CN114591937B - 一种固定化碳酸酐酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化碳酸酐酶及其制备方法和应用。所述固定化碳酸酐酶包括碳酸酐酶和环氧型树脂，且所述碳酸酐酶连接于所述环氧型树脂。所述固定化碳酸酐酶的制备方法包括以下步骤：(1)将碳酸酐酶与环氧型树脂混合，使发生固定化，进行固液分离获得滤饼；(2)将(1)中的滤饼置于缓冲液中保温后，进行固液分离得所述固定化碳酸酐酶。所述应用为所述固定化碳酸酐酶在二氧化碳捕集、利用及封存中的应用。本发明的固定化碳酸酐酶由环氧型树脂和碳酸酐酶制备而得，生产简便；酶活稳定，套用效果好，套用100次仍没有活性损失；易于在工业中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物酶技术领域，涉及一种固定化碳酸酐酶及其制备方法，以及所述固定化碳酸酐酶在二氧化碳捕集、利用及封存中的应用。
背景技术
随着社会的飞速发展，二氧化碳的排放问题日益严重，造成大气中二氧化碳含量增加，引发一系列气候问题，引起了人们的关注。碳排放较多的行业例如为燃煤电厂、钢铁和水泥，排放量占比较高。为减少二氧化碳排放，除了减少使用化石燃料外，还可以利用二氧化碳捕集、利用及封存(Carbon capture,utilisation and storage,CCUS)技术将工业生产中产生的二氧化碳转化为其它物质，从而减少碳排放。
二氧化碳的捕集方法包括：化学吸附、溶剂吸收、膜分离法和酶法。吸附、吸收、膜分离方法具有分离效率高等优点，但存在解析过程中消耗能量大，长期使用造成设备腐蚀等问题。而酶法固碳具有能耗低、环境友好等优点。
碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase,CA,EC 4.2.1.1)也称作碳酸脱水酶，是一种以Zn2+位活性中心的金属酶，能够高效催化二氧化碳的可逆水合反应，使其转化为碳酸氢根离子：催化速率可达自然条件下的106倍，是目前已知催化速率最快的酶之一。将碳酸酐酶应用于CCUS技术中，可以提高二氧化碳的吸收效率，有效解决传统工艺中的热能损失，且具有环境友好、可再生等优点，逐渐成为二氧化碳捕集与封存研究中的热点。但是游离的碳酸酐酶稳定性差，不易回收，限制了其在工业中的应用范畴。使用多孔材料(分子筛、多孔玻璃或活性炭)和无孔纳米材料(TiO2、SiO2或仿生SiO2)等作为固定化载体，碳酸酐酶的负载率(20-50mg/g)和活性保留率(30-50％)较低。
专利CN112538473A公开了一种利用磁性金属有机骨架材料固定化的碳酸酐酶催化碳酸钾吸收二氧化碳的方法，此方法不仅提高了碳酸钾吸收二氧化碳的速率，而且利用磁性金属有机骨架材料固定碳酸酐酶，使其能被磁铁吸引而聚集，从而利于固液分离，便于固定化酶的回收再利用。在40℃条件下，加入固定化碳酸酐酶的反应溶液对二氧化碳吸收速率是不加酶的反应溶液对二氧化碳吸收速率的1.6倍。但该专利并未涉及碳酸酐酶稳定性或使用寿命的问题。
专利CN113832137A公开了一种活性焦固定化碳酸酐酶及其制备方法和应用，该方法中以氨水作为吸收剂，富含纳米二氧化硅活性焦颗粒的比表面积可直接影响烟气中二氧化碳的脱除效率，其中脱出效率最高可达86.4％。但该专利公开的固定化碳酸酐酶的制备方法复杂，条件要求较高。
专利CN110218721B中公开了一种高稳定固定化碳酸酐酶及其制备方法与应用，该方法利用ZIF-8的多孔结构，在ZIF-8结构形成的同时将碳酸酐酶固定其中而制得固定化碳酸酐酶。该固定化碳酸酐酶在重复使用4次后能够保留初始活性的83％，套用效果较差，不利于工业化生产。
发明内容
为解决现有技术中固定化碳酸酐酶制备方法复杂、套用效果较差的问题，提供了一种固定化碳酸酐酶及其制备方法，以及所述固定化碳酸酐酶在二氧化碳捕集、利用及封存中的应用。
为此，本发明技术方案的第一方面提供了一种固定化碳酸酐酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将碳酸酐酶与环氧型树脂混合，使发生固定化，进行固液分离获得滤饼；
(2)将(1)中的滤饼置于缓冲液中保温后，进行固液分离得所述固定化碳酸酐酶。
本发明中，所述固液分离使用本领域常规技术手段，例如过滤和抽滤。
本发明中，所述固定化在震荡或搅拌条件下进行，可以使所述碳酸酐酶与所述环氧型树脂更好地混合，由此，本领域常规的震荡或搅拌手段均能应用于本发明。此外，使碳酸酐酶固定化常用的温度和时间均可以用于本发明。在一些优选的实施例中，上述制备方法的步骤(1)中，所述固定化在摇床中进行，转速为50～200r/min例如100r/min；和/或，所述固定化的时间为10～30h例如20～22h；和/或，所述固定化的温度为20～30℃例如25℃。
本发明中，所述保温可以在震荡或搅拌条件下进行。因此在一些优选的实施例中，步骤(2)中，所述保温的温度为20～30℃例如24～26℃；和/或，所述保温在搅拌下进行，所述搅拌的方式为机械搅拌；和/或，所述保温的时间为2～10h例如4～5h。
在一些优选的实施例中，上述制备方法的步骤(1)中，所述环氧型树脂与所述碳酸酐酶的质量体积比为1:(2～10)例如1:6，其中质量体积比的单位为g:mL，所述碳酸酐酶的活性单位为50～200WAU/mL例如120WAU/mL。
本发明中，所述缓冲液为本领域常用的缓冲液。在一些优选的实施例中，上述制备方法的步骤(2)中，所述缓冲液选自PBS和Tris-HCl缓冲液；和/或，所述环氧型树脂与所述缓冲液的质量体积比为1:(1～5)例如1:2。
在一些优选的实施例中，上述制备方法的步骤(2)中，所述PBS的浓度为0.02～0.2M例如0.05M，pH为7.0～7.4。
在一些优选的实施例中，上述制备方法的步骤(1)中，获得滤饼后还包括清洗过程；和/或，步骤(2)中，固液分离后还包括清洗过程；所述清洗例如用去离子水或缓冲液清洗，优选用去离子水清洗。
在一些优选的实施例中，上述制备方法的步骤(1)中，所述环氧型树脂为LX-1000EP或LXTE-604。所述环氧型树脂购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
本领域常规的碳酸酐酶均可以应用于本发明中，例如购自弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司，商品编号为ABC1066的碳酸酐酶。
本发明技术方案的第二方面提供了一种固定化碳酸酐酶，其特征在于，其包括碳酸酐酶和环氧型树脂，所述碳酸酐酶连接于所述环氧型树脂。
优选地，所述环氧树脂为型号为LX-1000EP或LXTE-604的树脂。
优选地，其是在如本发明技术方案的第一方面所述的任一项所述的制备方法制得的固定化碳酸酐酶。
本发明技术方案的第三方面提供了一种捕集、利用或封存二氧化碳的方法，其包括以下步骤：使用如本发明技术方案的第二方面所述的固定化碳酸酐酶来捕集、利用或封存二氧化碳。
本发明技术方案的第四方面提供了一种如本发明技术方案的第二方面所述的固定化碳酸酐酶在二氧化碳捕集、利用及封存中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的固定化碳酸酐酶由环氧型树脂和碳酸酐酶制备而得，生产简便；酶活稳定，套用效果好，套用100次仍没有活性损失；易于在工业中应用。
附图说明
图1为固定化碳酸酐酶A重复利用稳定性。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
碳酸酐酶，购自弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司，商品编号为ABC1066，酶活120WAU/mL，实施例中所用树脂均购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。
碳酸酐酶活性的检测方法参考Chirica等，2001，Biochim.Biophys.Acta1544(1-2):55-63所述方法。一个单位根据Wilbur[1U＝[(1/tc)-(1/tu)]×1000]定义，其中U是单位，而tc和tu分别代表催化的和未催化的反应的时间(以秒)(Wilbur,1948,J.Biol.Chem.176:147-154)。这些单位也称作Wilbur-Anderson单位(WAU)。
实施例1固定化碳酸酐酶的制备
将60mL上清酶(ABC1066，120WAU/mL)加入100mL三口瓶中，加入表1中的树脂10g(树脂购自西安蓝晓)，放入摇床中控制温度25℃，转速100r/min，固定化时间为20-22h。过滤后滤饼用去离子水清洗。具体地，表1的树脂中，固定化碳酸酐酶A和B所用树脂均为环氧型树脂，固定化碳酸酐酶C至F所用树脂为非环氧型的其它树脂。
配制20g 0.05M pH 7.0的磷酸盐缓冲液(0.25g磷酸氢二钾，0.01g磷酸二氢钾和20mL去离子水混合溶解)，控制内温为24-26℃，机械搅拌下，加入上步滤饼保温4-5h。保温结束后例如使用真空抽滤瓶连接真空抽滤机抽滤，用去离子水洗后得固定化酶。测定固定化酶的蛋白挂载率及酶活。结果如表1所示，固定化碳酸酐酶A、固定化碳酸酐酶B和固定化碳酸酐酶E挂载率及酶活较高。
表1不同载体对碳酸酐酶的固定化
| 固定化酶编号 | 载体树脂型号 | 固定化酶质量 | 酶蛋白挂载率 | 酶活 |
| 固定化碳酸酐酶A | LX-1000EP | 10.5g | 99.4％ | 70WAU/g |
| 固定化碳酸酐酶B | LXTE-604 | 10.5g | 99.5％ | 72WAU/g |
| 固定化碳酸酐酶C | LX1000HA | 10.3g | 60％ | 45WAU/g |
| 固定化碳酸酐酶D | LX1000HG | 10.3g | 20％ | 25WAU/g |
| 固定化碳酸酐酶E | LX1000IDA | 10.2g | 99％ | 90WAU/g |
| 固定化碳酸酐酶F | LX1000ME | 10.1g | 5％ | 0WAU/g |
实施例2固定化碳酸酐酶的稳定性
将实施例1所述固定化碳酸酐酶A或B1g加入10mL 10％(m/m)三乙醇胺的水溶液中，对照为同等酶活的液体酶加入10mL 10％三乙醇胺水溶液中，于80℃、100r/min的摇床中反应，使用Wilbur-Anderson测定法来测定酶活，并计算热处理一定时间后的残余酶活。结果如表2所示，本发明的固定化碳酸酐酶A热处理2h后仍能保持95％的活性，热处理20h后仍能维持50％的活性，优于固定化碳酸酐酶B的效果，并远优于固定化碳酸酐酶E和没有固定化的液体碳酸酐酶。
表2固定化碳酸酐酶的热稳定性
| 酶形式 | 初始酶活 | 热处理2h | 热处理20h |
| 固定化碳酸酐酶A | 100％ | 95％ | 50％ |
| 固定化碳酸酐酶B | 100％ | 91％ | 42％ |
| 固定化碳酸酐酶E | 100％ | 5％ | / |
| 液体碳酸酐酶 | 100％ | 20％ | / |
实施例3固定化碳酸酐酶A/B在二氧化碳吸收中的应用
将实施例1所得的固定化碳酸酐酶A和B各10g，分别加入含10g三乙醇胺的90mL水中，于35℃下将二氧化碳以1L/min的速率通入反应容器底部，至体系增重2g停止通气，测得所需时间分别为2分钟、2分20秒。对照为未添加碳酸酐酶、仅含有三乙醇胺水溶液，操作同上，测得体系增重2g所需时间为15分钟。由此可见，与未添加酶的三乙醇胺水溶液相比，固定化碳酸酐酶A、B吸收二氧化碳的速率分别是不加酶的反应溶液对二氧化碳吸收速率的7.5倍和6.4倍。
实施例4固定化碳酸酐酶A、B的重复利用
将实施例1制备的固定化碳酸酐酶A10g、三乙醇胺10g加入90mL水中，于35℃下将CO2以1L/min的速率通入容器底部，测试吸收剂吸收2gCO2所需的时间。过滤该体系中的固定化碳酸酐酶，重新配置成上述吸收体系，再次测试其吸收2g CO2所需时间。重复以上操作。结果如图1所示，在本试验条件下固定化酶套用100次，CO2的吸收速率几乎不发生变化，重复使用后酶活几乎没有损失，说明该固定化碳酸酐酶的稳定性较高，重复利用效果较好。
同样的方法测得固定化碳酸酐酶B套用100次，CO2的吸收速率也几乎不发生变化，重复使用后酶活几乎没有损失。
Claims (6)
1.一种固定化碳酸酐酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将碳酸酐酶与环氧型树脂混合，使发生固定化，进行固液分离获得滤饼；所述固定化在震荡或搅拌下进行，所述的震荡使用摇床，转速为100r/min，所述固定化的时间为20-22h；所述固定化的温度为25℃；
(2)将(1)中的滤饼置于缓冲液中保温后，进行固液分离获得所述固定化碳酸酐酶；所述保温的温度为24-26℃，所述保温在震荡或搅拌下进行，所述搅拌的方式为机械搅拌，所述保温的时间为4-5h；所述缓冲液为PBS缓冲液，所述环氧型树脂与所述缓冲液的质量体积比为1:2，所述PBS的浓度为0.05M，pH为7.0～7.4；
所述环氧型树脂为LX-1000EP或LXTE-604；
所述环氧型树脂与所述碳酸酐酶的质量体积比为1:6，所述质量体积比的单位为g:mL，所述碳酸酐酶的活性单位为120WAU/mL。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，获得滤饼后还包括清洗过程；和/或，步骤(2)中，固液分离后还包括清洗过程。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述清洗为用去离子水清洗。
4.一种固定化碳酸酐酶，其特征在于，所述固定化碳酸酐酶为如权利要求1～3任一项所述的制备方法制得的固定化碳酸酐酶。
5.一种捕集、利用或封存二氧化碳的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：使用如权利要求4所述的固定化碳酸酐酶来捕集、利用或封存二氧化碳。
6.一种如权利要求4所述的固定化碳酸酐酶在二氧化碳捕集、利用及封存中的应用。
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