CN114107275B - 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法。该酶固定化载体包含树脂球基体、通过化学键链接在树脂球基体上的‑N(CH2COOH)2基团、以及通过配位作用螯合吸附在‑N(CH2COOH)2基团上的金属离子；其中，树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂和/或环氧基型甲基丙烯酸树脂，树脂球基体的粒径为200～700μm。基于此，本发明有效解决了现有技术中酶固定化载体对酶的兼容性较差、固定化效果差，且固定化酶活性较差、重复使用过程中稳定性较差的问题。

Description

酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物催化领域，具体而言，涉及一种酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法。
背景技术
生物催化已成为绿色合成药物的重要部分，是催化合成药物结构单元和中间体最有前途和应用的技术之一，尤其是为手性合成提供了独特的难以替代的方法。在工业过程中越来越多地将酶用作催化剂，但是由于酶使用条件的温和性和其本身的易变性使酶对环境要求非常的苛刻，且难回收利用，从而大大限制了酶在工业中的应用。固定化酶技术的开发及应用可以有效地解决这些问题，因此经常被称为“生物催化剂”的固定化酶被广泛用于工业有机合成和生物转化中。
酶固定方法可分为物理法和化学法两大类。物理法主要包括吸附法和包埋法，化学法主要包括结合法和交联法。吸附法也称为非共价法，主要是通过氢键、范德华力、疏水作用力以及离子键等一些非共价键相互作用将酶与吸附介质结合在一起的固定方法。常用的无机吸附材料有硅胶、氧化铝、多孔玻璃、硅藻土等，常用的有机吸附材料主要包括天然的海藻酸盐、几丁质、壳聚糖、纤维素、淀粉，合成的有机材料有聚氨酯、大孔树脂等。包埋法是将游离酶包埋在特定凝胶等介质的孔隙中而固定，如用聚丙烯酰胺、海藻酸钙等凝胶介质进行的包埋。包埋法更简单，且包埋的酶蛋白结构可基本保持不变，酶活力损失也比较少，但存在一定的缺点，如酶组分的泄露和酶失活。结合法即为共价固定化，是基于载体材料有效官能团与酶相关官能团(如氨基、羧基、巯基、羟基等酶蛋白侧链基团)间的反应而相互结合。共价固定化使酶和载体之间的结合更强，这种酶与载体间产生的强化学键可显著减少酶的散失，提高酶的重复利用率。但是该方法条件苛刻，反应剧烈，酶活损失大(一般残余酶活在30％左右)。交联法是指通过双功能或多功能试剂(交联试剂)在酶分子之间、酶分子与载体间进行交联反应，形成共价键进行酶固定的一类方法。常用的交联试剂有戊二醛，己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。对于利用交联剂将酶交联而形成的无载体酶聚合物(cross-linked enzyme aggregates，CLEA)的研究较多，如苯丙氨酸氨裂合酶的CLEA化固定和蔗糖磷酸化酶CLEA化固定。综上，上述传统酶固定方法有不少缺陷，如吸附固定的酶容易流失，包埋固定后酶的底物及产物不易扩散，共价结合法容易导致酶失活，交联酶的机械性能比较差等。
但是，商业化亲和树脂多为蛋白纯化树脂，其基质一般为纤维素、交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。例如，金属螯合亲和树脂粒度小，大规模应用回收困难，且高剪切力下颗粒容易碎，在传统的搅拌罐反应模式下不易应用。同时，其树脂基质非常亲水储存条件要求高，需要酒精溶液储存，且尽量避免干燥，不适宜用作固定化酶。另外，其高昂的成本使其在工业化固定化酶应用中受到了很大的影响。
因此，有必要提供一种新的酶固定化载体，使其对酶的兼容性更好、固定化效果更佳。同时，固定化酶在化学反应的应用中，酶的活性得以更大程度的被保留、且在重复使用过程中稳定性较高。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法，以解决现有技术中酶固定化载体对酶的兼容性较差、固定化效果差，且固定化酶活性较差、重复使用过程中稳定性较差的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种酶固定化载体，酶固定化载体包含树脂球基体、通过化学键链接在树脂球基体上的-N(CH2COOH)2基团、以及通过配位作用螯合吸附在-N(CH2COOH)2基团上的金属离子；其中，树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂或环氧基型甲基丙烯酸树脂，树脂球基体的粒径为200～700μm。
进一步地，氨基型甲基丙烯酸树脂中，氨基型甲基丙烯酸树脂具有C2长度或C6长度碳链手臂的氨基官能团，且氨基含量为30～80μmol/g；优选地，氨基型甲基丙烯酸树脂为LX-1000HA、/>LX-1000EPN、/>LX-EPHA、/>LX-1000EA、LifetechTMECR8309、LifetechTMECR8409、ESR-1、ESR-3或ESQ-1中的一种或多种；更优选氨基型甲基丙烯酸树脂为/>LX-1000HA、/>LX-1000EPN、/>LX-EPHA或LifetechTMECR8309中的一种或多种；优选地，环氧基型甲基丙烯酸树脂的环氧当量为2～5μmol/g；更优选地，环氧基型甲基丙烯酸树脂为/>LX-1000EP、/>LX-103B、EP200、LX-107B、/>LX-1000SW、/>LX-1000SD、/>LX-109s、/>LX-1000HFA、LifetechTMECR8285、LifetechTMECR8204、LifetechTMECR8209、ES-1、ES103、ES-101、ReliZymeTMHFA403或ReliZymeTMEC-HFA中的一种或多种；更优选环氧基型甲基丙烯酸树脂为/>LX-1000EP、/>LX-109s、/>LX-1000HFA或ReliZymeTMEC-HFA中的一种或多种；优选地，金属离子为镍离子、铁离子、铜离子或钴离子。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶，固定化酶包括上述的酶固定化载体和固定在其上的酶。
进一步地，酶选自转氨酶、酮还原酶、醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、单加氧酶、烯还原酶、亚胺还原酶和氨基酸脱氢酶中的任意一种或多种；其中，转氨酶为来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶，或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或者来源于Actinobacteria的转氨酶，或者来源于Sciscionella sp.SE31的转氨酶；酮还原酶为来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的羰基还原酶，或者来源于Sporobolomyces salmonicolor的酮还原酶；醇脱氢酶为来源于Thermoanaerobiumbrockii的醇脱氢酶；甲酸脱氢酶为来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶；葡萄糖脱氢酶为来源于Lysinibacillus sphaericus G10的葡萄糖脱氢酶；单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶；烯还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶，或者来源于Chryseobacterium sp.CA49的烯还原酶；亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp.的亚胺还原酶，或者来源于Bacillus cereus的亚胺还原酶；氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶，或者来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶，或者来源于Thermoactinomyces intermediusATCC33205的氨基酸脱氢酶，或者来源于Thermosyntropha lipolytica的氨基酸脱氢酶。
根据本发明的另一方面，提供了一种上述的酶固定化载体的制备方法，包括以下步骤：提供树脂球基体；在树脂球基体上通过化学键链接-N(CH2COOH)2基团；在-N(CH2COOH)2基团上通过配位作用吸附金属离子，得到酶固定化载体；其中，树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂或环氧基型甲基丙烯酸树脂，树脂球基体的粒径为200～700μm。
进一步地，树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂时，将氨基型甲基丙烯酸树脂和氯乙酸钠混合，进行亲核取代反应，以在氨基型甲基丙烯酸树脂上链接-N(CH2COOH)2基团。
进一步地，将氨基型甲基丙烯酸树脂和氯乙酸钠的水溶液在20～25℃下搅拌30～60min后，用1～2mol/L的碱水溶液调节反应体系pH为9～10，然后升温至70～80℃，并在N2氛围下反应20～30h，以在氨基型甲基丙烯酸树脂上链接-N(CH2COOH)2基团；优选地，碱水溶液为碳酸钠水溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化锂溶液。
进一步地，树脂球基体为环氧基型甲基丙烯酸树脂时，将环氧基型甲基丙烯酸树脂和二乙酸亚胺二钠混合，进行加成反应，以在环氧基型甲基丙烯酸树脂上链接-N(CH2COOH)2基团。
进一步地，将环氧基型甲基丙烯酸树脂和二乙酸亚胺二钠的水溶液在20～25℃下搅拌30～60min后，升温至60～70℃，并在N2氛围下反应18～24h，以在环氧基型甲基丙烯酸树脂上链接-N(CH2COOH)2基团。
进一步地，在树脂球基体上通过化学键链接-N(CH2COOH)2基团的步骤后，在反应体系中加入金属盐溶液，进行络合反应，以在-N(CH2COOH)2基团上通过配位作用吸附金属离子，得到酶固定化载体；优选地，络合反应过程中，反应温度为20～30℃，反应时间为1～4h；优选地，金属盐溶液为氯化镍水溶液、硫酸铜水溶液、氯化亚铁水溶液或氯化钴水溶液；优选地，金属盐溶液中金属离子和树脂球基体的质量比为(0.05～0.1):1。
进一步地，氯乙酸钠与氨基型甲基丙烯酸树脂的质量比为(5～10):1。
进一步地，二乙酸亚胺二钠与环氧基型甲基丙烯酸树脂的质量比为(5～10):1。
根据本发明的另一方面，提供了一种上述的固定化酶的制备方法，包括以下步骤：将上述的酶固定化载体和酶进行固定化反应，得到固定化酶。
进一步地，固定化酶的制备方法包括以下步骤：将酶固定化载体分散于第一溶剂中形成分散液；其中，第一溶剂为磷酸缓冲液、氯化钠水溶液及咪唑缓冲液的混合溶液；将分散液与含酶的酶液进行反应，以使酶与酶固定化载体进行固定化反应，得到固定化酶。
进一步地，第一溶剂中，磷酸缓冲液的浓度为0.1～0.2mol/L；氯化钠水溶液的浓度为0.5～1mol/L；咪唑缓冲液的浓度为0.05～0.1mol/L。
进一步地，分散液与酶液进行反应的过程中，反应温度为20～25℃，反应时间为16～24h；优选地，每克酶固定化载体与4～8mL的酶液进行反应，且酶液中的蛋白含量为20～25mg/mL。
本发明的上述载体，以氨基型甲基丙烯酸树脂或环氧基型甲基丙烯酸树脂为树脂球基体，通过化学键在树脂球基体上连接有-N(CH2COOH)2基团，通过配位作用吸附在-N(CH2COOH)2基团上连接有金属离子。使用该载体，其一，其树脂球基体的粒径(200～700μm)比传统亲和树脂更大(20～80μm)，可重复回收性更佳。同时，相较于一般亲和树脂其机械强度更高，避免了高剪切力下树脂球基体破碎的问题，继而在传统的搅拌罐反应模式下，固定化酶的使用寿命更长，可重复回收性更佳。其二，由其构成的含氮二乙酸基团、金属离子的金属螯合亲和结构相较于一般的共价结合载体，载体只和蛋白末端的His标签结合，因此对酶的兼容性更好，能在固定化的同时最大程度保留酶活，且酶的重复使用稳定性更高。另外，上述类型树脂成本更低。基于此，本发明的上述载体对酶的兼容性更好，固定化效果更佳，且能在固定化的同时最大程度地保留酶的活性。进而，基于其固定得到的固定化酶，其活性更佳、重复使用过程中稳定性更高，更适宜在工业化固定化酶中应用。基于此，本发明有效解决了现有技术中酶固定化载体对酶的兼容性较差、固定化效果差，且固定化酶活性较差、重复使用过程中稳定性较差的问题。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
正如背景技术部分所描述的，现有技术中存在酶固定化载体对酶的兼容性较差、固定化效果差，且固定化酶活性较差、重复使用过程中稳定性较差的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了一种酶固定化载体，酶固定化载体包含树脂球基体、通过化学键链接在树脂球基体上的-N(CH2COOH)2基团、以及通过配位作用螯合吸附在-N(CH2COOH)2基团上的金属离子；其中，树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂或环氧基型甲基丙烯酸树脂，树脂球基体的粒径为200～700μm。
本发明的上述载体，以氨基型甲基丙烯酸树脂或环氧基型甲基丙烯酸树脂为树脂球基体，通过化学键在树脂球基体上连接有-N(CH2COOH)2基团，通过配位作用吸附在-N(CH2COOH)2基团上连接有金属离子。使用该载体，在后续固定酶的反应过程中，酶末端的His标签可以通过配位作用吸附金属离子上。具体地，-N(CH2COOH)2基团和金属离子形成配位键，但是-N(CH2COOH)2基团并不会全部占据金属离子的配位位点，带有His标签的酶继续占用金属离子上剩余的未被占用的配位位点，与载体通过配位作用形成固定化酶。相较于共价结合，其结合过程中由于酶主体和载体之间发生了化学反应，导致酶主体被破坏，而且其固定化酶刚性变强，导致酶活力较低。但与之不同的是，本发明由于采用了酶末端的His标签和载体中金属离子配位结合的形式，载体与酶的主体之间并没有反应接触，酶活力损失更小。
尤其是，本发明上述树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂和/或环氧基型甲基丙烯酸树脂。基于此，其一，其树脂球基体的颗粒比传统亲和树脂更大，可重复回收性更佳。同时，其机械强度更高，避免了高剪切力下树脂球基体破碎的问题，继而在传统的搅拌罐反应模式下，固定化酶的使用寿命更长，可重复回收性更佳。其二，由其构成的载体对酶的兼容性更好，能在固定化的同时最大程度保留酶活，且酶的重复使用稳定性更高。另外，上述类型树脂成本更低。基于此，本发明的上述载体对酶的兼容性更好，固定化效果更佳，且能在固定化的同时最大程度地保留酶的活性。进而，基于其固定得到的固定化酶，其活性更佳、重复使用过程中稳定性更高，更适宜在工业化固定化酶中应用。
总之，本发明有效解决了现有技术中酶固定化载体对酶的兼容性较差、固定化效果差，且固定化酶活性较差、重复使用过程中稳定性较差的问题。
优选地，氨基型甲基丙烯酸树脂具有C2长度或C6长度碳链手臂的氨基官能团，且氨基含量为30～80μmol/g；优选地，氨基型甲基丙烯酸树脂为LX-1000HA、/>LX-1000EPN、/>LX-EPHA、/>LX-1000EA、LifetechTMECR8309、LifetechTMECR8409、ESR-1、ESR-3或ESQ-1中的一种或多种；更优选氨基型甲基丙烯酸树脂为/>LX-1000HA、/>LX-1000EPN、/>LX-EPHA或LifetechTMECR8309中的一种或多种；
优选地，环氧基型甲基丙烯酸树脂的环氧当量为2～5μmol/g；更优选地，环氧基型甲基丙烯酸树脂为LX-1000EP、/>LX-103B、EP200、/>LX-107B、/>LX-1000SW、/>LX-1000SD、/>LX-109s、/>LX-1000HFA、LifetechTMECR8285、LifetechTMECR8204、LifetechTMECR8209、ES-1、ES103、ES-101、ReliZymeTMHFA403或ReliZymeTMEC-HFA中的一种或多种；更优选环氧基型甲基丙烯酸树脂为/>LX-1000EP、LX-109s、/>LX-1000HFA或ReliZymeTMEC-HFA中的一种或多种。
树脂球基体选自上述类型，一方面，其机械强度更高、颗粒比传统亲和树脂更大、成本更低廉，因而更易于大规模应用，工业生产前景较佳。另一方面，由其构成的载体对酶的兼容性更好，能在固定化的同时最大程度保留酶活，且酶的重复使用稳定性更高。上述树脂来源如下所示：
为了进一步提高酶和载体的结合稳定性，优选地，金属离子为镍离子、铁离子、铜离子或钴离子，更优选金属离子为镍离子、铜离子或钴离子。
本发明还提供了一种固定化酶，固定化酶包括上述的酶固定化载体和固定在其上的酶。
基于前文的各项原因，本发明的上述载体对酶的兼容性更好，固定化效果更佳，且能在固定化的同时最大程度地保留酶的活性。进而，基于其固定得到的固定化酶，其活性更佳、重复使用过程中稳定性更高，更适宜在工业化固定化酶中应用。
本发明的固定化酶，对酶具有广泛的适用性，比如，酶包括但不限于转氨酶、酮还原酶、醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、单加氧酶、烯还原酶、亚胺还原酶和氨基酸脱氢酶中的任意一种或多种；其中对以下酶类更为适用，转氨酶为来源于Chromobacteriumviolaceum DSM30191的转氨酶，或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或者来源于Actinobacteria的转氨酶，或者来源于Sciscionella sp.SE31的转氨酶；酮还原酶为来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的羰基还原酶，或者来源于Sporobolomycessalmonicolor的酮还原酶；醇脱氢酶为来源于Thermoanaerobium brockii的醇脱氢酶；甲酸脱氢酶为来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶；葡萄糖脱氢酶为来源于Lysinibacillus sphaericus G10的葡萄糖脱氢酶；单加氧酶为来源于Rhodococcussp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶；烯还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶，或者来源于Chryseobacterium sp.CA49的烯还原酶；亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp.的亚胺还原酶，或者来源于Bacillus cereus的亚胺还原酶；氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶，或者来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶，或者来源于Thermoactinomyces intermediusATCC33205的氨基酸脱氢酶，或者来源于Thermosyntropha lipolytica的氨基酸脱氢酶。本发明上述酶类的酶编号、来源及酶序列信息如下所示：
需说明的是，上述酶序列均为现有技术中已公开酶，本发明只是采用上述酶进行本发明酶固定化载体性能的验证。
为了进一步提高固定化酶的活性及重复使用稳定性，更优选地，当酶为转氨酶时，基体树脂为LX-1000HA、LX-1000EPN、LX-EPHA或LX-109s中的一种或多种；当酶为甲酸脱氢酶时，基体树脂为LX-1000EPN、LX-109s、LX-1000HFA、ECR8285或EC-HFA中的一种或多种；当酶为酮还原酶时，基体树脂为LX-109s、LX-EPHA、ECR8285、LX-1000HA或ECR8409中的一种或多种；当酶为单加氧酶时，基体树脂为LX-109s、LX-EPHA或LX-1000HA中的一种或多种；当酶为亚胺还原酶时，基体树脂为LX-109s和/或LX-EPHA；酶为氨基酸脱氢酶、醇脱氢酶或烯还原酶时，基体树脂为LX-109s、LX-1000EPN、LX-EPHA或LX-1000HA中的一种或多种。
本发明还提供了一种上述的酶固定化载体的制备方法，包括以下步骤：提供树脂球基体；在树脂球基体上通过化学键链接-N(CH2COOH)2基团；在-N(CH2COOH)2基团上通过配位作用吸附金属离子，得到酶固定化载体。
基于前文的各项原因，本发明的上述载体对酶的兼容性更好，固定化效果更佳，且能在固定化的同时最大程度地保留酶的活性。进而，基于其固定得到的固定化酶，其活性更佳、重复使用过程中稳定性更高，更适宜在工业化固定化酶中应用。
在一种优选的实施方案中，树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂时，将氨基型甲基丙烯酸树脂和氯乙酸钠混合，进行亲核取代反应，以在氨基型甲基丙烯酸树脂上链接-N(CH2COOH)2基团。更优选地，将氨基型甲基丙烯酸树脂和氯乙酸钠的水溶液在室温下搅拌30～60min后，用1～2mol/L的碱水溶液调节反应体系pH至9～10，然后升温至70～80℃，并在N2氛围下反应20～30h，以在氨基型甲基丙烯酸树脂上链接-N(CH2COOH)2基团；优选地，碱水溶液为碳酸钠水溶液、稀氢氧化钠溶液或氢氧化锂溶液。基于此，本发明氨基型甲基丙烯酸树脂球基体的转化率更高，且反应过程更平稳。
在一种优选的实施方案中，树脂球基体为环氧基型甲基丙烯酸树脂时，将环氧基型甲基丙烯酸树脂和二乙酸亚胺二钠混合，进行加成反应，以在环氧基型甲基丙烯酸树脂上链接-N(CH2COOH)2基团。更优选地，将环氧基型甲基丙烯酸树脂和二乙酸亚胺二钠的水溶液在20～25℃下搅拌30～60min后，升温至60～70℃，并在N2氛围下反应18～24h以在环氧基型甲基丙烯酸树脂上链接-N(CH2COOH)2基团。基于此，本发明环氧基型甲基丙烯酸树脂球基体的转化率更高，且反应过程更平稳。
在一种优选的实施方案中，在树脂球基体上通过化学键链接-N(CH2COOH)2基团步骤后，在反应体系中加入金属盐溶液，进行络合反应，以在-N(CH2COOH)2基团上通过配位作用吸附金属离子，得到酶固定化载体。优选地，络合反应过程中，反应温度为2～30℃，反应时间为1～4h；金属盐溶液为氯化镍、硫酸铜、氯化亚铁、氯化钴等。基于此，反应条件更适宜，促使反应得到的酶固定化载体产率更高，纯度更高。更优选金属盐溶液中金属离子和树脂球基体的质量比为(0.05～0.1):1。
为了进一步提高氨基型基体树脂的转化率，优选氯乙酸钠与氨基型甲基丙烯酸树脂的质量比为(5～10):1。
为了进一步提高环氧基型基体树脂的转化，优选二乙酸亚胺二钠与环氧基型甲基丙烯酸树脂的质量比为(5～10):1。
本发明还提供了一种上述的固定化酶的制备方法，包括以下步骤：将上述的酶固定化载体和酶进行固定化反应，得到固定化酶。
基于前文的各项原因，本发明的上述载体对酶的兼容性更好，固定化效果更佳，且能在固定化的同时最大程度地保留酶的活性。进而，基于其固定得到的固定化酶，其活性更佳、重复使用过程中稳定性更高，更适宜在工业化固定化酶中应用。
优选地，固定化酶的制备方法包括以下步骤：将酶固定化载体分散于第一溶剂中形成分散液；其中，第一溶剂为磷酸缓冲液、氯化钠水溶液及咪唑缓冲液的混合溶液。将分散液与含酶的酶液进行反应，以使酶与酶固定化载体进行固定化反应，得到固定化酶。第一溶剂为固定化创造了更为温和适宜的环境，可以保护酶的活力，加强酶的固定效果，防止酶液中非目的蛋白被固定。基于此，进一步提高了上述载体对酶的兼容性，且酶固定化效果更佳、活性更佳。
为了进一步提高固定化酶的活性及重复使用稳定性，优选第一溶剂中，磷酸缓冲液的浓度为0.1～0.2mol/L；优选地，氯化钠水溶液的浓度为0.5～1mol/L；优选地，咪唑缓冲液的浓度为0.05～0.1mol/L。
为了提高反应过程中的稳定性，同时提高反应效率，优选地，分散液与酶液进行反应的过程中，反应温度为20～25℃，反应时间为16～24h。更优选地，每克酶固定化载体对应4～8mL酶液，且酶液中的蛋白含量为20～25mg/mL。这样有利于促使酶更充分地固定，提供载量，并使固定化酶具有更高的催化活性。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。
实施例1
转氨酶在酶固定化载体上的固定及应用。
以氨基型甲基丙烯酸树脂为树脂球基体的酶固定化载体的制备：
取出5g氨基型甲基丙烯酸树脂球基体，加入250mL四口瓶中，加入75mL去离子水及22.5g氯乙酸钠，室温下机械搅拌120rpm，使载体分散均匀，搅拌30min后，用1MNa2CO3溶液调pH至9～10，随后升温至70℃在N2保护下反应20h(中途多次调节pH值，使pH值保持在9～10)。反应结束后将体系降至室温水洗至中性。将体系中液体去除，修饰后载体用去离子水清洗2次，加入100mL5mol/LNiCl水溶液，搅拌3h，去除金属离子体系，用去离子水清洗2次。
以环氧基型甲基丙烯酸树脂为树脂球基体的酶固定化载体的制备：
取出5g环氧基型甲基丙烯酸树脂球基体，加入250mL四口瓶中，加入75mL2M的水合二乙酸亚胺二钠盐溶液，室温下机械搅拌120rpm，使载体分散均匀，搅拌30min后，随后升温至60℃在N2保护下反应18h。反应结束后降至室温水洗至中性。将体系中液体去除，修饰后载体用去离子水清洗2次，加入100mL5mmol/LNiCl水溶液，搅拌3h，去除金属离子体系，用去离子水清洗2次。
转氨酶在以氨基型甲基丙烯酸树脂为树脂球基体的酶固定化载体上的固定：
称取1g上述酶固定化载体并用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.5MNaCl和0.05M咪唑缓冲液洗涤多次，除去缓冲液，并保持载体使用。然后加入4mL酶溶液(用0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.8MNaCl和0.05M咪唑缓冲液配制酶溶液使蛋白质含量为20～25mg/mL，具有辅因子PLP)，并在20℃下孵育16～24h，除去缓冲液。用含有0.5MNaCl的20M磷酸缓冲液(pH8.0)和0.05M咪唑缓冲液洗涤3次，并用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.5MNaCl缓冲液洗涤1次，除去缓冲液，并保持固定化酶使用。
转氨酶在以环氧基型甲基丙烯酸树脂为树脂球基体的酶固定化载体上的固定：
转氨酶在环氧基型甲基丙烯酸树脂上的固定：称取1g环氧基型树脂并用0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.8MNaCl缓冲液洗涤多次，除去缓冲液，并保持树脂使用。然后加入4mL由0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.8MNaCl缓冲液和0.1g酶粉配制成的酶溶(具有辅因子磷酸吡哆醛PLP)，并在20℃下孵育36～48h，除去缓冲液。用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.5MNaCl缓冲液洗涤3次，除去缓冲液，并保持固定化酶使用。
转氨酶在氨基型甲基丙烯酸树脂上的固定：称取1g氨基型的树脂并用0.1M磷酸缓冲液7.0洗涤多次，除去缓冲液，加入0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)和终浓度为2％的戊二醛溶液。然后加入4mL由0.1M磷酸缓冲液7.0和0.1g酶粉配置而成的酶液(具有辅因子PLP)，并在20℃下孵育16～24h，除去缓冲液。用含有0.5MNaCl的20mM磷酸缓冲液7.0洗涤3次，除去缓冲液，并保持固定化酶使用。
转氨酶在现有技术中商业化亲和层析树脂上的固定：
品牌 树脂名称 基质 官能团
漂莱特 MIDA-Ni 甲基丙烯酸酯 Ni+
伯乐 IMAC-Ni 甲基丙烯酸酯 Ni+
称取1g伯乐IMAC-Ni或漂莱特MIDA-Ni固定化载体并用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.5MNaCl和0.05M咪唑缓冲液洗涤多次，除去缓冲液，并保持载体使用。然后加入4mL酶溶液(用0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.8MNaCl和0.05M咪唑缓冲液配制酶溶液使蛋白质含量为20～25mg/mL，具有辅因子PLP)，并在20℃下孵育16～24h，除去缓冲液。用含有0.5MNaCl的20M磷酸缓冲液(pH8.0)和0.05M咪唑缓冲液洗涤3次，并用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)和0.5MNaCl缓冲液洗涤1次，除去缓冲液，并保持固定化酶使用。
固定化转氨酶活性及重复使用性测试：
(一)
在10mL的反应瓶中，加入0.1g主原料1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1mgPLP，补加0.1M磷酸缓冲液7.0至反应液终体积为1mL，再加入0.01g酶粉或由0.01g酶粉制备的固定化酶，在30℃下搅拌16～20h。测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表1：
表1
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(二)
在10mL的反应瓶中，加入0.05g的DMSO，溶解0.03g主原料2，并加入3eq异丙胺盐酸盐和1mgPLP，补加0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)至反应液终体积为1mL，再加入0.01g酶粉或由0.01g酶粉制备的固定化酶，在30℃下搅拌16～20h。测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表2：
表2
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实施例2
甲酸脱氢酶在酶固定化载体上的固定及应用。
和实施例1的不同仅在于将转氨酶等质量替换为甲酸脱氢酶，辅因子替换为等质量的NAD+。
固定化FDH活性及重复使用性测试：
在50mL的反应瓶中，加入5mL0.1MTris-Cl缓冲液(pH8.0-9.0)，溶解100mg主原料3，并加入108mg氯化铵，80mg铵盐，调节pH7.5～8.0，然后加入10mgNAD+，100mgAADH-Bc游离酶和5mgFDH酶粉或由5mg酶粉制成的固定化FDH。在30℃搅拌16～20h。每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表3：
表3
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实施例3
酮还原酶在酶固定化载体上的固定及应用。
和实施例1的区别仅在于将转氨酶等量替换为酮还原酶，辅因子替换为等质量的NAD+。固定化酮还原酶活性及重复使用性测试：
在10mL的反应瓶中，加入0.5mL异丙醇(IPA)，溶解0.1g原料4或5，并加入0.5mL0.1M磷酸缓冲液7.0和10mgNAD+，再加入10mg酶粉或由10mg酶粉制备的固定化酶，在30℃搅拌16～20h。每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。反应数据如下表4。
表4
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实施例4
单加氧酶在酶固定化载体上的固定及应用。
和实施例1的区别仅在于将转氨酶等量替换为单加氧酶，辅因子替换为等质量的NADP+。
固定化单加氧酶活性及重复使用性测试：
10ml的反应瓶中加入0.3mL的异丙醇，后加入100mg的底物6，5mgNADP+，3mL0.1M磷酸缓冲液(pH8.0)，然后加入2mg醇脱氢酶ADH-Tb游离酶及20mg环己酮单加氧酶游离酶或由22mg游离酶制备的固定化酶。在30℃下反应16～20小时，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经气相色谱法检测转化率，反应数据如下表5。
表5
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实施例5
亚胺还原酶在亲和修饰后的氨基和环氧基型甲基丙烯酸树脂上的固定及应用。
和实施例1的区别仅在于与将转氨酶等量替换为亚胺还原酶，辅因子替换为等质量的NAD+。
固定化亚胺还原酶活性及重复使用性测试：
将2mL0.1M磷酸缓冲液缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应球中，然后加入100mg上述底物7、10mgNAD+、60mg甲酸铵、10mgFDH和10mgIRED游离酶或由10mg游离酶制备的固定化IRED酶或由10mgFDH和10mgIRED游离酶制备的共固定化酶。在30℃下反应20小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经HPLC检测转化率测试结果见下表6。
表6
实施例6
GDH在亲和修饰后的氨基和环氧基型甲基丙烯酸树脂上的固定及应用。
和实施例1的区别仅在于将转氨酶等量替换为谷氨酸脱氢酶，辅因子替换为等质量的NADP+。
固定化GDH活性及重复使用性测试：
在10mL的反应瓶中，加入0.125mL甲醇，溶解0.25g主原料8，4eq葡萄糖和1mgNADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸)，补加0.1MK磷酸缓冲液(pH7.2)至反应液终体积为2mL，再加入0.3gADH-Tb酶粉和10mgGDH酶粉或由10mgGDH酶粉制备的固定化酶，在35℃搅拌20h。每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表7。
表7
实施例7
醇脱氢酶在亲和修饰后的氨基和环氧基型甲基丙烯酸树脂上的固定及应用。
和实施例1的区别仅在于将转氨酶等量替换为醇脱氢酶，辅因子替换为等质量的NADP+。
固定化醇脱氢酶活性及重复使用性测试：
在10mL的反应瓶中，加入0.125mL甲醇，溶解0.25g主原料8，并加入4eq葡萄糖和1mgNADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸)，补加0.1MK磷酸缓冲液7.2至反应液终体积为2mL，再加入10mgGDH酶粉和0.3gADH酶粉和或由0.3gADH酶粉制备的固定化酶或由0.3gADH和10mgGDH酶粉制备的固定化酶，在35℃搅拌20h。每一轮反应结束后将固定化酶分离，投入下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表8。
表8
实施例8
烯还原酶和在亲和修饰后的氨基和环氧基型甲基丙烯酸树脂上的固定及应用。
和实施例1的区别仅在于将转氨酶等量替换为烯还原酶，辅因子替换为等质量的NAD(P)+。
固定化烯还原酶活性及重复使用性测试：
3mL的0.1M磷酸缓冲液(pH7.0～8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入100mg的底物9，接着加入10mgNAD(P)+，80mg甲酸铵，2mgFDH及10mg的ERED游离酶或10mgERED游离酶制备的固定化酶或由2mgFDH和10mg的ERED游离酶制备的固定化酶。在30℃下反应16-20小时，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经气相色谱法检测转化率，反应数据如下表9。
表9
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实施例9
氨基酸脱氢酶在亲和修饰后的氨基和环氧基型甲基丙烯酸树脂上的固定及应用。
和实施例1的区别仅在于将转氨酶等量替换为氨基酸脱氢酶，辅因子替换为等质量的NAD+。
固定化氨基酸脱氢酶活性及重复使用性测试：
在20mL的反应瓶中，加入5mL0.1MTris-Cl缓冲液(pH8.0～9.0)，溶解100mg主原料10或主原料11，并加入108mg氯化铵，调节pH至pH7.5-8.0，然后加入10-50mgNAD+，150mg葡萄糖，5mgGDH和10mgAADH游离酶或由10mgAADH游离酶制成的固定化酶或由5mgGDH和10mgAADH游离酶制成的共固定化酶。在30℃搅拌16～20h。测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表10。
表10
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实施例10
转氨酶在不同金属离子亲和修饰后的氨基和环氧基型甲基丙烯酸树脂上的固定及应用和实施例1的区别仅在于将等摩尔量镍离子分别替换为钴离子和铜离子。
固定化转氨酶活性及重复使用性测试：
在10mL的反应瓶中，加入0.1g主原料1，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1mgPLP，补加0.1M磷酸缓冲液7.0至反应液终体积为1mL，再加入0.01g酶粉或由0.01g酶粉制备的固定化酶，在30℃下搅拌16～20h。测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表11。
表11
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法
<120> 辽宁凯莱英医药化学有限公司
<130> PN156196
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 459
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum DSM30191
<400> 1
Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala
1 5 10 15
His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly
20 25 30
Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu
35 40 45
Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val
50 55 60
Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu
65 70 75 80
Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val
85 90 95
Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp
100 105 110
Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile
115 120 125
Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro
165 170 175
Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly
180 185 190
Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu
195 200 205
Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val
210 215 220
Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu
245 250 255
Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe
260 265 270
Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys
290 295 300
Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe
305 310 315 320
Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val
325 330 335
Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile
340 345 350
Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu
355 360 365
His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu
370 375 380
Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile
385 390 395 400
Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg
405 410 415
Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg
420 425 430
Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala
450 455
<210> 2
<211> 459
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum DSM30191
<400> 2
Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala
1 5 10 15
His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly
20 25 30
Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu
35 40 45
Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val
50 55 60
Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu
65 70 75 80
Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val
85 90 95
Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp
100 105 110
Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile
115 120 125
Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys
130 135 140
Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly
145 150 155 160
Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro
165 170 175
Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly
180 185 190
Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu
195 200 205
Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val
210 215 220
Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr
225 230 235 240
Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu
245 250 255
Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe
260 265 270
Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys
275 280 285
Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys
290 295 300
Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe
305 310 315 320
Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val
325 330 335
Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile
340 345 350
Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu
355 360 365
His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu
370 375 380
Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile
385 390 395 400
Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg
405 410 415
Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg
420 425 430
Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu
435 440 445
Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala
450 455
<210> 3
<211> 476
<212> PRT
<213> Arthrobacter citreus
<400> 3
Met Gly Leu Thr Val Gln Lys Ile Asn Trp Glu Gln Val Lys Glu Trp
1 5 10 15
Asp Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Phe Ser Thr Gln Asn Glu Tyr Gln
20 25 30
Pro Val Pro Ile Glu Ser Thr Glu Gly Asp Tyr Leu Ile Thr Pro Gly
35 40 45
Gly Thr Arg Leu Leu Asp Phe Phe Asn Gln Leu Cys Cys Val Asn Leu
50 55 60
Gly Gln Lys Asn Gln Lys Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asp
65 70 75 80
Arg Tyr Gly Phe Val Trp Asp Thr Tyr Ala Thr Asp Tyr Lys Ala Lys
85 90 95
Ala Ala Lys Ile Ile Ile Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Asp Trp Pro
100 105 110
Gly Lys Val Arg Phe Val Ser Thr Gly Ser Glu Ala Val Glu Thr Ala
115 120 125
Leu Asn Ile Ala Arg Leu Tyr Thr Asn Arg Pro Leu Val Val Thr Arg
130 135 140
Glu His Asp Tyr His Gly Trp Thr Gly Gly Ala Ala Thr Val Thr Arg
145 150 155 160
Leu Arg Ser Phe Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asn Ser Glu Ser Phe
165 170 175
Ser Ala Gln Ile Pro Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Val Leu Met Ala
180 185 190
Pro Ser Ser Asn Thr Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asn Tyr Leu Lys Asp
195 200 205
Glu Asn Gly Glu Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu
210 215 220
Asn Tyr Gly Pro Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln
225 230 235 240
Gly Val Gly Ser Thr Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Val Pro Gln Ile Arg
245 250 255
Lys Met Thr Lys Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Ser Asp Glu Val Leu
260 265 270
Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Lys Trp Phe Gly Tyr Gln His Tyr Gly
275 280 285
Val Gln Pro Asp Ile Ile Thr Met Gly Lys Gly Leu Ser Ser Ser Ser
290 295 300
Leu Pro Ala Gly Ala Val Val Val Ser Lys Glu Ile Ala Ala Phe Met
305 310 315 320
Asp Lys His Arg Trp Glu Ser Val Ser Thr Tyr Ala Gly His Pro Val
325 330 335
Ala Met Ala Ala Val Cys Ala Asn Leu Glu Val Met Met Glu Glu Asn
340 345 350
Leu Val Glu Gln Ala Lys Asn Ser Gly Glu Tyr Ile Arg Ser Lys Leu
355 360 365
Glu Leu Leu Gln Glu Lys His Lys Ser Ile Gly Asn Phe Asp Gly Tyr
370 375 380
Gly Leu Leu Trp Ile Val Asp Ile Val Asn Ala Lys Thr Lys Thr Pro
385 390 395 400
Tyr Val Lys Leu Asp Arg Asn Phe Arg His Gly Met Asn Pro Asn Gln
405 410 415
Ile Pro Thr Gln Ile Ile Met Glu Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Leu
420 425 430
Ile Gly Gly Ala Met Pro Asn Thr Met Arg Ile Gly Ala Ser Leu Asn
435 440 445
Val Ser Arg Gly Asp Ile Asp Lys Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr Ala
450 455 460
Leu Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Trp Gln Gln Ser
465 470 475
<210> 4
<211> 341
<212> PRT
<213> Actinobacteria
<400> 4
Met Thr Ile Ser Lys Asp Ile Asp Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Val Ser
1 5 10 15
Val Ala Pro Gly Ala Ile Arg Glu Pro Thr Pro Ala Gly Ser Val Ile
20 25 30
Gln Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Glu Ser Ser Pro Phe Ala Gly Gly
35 40 45
Ala Ala Trp Ile Glu Gly Glu Tyr Val Pro Ala Ala Glu Ala Arg Ile
50 55 60
Ser Leu Phe Asp Thr Gly Phe Gly His Ser Asp Leu Thr Tyr Thr Val
65 70 75 80
Ala His Val Trp His Gly Asn Ile Phe Arg Ile Lys Asp His Ile Asp
85 90 95
Arg Val Phe Asp Gly Ala Gln Lys Leu Arg Leu Gln Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Lys Ala Glu Val Glu Asp Ile Thr Lys Arg Cys Val Ser Leu Ser Gln
115 120 125
Leu Arg Glu Ser Phe Val Asn Ile Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Ala
130 135 140
Arg Lys Gly Glu Lys Asp Leu Ser Lys Leu Thr Ser Gln Ile Tyr Ile
145 150 155 160
Tyr Ala Ile Pro Tyr Leu Trp Ala Phe Pro Pro Glu Glu Gln Ile Phe
165 170 175
Gly Thr Ser Ala Ile Val Pro Arg His Val Arg Arg Ala Gly Arg Asn
180 185 190
Thr Val Asp Pro Thr Val Lys Asn Tyr Gln Trp Gly Asp Leu Thr Ala
195 200 205
Ala Ser Phe Glu Ala Lys Asp Arg Gly Ala Arg Thr Ala Ile Leu Leu
210 215 220
Asp Ala Asp Asn Cys Val Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Val Met
225 230 235 240
Val Lys Asp Gly Lys Leu Ser Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly
245 250 255
Ile Thr Arg Leu Thr Val Met Glu Met Ala Asp Glu Met Gly Ile Glu
260 265 270
Phe Thr Leu Arg Asp Ile Thr Ser Arg Glu Leu Tyr Glu Ala Asp Glu
275 280 285
Leu Ile Ala Val Thr Thr Ala Gly Gly Ile Thr Pro Ile Thr Ser Leu
290 295 300
Asp Gly Glu Pro Leu Gly Asp Gly Thr Pro Gly Pro Val Thr Val Ala
305 310 315 320
Ile Arg Asp Arg Phe Trp Ala Met Met Asp Glu Pro Ser Ser Leu Val
325 330 335
Glu Ala Ile Glu Tyr
340
<210> 5
<211> 338
<212> PRT
<213> Sciscionella sp. SE31
<400> 5
Met Thr Thr Thr Glu Phe Ala Asn Ser Asn Leu Val Ala Val Glu Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ile Arg Glu Pro Thr Pro Pro Gly Ser Val Ile Gln Tyr Ser
20 25 30
Glu Tyr Glu Leu Asp Arg Ser Gln Pro Leu Ala Gly Gly Val Ala Trp
35 40 45
Ile Glu Gly Glu Tyr Val Pro Ala Asp Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe
50 55 60
Asp Thr Gly Phe Gly His Ser Asp Leu Thr Tyr Thr Val Ala His Val
65 70 75 80
Trp His Gly Asn Ile Phe Arg Leu Glu Asp His Leu Asp Arg Leu Leu
85 90 95
His Gly Ala Ala Arg Leu Lys Leu Glu Thr Gly Met Ser Arg Glu Glu
100 105 110
Leu Ala Gly Ile Ala Lys Arg Cys Val Ser Leu Ser Gln Leu Arg Glu
115 120 125
Ala Tyr Val Asn Ile Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Lys Lys Arg Gly
130 135 140
Glu Lys Asp Leu Thr Lys Leu Thr His Gln Val Tyr Val Tyr Ala Ile
145 150 155 160
Pro Tyr Leu Trp Ala Phe Pro Pro Glu Glu Gln Ile Phe Gly Thr Ser
165 170 175
Val Ile Val Pro Arg His Val Arg Arg Ala Gly Arg Asn Thr Ile Asp
180 185 190
Pro Thr Ile Lys Asn Tyr Gln Trp Gly Asp Leu Thr Ala Ala Ser Phe
195 200 205
Glu Ala Lys Asp Arg Gly Ala Arg Ser Ala Val Leu Leu Asp Ala Asp
210 215 220
Asn Cys Val Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Val Leu Val Lys Asp
225 230 235 240
Gly Ala Leu Val Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg
245 250 255
Lys Thr Val Tyr Glu Ile Ala Ala Ala Lys Gly Ile Glu Thr Met Leu
260 265 270
Arg Asp Val Thr Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Ala Asp Glu Leu Met Ala
275 280 285
Val Thr Thr Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Thr Ser Leu Asp Gly Glu
290 295 300
Gln Val Gly Asn Gly Glu Pro Gly Pro Ile Thr Val Ala Ile Arg Asp
305 310 315 320
Arg Phe Trp Ala Leu Met Asp Glu Pro Ser Ser Leu Ile Glu Ala Ile
325 330 335
Asp Tyr
<210> 6
<211> 253
<212> PRT
<213> Acetobacter sp. CCTCC M209061
<400> 6
Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala
35 40 45
Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val
50 55 60
Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Asn Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Ser
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Val Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 7
<211> 603
<212> PRT
<213> Rhodococcus ruber-SD1
<400> 7
Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg
20 25 30
Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Met Pro Ile Thr
35 40 45
Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly
50 55 60
Gly Phe Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Arg Leu Arg Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Glu Ser Val Arg Ile Ile Asp Lys Ala Gly Asp Phe Gly Gly Val Trp
85 90 95
Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Met Cys Asp Thr Ala Ala Met Val
100 105 110
Tyr Met Pro Leu Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Met Pro Thr Glu Lys Tyr
115 120 125
Ala His Gly Pro Glu Ile Leu Glu His Cys Gln Arg Ile Gly Lys His
130 135 140
Tyr Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Leu Phe His Thr Glu Val Thr Asp Leu
145 150 155 160
Val Trp Gln Glu His Asp Gln Arg Trp Arg Ile Ser Thr Asn Arg Gly
165 170 175
Asp His Phe Thr Ala Gln Phe Val Gly Met Gly Thr Gly Pro Leu His
180 185 190
Val Ala Gln Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile Glu Ser Phe Arg Gly Lys
195 200 205
Ser Phe His Thr Ser Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Thr Gly Gly Asp Ala
210 215 220
Leu Gly Ala Pro Met Asp Lys Leu Ala Asp Lys Arg Val Ala Val Ile
225 230 235 240
Gly Thr Gly Ala Thr Ala Val Gln Cys Val Pro Glu Leu Ala Lys Tyr
245 250 255
Cys Arg Glu Leu Tyr Val Val Gln Arg Thr Pro Ser Ala Val Asp Glu
260 265 270
Arg Gly Asn His Pro Ile Asp Glu Lys Trp Phe Ala Gln Ile Ala Thr
275 280 285
Pro Gly Trp Gln Lys Arg Trp Leu Asp Ser Phe Thr Ala Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Val Leu Thr Asp Pro Ser Glu Leu Ala Ile Glu His Glu Asp Leu
305 310 315 320
Val Gln Asp Gly Trp Thr Ala Leu Gly Gln Arg Met Arg Ala Ala Val
325 330 335
Gly Ser Val Pro Ile Glu Gln Tyr Ser Pro Glu Asn Val Gln Arg Ala
340 345 350
Leu Glu Glu Ala Asp Asp Glu Gln Met Glu Arg Ile Arg Ala Arg Val
355 360 365
Asp Glu Ile Val Thr Asp Pro Ala Thr Ala Ala Gln Leu Lys Ala Trp
370 375 380
Phe Arg Gln Met Cys Lys Arg Pro Cys Phe His Asp Asp Tyr Leu Pro
385 390 395 400
Ala Phe Asn Arg Pro Asn Thr His Leu Val Asp Thr Gly Gly Lys Gly
405 410 415
Val Glu Arg Ile Thr Glu Asn Gly Val Val Val Ala Gly Val Glu Tyr
420 425 430
Glu Val Asp Cys Ile Val Tyr Ala Ser Gly Phe Glu Phe Leu Gly Thr
435 440 445
Gly Tyr Thr Asp Arg Ala Gly Phe Asp Pro Thr Gly Arg Asp Gly Val
450 455 460
Lys Leu Ser Glu His Trp Ala Gln Gly Thr Arg Thr Leu His Gly Met
465 470 475 480
His Thr Tyr Gly Phe Pro Asn Leu Phe Val Leu Gln Leu Met Gln Gly
485 490 495
Ala Ala Leu Gly Ser Asn Ile Pro His Asn Phe Val Glu Ala Ala Arg
500 505 510
Val Val Ala Ala Ile Val Asp His Val Leu Ser Thr Gly Thr Ser Ser
515 520 525
Val Glu Thr Thr Lys Glu Ala Glu Gln Ala Trp Val Gln Leu Leu Leu
530 535 540
Asp His Gly Arg Pro Leu Gly Asn Pro Glu Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr
545 550 555 560
Asn Asn Glu Gly Lys Pro Ala Glu Leu Lys Asp Arg Leu Asn Val Gly
565 570 575
Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Ala Phe Phe Arg Met Met Asp His Trp Leu
580 585 590
Ala Ala Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Phe Arg
595 600
<210> 8
<211> 541
<212> PRT
<213> Rhodococcus sp. Phi1
<400> 8
Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln
20 25 30
Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr
35 40 45
Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His
50 55 60
Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
85 90 95
Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
100 105 110
Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
165 170 175
Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
180 185 190
Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe
195 200 205
Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr
210 215 220
Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
245 250 255
Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu
260 265 270
Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Phe Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly
275 280 285
Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys
305 310 315 320
Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
325 330 335
Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp
355 360 365
Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp
370 375 380
Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
385 390 395 400
Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly
405 410 415
Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn
420 425 430
Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp
435 440 445
Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile
450 455 460
Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp
465 470 475 480
Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly
485 490 495
Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gly
500 505 510
Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr
515 520 525
Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala
530 535 540
<210> 9
<211> 537
<212> PRT
<213> Brachymonas petroleovorans
<400> 9
Met Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ala Ile His Phe Asp Ala Ile Val Val
1 5 10 15
Gly Ala Gly Phe Gly Gly Met Tyr Met Leu His Lys Leu Arg Asp Gln
20 25 30
Leu Gly Leu Lys Val Lys Val Phe Asp Thr Ala Gly Gly Ile Gly Gly
35 40 45
Thr Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr His Ser
50 55 60
His Val Tyr Gln Tyr Ser Phe Asp Glu Ala Met Leu Gln Glu Trp Thr
65 70 75 80
Trp Lys Asn Lys Tyr Leu Thr Gln Pro Glu Ile Leu Ala Tyr Leu Glu
85 90 95
Tyr Val Ala Asp Arg Leu Asp Leu Arg Pro Asp Ile Gln Leu Asn Thr
100 105 110
Thr Val Thr Ser Met His Phe Asn Glu Val His Asn Ile Trp Glu Val
115 120 125
Arg Thr Asp Arg Gly Gly Tyr Tyr Thr Ala Arg Phe Ile Val Thr Ala
130 135 140
Leu Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Trp Pro Asn Ile Pro Gly Arg Glu
145 150 155 160
Ser Phe Gln Gly Glu Met Tyr His Thr Ala Ala Trp Pro Lys Asp Val
165 170 175
Glu Leu Arg Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly
180 185 190
Val Gln Leu Ile Thr Ala Ile Ala Pro Glu Val Lys His Leu Thr Val
195 200 205
Phe Gln Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Thr Gly Asn Arg Pro Val
210 215 220
Ser Ala Gln Glu Ile Ala Glu Val Lys Arg Asn Phe Ser Lys Val Trp
225 230 235 240
Gln Gln Val Arg Glu Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr
245 250 255
Val Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Gln Arg Val Phe Gln
260 265 270
Glu Ala Trp Asn Gln Gly Asn Gly Phe Tyr Tyr Met Phe Gly Thr Phe
275 280 285
Cys Asp Ile Ala Thr Asp Pro Gln Ala Asn Glu Ala Ala Ala Thr Phe
290 295 300
Ile Arg Asn Lys Ile Ala Glu Ile Val Lys Asp Pro Glu Thr Ala Arg
305 310 315 320
Lys Leu Thr Pro Thr Asp Val Tyr Ala Arg Arg Pro Leu Cys Asp Ser
325 330 335
Gly Tyr Tyr Arg Thr Tyr Asn Arg Ser Asn Val Ser Leu Val Asp Val
340 345 350
Lys Ala Thr Pro Ile Ser Ala Met Thr Pro Arg Gly Ile Arg Thr Ala
355 360 365
Asp Gly Val Glu His Glu Leu Asp Met Leu Ile Leu Ala Thr Gly Tyr
370 375 380
Asp Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Asp Leu Arg Gly Arg Gly
385 390 395 400
Gly Gln Thr Ile Asn Glu His Trp Asn Asp Thr Pro Thr Ser Tyr Val
405 410 415
Gly Val Ser Thr Ala Asn Phe Pro Asn Met Phe Met Ile Leu Gly Pro
420 425 430
Asn Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Ala Gln Val Glu
435 440 445
Trp Ile Thr Asp Leu Val Ala His Met Arg Gln His Gly Leu Ala Thr
450 455 460
Ala Glu Pro Thr Arg Asp Ala Glu Asp Ala Trp Gly Arg Thr Cys Ala
465 470 475 480
Glu Ile Ala Glu Gln Thr Leu Phe Gly Gln Val Glu Ser Trp Ile Phe
485 490 495
Gly Ala Asn Ser Pro Gly Lys Lys His Thr Leu Met Phe Tyr Leu Ala
500 505 510
Gly Leu Gly Asn Tyr Arg Lys Gln Leu Ala Asp Val Ala Asn Ala Gln
515 520 525
Tyr Gln Gly Phe Ala Phe Gln Pro Leu
530 535
<210> 10
<211> 366
<212> PRT
<213> Thermoactinomyces intermedius ATCC33205
<400> 10
Met Arg Asp Val Phe Glu Met Met Asp Arg Tyr Gly His Glu Gln Val
1 5 10 15
Ile Phe Cys Arg His Pro Gln Thr Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala Leu
20 25 30
His Asn Thr Thr Ala Gly Pro Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met Ile Pro
35 40 45
Tyr Ala Ser Thr Asp Glu Ala Leu Glu Asp Val Leu Arg Leu Ser Lys
50 55 60
Gly Met Thr Tyr Lys Cys Ser Leu Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly
65 70 75 80
Lys Met Val Ile Ile Gly Asp Pro Lys Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu
85 90 95
Phe Arg Val Ile Gly Arg Phe Val Gly Gly Leu Asn Gly Arg Phe Tyr
100 105 110
Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr Asn Pro Glu Asp Phe Val His Ala Ala
115 120 125
Arg Glu Ser Lys Ser Phe Ala Gly Leu Pro Lys Ser Tyr Gly Gly Lys
130 135 140
Gly Asp Thr Ser Ile Pro Thr Ala Leu Gly Val Phe His Gly Met Arg
145 150 155 160
Ala Thr Ala Arg Phe Leu Trp Gly Thr Asp Gln Leu Lys Gly Arg Val
165 170 175
Val Ala Ile Gln Gly Val Gly Lys Val Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Val Glu Val Gly Ala Tyr Cys Lys Ile Ala Asp Ile Asp Ser Val
195 200 205
Arg Cys Glu Gln Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Lys Val Gln Leu Val
210 215 220
Asp Val Asn Arg Ile His Lys Glu Ser Cys Asp Ile Phe Ser Pro Cys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gly Val Val Asn Asp Asp Thr Ile Asp Glu Phe Arg Cys
245 250 255
Leu Ala Ile Val Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Val Glu Asp Arg His
260 265 270
Gly Ala Leu Leu Gln Lys Arg Ser Ile Cys Tyr Ala Pro Asp Tyr Leu
275 280 285
Val Asn Ala Gly Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Glu Gly Phe
290 295 300
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305 310 315 320
Leu Asp Ile Phe His Arg Ala Lys Asn Glu Asn Ile Thr Thr Cys Glu
325 330 335
Ala Ala Asp Arg Ile Val Met Glu Arg Leu Lys Lys Leu Thr Asp Ile
340 345 350
Arg Arg Ile Leu Leu Glu Asp Pro Arg Asn Ser Ala Arg Arg
355 360 365
<210> 11
<211> 301
<212> PRT
<213> Thermosyntropha lipolytica
<400> 11
Met Gly Glu Lys Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Ile Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Ala Leu Asp Ala Ile Lys Ala Ala Pro Asp Met Glu Leu Ala
20 25 30
Gly Val Val Arg Arg Ser Ser Ser Leu Gly Asp Lys Pro Ala Glu Leu
35 40 45
Ala Asp Val Pro Val Val Gly Ser Ile Lys Glu Leu Thr Gly Val Lys
50 55 60
Val Ala Leu Leu Cys Thr Pro Thr Arg Ser Val Pro Glu Tyr Ala Arg
65 70 75 80
Glu Ile Leu Ala Leu Gly Ile Asn Thr Val Asp Ser Tyr Asp Ile His
85 90 95
Gly Gln Leu Ala Asp Leu Arg Leu Glu Leu Asp Lys Val Ala Lys Glu
100 105 110
His Asn Ala Val Ala Val Ile Ser Ala Gly Trp Asp Pro Gly Thr Asp
115 120 125
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145 150 155 160
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Ala Leu Thr Ala Gln Ile Met Val Ala Ser Ala Arg Ala Ser Val Lys
260 265 270
Gln Lys Pro Gly Ala Tyr Thr Met Ile Gln Ile Pro Ile Ile Asp Tyr
275 280 285
Met Tyr Gly Asp Pro Asp Glu Ile Ile Arg Gln Leu Val
290 295 300

Claims (24)

1.一种酶固定化载体，其特征在于，所述酶固定化载体包含树脂球基体、通过化学键链接在所述树脂球基体上的-N(CH2COOH)2基团、以及通过配位作用螯合吸附在所述-N(CH2COOH)2基团上的金属离子；其中，所述树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂或环氧基型甲基丙烯酸树脂，所述树脂球基体的粒径为200~700μm；
所述氨基型甲基丙烯酸树脂具有C2长度或C6长度碳链手臂的氨基官能团，且氨基含量为30~80µmol/g；
所述环氧基型甲基丙烯酸树脂的环氧当量为2~5µmol/g。
2.根据权利要求1所述的酶固定化载体，其特征在于，所述氨基型甲基丙烯酸树脂为Seplite®LX-1000HA、Seplite®LX-1000EPN、Seplite®LX-EPHA、Seplite®LX-1000EA、Lifetech™ECR8309、Lifetech™ECR8409、ESR-1、ESR-3或ESQ-1中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的酶固定化载体，其特征在于，所述氨基型甲基丙烯酸树脂为Seplite®LX-1000HA、Seplite®LX-1000EPN、Seplite®LX-EPHA或Lifetech™ECR8309中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的酶固定化载体，其特征在于，所述环氧基型甲基丙烯酸树脂为Seplite®LX-1000EP、Seplite®LX-103B、EP200、Seplite®LX-107B、Seplite®LX-1000SW、Seplite®LX-1000SD、Seplite®LX-109s、Seplite®LX-1000HFA、Lifetech™ECR8285、Lifetech™ECR8204、Lifetech™ECR8209、ES-1、ES103、ES-101、ReliZyme™HFA403或ReliZyme™EC-HFA中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的酶固定化载体，其特征在于，所述环氧基型甲基丙烯酸树脂为Seplite®LX-1000EP、Seplite®LX-109s、Seplite®LX-1000HFA或ReliZyme™EC-HFA中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的酶固定化载体，其特征在于，所述金属离子为镍离子、铁离子、铜离子或钴离子。
7.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶包括权利要求1至6中任一项所述的酶固定化载体和固定在其上的酶。
8.根据权利要求7所述的固定化酶，其特征在于，所述酶选自转氨酶、酮还原酶、醇脱氢酶、甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、单加氧酶、烯还原酶、亚胺还原酶和氨基酸脱氢酶中的任意一种或多种；其中，
所述转氨酶为来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶，或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或者来源于Actinobacteria的转氨酶，或者来源于Sciscionella sp. SE31的转氨酶；
所述酮还原酶为来源于Acetobacter sp. CCTCC M209061的羰基还原酶，或者来源于Sporobolomyces salmonicolor的酮还原酶；
所述醇脱氢酶为来源于Thermoanaerobium brockii的醇脱氢酶；
所述甲酸脱氢酶为来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶；
所述葡萄糖脱氢酶为来源于Lysinibacillus sphaericus G10的葡萄糖脱氢酶；
所述单加氧酶为来源于Rhodococcus sp. Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶；
所述烯还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶，或者来源于Chryseobacterium sp. CA49的烯还原酶；
所述亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp.的亚胺还原酶，或者来源于Bacillus cereus的亚胺还原酶；
所述氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶，或者来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶，或者来源于Thermoactinomyces intermedius ATCC33205的氨基酸脱氢酶，或者来源于Thermosyntropha lipolytica的氨基酸脱氢酶。
9.一种权利要求1至6中任一项所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供树脂球基体；
在所述树脂球基体上通过化学键链接-N(CH2COOH)2基团；
在所述-N(CH2COOH)2基团上通过配位作用螯合吸附金属离子，得到所述酶固定化载体；
其中，所述树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂或环氧基型甲基丙烯酸树脂，所述树脂球基体的粒径为200~700μm；
所述树脂球基体为氨基型甲基丙烯酸树脂时，将所述氨基型甲基丙烯酸树脂和氯乙酸钠混合，进行亲核取代反应，以在所述氨基型甲基丙烯酸树脂上链接所述-N(CH2COOH)2基团。
10.根据权利要求9所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，将所述氨基型甲基丙烯酸树脂和所述氯乙酸钠的水溶液在20~25℃下搅拌30~60min后，用1~2mol/L的碱水溶液调节反应体系pH为9~10，然后升温至70~80℃，并在N2氛围下反应20~30h，以在所述氨基型甲基丙烯酸树脂上链接所述-N(CH2COOH)2基团。
11.根据权利要求10所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，所述碱水溶液为碳酸钠水溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化锂溶液。
12.根据权利要求9所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，所述树脂球基体为环氧基型甲基丙烯酸树脂时，将所述环氧基型甲基丙烯酸树脂和二乙酸亚胺二钠混合，进行加成反应，以在所述环氧基型甲基丙烯酸树脂上链接所述-N(CH2COOH)2基团。
13.根据权利要求12所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，将所述环氧基型甲基丙烯酸树脂和所述二乙酸亚胺二钠的水溶液在20~25℃下搅拌30~60min后，升温至60~70℃，并在N2氛围下反应18~24h，以在所述环氧基型甲基丙烯酸树脂上链接所述-N(CH2COOH)2基团。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，在所述树脂球基体上通过化学键链接所述-N(CH2COOH)2基团的步骤后，在反应体系中加入金属盐溶液，进行络合反应，以在所述-N(CH2COOH)2基团上通过配位作用螯合吸附所述金属离子，得到所述酶固定化载体。
15.根据权利要求14所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，所述络合反应过程中，反应温度为20~30℃，反应时间为1~4h。
16.根据权利要求14所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，所述金属盐溶液为氯化镍水溶液、硫酸铜水溶液、氯化亚铁水溶液或氯化钴水溶液。
17.根据权利要求14所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，所述金属盐溶液中金属离子和所述树脂球基体的质量比为（0.05~0.1）:1。
18.根据权利要求9所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，所述氯乙酸钠与所述氨基型甲基丙烯酸树脂球的质量比为（5~10）:1。
19.根据权利要求12所述的酶固定化载体的制备方法，其特征在于，所述二乙酸亚胺二钠与所述环氧基型甲基丙烯酸树脂球的质量比为（5~10）:1。
20.一种权利要求7所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1至6中任一项所述的酶固定化载体和酶进行固定化反应，得到所述固定化酶。
21.根据权利要求20所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述固定化酶的制备方法包括以下步骤：
将所述酶固定化载体分散于第一溶剂中形成分散液；其中，所述第一溶剂为磷酸缓冲液、氯化钠水溶液及咪唑缓冲液的混合溶液；
将所述分散液与含所述酶的酶液进行反应，以使所述酶与所述酶固定化载体进行所述固定化反应，得到所述固定化酶。
22.根据权利要求21所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述第一溶剂中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1~0.2mol/L；所述氯化钠水溶液的浓度为0.5~1mol/L；所述咪唑缓冲液的浓度为0.05~0.1mol/L。
23.根据权利要求21所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，所述分散液与所述酶液进行反应的过程中，反应温度为20~25℃，反应时间为16~24h。
24.根据权利要求21所述的固定化酶的制备方法，其特征在于，每克所述酶固定化载体与4~8mL的所述酶液进行反应，且所述酶液中的蛋白含量为20~25mg/mL。
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