻吩的甲氧基化反应。在用水溶液洗涤后，获得82g/l酸7-甲氧基-头孢噻吩的二氯甲烷溶液。
用约300ml水提取500ml二氯甲烷溶液，用10％(w/v)的碳酸钠水溶液进行滴定以获得最终pH为8.0；分离所述相，并且用少量水洗涤亚甲基相获得355ml的109g/l水性的产物溶液，相当于提取率为94％。在+25℃真空下蒸馏水相消除溶剂残余物。
如实施例6中所描述的，用40g的酶水解所述水相，并用10％(w/v)的碳酸钠水溶液控制pH值，2小时后，中断反应并分离产物。获得33g的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐，其滴定度为70.8％。所述催化剂可以在多次反应循环中再次利用。
实施例9
在不分离中间体的情况下合成头孢西丁
如实施例8中所述制备7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩，获得浓度为80g/l的水溶液，其用2g碳脱色。按照EP1748049A2中所描述的步骤，过滤后，加入固体NaCl直到饱和，并用溴化四丁基铵的二氯甲烷溶液提取所述溶液。在四氢呋喃中用氯代磺酰异氰酸酯实施氨基甲酰化，分离酸头孢西丁，然后如相同专利所述，将所述头孢西丁转化为相应的钠盐。
获得13g头孢西丁钠。 
实施例10
作为酸或钠盐的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的分离
如实施例6中所述进行反应；水解结束时，过滤所述催化剂并再次利用，然后酸化水溶液直到7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩开始沉淀。使沉淀持续30分钟，然后加入盐酸直到pH值为2.5，冷却到+4℃。所述混合物经布氏漏斗过滤获得白色固体状的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩。用乙酸乙酯提取母液，分离相并向有机相中加入2-乙基己酸钠，获得7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩钠盐的沉淀。
实施例11
在水混悬液中7-甲氧基-头孢噻吩的酶促水解
将130g的7-甲氧基头孢噻吩环己胺盐悬浮于300ml水中，然后加入10％(w/v)的碳酸钠水溶液使pH值为7；获得悬浮液，向其中加入如实施例6所述制备的100g固定酶。将温度控制在+20℃且pH值恒 定条件下实施反应；随着水解进行观察到底物完全溶解。持续该过程直到获得低于0.5g/l的7-甲氧基-头孢噻吩残余物，然后如实施例1中所述滤除所述催化剂并分离产物。获得98.3g的7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐，其滴定度为70％，摩尔产率为85％。
实施例12
通过7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的二苄基乙二胺盐的热沉淀分离7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩
如实施例中11所述进行反应。唯一的区别是在加入所述二苄基乙二胺双乙酸盐前将水/乙酸乙酯混合物加热到+35℃。为了引发7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐的沉淀，将温度维持在+30/35℃约30分钟，并在过滤前逐渐冷却到+4℃。获得约为85％的摩尔产率。
实施例13
用于沉淀7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的二苄基乙二胺的应用
如实施例11中所述进行反应。唯一的区别是向7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩水溶液中加入10vol％的甲醇，然后加入乙酸乙酯，在加入二苄基乙二胺碱之前，加热到+30/35℃。在过滤前将混合物逐渐冷却到+4℃。获得约为85％的摩尔产率。使用乙醇、异丙醇或甘油替代甲醇获得相似的结果。
实施例14
作为温度的函数的乙酰酯酶活性
制备乙酸乙酯(0.5ml)在pH值为7的50mM磷酸盐缓冲液中的溶液(50ml)，然后用100微升来自大肠杆菌中的重组短小芽胞杆菌的乙酰基木聚糖酯酶实施水解，所述乙酰基木聚糖酯酶如实施例5所述使用游离非固定蛋白制备。
在温度+10℃到+35℃之间，在通过自动滴定的恒定pH下进行各项测试，在反应的最初10分钟期间，基于碱的加入速率，计算每次测试 所述酶的水解活性。
通过用0.1N的NaOH滴定经所述酯水解释放的乙酸量，并通过以下公式计算，将所述活性表示为每ml溶液的国际单位(IU)：
IU＝[平均NaOH消耗量(ml/min)×100×f]/样本体积(ml)
其中f＝0.1N的碳酸钠滴定度的校正因子
平均消耗量＝在滴定的最初10分钟内0.1N的NaOH的消耗量，以ml/min表示
样本体积＝乙酰酯酶溶液的体积，以ml表示。
对表示的酶活性对反应温度绘图，得到如附图1所示的图。
如实施例5到7中所述，使用固定在树脂上的蛋白获得相似的结果。
实施例15
作为PH的函数的乙酰酯酶活性
按照实施例14中所描述的步骤，溶液温度控制在+25℃，通过自动滴定维持pH恒定将在5-9之间。如实施例14中所述计算水解活性，并将活性以IU/ml对操作pH绘图，获得附图2的曲线。
实施例16
作为pH和温度的函数的7-甲氧基-头孢噻吩的水解动力学
如实施例6中所述制备200g/l的7-甲氧基-头孢噻吩溶液，并用来自大肠杆菌中的重组短小芽胞杆菌的乙酰基木聚糖酯酶水解，但是在pH为5.0-9.0之间并温度在-10℃到+35℃之间操作。在温度低于0℃的情况下，向水溶液中加入10vol％的甘油。
进行反应，直到获得的7-甲氧基-头孢噻吩的残余物低于1g/l终止反应。 
附图3显示的仅仅是一些反应动力学。取决于反应条件，可获得的产物产率和质量受可能的产物降解的影响。
实施例17
用固定乙酰酯酶的7-甲氧基-头孢噻吩的水解
按照实施例5中所描述的步骤，如实施例5-7中所述使用固定在树脂上的乙酰酯酶，并且在pH为5并+35℃下操作。反应终止时，停止搅拌，倾析所述催化剂，然后通过虹吸作用分离溶液，并且如实施例11中所述分离化合物I，获得7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩，其滴定度为69％。在pH为9，温度为-10℃下操作，并向水溶液中加入10％甘油得到相似结果。
实施例18
从7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩合成头孢西丁
例如象WO2004/083217A1中所述，通过与氯代磺酰基异氰酸酯反应，将通过实施例1(样本A)和实施例12(样本B)所描述的步骤获得的两个7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩二苄基乙二胺盐的样本转化为头孢西丁。获得相同的摩尔产率。
附图说明
图1是对表示的酶活性对反应温度绘图。
图2是将活性以IU/ml对操作pH绘图。
图3是显示的仅仅是一些反应动力学。

Claims (1)

1.制备作为头孢西丁合成的中间体的式I化合物的方法，
其中使式II化合物
经历乙酰基水解，其特征在于所述水解在pH为7-8之间，温度为0℃和+20℃之间，在由至少一种具有水解乙酰基活性的酶组成的催化剂存在下，在水中进行，所述酶是由选自红冬孢酵母和短小芽胞杆菌的微生物获得的，并且通过沉淀从水性反应介质中获得作为二苄基乙二胺的盐的所述式I化合物。
CN200810169803.4A 2007-10-09 2008-10-07 用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法 Active CN101418331B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT001951A ITMI20071951A1 (it) 2007-10-09 2007-10-09 Processo per la produzione di 7-metossi-3-desacetilcefalotina
ITMI2007A001951 2007-10-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101418331A CN101418331A (zh) 2009-04-29
CN101418331B true CN101418331B (zh) 2015-04-15

Family

ID=40149854

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200810169803.4A Active CN101418331B (zh) 2007-10-09 2008-10-07 用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8067195B2 (zh)
EP (1) EP2048240A3 (zh)
KR (1) KR101505412B1 (zh)
CN (1) CN101418331B (zh)
IT (1) ITMI20071951A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7662955B2 (en) * 2003-03-20 2010-02-16 Orchid Chemicals And Pharmaceuticals Ltd. Process for the preparation of cefoxitin
ITMI20051451A1 (it) * 2005-07-27 2007-01-28 Acs Dobfar Spa Procedimento per la preparazione di cefoxitin sodico
CN101555252B (zh) * 2009-05-21 2011-05-11 苏州致君万庆药业有限公司 一种抗菌素头孢西丁的合成方法
CN102936614B (zh) * 2012-12-07 2015-04-01 苏州中联化学制药有限公司 7-α-甲氧基-3-去乙酰基头孢噻吩苄星盐的合成方法
CN105254650A (zh) * 2015-11-02 2016-01-20 四川清山绿水实业发展有限公司 抗菌药物头孢西丁酸的合成方法
JP7441953B2 (ja) * 2020-01-14 2024-03-01 ▲凱▼菜英生命科学技▲術▼（天津）有限公司 変性エポキシ樹脂固定化酵素、製造方法及び使用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4297488A (en) * 1970-06-16 1981-10-27 Merck & Co., Inc. 7-α-Methoxy cephalosporins

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1121308A (en) * 1964-10-30 1968-07-24 Glaxo Lab Ltd Cephalosporins
US4292427A (en) 1976-11-17 1981-09-29 Merck & Co., Inc. Cephalosporin compounds
US4474879A (en) * 1982-11-16 1984-10-02 Eli Lilly And Company Process for 3-hydroxymethyl cephalosporin sulfones
AU2001240112A1 (en) 2000-03-09 2001-09-17 Bristol-Myers Squibb Company Direct production of desacetylcephalosporin c
WO2004083217A1 (en) 2003-03-20 2004-09-30 Orchid Chemicals & Pharmaceuticals Ltd An improved process for the preparation of cefoxitin
ITMI20051451A1 (it) 2005-07-27 2007-01-28 Acs Dobfar Spa Procedimento per la preparazione di cefoxitin sodico

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4297488A (en) * 1970-06-16 1981-10-27 Merck & Co., Inc. 7-α-Methoxy cephalosporins

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Politino M, et al.Purification and characterization of a cephalosporin esterase from Rhodosporidium torulodies.《Applied and Environmental Microbiology》.1997,第63卷(第12期),第4807-4811页. *
Ratcliffe RW, et al.Total synthesis of beta-lactam antibiotics III.(+)-cefoxtin.《Tetrahedron Letters》.1973,(第46期),第4653-4656页. *
Takimoto A, et al.Batch production of deacetyl 7-aminocephalosporanic acid by immobilized cephalosporin-C deacetylase.《Appl. Microbiol. Biotechnol.》.2004,第65卷第263-267页. *

Also Published As

Publication number Publication date
US8067195B2 (en) 2011-11-29
KR20090036515A (ko) 2009-04-14
CN101418331A (zh) 2009-04-29
KR101505412B1 (ko) 2015-03-25
ITMI20071951A1 (it) 2008-01-08
EP2048240A2 (en) 2009-04-15
EP2048240A3 (en) 2010-10-06
US20090093032A1 (en) 2009-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101418331B (zh) 用于产生7-甲氧基-3-脱乙酰基头孢噻吩的方法
NO136756B (zh)
EP0531991A2 (en) Method for preparing chitosan
CN102676614A (zh) 一种低聚半乳糖的制备方法
CN102112617A (zh) 通过毕赤酵母发酵共生产几丁质、其衍生物以及包含葡萄糖、甘露糖和/或半乳糖的聚合物的方法
CN104498365A (zh) 一株产甲壳素脱乙酰酶菌株及在发酵产甲壳素脱乙酰酶中的应用
US2821501A (en) Recovery of starch
CN102220244B (zh) 一种哈茨木霉菌株及其用该菌株制备右旋糖酐酶的方法
EP2321421A1 (en) Process for preparation of mycophenolic acid, its salt and ester derivatives
CN109136314B (zh) 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧-2-氨基腺苷的方法
SE438164B (sv) Forfarande for framstellning av cefamycin c genom odling av streptomyces sp. ofr 1022(atcc nr 31666)
CN1671852A (zh) 含有辅酶q10的溶液的制备方法
CN109136313A (zh) 利用密西根克雷伯氏菌合成2’-脱氧腺苷的方法
CN104911106A (zh) 一种嗜松青霉菌株及其该菌株制备右旋糖酐酶的方法
JPH10316702A (ja) 微生物由来のキトサンおよびその製造方法
CN107236779A (zh) 一种真菌催化甾体生物转化的方法
CN108410929B (zh) 阿尼芬净前体的制备方法
US4689296A (en) Method of preparing novel thermostable transglucosidase
CN1080761C (zh) 2－酮基－l－古洛糖酸的改良性生产方法
EP0402416A1 (en) Process for the preparation of tannase intended for the production of gallic acid, with the aid of an aspergillus culture
JP3642095B2 (ja) 新規中性キシラナーゼおよびその製造法
JPH0740950B2 (ja) 微生物によるニコチアナミンの製造法
CN108516931B (zh) 一种α-酮亮氨酸钙的制备方法
JPH09131199A (ja) リポマイセス属微生物の産生する菌体外多糖の製造方法
JPH01104194A (ja) Ｄ−（−）−酒石酸の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant