CN111117995A

CN111117995A - 改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用

Info

Publication number: CN111117995A
Application number: CN202010038672.7A
Authority: CN
Inventors: 洪浩; 詹姆斯·盖吉; 肖毅; 罗杰斯卡·维亚撒·威廉姆斯; 崔瑜霞; 张娜; 赵佳东; 高妍妍
Original assignee: Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Current assignee: Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-05-08

Abstract

本发明公开了一种改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用。其中，该制备方法包括以下步骤：将环氧树脂进行改性，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰，然后加入待固定的酶和戊二醛进行固定得到改性环氧树脂固定化酶。应用本发明的技术方案，将环氧树脂进行改性，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰，并通过树脂中的醛基与聚乙烯亚胺中的氨基共价结合每种酶，然后通过双功能试剂戊二醛活化，通过这种方式，空间树脂臂增加，形成网状结构，通过共价结合可以更容易地结合酶，因为空间抑制减少，酶负荷也可以得到改善。

Description

改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，具体而言，涉及一种改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用。

背景技术

酶作为生物催化剂广泛用于不同的工业过程，与化学催化剂相比酶具有高活性、选择性强和特异性高的优点。酶能够在非常温和的反应条件下生成复杂的化合物，这就使得人们能够开发出更具可持续性的工艺，从而使得酶催化工艺成为新兴的平台。由于酶是生物来源的，所以它们通常具有与工业过程所需的操作特性不同的操作特征。

生物催化剂可以使用全活细胞、死细胞、粗酶或纯化酶来生产，这取决于酶的类型和应用。酶的可扩大生产和蛋白质工程的进步使得生物催化剂有可能实现商业化应用，并且具有较好的经济价值。

由于酶具有独特的工艺和成本优势，其被越来越多地应用于工业过程中，这也对酶的固定化形式提出了越来越高的要求。通常称为“生物催化剂”的固定化酶广泛用于工业有机合成和生物转化。

在生物技术过程中成功使用酶的最有用的策略之一是它们的固定化。适当的酶固定是提高酶性能的有力工具，例如对剧烈反应条件的抵抗(例如，远离其生理范围的pH和温度)，增强的酶活性、循环使用性能、连续使用性能，以及改善的底物特异性、对映体特异性或产物选择性。

新型固定化平台的出现使得固定化酶在连续流动生物催化中完美整合。新型高效酶的发现和进化、强调生物催化的新型反向合成方法、降低的重组蛋白成本和酶固定化策略等都是生物催化在连续合成中应用的良好基础。

基于酶的氨基酸侧链的官能团独特特征可以通过以下几种方式使其与载体进行固定：可逆键(如范德华力、疏水或离子键)和不可逆化学键(如共价连接)吸附在载体表面上(Sheldon等2013)。

共价连接使生物催化剂与载体不可逆结合，因此，可以防止酶泄漏并有效地提高酶的可回收性。在共价载体中，环氧活化载体几乎是理想的基质，可以在实验室和工业规模上非常容易地固定蛋白质(Hannibal-Friedrich et al 1980；Hernaiz et al 2000；Calleri et al 2004；Podgornik,H.et al 2002)。这些载体以激活形式存在。此外，这些载体即便悬浮在中性水性介质中在储存和运输过程中也非常稳定，其可以用于长期固定，允许酶完全覆盖支持表面。在非常温和的实验条件(例如pH 7.0)下环氧活化载体与蛋白质反应，可以促进蛋白质(仲胺，硫醚和醚)的非常小的化学修饰。

通常，可溶性蛋白质在中性pH值下几乎不与环氧基团反应。环氧树脂载体的这种低反应性导致酶在这些载体上的固定通过两步机制产生：首先，蛋白质快速温和的物理吸附在载体上；其次，吸附蛋白与邻近环氧基团之间发生共价反应[Wheatley et al 1999；Bauer-Arnaz et al 1998]。

由于这种机制，用于固定蛋白质的商业环氧树脂载体是相当疏水的，以便当它们以高离子强度(通过疏水相互作用)温育时吸附蛋白质。在一些情况下，使用疏水性载体可以促进蛋白质结构的错误折叠，该蛋白质结构由位于外层的内部疏水性氨基酸的异常结构的稳定化引起(Fitzpatrick PA et al 1993)。此外，通常使用高浓度盐可以使不同酶的活性丧失，尤其是亚基之间的通过离子力连接的多聚体酶的活性(Fernandez-Lafuente etal 2009)。尽管环氧树脂载体是非常重要的固定平台，但随着新酶的出现，特别是进化的多聚酶，需要在环氧树脂载体上进行整体改进和新的固定化过程。

Bolivar等(2007)评估了使用环氧树脂、氨基环氧树脂、乙二醛(环氧树脂)和用戊二醛处理吸附在胺化载体上的酶来固定来自博伊丁氏假丝酵母的甲酸脱氢酶的不同固定化策略。其中，使用氨基环氧树脂载体(与可溶性酶相比，12倍因子)和乙二醇基琼脂糖载体(150倍因子)显示出稳定性最佳。然而，两种情况下活性恢复仅略高于15％。

Truppo等人(2012)评估了使用三菱的几种聚合物基树脂(SEPABEADS)固定Januvia转氨酶(CDX0117，Codexis)，以便在有机溶剂中使用固定化酶。选择的树脂包括用于共价固定的三种环氧化物官能化载体(EC-EP，EC-HFA/S和EXE119)，和用于通过疏水相互作用固定的两种吸附载体(EXA252和EXE120)。尽管测试的许多载体显示出活性，但一种高度疏水的十八烷基官能化聚甲基丙烯酸酯树脂SEPABEAD EXE120(吸附载体)具有最高的比活性。在EXE120树脂上回收多达45％的固定化过程中加入的酶活性，导致树脂上转氨酶的加载量为4wt％(每1g固体载体转移酶40mg)。在固定化条件下，环氧树脂载体EC-EP显示出较差的酶结合和表达，这可能是由于环氧树脂载体使酶变性。

Hui Ren等(2016)报道了通过共价连接将来自古生物Archaeoglobus fulgidus的嗜热酯酶AFEST固定到环氧树脂载体Sepabeads EC-EP上，然后将固定化酶用作聚合反应(“-己内酯”)的生物催化剂。使用对硝基苯基辛酸盐作为底物，分别在80℃下测定固定化酶的酶负载量和回收活性为72mg/g和10.4U/mg。固定化酶具有良好的重复使用性，在15次间歇反应中单体转化率超过75％。

Ana I.Benitez-Mateos等(2018)报道了多孔载体通过与辅因子PLP结合而用于开发自给式固定化转氨酶。在这项工作中，来自Halomonas elongata的ω-转氨酶与PLP共同固定在涂有聚乙烯亚胺的多孔甲基丙烯酸酯基金属螯合载体上。填充床反应器在模型胺(α-甲基苄基胺)的对映选择性脱氨基中以1.45mL×min^-1连续运行至50个柱体积，在所有循环中产生>90％的转化率而无需外源添加辅因子。用来自紫色色杆菌和荧光假单胞菌的转氨酶进行类似的方法，其显示出相似的活性。然而，尽管这种方法似乎是积极的，但总体上最长的操作时间酶报告的稳定性是133分钟。

尽管目前已经有一些关于固定化酶的报道，表1中列出的酶的固定化酶报道很少，甚至没有。

表1

简称	酶	来源
			TA-Af	转氨酶	Aspergillus fumigatus
TA-Ac	转氨酶	Arthrobacter citreus
			TA-Cv	转氨酶	Chromobacterium violaceum DSM30191
KRED-Ac	酮还原酶	Acetobacter sp.CCTCC M209061
			KRED-Cm	酮还原酶	Candida macedoniensis.AKU4588
CHMO-Bp	环己酮单加氧酶	Brachymonas petroleovorans
			CHMO-Rr	环己酮单加氧酶	Rhodococcus ruber-SD1
CHMO-Rs	环己酮单加氧酶	Rhodococcus sp.Phi1
			ERED-Sc	烯还原酶	Saccharomyces cerevisiae
ERED-Chr	烯还原酶	ChrySEQbacterium sp.CA49
			NIT-An	腈水解酶	Aspergillus niger CBS 513.88
NIT-Nc	腈水解酶	Neurospora crassa OR74A
			IRED-Str	亚胺还原酶	Streptomyces sp.
IRED-Bc	亚胺还原酶	Bacillus cereus
			PAL-An	氨裂解酶	photorhabdus luminescens
PAL-Ss	氨裂解酶	Solenostemon scutellarioides
			AADH-Bc	氨基酸脱氢酶	Bacillus cereus
AADH-Bs	氨基酸脱氢酶	Bacillus sphaericus
			FDH	甲酸铵脱氢酶	Candida boidini

对于现有技术中报道的固定化酶的方法，不适于表1中的酶在工业上应用，需要进一步改进其稳定性。

发明内容

本发明旨在提供一种改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用，以提高酶的循环使用稳定性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种改性环氧树脂固定化酶的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将环氧树脂进行改性，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰，然后加入待固定的酶和戊二醛进行固定得到改性环氧树脂固定化酶。

进一步地，将环氧树脂进行改性包括采用高碘酸钠氧化环氧树脂或使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应。

进一步地，当将环氧树脂进行改性为采用高碘酸钠氧化环氧树脂时，在加入高碘酸钠前先用乙酸处理环氧树脂，在加入待固定的酶和戊二醛进行固定后还包括添加交联剂戊二醛或葡聚糖醛进行二次交联的步骤。

进一步地，当将环氧树脂进行改性为使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应时，在向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰后，还包括加入金属离子溶液进行处理的步骤，且待固定的酶具有his标签；优选地，金属离子溶液选自氯化钴、硫酸钴、氯化镍、硫酸铜、氯化亚铁、硫酸亚铁中的一种或多种；优选地，金属离子溶液的浓度为5～100mmol/L，优选为10～50mmol/L。

进一步地，待固定的酶和戊二醛的加入顺序依次为待固定的酶、戊二醛或戊二醛、待固定的酶。

进一步地，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰的步骤中还包括辅助因子的加入，辅助因子为NAD+、NADP+或PLP；优选的，聚乙烯亚胺以聚乙烯亚胺水溶液的形式参与反应，辅助因子在聚乙烯亚胺水溶液中的终浓度为1～10mg/mL，优选为3～6mg/mL；优选的，交联剂戊二醛或葡聚糖醛在使用之前还包括用PEG修饰交联剂的步骤，PEG修饰交联剂戊二醛或葡聚糖醛包括将交联剂用水溶解，再加入PEG，20～30℃搅拌1～6h，PEG选自PEG400～PEG2000,PEG与交联剂的质量比为1：1～10：1，进一步优选为2：1～4：1。

进一步地，乙酸处理环氧树脂中，采用的乙酸为乙酸溶液，乙酸溶液中乙酸的浓度为0.5～3M，优选为1～2M；乙酸溶液与环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为10～15：1；优选地，采用高碘酸钠氧化环氧树脂时所采用的高碘酸钠溶液中高碘酸钠的浓度为50～500mM，优选为100～200mM；高碘酸钠溶液与环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为5～15：1；优选地，聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa，聚乙烯亚胺水溶液的浓度为0.5％～3％，优选为1％～2％；聚乙烯亚胺水溶液的pH为6～11，进一步优选为7～10；优选地，交联剂戊二醛或葡聚糖醛的体积/质量终浓度为0.1％～3％，优选为0.3％～2％；优选地，酶与改性环氧树脂的质量比为0.05～0.3：1；优选地，使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应中亚氨基二乙酸采用的是亚氨基二乙酸水溶液，亚氨基二乙酸水溶液的浓度为0.5～3M，优选为1～2M，亚氨基二乙酸水溶液与环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为10～15：1；亚氨基二乙酸水溶液的pH为6.0～10.0，优选为7.0～9.0。

进一步地，乙酸与环氧树脂混合后的处理时间为6～24h，优选为10-15h；优选地，高碘酸钠溶液与环氧树脂混合后的反应时间为1～6h，优选为2～3h；优选地，聚乙烯亚胺水溶液与环氧树脂混合后的反应时间为1～20h，优选为3～6h；优选地，酶与改性环氧树脂混合后的反应时间为2～24h，优选为15～20h；优选地，加入交联剂后，反应时间为10～120min，优选为20～60min；优选地，亚氨基二乙酸水溶液与环氧树脂混合后的作用时间为0.5～6h，优选为1～2h；优选地，聚乙烯亚胺水溶液与载体混合后的作用时间为1～20h，进一步地，为3～6h；加入金属离子后，作用时间为1～6h，进一步地，为1～3h；酶液与载体混合后的作用时间为4～48h，进一步地，作用时间为15～20h。

进一步地，环氧树脂选自由

Lifetech^TMECR8285,ECR8204、ECR8209、

LX1000EA、LX1000EP、LX103B、EP200、LX1000HFA、HFA001、LX107S、LX1000SW、LX1000SD、

ES1、ES103、ES105、ES108和ES109组成的组中的一种或多种。

进一步地，待固定的酶为选自由来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶、来源于Aspergillus fumigatus的转氨酶、来源于Vibrio fluvialis strain JS17的转氨酶、来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶、来源于Candidamacedoniensis AKU4588的酮还原酶、来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶、来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶、源于Rhodococcus ruber-SD1的单加氧酶、来源于photorhabdus luminescens的氨裂解酶、来源于Solenostemonscutellarioides的氨裂解酶、来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶、来源于ChrySEQbacterium sp.CA49的烯还原酶、来源于Streptomyces sp或Bacillus cereus的亚胺还原酶、来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶、来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶、来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurosporacrassa OR74A的腈水解酶组成的组中的一种或多种；来源于Chromobacterium violaceumDSM30191的转氨酶为具SEQ ID NO：2序列或具有SEQ ID NO：3的突变体；来源于Arthrobacter citreus的转氨酶为具有SEQ ID NO：5序列或SEQ ID NO：6序列的突变体；来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶为具有SEQ ID NO：8序列或SEQ ID NO：9序列的突变体；来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEQ ID NO：11序列或SEQ ID NO：12序列的突变体；来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEQ ID NO：14序列或SEQ ID NO：15序列的突变体。

根据本发明的另一方面，提供了一种改性环氧树脂固定化酶。该固定化酶通过上述任一种制备方法制备得到。

根据本发明的再一方面，提供了一种改性环氧树脂固定化酶在水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系中的应用。

进一步地，水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系在填充床反应器或连续搅拌釜反应器中进行反应。

应用本发明的技术方案，将环氧树脂进行改性，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰，并通过树脂中的醛基与聚乙烯亚胺中的氨基共价结合每种酶，然后通过双功能试剂戊二醛活化，通过这种方式，空间树脂臂增加，形成网状结构，通过共价结合可以更容易地结合酶，因为空间抑制减少，酶负荷也可以得到改善。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

名词解释及缩写：

IDA：Iminodiacetic acid disodium salt hydrate,亚氨基二乙酸二钠盐水合物。

GA：Glutaraldehyde，戊二醛

PEI：polyethyleneimine，聚乙烯亚胺

PEG：polyethylene glycol，聚乙二醇

在大多数情况下，生物催化可以依赖于有效的生物催化剂。酶是多功能的生物催化剂，具有高立体选择性和区域选择性以及高周转率。然而，游离酶相对敏感且不稳定，并且它们不能被有效回收和再利用。为了克服这些限制并扩大其适用性，在使用前，游离酶通常通过固定作用与惰性不溶性物质连接。

环氧树脂已被用于固定脂肪酶、酰基转移酶等几种酶，该过程非常简单易操作，但酶应在固定前进行纯化，以获得好的恢复活性，但是即便如此恢复活性仍不如其他载体固定化方案甚至使用纯酶。针对此，本申请提出了下列技术方案。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种改性环氧树脂固定化酶的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将环氧树脂进行改性，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰，然后加入待固定的酶和戊二醛进行固定得到改性环氧树脂固定化酶。

在本发明一种典型的实施方式中，将环氧树脂进行改性包括采用高碘酸钠氧化环氧树脂或使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应，从而得到性能改善的环氧树脂。优选的，当将环氧树脂进行改性为采用高碘酸钠氧化环氧树脂时，在加入高碘酸钠前先用乙酸处理环氧树脂，在加入待固定的酶和戊二醛进行固定后还包括添加交联剂戊二醛或葡聚糖醛进行二次交联的步骤，从而使使固定更强。

在本申请中，修改了亚氨基二乙酸和金属对环氧树脂的改性。在环氧树脂与亚氨基二乙酸反应后，加入PEI并通过离子附着与树脂结合，然后用合适的金属处理。之后加入His标记的酶，然后进行戊二醛交联以使附着更强。PEI可以结合比亚氨基二乙酸更强的金属，也可以与戊二醛交联，从而使酶泄漏减少很多。根据本发明一种典型的实施方式，当将环氧树脂进行改性为使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应时，在向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰后，还包括加入金属离子溶液进行处理的步骤，且待固定的酶具有his标签；优选地，金属离子溶液选自氯化钴、硫酸钴、氯化镍、硫酸铜、氯化亚铁、硫酸亚铁中的一种或多种；优选地，金属离子溶液的浓度为5～100mmol/L，优选为10～50mmol/L。

优选的，待固定的酶和戊二醛的加入顺序依次为待固定的酶、戊二醛或戊二醛、待固定的酶。

根据本发明一种典型的实施方式，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰的步骤中还包括辅助因子的加入，辅助因子为NAD+、NADP+或PLP；优选的，聚乙烯亚胺以聚乙烯亚胺水溶液的形式参与反应，辅助因子在聚乙烯亚胺水溶液中的终浓度为1～10mg/mL，优选为3～6mg/mL；优选的，交联剂戊二醛或葡聚糖醛在使用之前还包括用PEG修饰交联剂的步骤，PEG修饰交联剂戊二醛或葡聚糖醛包括将交联剂用水溶解，再加入PEG，20～30℃搅拌1～6h，PEG选自PEG400～PEG2000，PEG与交联剂的质量比为1：1～10：1，重复使用性均较好，进一步优选为2：1～4：1。

根据本发明一种典型的实施方式，乙酸处理环氧树脂中，采用的乙酸为乙酸溶液，乙酸溶液中乙酸的浓度为0.5～3M，优选为1～2M；乙酸溶液与环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为10～15：1；优选地，采用高碘酸钠氧化环氧树脂时所采用的高碘酸钠溶液中高碘酸钠的浓度为50～500mM，优选为100～200mM；高碘酸钠溶液与环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为5～15：1；优选地，聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa，聚乙烯亚胺水溶液的浓度为0.5％～3％，优选为1％～2％；聚乙烯亚胺水溶液的pH为6～11，进一步优选为7～10；优选地，交联剂戊二醛或葡聚糖醛的体积/质量终浓度为0.1％～3％，优选为0.3％～2％；优选地，酶与改性环氧树脂的质量比为0.05～0.3：1；优选地，使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应中亚氨基二乙酸采用的是亚氨基二乙酸水溶液，亚氨基二乙酸水溶液的浓度为0.5～3M，优选为1～2M，亚氨基二乙酸水溶液与环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为10～15：1；亚氨基二乙酸水溶液的pH为6.0～10.0，优选为7.0～9.0时，稳定性最好。

根据本发明一种典型的实施方式，乙酸与环氧树脂混合后的处理时间为6～24h，优选为10-15h；优选地，高碘酸钠溶液与环氧树脂混合后的反应时间为1～6h，优选为2～3h；优选地，聚乙烯亚胺水溶液与环氧树脂混合后的反应时间为1～20h，优选为3～6h；优选地，酶与改性环氧树脂混合后的反应时间为2～24h，优选为15～20h；优选地，加入交联剂后，反应时间为10～120min，优选为20～60min；优选地，亚氨基二乙酸水溶液与环氧树脂混合后的作用时间为0.5～6h，优选为1～2h；优选地，聚乙烯亚胺水溶液与载体混合后的作用时间为1～20h，进一步地，为3～6h；加入金属离子后，作用时间为1～6h，进一步地，为1～3h；酶液与载体混合后的作用时间为4～48h，进一步地，作用时间为15～20h。

根据本发明一种典型的实施方式，环氧树脂选自由

Lifetech^TMECR8285,ECR8204、ECR8209、

ES1、ES103、ES105、ES108和ES109组成的组中的一种或多种。

根据本发明一种典型的实施方式，待固定的酶为选自由来源于Chromobacteriumviolaceum DSM30191的转氨酶、来源于Aspergillus fumigatus的转氨酶、来源于Vibriofluvialis strain JS17的转氨酶、来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶、来源于Candida macedoniensis AKU4588的酮还原酶、来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶、来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶、源于Rhodococcusruber-SD1的单加氧酶、来源于photorhabdus luminescens的氨裂解酶、来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶、来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶、来源于ChrySEQbacterium sp.CA49的烯还原酶、来源于Streptomyces sp或Bacilluscereus的亚胺还原酶、来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶、来源于Bacillussphaericus的苯丙氨酸脱氢酶、来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurospora crassa OR74A的腈水解酶组成的组中的一种或多种；来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶为具SEQ ID NO：2序列或具有SEQ ID NO：3的突变体；来源于Arthrobacter citreus的转氨酶为具有SEQ ID NO：5序列或SEQ ID NO：6序列的突变体；来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶为具有SEQ ID NO：8序列或SEQ ID NO：9序列的突变体；来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEQ ID NO：11序列或SEQ ID NO：12序列的突变体；来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEQ ID NO：14序列或SEQ ID NO：15序列的突变体。

上述酶所参与反应的化学过程简述如下：

上述反应式中的R，R₁和R₂可以各自独立的选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或R₁与其所连接的杂环形成稠环体系。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种改性环氧树脂固定化酶。该固定化酶通过上述任一种制备方法制备得到。

根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种改性环氧树脂固定化酶在水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系中的应用。优选的，水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系在填充床反应器或连续搅拌釜反应器中进行反应。

在本发明一典型的实施方式中，通过对环氧树脂(例如，表2所示的环氧树脂，Epoxy为环氧基)进行改性，进而提高环氧树脂固定化酶的可重复使用性。

表2

典型的，通过高碘酸钠氧化环氧树脂或亚氨基二乙酸改性环氧树脂来改变环氧树脂的性能。具体描述如下：

一、酶在高碘酸钠氧化环氧树脂上的固定化

用高碘酸钠氧化后，通过PEI(聚乙烯亚胺)或PEI和其他辅助因子的进一步修饰氧化环氧树脂，并通过树脂中的醛基与PEI中的氨基共价结合每种酶，然后通过双功能试剂戊二醛活化，通过这种方式，空间树脂臂增加，形成网状结构，通过共价结合可以更容易地结合酶，因为空间抑制减少，酶负荷也可以得到改善。为了使固定更强，可以添加额外的接头如戊二醛或葡聚糖醛用于二次交联。

酶也可以通过离子吸附结合在PEI改性氧化环氧树脂上，然后加入交联剂进行酶、PEI和树脂之间的交联，形成网状结构和强结合。

二、在亚氨基二乙酸改性环氧树脂上固定酶

之前有报道将His标记的酶固定在金属改性环氧树脂上，首先使环氧树脂与亚氨基二乙酸反应以转化载体表面上的部分环氧化物，然后用合适的金属离子溶液处理以在树脂上络合。然后添加带His标签的酶，His标签和金属之间的选择性相互作用允许快速络合，然后蛋白质表面上的亲核残基(Lys，Cys或Ser)与载体上未反应的环氧残基之间发生反应，完成共价链接。然后通过用EDTA溶液洗涤除去金属离子。为了确保不残留反应性环氧化物，最后用甘氨酸作为封端剂处理载体。酶可以特异性地结合到树脂上，但稳定性仍然不是很好，经过6个循环后，残留活性小于10％。金属和亚氨基二乙酸改性树脂的络合不够强，酶很容易泄漏。

在本申请中，修改了亚氨基二乙酸和金属对环氧树脂的改性。在环氧树脂与亚氨基二乙酸反应后，加入PEI并通过离子附着与树脂结合，然后用合适的金属处理。之后加入His标记的酶，然后进行戊二醛交联以使附着更强。PEI可以结合比亚氨基二乙酸更强的金属，也可以与戊二醛交联，从而使酶泄漏减少很多。

为了使该方案适用于没有His标签的酶，在PEI修饰后不使用金属，加入戊二醛，戊二醛与PEI形成共价结合并在环氧树脂表面上残留羟基残留物，然后加入酶共价连接结合。

在两种方法中，酶也可以在加入戊二醛之前加入，以与PEI之间的离子吸附及与金属离子的亲和吸附两种方式与载体结合，然后加入交联剂进行酶、PEI和树脂之间的交联，形成网状结构和强结合。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

以下实施例中用到的酶及其来源见下表3～8。

表3

表4

表5

表6

表7

表8

实施例1

酶在高碘酸钠氧化环氧树脂上的固定化

将5g环氧树脂ECR8285或LX1000EP分别加入到20mL 1M乙酸中，在室温下温和搅拌12小时，用20mL蒸馏水洗涤乙酸处理过的载体3次，将处理过的载体悬浮在20ml 50mM高碘酸钠中，在室温下温和搅拌2小时，过滤并用蒸馏水洗涤。

5g改性环氧树脂用0.1M磷酸缓冲液重悬，加入PEI，是终浓度为1％，调节pH至pH7.0，温和搅拌2小时后，加入50-100mM戊二醛，在室温下温和搅拌1-2小时。然后过滤载体树脂并用10ml水洗涤。将洗过的载体加入到酶溶液中(10ml酶，含有5mg/mL辅因子，溶在40mL 100mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)，在10-25℃搅拌4小时，冰箱中过夜。隔夜静置后，过滤酶，用0.1M PB缓冲液(pH 7.0)洗涤。任选地，在隔夜静置后，将过量的戊二醛(20-50mM)或葡聚糖醛(10-50mM)加入溶液中，在10-25℃下温和搅拌1小时，然后过滤并用0.1M PB缓冲液(pH 7.0)洗涤。

实施例2

酶在高碘酸钠氧化环氧树脂上的固定化

将5g环氧树脂珠加入到50mL 1M乙酸中，在室温下温和搅拌下12小时，用50mL蒸馏水洗涤乙酸处理过的载体3次，每次温和搅拌10分钟，将处理过的载体悬浮在100ml高碘酸钠中，在室温下温和搅拌2小时，过滤并用蒸馏水洗涤。

5g改性环氧树脂用0.1M磷酸缓冲液重悬，加入PEI，终浓度为1％，调节pH至pH7.0，温和搅拌2小时。然后过滤载体并用10ml水洗涤。将洗过的载体加入到酶溶液中(10ml酶，含有5mg/mL辅因子，溶在40mL 100mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)，在室温搅拌4小时，冰箱中过夜。隔夜静置后，将20-100mM戊二醛加入到溶液中，在10-25℃下温和搅拌1小时，然后过滤并用0.1M PB缓冲液(pH 7.0)洗涤。

实施例3

在亚氨基二乙酸改性环氧树脂上固定酶

将4g载体加入8mL载体修饰缓冲液(0.1M硼酸钠，1M亚氨基二乙酸，pH8.5)中，在室温下在中振荡2小时。2小时后，滤出载体以除去载体修饰缓冲液并用双蒸水洗涤，然后用磷酸盐缓冲液重悬，并加入PEI使PEI终浓度为1％，调节pH8.0-11.0，并温和混搅拌3小时。过滤载体并用30ml水洗涤3次，然后用20mL磷酸缓冲液重悬，并加入金属例子，使金属离子的浓度为10-30mM。金属例子选自CoCl₂或NiCl₂.6 H₂O或CuSO₄.5H₂O或FeCl₂或FeCl₂。

在室温下摇动2小时。将树脂再次用双蒸水冲洗并用0.1M PB缓冲液(pH 8.0)洗涤。再次用含有50mM戊二醛的缓冲液(0.1M PB pH＝8.0)重新悬浮(根据每种酶用辅因子预处理)，在室温下温和搅拌1小时。过滤并用0.1M PB pH＝7.0洗涤3次。

将预处理的树脂用16mL 0.1M PB pH＝7.0重悬，加入4-8mL酶溶液(50-100mg/mL蛋白质含量，辅因子3-10mg/mL)，轻轻搅拌持续30分钟，过夜，过滤。用20ml 0.05M PB缓冲液(pH 7.5，其中含有0.05M EDTA和0.5M NaCl)洗涤2次，每次温和搅拌10分钟。随后用20ml水洗涤3次，然后用0.1M PB缓冲液(pH7.5)洗涤。

实施例4

在亚氨基二乙酸改性环氧树脂上固定酶

将4g载体加入8mL载体修饰缓冲液(0.1M硼酸钠，1M亚氨基二乙酸，pH8.5)中，在室温下在中振荡2小时。2小时后，滤出载体以除去载体修饰缓冲液并用双蒸水洗涤，然后用磷酸盐缓冲液重悬，并加入PEI使PEI终浓度为1％，调节pH8.0-11.0，并在温和搅拌3小时。过滤载体并用30ml水洗涤3次，然后用20mL磷酸缓冲液重悬，并加入金属例子，使金属离子的浓度为10-30mM。金属例子选自CoCl₂或NiCl₂.6 H₂O或CuSO₄.5H₂O或FeCl₂或FeCl₂

在室温下摇动2小时。将树脂再次用双蒸水冲洗并用0.1M PB缓冲液(pH 8.0)洗涤。再次用16mL缓冲液(0.1M PB pH＝8.0)重新悬浮，加入4-8mL酶溶液(50-100mg/mL蛋白质含量，辅因子3-10mg/mL)，轻轻搅拌持续30分钟，过夜，过滤。用20ml 0.05M PB缓冲液(pH7.5，其中含有0.05M EDTA和0.5M NaCl)洗涤2次，每次温和搅拌10分钟。随后用20ml水洗涤3次，然后用0.1M PB缓冲液(pH7.5)洗涤。

实施例5

在亚氨基二乙酸改性环氧树脂上固定酶

将4g载体加入8mL载体修饰缓冲液(0.1M硼酸钠，1M亚氨基二乙酸，pH8.5)中，在室温下在中振荡2小时。2小时后，滤出载体以除去载体修饰缓冲液并用双蒸水洗涤，然后用磷酸盐缓冲液重悬，并加入PEI使PEI终浓度为1％，调节pH8.0-11.0)悬浮并在温和搅拌3小时。过滤载体并用30ml水洗涤3次，然后用20mL磷酸缓冲液重悬，并加入金属例子，使金属离子的浓度为10-30mM。金属例子选自CoCl₂或NiCl₂.6 H₂O或CuSO₄.5H₂O或FeCl₂或FeCl₂。

过滤载体并用30ml水洗涤3次，然后重悬于16mL PB缓冲液(0.1M pH＝8.0)，加入4-8mL酶溶液(50-100mg/mL蛋白质含量，辅因子3-10mg/mL)，轻轻搅拌持续30分钟，过夜，过滤。加入16mL 0.1M PB(pH＝8.0)、5mg/ml辅因子和50mM戊二醛，在室温下温和摇动30分钟。用20ml 0.05M PB缓冲液(pH 7.5，其中含有0.05M EDTA和0.5M NaCl)洗涤2次，每次温和搅拌10分钟。随后用20ml水洗涤3次，然后用0.1M PB缓冲液(pH7.5)洗涤。

实施例6

在亚氨基二乙酸改性环氧树脂上固定酶

将4g载体加入8mL载体修饰缓冲液(0.1M硼酸钠，1M亚氨基二乙酸，pH8.5)中，在室温下在中振荡2小时。2小时后，滤出载体以除去载体修饰缓冲液并用双蒸水洗涤，然后磷酸盐缓冲液重悬，并加入PEI使PEI终浓度为1％，调节(pH8.0-11.0)并在温和搅拌3小时。过滤载体并用30ml水洗涤3次，然后用20mL磷酸缓冲液重悬，并加入金属例子，使金属离子的浓度为10-30mM。金属例子选自CoCl₂或NiCl₂.6 H₂O或CuSO₄.5H₂O或FeCl₂或FeCl₂

过滤载体并用30ml水洗涤3次，将预处理的载体重悬于16mL PB缓冲液(0.1M pH＝8.0)，加入4-8mL酶溶液(50-100mg/mL蛋白质含量，辅因子3-10mg/mL)，轻轻搅拌持续30分钟，过夜，过滤。加入16mL 0.1M PB(pH＝8.0)、5mg/ml辅因子和50mM戊二醛，在室温下温和摇动30分钟。用20ml 0.05M PB缓冲液(pH 7.5，其中含有0.05M EDTA和0.5M NaCl)洗涤2次，每次温和搅拌10分钟。随后用20ml水洗涤3次，然后用0.1M PB缓冲液(pH7.5)洗涤。

或将预处理的树脂用16mL 0.1M PB pH＝7.0重悬，加入4-8mL酶溶液(50-100mg/mL蛋白质含量，辅因子3-10mg/mL)，轻轻搅拌持续30分钟，过夜，过滤。用20ml 0.05M PB缓冲液(pH 7.5，其中含有0.05M EDTA和0.5M NaCl)洗涤2次，每次温和搅拌10分钟。随后用20ml水洗涤3次，然后用0.1M PB缓冲液(pH7.5)洗涤。

实施例7

同实施例2，将戊二醛改为PEI修饰的戊二醛,PEG分子量6000Da，PEG与戊二醛的质量比为1：1。

实施例8

同实施例1，将戊二醛改为醛基化右旋糖酐。

实施例9

同实施例5，将戊二醛改为PEI修饰的戊二醛,PEG分子量6000Da，PEG与戊二醛的质量比为1：1。

实施例10

固定化转氨酶的转化和重复使用试验

在10mL的反应瓶中，加入0.3mL MeOH，溶解0.1g主原料1或主原料2，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，再加入5mg酶粉或由20mg酶粉制备的交联酶聚集体湿酶或交联酶聚集体冻干粉，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表9：

表9

IDA*-环氧载体经IDA和金属离子修饰后，亲和吸附结合酶

IDA¹-环氧载体经IDA修饰后，进一步用PEI和金属离子修饰，并在加酶前用交联剂修饰

IDA²-环氧载体经IDA修饰后，进一步用PEI和金属离子修饰，结合酶后再用交联剂交联

IDA³-环氧载体经IDA修饰后，进一步用PEI和金属离子修饰，并在加酶前用PEG处理的交联剂修饰

IDA⁴-环氧载体经IDA修饰后，进一步用PEI和金属离子修饰，结合酶后再用PEG处理的交联剂进一步交联

SP¹-环氧载体经高碘酸钠氧化，进一步用PEI修饰，并在加酶前用交联剂修饰

SP²-环氧载体经高碘酸钠氧化，用PEI修饰，再用戊二醛修饰，加酶后进一步用交联剂交联

SP³-环氧载体经高碘酸钠氧化，用PEI修饰，加酶后再进一步用交联剂交联

SP⁴-环氧载体经高碘酸钠氧化后，进一步用PEI和金属离子修饰，结合酶后再用PEG处理的交联剂进一步交联

实施例11

固定化酮还原酶的转化和重复使用试验

在10mL的反应瓶中，加入0.5mL异丙醇(IPA)，溶解0.1g主原料3或4，并加入0.5mL0.1M PB 7.0和1-10mg NAD+，再加入5mg酶粉或由10mg酶粉制备的固定化酶，在30℃搅拌16-20h。体系经GC检测转化率，反应数据如下表10：

表10

实施例12

固定化CHMOs的转化和重复使用试验

CHMO环氧载体固定化酶的活性通过利用以下底物5进行反应来检测

0.3mL的异丙醇装入10ml的反应瓶中，随后加入100mg的底物5，3mL含有5mg NADP+的0.1M PB(pH 8.0)，然后加入2mg醇脱氢酶ADH-Tb游离酶及20mg环己酮单加氧酶游离酶由50mg游离酶制备的固定化酶。在30℃下反应16-20小时，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经GC检测转化率，反应数据如下表11：

表11：

实施例13

固定化ERED的转化和重复使用试验

ERED环氧载体固定化酶的活性通过利用以下底物6进行反应来检测

3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应瓶中，随后通过加入100mg的底物6，接着加入10mg NAD(P)+，80mg甲酸铵，2mg FDH及10mg的ERED游离酶或30mg游离酶制备的固定化酶。在30℃下反应16-20小时，测试转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经GC检测转化率，反应数据如下表12：

表12：

实施例14

固定化NITs的转化和重复使用试验

NIT氨基载体固定化酶的活性通过利用以下底物7进行反应来检测

将2mL 0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应瓶中，并加入100mg上述底物9，然后加入含有20mg NIT游离酶或由30mg游离酶制备的固定化酶。在30℃下反应16小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。体系经GC检测转化率，反应数据如下表13：

表13

实施例15

固定化IRED的转化和重复使用试验，通过以下底物8进行检测。

将2mL 0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应球中，然后加入100mg底物8、10mg NAD⁺、60mg甲酸铵、10mg FDH和10mg IRED游离酶或由30mg游离酶制备的固定化酶。在30℃下反应20小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。

体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表14：

表14

实施例16

固定化PAL的转化和重复使用试验

固定化酶的活性和重复使用次数通过利用以下底物9进行反应来检测

将8mL 4M氨基甲酸铵水溶液(pH 9.0～9.5)加入10mL反应瓶中，并加入100mg上述底物9，然后加入10mg氨裂解酶游离酶或由40mg游离酶。在30℃下反应16-20小时后，检测转化率，每一轮反应结束后将固定化酶分离出来，下一轮反应中重复使用，考察重复使用次数。

体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表15：

表15

实施例17

固定化AADH的转化和重复使用试验

在10mL的反应瓶中，加入5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0-9.0)，溶解100mg主原料10、主原料11或主原料12，并加入108mg氯化铵，调节pH至pH7.5-8.0，然后加入10-50mg NAD⁺，150mg葡萄糖和5mgGDH，10mg AADH或由30mg游离酶制成的固定化AADH。在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表16：

表16

实施例18

固定化FDH的转化和重复使用试验

在10mL的反应瓶中，加入5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0-9.0)，溶解100mg主原料12，并加入108mg氯化铵，80mg铵盐，调节pH至pH7.5-8.0，然后加入10-50mg NAD⁺，100mgAADH-Bc游离酶和5mg FDH，或由10mg游离酶制成的固定化FDH。在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下表17：

表17

实施例19

转氨酶氨基载体固定化酶在填充床连续反应中的应用

实施例中转氨酶TA-Cv-V1固定化至载体ECR8285，经IDA¹的方式固定化，所得固定化酶填充至120mL柱体积的柱状反应器中，固定化酶用量72g。

500g底物1，用1.5L的甲醇溶解，并加入4eq的异丙胺盐酸盐(1.8L的6M异丙胺盐酸盐水溶液)和5g PLP，不加PB缓冲液(0.1M,pH8.0)定容至5L。

设置流速0.6mL/min，即保留时间200min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞98％，持续运行260h，转化率无降低，运行280h，转化率降低至90％。具体见表18。

表18：

实施例20

转氨酶固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用

使用同实施例1的固定化酶TA-Ac-V1，载体为LX1000HFA,经SP²的方式固定化。200mL反应器中加入50g转氨酶TA-Ac-V1的固定化酶，加入150mL磷酸缓冲液。

500g底物1，加入3.2L PB(0.1M,pH 7.0)，1.8L异丙胺盐酸盐水溶液(6M)和5gPLP，打浆制成混悬液。

以0.4mL/min的速度向反应瓶中连续添加底物混悬液(即保留时间500min)，同时以同样的流速在出口抽出反应体系(管道末端加过滤头，防止将固定化酶抽出)。在该条件下，转化率可达90％以上，且连续运行2000h，转化率基本无降低。结果如表19所示。

表19

实施例21

氨裂解酶PAL-Ss固定化酶，载体为HFA001，经IDA⁴的方式固定化。所得固定化酶6g填充至10mL柱状反应器。

500g底物9，用4.5L的氨基甲酸铵水溶液(4M,pH9.0～9.5)溶解。

设置流速0.03mL/min，即保留时间330min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率80％，持续运行300h，转化率无降低，运行310h，转化率降低至70％。见表20。

表20：

实施例22

实施例制备的酮还原酶KRED-Ac-V1固定化酶，载体为LX1000EP，经IDA⁴的方式固定化。所得固定化酶6g填充至10mL柱状反应器。。

100g底物3，用0.3L的异丙醇溶解，加入0.7LPB缓冲液(0.1M,pH7.0)溶解，然后加入0.1g NAD⁺。

设置流速0.05mL/min，即保留时间200min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞90％，持续运行200h，转化率无降低，运行210h，转化率降低至80％。见表21。

表21：KRED-Ac固定化酶在填充床连续反应中的反应结果

实施例23

高碘酸钠氧化环氧树脂固定化各参数调查

考察乙酸的浓度和用量，高碘酸钠的浓度和用量，以及交联剂的浓度

以实施例4的方法，将FDH固定至LX1000HFA载体上，亚氨基二乙酸(IDA)的浓度设为0.2～3mol/L，IDA溶液与载体的体积/质量比为2～25：1，金属例子的浓度设为5～100mmol/L，并考察交联剂右旋糖酐醛(DA)的范围。其中IDA浓度1-2mol/L最好，与载体的体积/质量比为10～20：1时最好；金属离子浓度为10～100mmol/L时活性均较好，考虑到成本，可使用10～50mmol/L的浓度；交联剂DA在0.5％～2％的范围内最好。具体参数及结果见表22。

表22：

考察乙酸浓度，乙酸溶液与载体的体积/质量比，高碘酸钠的浓度，高碘酸钠溶液与载体的体积/质量比，以及交联剂GA的浓度。

同实施例3的方法，将FDH固定至载体HFA，设置不同的乙酸浓度、乙酸溶液与载体的体积/质量比、高碘酸钠的浓度、高碘酸钠溶液与载体的体积/质量比、以及交联剂GA的浓度。结果显示，乙酸浓度最优为1-2mol/L；乙酸溶液与载体的体积/质量比最优为10～15：1；高碘酸钠浓度为0.1～0.2mol/L时最优，与载体的体积质量比为5～25时效果均较好，考虑到成本节约，可优选5～15：1；交联剂浓度为0.5％～2％时均较好。具体参数及结果见表23。

表23

考察PEI的用量

同实施例2(IDA4)和实施例5(SP3)的方法，将FDH固定化至载体ECR8285，选择不同分子量的PEI，并设置不同的PEI浓度，考察PEI的合适用量，并考察不同pH值对固定化酶的影响。结果显示，PEI分子量在3KDa到70KDa均有相近的效果，PEI最适浓度范围为1％～2％；pH6.0～10.0对固定化酶活性影响不大，pH在7～9时，稳定性最好。具体参数及结果见表24。

表24

考察PEG修饰交联剂的比例

同实施例7(SP4)及实施例9(IDA4)的方法，将FDH固定化至载体ECR8285上，考察PEG修饰戊二醛的方法中PEG的范围，及PEG与GA的比例。结果显示PEG200、PEG2000、PEG6000均能修饰戊二醛，PEG与GA的比例在1：1～10：1的范围内酶的重复使用性均较好，在2：1～4：1时最好。具体参数及结果见表25。

表25

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司

<120> 改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用

<130> PN113553KLY

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 459

<212> PRT

<213> Chromobacterium violaceum DSM30191

<400> 1

Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala

1 5 10 15

His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu

35 40 45

Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu

65 70 75 80

Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val

85 90 95

Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp

100 105 110

Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile

115 120 125

Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys

130 135 140

Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly

145 150 155 160

Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro

165 170 175

Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly

180 185 190

Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu

195 200 205

Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val

210 215 220

Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys

290 295 300

Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val

325 330 335

Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile

340 345 350

Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu

355 360 365

His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu

370 375 380

Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile

385 390 395 400

Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg

405 410 415

Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg

420 425 430

Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu

435 440 445

Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala

450 455

<210> 4

<211> 476

<212> PRT

<213> Arthrobacter citreus

<400> 4

Met Gly Leu Thr Val Gln Lys Ile Asn Trp Glu Gln Val Lys Glu Trp

1 5 10 15

Asp Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Phe Ser Thr Gln Asn Glu Tyr Gln

20 25 30

Pro Val Pro Ile Glu Ser Thr Glu Gly Asp Tyr Leu Ile Thr Pro Gly

35 40 45

Gly Thr Arg Leu Leu Asp Phe Phe Asn Gln Leu Cys Cys Val Asn Leu

50 55 60

Gly Gln Lys Asn Gln Lys Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asp

65 70 75 80

Arg Tyr Gly Phe Val Trp Asp Thr Tyr Ala Thr Asp Tyr Lys Ala Lys

85 90 95

Ala Ala Lys Ile Ile Ile Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Asp Trp Pro

100 105 110

Gly Lys Val Arg Phe Val Ser Thr Gly Ser Glu Ala Val Glu Thr Ala

115 120 125

Leu Asn Ile Ala Arg Leu Tyr Thr Asn Arg Pro Leu Val Val Thr Arg

130 135 140

Glu His Asp Tyr His Gly Trp Thr Gly Gly Ala Ala Thr Val Thr Arg

145 150 155 160

Leu Arg Ser Phe Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asn Ser Glu Ser Phe

165 170 175

Ser Ala Gln Ile Pro Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Val Leu Met Ala

180 185 190

Pro Ser Ser Asn Thr Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asn Tyr Leu Lys Asp

195 200 205

Glu Asn Gly Glu Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu

210 215 220

Asn Tyr Gly Pro Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln

225 230 235 240

Gly Val Gly Ser Thr Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Val Pro Gln Ile Arg

245 250 255

Lys Met Thr Lys Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Ser Asp Glu Val Leu

260 265 270

Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Lys Trp Phe Gly Tyr Gln His Tyr Gly

275 280 285

Val Gln Pro Asp Ile Ile Thr Met Gly Lys Gly Leu Ser Ser Ser Ser

290 295 300

Leu Pro Ala Gly Ala Val Val Val Ser Lys Glu Ile Ala Ala Phe Met

305 310 315 320

Asp Lys His Arg Trp Glu Ser Val Ser Thr Tyr Ala Gly His Pro Val

325 330 335

Ala Met Ala Ala Val Cys Ala Asn Leu Glu Val Met Met Glu Glu Asn

340 345 350

Leu Val Glu Gln Ala Lys Asn Ser Gly Glu Tyr Ile Arg Ser Lys Leu

355 360 365

Glu Leu Leu Gln Glu Lys His Lys Ser Ile Gly Asn Phe Asp Gly Tyr

370 375 380

Gly Leu Leu Trp Ile Val Asp Ile Val Asn Ala Lys Thr Lys Thr Pro

385 390 395 400

Tyr Val Lys Leu Asp Arg Asn Phe Arg His Gly Met Asn Pro Asn Gln

405 410 415

Ile Pro Thr Gln Ile Ile Met Glu Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Leu

420 425 430

Ile Gly Gly Ala Met Pro Asn Thr Met Arg Ile Gly Ala Ser Leu Asn

435 440 445

Val Ser Arg Gly Asp Ile Asp Lys Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr Ala

450 455 460

Leu Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Trp Gln Gln Ser

465 470 475

<210> 7

<211> 253

<212> PRT

<213> Acetobacter sp. CCTCC M209061

<400> 7

Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn

1 5 10 15

Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala

35 40 45

Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val

50 55 60

Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu

65 70 75 80

Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Asn Tyr Ser

85 90 95

Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser

100 105 110

Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala

115 120 125

Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Ser

130 135 140

Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Val Ala Ser Lys Gly

145 150 155 160

Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser

165 170 175

Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr

180 185 190

Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys

195 200 205

Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile

210 215 220

Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr

225 230 235 240

Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln

245 250

<210> 10

<211> 541

<212> PRT

<213> Rhodococcus sp. Phi1

<400> 10

Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly

1 5 10 15

Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln

20 25 30

Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr

35 40 45

Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His

50 55 60

Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp

65 70 75 80

Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser

85 90 95

Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu

100 105 110

Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser

115 120 125

Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val

130 135 140

Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr

145 150 155 160

Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn

165 170 175

Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln

180 185 190

Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe

195 200 205

Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr

210 215 220

Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp

225 230 235 240

Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu

245 250 255

Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu

260 265 270

Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Phe Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly

275 280 285

Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile

290 295 300

Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys

305 310 315 320

Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly

325 330 335

Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys

340 345 350

Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp

355 360 365

Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp

370 375 380

Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly

385 390 395 400

Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly

405 410 415

Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn

420 425 430

Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp

435 440 445

Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile

450 455 460

Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp

465 470 475 480

Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly

485 490 495

Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gly

500 505 510

Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr

515 520 525

Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala

530 535 540

<210> 13

<211> 603

<212> PRT

<213> Rhodococcus ruber-SD1

<400> 13

Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu

1 5 10 15

Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg

20 25 30

Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Met Pro Ile Thr

35 40 45

Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly

50 55 60

Gly Phe Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Arg Leu Arg Glu Ser Gly Val

65 70 75 80

Glu Ser Val Arg Ile Ile Asp Lys Ala Gly Asp Phe Gly Gly Val Trp

85 90 95

Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Met Cys Asp Thr Ala Ala Met Val

100 105 110

Tyr Met Pro Leu Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Met Pro Thr Glu Lys Tyr

115 120 125

Ala His Gly Pro Glu Ile Leu Glu His Cys Gln Arg Ile Gly Lys His

130 135 140

Tyr Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Leu Phe His Thr Glu Val Thr Asp Leu

145 150 155 160

Val Trp Gln Glu His Asp Gln Arg Trp Arg Ile Ser Thr Asn Arg Gly

165 170 175

Asp His Phe Thr Ala Gln Phe Val Gly Met Gly Thr Gly Pro Leu His

180 185 190

Val Ala Gln Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile Glu Ser Phe Arg Gly Lys

195 200 205

Ser Phe His Thr Ser Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Thr Gly Gly Asp Ala

210 215 220

Leu Gly Ala Pro Met Asp Lys Leu Ala Asp Lys Arg Val Ala Val Ile

225 230 235 240

Gly Thr Gly Ala Thr Ala Val Gln Cys Val Pro Glu Leu Ala Lys Tyr

245 250 255

Cys Arg Glu Leu Tyr Val Val Gln Arg Thr Pro Ser Ala Val Asp Glu

260 265 270

Arg Gly Asn His Pro Ile Asp Glu Lys Trp Phe Ala Gln Ile Ala Thr

275 280 285

Pro Gly Trp Gln Lys Arg Trp Leu Asp Ser Phe Thr Ala Ile Trp Asp

290 295 300

Gly Val Leu Thr Asp Pro Ser Glu Leu Ala Ile Glu His Glu Asp Leu

305 310 315 320

Val Gln Asp Gly Trp Thr Ala Leu Gly Gln Arg Met Arg Ala Ala Val

325 330 335

Gly Ser Val Pro Ile Glu Gln Tyr Ser Pro Glu Asn Val Gln Arg Ala

340 345 350

Leu Glu Glu Ala Asp Asp Glu Gln Met Glu Arg Ile Arg Ala Arg Val

355 360 365

Asp Glu Ile Val Thr Asp Pro Ala Thr Ala Ala Gln Leu Lys Ala Trp

370 375 380

Phe Arg Gln Met Cys Lys Arg Pro Cys Phe His Asp Asp Tyr Leu Pro

385 390 395 400

Ala Phe Asn Arg Pro Asn Thr His Leu Val Asp Thr Gly Gly Lys Gly

405 410 415

Val Glu Arg Ile Thr Glu Asn Gly Val Val Val Ala Gly Val Glu Tyr

420 425 430

Glu Val Asp Cys Ile Val Tyr Ala Ser Gly Phe Glu Phe Leu Gly Thr

435 440 445

Gly Tyr Thr Asp Arg Ala Gly Phe Asp Pro Thr Gly Arg Asp Gly Val

450 455 460

Lys Leu Ser Glu His Trp Ala Gln Gly Thr Arg Thr Leu His Gly Met

465 470 475 480

His Thr Tyr Gly Phe Pro Asn Leu Phe Val Leu Gln Leu Met Gln Gly

485 490 495

Ala Ala Leu Gly Ser Asn Ile Pro His Asn Phe Val Glu Ala Ala Arg

500 505 510

Val Val Ala Ala Ile Val Asp His Val Leu Ser Thr Gly Thr Ser Ser

515 520 525

Val Glu Thr Thr Lys Glu Ala Glu Gln Ala Trp Val Gln Leu Leu Leu

530 535 540

Asp His Gly Arg Pro Leu Gly Asn Pro Glu Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr

545 550 555 560

Asn Asn Glu Gly Lys Pro Ala Glu Leu Lys Asp Arg Leu Asn Val Gly

565 570 575

Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Ala Phe Phe Arg Met Met Asp His Trp Leu

580 585 590

Ala Ala Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Phe Arg

595 600

Claims

1.一种改性环氧树脂固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将环氧树脂进行改性，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰，然后加入待固定的酶和戊二醛进行固定得到所述改性环氧树脂固定化酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将环氧树脂进行改性包括采用高碘酸钠氧化环氧树脂或使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，当所述将环氧树脂进行改性为采用高碘酸钠氧化环氧树脂时，在加入高碘酸钠前先用乙酸处理所述环氧树脂，在加入待固定的酶和戊二醛进行固定后还包括添加交联剂戊二醛或葡聚糖醛进行二次交联的步骤。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，当所述将环氧树脂进行改性为使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应时，在向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰后，还包括加入金属离子溶液进行处理的步骤，且所述待固定的酶具有his标签；

优选地，所述金属离子溶液选自氯化钴、硫酸钴、氯化镍、硫酸铜、氯化亚铁、硫酸亚铁中的一种或多种；

优选地，所述金属离子溶液的浓度为5～100mmol/L，优选为10～50mmol/L。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述待固定的酶和戊二醛的加入顺序依次为所述待固定的酶、戊二醛或戊二醛、所述待固定的酶。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，向改性环氧树脂中加入聚乙烯亚胺进行进一步修饰的步骤中还包括辅助因子的加入，所述辅助因子为NAD+、NADP+或PLP；

优选的，所述聚乙烯亚胺以聚乙烯亚胺水溶液的形式参与反应，所述辅助因子在所述聚乙烯亚胺水溶液中的终浓度为1～10mg/mL，优选为3～6mg/mL；

优选的，所述交联剂戊二醛或葡聚糖醛在使用之前还包括用PEG修饰交联剂的步骤，所述PEG修饰所述交联剂戊二醛或葡聚糖醛包括将交联剂用水溶解，再加入PEG，20～30℃搅拌1～6h，PEG选自PEG400～PEG2000,PEG与交联剂的质量比为1：1～10：1，进一步优选为2：1～4：1。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸处理环氧树脂中，采用的乙酸为乙酸溶液，所述乙酸溶液中乙酸的浓度为0.5～3M，优选为1～2M；所述乙酸溶液与所述环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为10～15：1；

优选地，所述采用高碘酸钠氧化环氧树脂时所采用的高碘酸钠溶液中高碘酸钠的浓度为50～500mM，优选为100～200mM；所述高碘酸钠溶液与环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为5～15：1；

优选地，所述聚乙烯亚胺的分子量为3KDa～70KDa，所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为0.5％～3％，优选为1％～2％；所述聚乙烯亚胺水溶液的pH为6～11，进一步优选为7～10；

优选地，交联剂戊二醛或葡聚糖醛的体积/质量终浓度为0.1％～3％，优选为0.3％～2％；

优选地，酶与所述改性环氧树脂的质量比为0.05～0.3：1；

优选地，所述使用亚氨基二乙酸与环氧树脂进行反应中亚氨基二乙酸采用的是亚氨基二乙酸水溶液，所述亚氨基二乙酸水溶液的浓度为0.5～3M，优选为1～2M，所述亚氨基二乙酸水溶液与环氧树脂的体积质量比为5～20：1，优选为10～15：1；所述亚氨基二乙酸水溶液的pH为6.0～10.0，优选为7.0～9.0。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述乙酸与所述环氧树脂混合后的处理时间为6～24h，优选为10-15h；

优选地，所述高碘酸钠溶液与所述环氧树脂混合后的反应时间为1～6h，优选为2～3h；

优选地，所述聚乙烯亚胺水溶液与所述环氧树脂混合后的反应时间为1～20h，优选为3～6h；

优选地，所述酶与所述改性环氧树脂混合后的反应时间为2～24h，优选为15～20h；

优选地，加入交联剂后，反应时间为10～120min，优选为20～60min；

优选地，所述亚氨基二乙酸水溶液与所述环氧树脂混合后的作用时间为0.5～6h，优选为1～2h；

优选地，所述聚乙烯亚胺水溶液与载体混合后的作用时间为1～20h，进一步地，为3～6h；加入金属离子后，作用时间为1～6h，进一步地，为1～3h；酶液与载体混合后的作用时间为4～48h，进一步地，作用时间为15～20h。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环氧树脂选自由

Lifetech^TMECR8285,ECR8204、ECR8209、

ES1、ES103、ES105、ES108和ES109组成的组中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述待固定的酶为选自由来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶、来源于Aspergillus fumigatus的转氨酶、来源于Vibrio fluvialis strain JS17的转氨酶、来源于Acetobacter sp.CCTCCM209061的酮还原酶、来源于Candida macedoniensis AKU4588的酮还原酶、来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶、来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶、源于Rhodococcus ruber-SD1的单加氧酶、来源于photorhabdus luminescens的氨裂解酶、来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶、来源于Saccharomycescerevisiae的烯还原酶、来源于ChrySEQbacterium sp.CA49的烯还原酶、来源于Streptomyces sp或Bacillus cereus的亚胺还原酶、来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶、来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶、来源于Aspergillus niger CBS513.88的腈水解酶和来源于Neurospora crassa OR74A的腈水解酶组成的组中的一种或多种；

优选地，所述来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶为具SEQ ID NO：2序列或具有SEQ ID NO：3的突变体；所述来源于Arthrobacter citreus的转氨酶为具有SEQ ID NO：5序列或SEQ ID NO：6序列的突变体；所述来源于Acetobacter sp.CCTCCM209061的酮还原酶为具有SEQ ID NO：8序列或SEQ ID NO：9序列的突变体；所述来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEQ ID NO：11序列或SEQ ID NO：12序列的突变体；所述来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEQ ID NO：14序列或SEQ ID NO：15序列的突变体。

11.一种改性环氧树脂固定化酶，其特征在于，所述固定化酶通过如权利要求1至10中任一项所述的制备方法制备得到。

12.如权利要求11所述的改性环氧树脂固定化酶在水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系在填充床反应器或连续搅拌釜反应器中进行反应。