CN113355314A - 一种改性环氧树脂固定化酶及其制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改性环氧树脂固定化酶及其制备方法与用途，属于酶催化领域。本公开的方法为：向经预处理的环氧树脂中加入乙二胺进行改性，将改性环氧树脂经活化后加入待固定的酶进行固定，得到固定化酶，获得双功能团的环氧树脂，可以解决一种官能团固定效果差的现象，不仅提升了固定化酶的酶活，也可使固定效果更强，具有更好的重复使用性，还可以缩短固定化时间。本发明的制备方法操作简单，可操作性高，制备的固定化酶具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于酶催化领域，具体地涉及一种改性环氧树脂固定化酶及其制备方法与用途。
背景技术
肌醇(inositol)，又称环己六醇(cyclohexanhexol)，是一种水溶性六碳环维生素B族化合物。化学式与葡萄糖(C6H12O6)相同，但具有六碳环。几乎所有的细胞中都含有肌醇，以游离态或结合态的形式存在。肌醇也是一种水溶性维生素，是人和动物生长所必需的物质。广泛用于化妆品、饲料、食品和药物等行业。在化妆品行业，肌醇可以促进细胞生长和防止细胞衰老；在饲料行业中可以作为生物促进剂，可促进牲畜生长和防止死亡；在食品行业中，肌醇常作为营养强化剂，防止脂肪在人体内特别是心血管内沉积；在制药行业，它是一种广泛使用的掺假剂，与许多药物混合，如紫杉醇；此外，它还用于治疗中枢神经系统疾病如抑郁症、肝硬化、脂肪肝和糖尿病等疾病。目前，肌醇的生产主要是通过酸水解从糠和植物种子中提取的磷酸酯化肌醇衍生物(如肌醇六磷酸肌醇)得到的，但是，这种方法，需要一系列的纯化步骤，而且，利用无机酸在低pH、高温、高压下水解成肌醇和磷酸盐，会产生大量富磷废物。因此，这种生产方法原料成本高，污染严重，生产效率低，不适合规模化的绿色生产理念。
近年来，利用生物酶将淀粉转化为肌醇的体外多酶体系引起了广泛关注，这种多酶体系由四种酶(α-葡萄糖磷酸酶、葡萄糖磷酸变位酶、肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇单磷酸酶)组成。首先，α-葡萄糖磷酸酶将淀粉和磷酸盐生产葡萄糖-1-磷酸，然后，葡萄糖磷酸变位酶将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸，再经过肌醇-1-磷酸合成酶的作用，使葡萄糖-6-磷酸异构化为肌醇-1-磷酸。最后，经过肌醇单磷酸酶，将肌醇-1-磷酸脱磷酸化合成肌醇；转化过程中无需外加ATP或NAD+等辅酶。与传统的肌醇生产相比，这种体外多酶体系生产肌醇原料成本低、绿色环保，生产效率高，具有很强的竞争力。
虽然酶催化转化效率高、绿色环保，但是由于大多数游离酶价格昂贵、稳定性差、不能回收重复利用，使游离酶的使用成本居高不下。在利用游离多酶体系转化生产肌醇过程中，需要大量使用的关键限速酶肌醇-1-磷酸合成酶同样存在稳定性差、难以回收利用和使用成本高的问题，因此，如果能提高肌醇-1-磷酸合成酶的稳定性，使其能够回收重复使用将对于降低肌醇生产成本有重要现实意义。
固定化酶技术不仅能显著提高酶的稳定性，而且固定化酶与产物易分离，可以实现酶的回收循环利用以及反应的连续进行。不仅可以降低生产成本，而且能简化生产工艺。随着固定化酶技术的不断发展，固定化酶在工业上的应用越来越广泛。
环氧基树脂具有较好的稳定性和机械强度，可再生能力强等优点，而且可连接不同功能基团的侧链，适应于大多数酶分子的固定；因而在实际工业领域得到了广泛的应用。但是商业化的环氧基树脂通常只具有单一的功能团，与酶的作用力弱；导致酶的固定化效率、酶活回收率较低以及重复利用性差。
发明内容
本发明提出了一种改性环氧树脂固定化酶及其制备方法与用途。该方法操作简单、成本低、重复性好，所得固定化酶的酶活力高、稳定性和重复利用性好，可以很好的应用于肌醇工业化生产。
本发明公开了一种制备固定化酶的方法，步骤如下：
向经预处理的环氧树脂中加入乙二胺进行改性，得到改性环氧树脂，将所述改性环氧树脂经活化后加入酶进行固定，得到固定化酶。
优选地，所述经预处理的环氧树脂与所述乙二胺的水溶液质量体积比1:(2-7)。
优选地，所述乙二胺的水溶液浓度为1％-11％；调节所述乙二胺的水溶液pH至7.0-11.0。优选地，使用缓冲液调节所述乙二胺的水溶液pH。
优选地，所述经预处理的环氧树脂与所述乙二胺的反应时间为20min-420min。
优选地，所述酶为谷氨酸氧化酶或肌醇-1-磷酸合成酶中的一种。
优选地，所述环氧树脂选自环氧树脂1000EP、环氧树脂103B、环氧树脂107S中的一种或多种。
优选地，选择用交联剂进行所述活化；所述交联剂为戊二醛、己二胺、京尼平、顺丁稀二酸酐和双偶氮苯、异氰酸衍生物中的至少一种。
优选地，所述交联剂的质量浓度为0.1-1.0％。
优选地，所述改性环氧树脂与所述交联剂的质量体积比为1:(1-3)。
优选地，将所述酶与所述经活化的改性环氧树脂的质量比为1:(200-600)。
优选地，所述酶与所述经活化的改性环氧树脂混合后，共同加入到沉淀剂溶液中进行固定。优选地，所述固定时间为6-24h。优选地，所述沉淀剂溶液为饱和度硫酸铵、PEG6000、乙醇、或丙酮中的一种。
本发明公开了由所述方法制备获得的固定化酶。
本发明公开了由所述固定化酶在水性缓冲液体系中的用途。
附图说明
图1为本发明实施例1制备改性环氧树脂固定肌醇-1-磷酸合成酶的荧光显微镜外观图；
图2为本发明实验例1固定化肌醇-1-磷酸合成酶的酶活；
图3为本发明实验例3戊二醛的浓度对于固定化酶的影响；
图4为本发明实验例5环氧树脂与乙二胺的比例对固定化酶的影响；
图5为本发明实验例6固定化肌醇-1-磷酸合成酶的重复使用性；
图6为本发明实验例6固定化肌醇-1-磷酸合成酶pH耐受性；
图7为本发明实验例6固定化肌醇-1-磷酸合成酶用于生产肌醇的性能测试；
图8为本发明实验例6固定化肌醇-1-磷酸合成酶用于生产肌醇循环性能。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
本发明的第一个目的是提供一种制备固定化酶的方法，步骤如下：
向经预处理的环氧树脂中加入乙二胺进行改性，得到改性环氧树脂，将改性环氧树脂经活化后加入待固定的酶进行固定，得到固定化酶。
优选地，所述酶为谷氨酸氧化酶或肌醇-1-磷酸合成酶中的一种。
本发明中，通过添加乙二胺水溶液对环氧树脂进行修饰，通过乙二胺引入新的官能团使载体带有多种活性基团，这样可以解决由于单一官能团不能快速高效的固定酶分子的问题；同时也解决了酶不能与环氧基反应而导致的不能共价固定酶的问题。利用乙二胺的一个氨基与载体上环氧基发生开环反应，使载体携带改性环氧树脂双官能团。经过乙二胺修饰后，可以改善固定化酶微环境电荷状态，增加正负电荷的相互吸引作用，可以增加树脂的亲水性，降低疏水性，提高酶与载体的碰撞几率，缩短固定时间，提高固定效果。
I.制备改性环氧树脂
优选地，所述经预处理的环氧树脂与乙二胺水溶液质量体积比1:(2-7)。所述经预处理的环氧树脂与乙二胺水溶液质量体积比可以为1：(2-6)、1：(2-5)或1：(3-6)等；诸如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6或1:7。在一些实施方式中，所述经预处理的环氧树脂与乙二胺水溶液质量体积比1g：(2-7)mL。
环氧树脂与乙二胺水溶液质量体积比在上述范围内，可以进一步使得乙二胺更好的引入氨基。在上述体积质量比下，可以使树脂充分与乙二胺水溶液接触，保证每个载体分子都可以与乙二胺反应。在这个范围内树脂可以很好的悬浮在溶液中。
优选的，所述乙二胺水溶液浓度为1％-11％。在上述浓度的乙二胺水溶液中，可以进一步使引入氨基数目得到控制。优选地，所述乙二胺水溶液浓度为2％-11％。所述乙二胺水溶液浓度可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。
优选地，调节所述乙二胺水溶液pH至7.0-11.0。优选地，调节所述乙二胺水溶液pH至8.0-10.0。更优选地，调节所述乙二胺水溶液pH至9.0。
优选地，使用缓冲液调节所述乙二胺水溶液pH。
本发明中，乙二胺水溶液pH值调节至7.0-11.0，更加有利于环氧基开环反应，从而更加有效的使得乙二胺与环氧基树脂反应，形成改性环氧树脂。
优选地，所述经预处理的环氧树脂与乙二胺的反应时间为20min-420min。在一些实施方式中，经预处理的环氧树脂与乙二胺的反应时间可以为20min、60min、90min、120min、150min、180min、210min、240min、270min、300min、330min、360min、390min、或420min。更优选地，所述经预处理的环氧树脂与乙二胺的反应时间为20min-240min。更优选地，所述经预处理的环氧树脂与乙二胺的反应时间为20min-180min。
优选地，使用缓冲液将所述环氧树脂进行预处理，维持至中性环境。
优选地，用于所述环氧树脂的预处理的缓冲液和/或调节所述乙二胺水溶液的缓冲液为Tris-HCl、HEPEs、PB或PBS中的一种。
优选地，使用30-80mM Tris-HCl缓冲液对所述环氧树脂进行预处理。
本发明中，使用缓冲液预处理树脂目的是除去树脂中的乙醇，同时，将储存树脂中对固定化酶的可溶性杂质去除，并使树脂吸水溶胀，使官能团裸露出来处于可以与乙二胺酶可反应的状态。同时但本发明可以在温和缓冲液中实现氨基引入量的控制。更优选地，所述Tris-HCl缓冲液为30-80mM。
优选地，缓冲液的pH为6.0-11.0。优选地，缓冲液的pH为6.0-10.0。缓冲液的pH可以为6.0-10.0、7.0-10.0或7.0-10.0。在一些实施方式中，缓冲液的pH的调控可根据一种酶或者综合多种酶的最适pH的平均值来进行调控。
例如，在一些实施方式中，Tris-HCl缓冲液在30-80mM的范围下，可进一步更好的维持树脂溶液的pH值(系统环境pH为7.0-11.0的范围)，保证固定化载体的中性条件，有利于中性酶或者碱性酶的固定化。
更优选地，所述环氧树脂与所述Tris-HCl缓冲液的质量体积(m/v)比为1:(2-8)。环氧树脂与所述Tris-HCl缓冲液的质量体积比在上述范围内可以进一步更好地使载体得到活化去除乙醇和不溶物。在一些实施方式中，所述环氧树脂与所述Tris-HCl缓冲液的质量体积(m/v)比为1g：(2-8)mL。
优选地，所述环氧树脂与所述Tris-HCl缓冲液的质量体积(m/v)比为1:(3-5)。更优选地，所述环氧树脂与所述Tris-HCl缓冲液的质量体积(m/v)比为1:4。
更优选地，所述Tris-HCl缓冲液的pH为6.5-8.5。在该pH范围下可以进一步维持pH稳定，同时进一步保证酶，例如肌醇-1-磷酸合成酶和谷氨酸氧化酶的稳定。
更优选地，所述预处理的总时间为50-90min。在上述预处理时间范围内，可以进一步增进预处理效果，使其充分得到活化。
更优选地，所述预处理的总时间包括震荡时间和静置时间；所述预处理的震荡时间为10-20min；所述预处理的静置时间为40-70min。
II.制备活化的改性环氧树脂
优选地，选择用交联剂对所述改性环氧树进行活化。
优选地，所述交联剂为戊二醛、己二胺、京尼平、顺丁稀二酸酐和双偶氮苯、异氰酸衍生物中的至少一种。
更优选地，交联剂为戊二醛。
优选地，所述交联剂的质量浓度为0.1-1.0％。在该质量浓度的交联剂浓度可以提高酶活。使用交联剂活化可以使氨基通过醛基的方式与酶结合，同时改变固定化酶微环境拥挤的情况。
优选地，所述戊二醛的浓度为0.10％-0.75％。更优选地，所述戊二醛的浓度为0.10％-0.5％。更优选地，所述戊二醛的浓度为0.10％-0.5％。优选地，所述改性环氧树脂与交联剂的的质量体积比为1:(1-3)。
优选地，所述改性环氧树脂与戊二醛的的质量体积比为1:(1-3)。
在一些实施方式中，所述改性环氧树脂与戊二醛的的质量体积比1g:(1-3)mL。
III.酶的固定化
优选地，所述酶与经活化的改性环氧树脂的质量比为1:(200-600)。优选地，所述酶与经活化的改性环氧树脂的质量比为1:(200-500)。更优选地，所述酶与经活化的改性环氧树脂的质量比为1:(300-500)。环氧树脂的添加占比在该范围内可以进一步更好地确定最佳酶活回收率。
在一些实施方式中，所述酶与经活化的改性环氧树脂的质量比为1mg:(200-600mg)。在一些实施方式中，所述酶与经活化的改性环氧树脂的质量比为1mg:(300-500mg)。在一些实施方式中，所述酶与经活化的改性环氧树脂的质量比为1mg:(320-450mg)。
优选地，所述经活化的改性环氧树脂与酶混合后，共同加入到沉淀剂溶液中进行固定。
优选地，所述沉淀剂为饱和度硫酸铵、PEG6000、乙醇、或丙酮中的一种。
更优选地，所述沉淀剂溶液质量百分比为50-80％饱和度硫酸铵溶液、20-40％的PEG6000溶液、60-80％乙醇溶液或20-40％丙酮溶液中的一种。在一些实施方式中，所述沉淀剂为饱和度硫酸铵溶液，浓度可以为50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方式中，所述沉淀剂为PEG6000溶液，浓度可以为20％、25％、30％、35％、40％。在一些实施方式中，载体固定化酶的过程在沉淀剂中进行，目的是让绝大多数蛋白酶沉淀析出，更容易与载体上官能团反应，从而使载体携带更多的酶，表现更高的固定化酶活力。
优选地，所述经活化的改性环氧树脂与酶混合得到的固定化酶树脂与沉淀剂的质量体积比为0.2-0.6:1。更优选地，所述固定化酶树脂与沉淀剂的质量体积比为0.2-0.5:1。在一些实施方式中，固定化酶树脂与沉淀剂的质量体积比为200mg-600mg:1mL。
更优选地，所述固定时间为6-24h。固定化时间在该时间范围内可进一步提高酶活。
更优选地，所述固定时间为8-18h。
优选地，所述环氧树脂选自环氧树脂1000EP、环氧树脂103B、环氧树脂107S中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述制备固定化酶的方法，步骤如下：
(1)将经缓冲液预处理的环氧树脂与乙二胺水溶液按照质量体积比1：(2-6)混合，经振荡、抽滤、洗涤，得到改性环氧树脂；
(2)向所述改性环氧树脂中加入浓度为0.1％-1.0％的戊二醛，经抽滤，得到活化改性环氧树脂；
(3)将酶与所述活化改性环氧树脂按照质量比1:(100-600)混合，加入到70％饱和度硫酸铵溶液中搅拌固定6-36h，离心，洗涤，得到氨基环氧基树脂固定化酶。
在一些实施方式中，所述制备固定化酶的方法，步骤如下：
(1)使用50mM Tris-HCl缓冲液预处理环氧树脂，树脂和Tris-HCl缓冲液按照质量体积比1:(2-8)混合，放置旋转摇床上预处理15min；然后，静置抽滤洗涤；本申请采用50mMTris-HCl缓冲液(pH＝7.2)，可以保持树脂处于中性状态。
(2)制备浓度为1-10％的乙二胺水溶液，使用HCl调节pH至7.0-11.0，避光备用；
(3)将所述步骤(1)的预处理树脂和所述步骤(2)的乙二胺水溶液按照质量体积比1:(2-6)混合，室温下旋转摇床振荡1-4h，抽滤取滤渣；再经洗涤，得到乙二胺修饰的改性环氧树脂双官能团树脂；
(4)将所述步骤(3)双官能团树脂使用戊二醛活化，即戊二醛浓度0.1％-1.0％活化60min，经抽滤洗涤除去剩余的戊二醛水溶液；即得到活化双官能团树脂；
所述步骤(4)中，加入戊二醛活化载体，使载体上氨基与戊二醛作用。
(5)将酶和所述步骤(4)中得到的活化改性环氧双官能团树脂按照质量比1:(100-600)混合，加入到50％-80％饱和度硫酸铵溶液中搅拌固定6-36h，离心，洗涤，得到氨基环氧基树脂固定化酶。
本发明的第二个目的是提供由所述方法制备获得的固定化酶。
优选地，所述固定化酶为固定化谷氨酸氧化酶或固定化肌醇-1-磷酸合成酶中的一种。
本发明的第三个目的是提供所述固定化酶在水性缓冲液体系中的用途。
所述固定化酶在生产肌醇、α-酮戊二酸、氨或过氧化氢的至少一种。
与现有技术相比，本发明有如下优势：
因此，本发明以环氧基丙烯酸树脂(1000EP)为载体，利用乙二胺对其进行氨基化修饰，并用于固定闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus，Afu)肌醇-1-磷酸合成酶，与单功能团环氧树脂相比，双功能团环氧树脂固定的肌醇-1-磷酸合成酶的酶活和重复利用性得到显著提高，固定化酶的酶活高达87％，重复使用10次依旧保留86.4％的初始酶活。通过考察合成肌醇的循环使用性能发现，在循环利用16次后肌醇产量可以保持初始值的37％。
1、本发明首次提出了一种利用乙二胺修饰改性环氧基丙烯酸树脂，获得双功能团的环氧树脂。制备改性环氧基丙烯酰胺树脂，是通过乙二胺的一个氨基与活化的环氧基丙烯酰胺树脂的环氧基发生开环反应，乙二胺的另一个氨基处于游离状态，与树脂本身未参与反应的环氧基形成携带有氨基-环氧基的双官能团的丙烯酰胺树脂，经过修饰后环氧树脂就携带氨基与环氧基两种官能团。可以解决一种官能团固定效果差的现象，当酶与环氧基反应的官能团不足时，有氨基来补充；同理氨基也是。这不仅提升了固定化酶的酶活，也可使固定效果更强，具有更好的重复使用性，还可以缩短固定化时间。本发明的制备方法操作简单，可操作性高。
2、本发明首次利用改性环氧基丙烯酸树脂固定化酶，如肌醇-1-磷酸合成酶或者谷氨酸氧化酶，并且具有较高的酶活回收率。由于本方法的特殊性，引入的乙二胺和戊二醛可以增加载体臂，在载体表面形成网状结构，减少空间拥挤状况，一定程度上减少了底物传质阻力，使载体提高酶的负载能力，从而表现出固定化酶活力和稳定性的提高。
本发明固定酶，如肌醇-1-磷酸合成酶或者谷氨酸氧化酶，操作简单，生产成本低，稳定性良好，有利于工业化大规模使用。
3、首次利用改性环氧树脂固定化肌醇-1-磷酸合成酶生产肌醇，它具有很好的循环使用性；与传统的固定化酶相比，经过改性后的载体固定肌醇-1-磷酸合成酶，可显著提高重复使用次数，在循环利用10次后酶活依旧保持初始酶活的86.4％；表型出良好的重复使用性；通过考察固定化酶生产肌醇的循环使用性能发现，在循环利用16次后肌醇产量可以保持初始值的37％。有望成为解决体外酶催化生产肌醇高成本问题的方法。
4、本申请中，前期预处理树脂经过中性缓冲液活化即可，整个过程固定时间短，工艺操作简单，固定化成本低。
5、本申请减少了有机试剂(有毒试剂)和无机试剂(比如强氧化剂)的使用，环保，降低成本；并且通过乙二胺修饰可以控制氨基数目，从而避免过多氨基的引入使酶活回收率降低。
6、本申请通过添加乙二胺，可以在微环境下可以改变树脂电荷状态，通过增加吸附效果，提高酶活回收率。保留原有部分的环氧基，新引入部分氨基，形成了双官能团的载体。也可以在微环境下增加部分树脂臂，降低拥挤状态。
实施例
实施例1改性环氧树脂固定肌醇-1-磷酸合成酶的制备方法
按照如下步骤合成改性环氧树脂固定肌醇-1-磷酸合成酶：
取4g的环氧基树脂1000EP于50mL离心管中，加入15mL的50mMTris-HCl缓冲液搅拌15分钟，维持总体系环境的pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取1.0g活化后的环氧树脂1000EP于10mL不同离心管中，加入质量浓度为5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)6mL放置旋转摇床上反应2h使用milli-Q反复洗去未反应的乙二胺，采用抽滤洗涤；再加入2mL 0.25％戊二醛在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次，然后，称取400mg树脂放置于1mL、质量百分比70％的硫酸铵沉淀剂溶液(含有0.472g硫酸铵)中，再加入1mL终浓度为0.7mg/mL的IPS酶溶液，其中，酶溶液的溶剂为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应12h，使用50mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液洗涤3次可得到固定化酶。
酶活测定方法：在50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，30mM底物，5mM硫酸镁，IMP(足量)体系中进行的，在反应中最后加入底物，涡旋振荡混合均匀后放入70℃水浴锅开始计时反应10min，反应结束后；立即放入冰中降温终止反应，然后取出50μL样品，加入钼酸试剂(pH5.0)测的样品中的磷含量，操作在冰上进行。注：IPS与IMP在常温下几乎没有酶活，并且在pH 5.0钼酸试剂中IPS酶会失活。
向50μL的样品中加入500μL的钼酸试剂，然后加入125μL的抗坏血酸试剂。将溶液振荡混合好，在30℃孵化20min。采用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定)进行测定得到OD850nm，通过标准曲线换算得到酶活。
酶活回收率按照下式进行计算
测定结果为：在粗酶浓度为0.7mg/mL的合成条件下固定化酶的酶活回收率为86％。
在利用乙二胺修饰后的环氧基树脂在经过戊二醛活化，使官能团数目不发生减少，通过戊二醛的桥梁作用，减轻树脂表面微环境的固定化酶的拥挤程度；从而使载体携带更多酶，以至于实现较高的固定化酶活力。
由图1可以看出，为本发明实施例1制备改性环氧树脂固定肌醇-1-磷酸合成酶的荧光显微镜外观图，由图中可以看出载体表面携带有大量荧光物质，说明被荧光标记的酶成功的结合在载体上。需要说明的是，本发明实施例2-5制备的固定化酶同样获得了与实施例1相近的外观。
实施例2固定化肌醇-1-磷酸合成酶的制备方法
按照如下步骤合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶：
取5g的环氧基树脂1000EP于50mL离心管中，加入20mL的50mM Tris-HCl缓冲液搅拌15分钟，维持总体系环境的pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取1.0g活化后的环氧树脂1000EP于10mL不同离心管中，加入5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)6mL放置旋转摇床上反应2h使用milli-Q反复洗去未反应的乙二胺，采用抽滤洗涤；再加入2mL 0.25％戊二醛在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次，然后，称取400mg树脂放置于1mL、质量百分比70％的硫酸铵沉淀剂溶液(含有0.472g硫酸铵)中，再加入1mL终浓度为0.7mg/mL的IPS酶溶液，其中，酶溶液的溶剂为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应12h，使用50mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液洗涤3次可得到固定化酶。
酶活测定方法：同实施例1
测定结果为：在载体添加为400mg的条件下合成改性环氧树脂肌醇-1-磷酸合成酶的酶活回收率为87％。
实施例3固定化肌醇-1-磷酸合成酶的制备方法
按照如下步骤合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶：
取8g的环氧基树脂1000EP于50mL离心管中，加入32mL mL的50mM Tris-HCl缓冲液搅拌15分钟，维持pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取4.0g活化后的环氧树脂1000EP于50mL不同离心管中，加入5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)24mL放置旋转摇床上反应2h，使用milli-Q反复抽滤洗涤洗去未反应的乙二胺，再加入8mL 0.25％戊二醛在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次，然后，称取800mg改性环氧树脂放置于2mL、质量百分比70％的硫酸铵沉淀剂溶液(含有0.944g硫酸铵)中，再加入2mL终浓度为0.7mg/mL的IPS酶溶液，其中酶溶液的溶剂为50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应12h，使用50mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液洗涤3次可得到固定化酶。
酶活测定方法：同实施例1。
测定结果为：在载体添加为800mg的条件下合成改性环氧树脂肌醇-1-磷酸合成酶的酶活回收率为89％。
实施例4固定化肌醇-1-磷酸合成酶的制备方法
按照如下步骤合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶：
取8g的环氧基树脂1000EP于50mL离心管中，加入32mL的50mM Tris-HCl缓冲液搅拌15分钟，维持pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取3.0g活化后的环氧树脂1000EP于50mL不同离心管中，加入5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)18mL放置旋转摇床上反应2h，使用milli-Q反复抽滤洗涤洗去未反应的乙二胺，再加入6mL 0.5％戊二醛在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次，然后，称取600mg改性环氧树脂于放置于1.5mL、质量百分比70％的硫酸铵沉淀剂溶液(含有0.708g硫酸铵)中，再加入1.5mL终浓度为0.7mg/mL的IPS酶溶液，其中，酶溶液的溶剂为50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应12h，使用50mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液洗涤3次可得到固定化酶。
酶活测定方法：同实施例1。
测定结果为：在载体添加为600mg的条件下合成改性环氧树脂肌醇-1-磷酸合成酶的酶活回收率为86％。
实施例5固定化肌醇-1-磷酸合成酶的制备方法
按照如下步骤合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶：
取8g的环氧树脂103B于50mL离心管中，加入32mL的PBS缓冲液(pH＝7.2)搅拌15分钟，维持pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取4.0g活化后的环氧树脂环氧树脂103B于50mL不同离心管中，加入5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)18mL放置旋转摇床上反应2h，使用milli-Q反复抽滤洗涤洗去未反应的乙二胺，再加入6mL0.4％京尼平在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次，然后，称取600mg改性环氧树脂于放置于1.5mL、质量百分比75％的乙醇沉淀剂溶液(含有0.708g硫酸铵)中，再加入1.5mL终浓度为0.7mg/mL的IPS酶溶液，其中，酶溶液的溶剂为PBS缓冲液(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应12h，使用PBS缓冲液(pH＝7.2)洗涤3次可得到固定化酶。
酶活测定方法：同实施例1。
测定结果为：在载体添加为600mg的条件下合成改性环氧树脂肌醇-1-磷酸合成酶的酶活回收率为82％。
实施例6固定化谷氨酸氧化酶
按照如下步骤合成改性环氧树脂固定化谷氨酸氧化酶：
取4g的环氧基树脂1000EP于50mL离心管中，加入15mL的50mMTris-HCl缓冲液搅拌15分钟，维持总体系环境的pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取1.0g活化后的环氧树脂1000EP于10mL不同离心管中，加入5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)6mL放置旋转摇床上反应2h使用milli-Q反复洗去未反应的乙二胺，采用抽滤洗涤；再加入2mL0.25％戊二醛在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次，然后，称取400mg树脂放置于1mL、质量百分比70％的硫酸铵沉淀剂溶液(含有0.472g硫酸铵)中，再加入1mL终浓度为0.03mg/mL的谷氨酸氧化酶溶液，其中，酶溶液的溶剂为50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应12h，使用50mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液洗涤3次可得到固定化酶。
酶活回收率按照下式进行计算
测定结果为：在载体添加为400mg的条件下合成改性环氧树脂的酶活回收率为30％。
对比例1固定化谷氨酸氧化酶
改性环氧树脂固定化谷氨酸氧化酶的制备方法与实施例6相近，不同的步骤在于不添加乙二胺进行反应，并且不添加戊二醛活化，称取300mg树脂进行固定化，经测定，酶的回收率为6.4％。
实验例1在不同时间条件下固定化肌醇-1-磷酸合成酶的制备方法
为了说明在不同时间条件对固定肌醇-1-磷酸合成酶回收率的影响，将实验分为六组，其中每组的制备方法如下：
按照如下步骤合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶：
取8g的环氧基树脂1000EP于50mL离心管中，加入32mL的50mM Tris-HCl缓冲液搅拌15分钟，维持pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取4.0g活化后的环氧树脂1000EP于50mL不同离心管中，加入5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)24mL放置旋转摇床上反应2h，使用milli-Q反复抽滤洗涤洗去未反应的乙二胺，再加入8mL0.25％戊二醛在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次，然后，称取400mg改性环氧树脂放置于1mL、质量百分比70％的硫酸铵沉淀剂溶液(含有0.472g硫酸铵)中，再加入1mL终浓度为0.7mg/mL的IPS酶溶液，其中，酶溶液的溶剂为50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应。其中，六组实验中，对应的摇床反应时间分别为6h、12h、18h、24h、30h、36h，分别使用50mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液洗涤3次可得到固定化酶。
酶活测定方法：在50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，30mM底物，5mM硫酸镁,IMP(足量)体系中进行的，在反应中最后加入底物，涡旋振荡混合均匀后放入70℃水浴锅开始计时反应10min，反应结束后；立即放入冰中降温终止反应，然后取出50μL样品，加入钼酸试剂(pH5.0)测的样品中的磷含量，操作在冰上进行。注：IPS与IMP在常温下几乎没有酶活，并且在pH 5.0钼酸试剂中IPS酶会失活。
向50μL的样品中加入500μL的钼酸试剂，然后加入125μL的抗坏血酸试剂。将溶液振荡混合好，在30℃孵化20min。采用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定)进行测定得到OD850nm，通过标准曲线换算得到酶活。
酶活回收率按照下式进行计算
测定结果为：参照图2，在载体添加为400mg的条件下合成改性环氧树脂肌醇-1-磷酸合成酶的酶活回收率为70％，73％，87％，85％，83％，70％。
实验例2在不同载体添加量下固定化肌醇-1-磷酸合成酶及其酶活回收率
为了说明在不同载体添加量对固定肌醇-1-磷酸合成酶回收率的影响，将实验分为五组，其中每组的制备方法如下：
按照如下步骤合成固定化酶：
取4g的环氧基树脂1000EP于50mL离心管中，加入16mL的50mM Tris-HCl缓冲液搅拌15分钟，维持pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取3.5g活化后的环氧树脂1000EP于50mL不同离心管中，加入5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)21mL放置旋转摇床上反应2h，使用milli-Q反复抽滤洗涤洗去未反应的乙二胺，再加入7mL0.5％戊二醛在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次。然后，在每组中，分别称取100，200，300，400，500mg改性树脂分别置于1mL、质量百分比70％的硫酸铵沉淀剂溶液(含有0.472g硫酸铵)中，在再每组中分别加入1mL终浓度为0.7mg/mL的IPS酶溶液，其中，酶溶液的溶剂为50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应12h，使用50mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液洗涤3次可得到固定化酶。
酶活测定方法：在50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，30mM底物，5mM硫酸镁，IMP(足量)体系中进行的，在反应中最后加入底物，涡旋振荡混合均匀后放入70℃水浴锅开始计时反应10min，反应结束后；立即放入冰中降温终止反应，然后取出50μL样品，加入钼酸试剂(pH5.0)测的样品中的磷含量，操作在冰上进行。注：IPS与IMP在常温下几乎没有酶活，并且在pH 5.0钼酸试剂中IPS酶会失活。
向50μL的样品中加入500μL的钼酸试剂，然后加入125μL的抗坏血酸试剂。将溶液振荡混合好，在30℃孵化20min。采用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定)进行测定得到OD850nm，通过标准曲线换算得到酶活。
酶活回收率按照下式进行计算
测定结果为：在载体添加为12h的条件下合成改性环氧树脂肌醇-1-磷酸合成酶的酶活回收率(对应100mg、200mg、300mg、400mg、500mg改性树脂)分别为25％，54％，76％，85％，72％。
实验例3在不同浓度的戊二醛活化载体下合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶及其酶活回收率
为了说明在不同载体添加量对固定肌醇-1-磷酸合成酶回收率的影响，将实验分为五组，其中每组的制备方法如下：
按照如下步骤合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶：
取4g的环氧基树脂1000EP于50mL离心管中，加入16mL的50mM Tris-HCl缓冲液搅拌15分钟，维持pH＝7.2，1小时后抽滤，使用去离子水洗涤载体。
称取3.5g活化后的环氧树脂1000EP于50mL不同离心管中，加入5％乙二胺水溶液(pH＝9.0)21mL放置旋转摇床上反应2h，使用milli-Q反复抽滤洗涤洗去未反应的乙二胺，每个实验组再分别对应加入不同的终浓度戊二醛，在摇床上活化1h，利用缓冲液洗涤3次，然后，分别称取400mg改性树脂加入1mL到含有0.472g硫酸铵5mL离心管中，再加入1mL终浓度为0.7mg/mL的IPS酶溶液，其中，酶溶液的溶剂为50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，放置旋转摇床反应12h，使用50mM Tris-HCl(pH＝7.2)缓冲液洗涤3次可得到固定化酶。
五组实验中在上述制备方法中，唯一不同的是戊二醛的终浓度分别对应为0.1，0.25，0.5，0.75，1.0％在摇床上活化1h。
酶活测定方法：在50mM Tris-HCl(pH＝7.2)，30mM底物，5mM硫酸镁,IMP(足量)体系中进行的，在反应中最后加入底物，涡旋振荡混合均匀后放入70℃水浴锅开始计时反应10min，反应结束后；立即放入冰中降温终止反应，然后取出50μL样品，加入钼酸试剂(pH5.0)测的样品中的磷含量，操作在冰上进行。注：IPS与IMP在常温下几乎没有酶活，并且在pH 5.0钼酸试剂中IPS酶会失活。
向50μL的样品中加入500μL的钼酸试剂，然后加入125μL的抗坏血酸试剂。将溶液振荡混合好，在30℃孵化20min。采用紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司生产的UV-5100紫外分光光度计进行酶活测定)进行测定得到OD850nm，通过标准曲线换算得到酶活。
酶活回收率按照下式进行计算
测定结果为：参照附图3，在载体添加为400mg的条件下合成改性环氧树脂肌醇-1-磷酸合成酶的酶活回收率(对应戊二醛浓度0.1，0.25，0.5，0.75，1.0％)分别为82％，85.9％，79％，62％，59％。
此酶在高浓度的戊二醛处理下，酶活损失较大，需要降低戊二醛的浓度次可以进一步提高酶活回收率。并且通过乙二胺修饰在使用戊二醛活化时，戊二醛浓度也不易过高。
实验例4乙二胺的反应时间对于合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶及其酶活回收率的影响
(一)实验步骤
将实验分为八组，实验方法与实施例1的实验步骤相近，不同之处在于，
加入戊二醛的浓度为0.5％，之后称取300mg树脂放置于硫酸铵沉淀剂溶液中，再加入IPS酶溶液后，放置旋转摇床反应24h。
此外，实验组设置为：加入乙二胺水溶液后放置旋转摇床上分别反应20min、40min、60min、120min、180min、300min、420min；以及空白对照组：不添加乙二胺，不使用milli-Q进行冲洗和抽滤洗涤；不添加戊二醛，其他操作方式与本实验例实验步骤一致。
待八组的制备固定化酶完成后，测定各固定化酶中氨基量。
(二)测试方法
(a)氨基量的测定方法步骤如下：
分别从每组中的实施例4修饰好的载体中，准确称取10mg修饰后的1000EP放于10mL离心管中，利用耦合液(冰醋酸：无水甲醇为0.8:100(v/v))重复洗涤3次后，加入2mL对硝基苯甲醛溶液(0.5μmol/L)在旋转摇床(40rpm/min)上充分反应3h，完成后，使用耦合液洗去残留的对硝基苯甲醛。再加入2mL水解液(水：甲醇：冰醋酸为75:75:0.2(v/v/v))，在旋转摇床(40rpm/min)上反应4h，取上清液，使用耦合液稀释10倍，于OD267nm下测定吸光值。配制不同浓度的对硝基苯甲醛建立标准曲线，根据标准曲线计算待测样品氨基数目。其原理为：除去载体上杂质，加入对硝基苯甲醛(一种试剂)使与氨基结合，然后再通过水解液洗脱对硝基苯甲醛，最后检测对硝基苯甲醛量可以计算氨基量。
(b)酶活的测定，方法同实施例1
(三)测定结果
详见下表1.
表1乙二胺反应时间对于酶活的影响
此外，空白对照中，酶活回收率为72.5％。
由表1树脂与乙二胺反应为120min时，进一步研究酶活回收率，在控制树脂与乙二胺反应为120min，同时调整戊二醛为0.25％，载体为400mg，固定化时间为12h的下，其他固定化酶的步骤与上述实验例4的实验步骤相同时，酶活回收率为87％。其中戊二醛的引入仅作为乙二胺的固定效果辅助作用而已，而乙二胺的加入以及树脂与乙二胺的反应时间对于酶活回收率的影响和氨基量有着显著的作用。
在对照组中，在不添加氨基的情况下，酶活回收率最高(即选择不同的酶活固定时间下比较，酶活回收率最高的的固定化时间为24h)为72.5％，但是是在总计固定化时间为24h时，才能能到最高酶活回收率，其他固定化时间，酶活回收率均较低。而加入乙二胺的实验继续对其进行固定化，酶活回收率最高为87％，且固定化时间仅为12h。
由表1的氨基量可以看出，随着反应时间的延长载体的氨基密度不断提高，氨基修饰密度随着时间出现这种增长模式的原因主要是由于在反应初期，载体表面存在的环氧基团密度较高，大量的环氧基团与EDA发生开环反应，导致氨基的修饰密度随着时间的增加而迅速增加。随着反应的进行，大多数环氧基团完成与EDA的反应，从而树脂的氨基密度趋于稳定。
酶活随着氨基修饰密度的增加呈现先上升后下降的趋势，这可能是由于氨基的修饰密度与环氧基的密度达到最适比例，经过戊二醛活化的载体可以更加充分的与酶结合，从而提高酶活。当氨基修饰密度过高，就导致活化后的载体有更多的醛基，就有较强的作用引起酶分子的变性，最终导致酶活降低。因此，通过限制乙二胺的修饰时间，可以保证得到较高酶活的固定化酶。
由表可以看出，氨基多，酶活回收率反而下降。基于此结论，为了再次验证该氨基量对于酶活的影响，发明人还进行了额外的对照实验，即通过使用氨基树脂1000HA固定肌醇-1-磷酸合成酶，酶活回收率最高仅为42.5％(说明书未示出实施例)，也进一步验证了氨基多对于酶活回收率的影响。现有技术中并未有公开说明此酶与氨基量的关系，可以如何影响酶的固定化。而本发明首次发现并不是氨基越多就会适合酶的固定。本发明首次确定了，在特定氨基引入量中，实现了酶的有效固定化。
实验例5环氧树脂和乙二胺的比例对于合成固定化肌醇-1-磷酸合成酶及其酶活的影响
为了说明环氧树脂和乙二胺的不同比例对固定肌醇-1-磷酸合成酶回收率的影响，将实验分为六组，其中每组的制备方法同实施例1，唯一不同的是，每组对应的乙二胺浓度分别为：1％、3％、5％、7％、9％、11％。
相对酶活的测试方法为：以最高酶活为100％，其它组的酶活与最高酶活比为相对酶活。
由图4得到，固定化肌醇-1-磷酸合成酶的相对酶活(对应的乙二胺浓度分别为：1％、3％、5％、7％、9％、11％)分别为81.0％、97.6％、100％、98.3％、95.9％、95.5％。
本发明发现并不是一味添加氨基即可实现酶的固定化。本发明发现，环氧基在中性酶溶液中与酶分子的活性基团反应较慢，短时间不能完全使酶固定，而本发明发现由于肌醇-1-磷酸合成酶分子的活性中心存在较多氨基，如果载体上太多氨基，再通过戊二醛活化与酶反应，这样会使部分对戊二醛敏感的酶出现造成酶活损失，太少又不能很好地起到固定效果。使酶分子在温和的条件下顺利进行固定，故需要把控引入氨基量。
因此，为了缩短固定化时间，提高固定效果，提高酶活，故需要把控氨基与环氧基的比例(即通过控制乙二胺反应的时间和乙二胺的添加量)，并不是引入的氨基越多酶活就越高。正是通过本申请乙二胺的方式引入氨基数目可以很好的得到把控。
实验例6固定化酶的性能测试
(一)重复利用性
实验方法：取实验例3中，戊二醛为0.25％组制备的固定化酶120mg于5mL离心管中，加入体积为500μL浓度为60mM的6-磷酸葡萄糖二钠(pH＝7.2)，100μL浓度为50mM硫酸镁和足量的IMP，最后使用缓冲液补足1mL体系；在70℃的磁力搅拌水浴锅中搅拌反应10min，自然沉降得固定化酶，取上清测的生成磷酸根量，固定化酶用2mL(50mmol/L pH 7.2)的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，沉降得到的固定化酶，弃上清，加入新的6-磷酸葡萄糖二钠，硫酸镁和IMP，进行第二轮反应，依次进行催化；测每次固定化酶和洗涤液上清含磷量，进而检测固定化酶的剩余酶活。酶活测定结果参照附图5，本发明制备的固定肌醇-1-磷酸合成酶，可实现很好的循环使用次数，其可在重复使用10次后酶活损失不到15％；这是因为酶被牢固的共价键结合到载体上，从而导致循环使用酶活损失较小，表现出良好的重复使用性。
表2固定化酶的重复利用性
需要说明的是本发明实施例1-5制备的固定化肌醇-1-磷酸合成酶在重复利用性上具有与实施例7相近的技术效果。
(二)pH耐受性
实验方法：将实验例3中，戊二醛为0.25％组制备的固定化酶和游离酶，在初始酶活均为相同条件下(初始酶活的总酶活均为0.019U，且初始酶活体系酶活均为0.63U/ml)，分别置于pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的50mM Tris-HCl缓冲液中孵育2h，按照实验方法测定固定化酶和游离酶的酶活，将最高酶活定义为100％，其余酶活比上最高酶活，为在不同pH值下的耐受性。酶活测定结果参照附图6，游离酶在pH值为6-7时酶活出现急剧下降，而固定化酶的酶活在pH值为6-7相对酶活75％和97％；固定化酶较游离酶表现出较好的耐酸性。
表3固定化酶的pH耐受性
需要说明的是本发明实施例1-5制备的固定化肌醇-1-磷酸合成酶在pH耐受性上与表3具有相近的技术效果。
(三)固定化酶用于肌醇生产
实验方法：按照实验例3中，戊二醛为0.25％组制备固定化酶应用于肌醇生产。75mg固定化酶(湿固定化酶)于10mL离心管中，再向离心管中加入体积为1mL浓度为1.5-5.5g/L的6-磷酸葡萄糖二钠(pH＝7.2)，200μL浓度为50mM硫酸镁溶液和足量的IMP；在70℃的磁力搅拌水浴锅中搅拌反应2h，6h，10h，14h，18h，22h，26h，30h，34h，38h；然后4000rpm离心5min，取上清于1mL离心管，保存于-20℃；通过HPLC检测肌醇产量。肌醇检测结果参照图附图7，固定化酶催化底物生产肌醇反应22小时基本趋于平缓产量为1.54g/L。
表4固定化酶用于肌醇生产
需要说明的是本发明实施例1-5制备的固定化肌醇-1-磷酸合成酶在用于肌醇生产上与表4具有相近的技术效果。
(四)固定化肌醇-1-磷酸合成酶生产肌醇的循环性能
实验方法：按实验例3中，戊二醛为0.25％组制备固定化酶应用于生产肌醇。75mg固定化酶(湿固定化酶)于10mL离心管中，再向离心管中加入体积为1mL浓度为1.5-5.5g/L的6-磷酸葡萄糖二钠(pH＝7.2)，200μL浓度为50mM硫酸镁溶液和足量的IMP；在70℃的磁力搅拌水浴锅中搅拌反应10h；然后4000rpm离心5min，取上清于1.5mL离心管，保存于-20℃；然后固定化酶用(50mmol/LpH7.2)的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，然后4000rpm离心5min得固定化酶，弃上清，加入新的6-磷酸葡萄糖二钠，硫酸镁和IMP,进行下一轮反应，依次进行催化；保留每次反应上清，使用HPLC检测每次反应上清肌醇含量；从而说明固定化酶的循环使用性能。固定化酶循环性能检测结果参照图附图8，本发明制备的固定肌醇-1-磷酸合成酶，可实现很好的循环效果，使用16次可以保留37％的初始产量。
表5固定化肌醇-1-磷酸合成酶生产肌醇的循环性能
需要说明的是本发明实施例1-5制备的固定化肌醇-1-磷酸合成酶在固定化肌醇-1-磷酸合成酶生产肌醇的循环性能上与表5具有相近的技术效果。
以上所述实例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但其技术范围不受限于以上实施方式。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做各种改进并实施，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种制备固定化酶的方法，其特征在于：步骤如下：
向经预处理的环氧树脂中加入乙二胺进行改性，得到改性环氧树脂，将所述改性环氧树脂经活化后加入酶进行固定，得到固定化酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述经预处理的环氧树脂与所述乙二胺的水溶液质量体积比1:(2-7)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述乙二胺的水溶液浓度为1％-11％；调节所述乙二胺的水溶液pH至7.0-11.0。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述经预处理的环氧树脂与所述乙二胺的反应时间为20min-420min。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述酶为谷氨酸氧化酶或肌醇-1-磷酸合成酶中的一种；和/或
所述环氧树脂选自环氧树脂1000EP、环氧树脂103B、环氧树脂107S中的一种或多种。
6.根据权利要1或2所述的方法，其特征在于：选择用交联剂进行所述活化；所述交联剂为戊二醛、己二胺、京尼平、顺丁稀二酸酐和双偶氮苯、异氰酸衍生物中的至少一种；和/或
所述交联剂的质量浓度为0.1-1.0％；和/或
所述改性环氧树脂与所述交联剂的质量体积比为1:(1-3)。
7.根据权利要1或2所述的方法，其特征在于：将所述酶与所述经活化的改性环氧树脂的质量比为1:(200-600)。
8.根据权利要7所述的方法，其特征在于：所述酶与所述经活化的改性环氧树脂混合后，共同加入到沉淀剂溶液中进行固定；所述固定时间为6-24h；和/或
所述沉淀剂溶液为饱和度硫酸铵、PEG6000、乙醇、或丙酮中的一种。
9.由权利要求1-8任一所述方法制备获得的固定化酶。
10.由权利要求9所述的固定化酶在水性缓冲液体系中的用途。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114591937A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-06-07 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种固定化碳酸酐酶及其制备方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI932693A0 (it) * | 1993-12-22 | 1993-12-22 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Immobilizzazione di enzimi b-lattame acilasi su resine di tipo poliacrilestere modificate con diammine alifatiche |
| ITMI20011537A0 (it) * | 2001-07-19 | 2001-07-19 | Pro Bio Sint Srl | Transglicosilazione di nucleosidi mediante biocatalisi con enzimi immobilizzati e stabilizzati |
| CN103865917A (zh) * | 2012-12-12 | 2014-06-18 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法 |
| CN110241107A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-09-17 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种使用氨基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶 |
| CN111117995A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-08 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITMI932693A0 (it) * | 1993-12-22 | 1993-12-22 | Mini Ricerca Scient Tecnolog | Immobilizzazione di enzimi b-lattame acilasi su resine di tipo poliacrilestere modificate con diammine alifatiche |
| ITMI20011537A0 (it) * | 2001-07-19 | 2001-07-19 | Pro Bio Sint Srl | Transglicosilazione di nucleosidi mediante biocatalisi con enzimi immobilizzati e stabilizzati |
| CN103865917A (zh) * | 2012-12-12 | 2014-06-18 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种原子转移自由基聚合修饰的金属丝固定化酶反应器的制备方法 |
| CN110241107A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-09-17 | 中国科学院南海海洋研究所 | 一种使用氨基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶 |
| CN111117995A (zh) * | 2020-01-14 | 2020-05-08 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| DENIZ YILDIRIM等: "Preparative-scale kinetic resolution of racemic styrene oxide by immobilized epoxide hydrolase", 《ENZYME MICROB TECHNOL.》 * |
| PINGPING HAN等: "Efficient Multi-Enzymes Immobilized on Porous Microspheres for Producing Inositol From Starch", 《FRONT BIOENG BIOTECHNOL.》 * |
| 张利坤等: "环氧树脂固定化L-谷氨酸氧化酶", 《生物加工过程》 * |
| 李榴莹: "改性环氧基树脂为载体的7α-和7β-HSDH的固定化研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114591937A (zh) * | 2022-03-29 | 2022-06-07 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种固定化碳酸酐酶及其制备方法和应用 |
| CN114591937B (zh) * | 2022-03-29 | 2023-09-05 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种固定化碳酸酐酶及其制备方法和应用 |
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