CN114774401B - 双酶和金纳米粒子共固定化级联催化淀粉生产葡萄糖酸的方法 - Google Patents
双酶和金纳米粒子共固定化级联催化淀粉生产葡萄糖酸的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及双酶和金纳米粒子共固定化级联催化淀粉生产葡萄糖酸的方法；以核锥结构花状硅球为主体，对其进行巯基化后利用金硫键将Au纳米粒子吸附于孔道内，再通过金硫键对葡萄糖淀粉酶与葡萄糖氧化酶进行定向固定，从而实现天然酶‑纳米酶共固定。在GA的作用下，淀粉转化为葡萄糖，在GOx的催化下，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，但在此过程中产生了H2O2，H2O2具有强氧化性，会对天然酶的活性造成一定的影响，甚至使其完全失活，因此利用Au纳米粒子降解H2O2并产生氧气，降低其对酶活性造成的影响，同时产生的氧气可促进GOx对葡萄糖的氧化。30min时，淀粉转化为葡萄糖酸的转化率为97.8％，催化体系展现出巨大的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及双酶和金纳米粒子共固定化级联催化淀粉生产葡萄糖酸的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
葡萄糖酸(C6H12O7)是一种无毒无味、不挥发的弱酸，广泛用于医药、食品、建筑等领域，可作为药物及保健品的补充剂、饮料的酸味调节剂；可作为生产木寡糖的有效催化剂；可用于治疗因普罗帕酮中毒而引起的心脏骤停；可用作水泥添加剂以提高耐水性及强度等。目前，葡萄糖酸主要通过化学、生化、生物电化学及电化学等方式制备，但电力成本增长迅速，化学方法具有环境毒性及生物危害，发酵方法中产品的分离及纯化难度较大等，相比之下，酶法反应条件温和、操作简单、特异性强、副产物少，是一种较为绿色便捷的方式，能够被用来高效经济地生产葡萄糖酸。一些常见的用于酶法制备葡萄糖酸的酶包括葡萄糖氧化酶，可直接催化葡萄糖转化为葡萄糖酸；葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶级联催化葡萄糖制备葡萄糖酸；纤维素酶与葡萄糖氧化酶级联催化纤维素制备葡萄糖酸；葡萄糖淀粉酶与葡萄糖氧化酶级联催化淀粉制备葡萄糖酸等。由于多酶级联反应可实现由反应物到产物的“一步”转化，能够产生底物通道效应，提高催化反应速率；可避免反应中间体的分离纯化过程，降低成本；可控制和转移不利的反应平衡，促使反应正向移动，从而提高催化效率等，因此，在制备葡萄糖酸方面多采用级联催化的方法。然而，在以淀粉为原料制备葡萄糖酸的报道中并未提及去除级联反应过程中生成的对酶活性存在影响的H2O2。
纳米酶本质上是人工酶，其融合了天然酶和纳米材料的优势，在模拟酶活性的同时借助纳米技术赋予材料较高的抵抗性及可回收性，具有低成本、易于制备、高稳定性、表面可功能化等特点，可广泛用于生物传感器、环境修复及生物医学等领域。目前，纳米材料可模拟四种类型的天然酶，包括氧化酶(如Au、Cu2O、Pt)，过氧化物酶(如Ag、Pt、Fe3O4)，过氧化氢酶(如金属及金属氧化物)和超氧化物歧化酶(如富勒烯、氧化铈)。其中，金纳米粒子兼具氧化酶与过氧化氢酶酶样活性，其可在一定程度上氧化葡萄糖，又可以催化降解H2O2。由于大多数天然酶具有稳定性不足、纯化成本高昂、回收利用困难等固有缺陷，并且在高温或有机/有毒介质中容易失活，因此设计合成稳定、成本低的纳米酶，用全化学合成或半化学合成的方法代替天然酶合成具有重要的实际应用价值。
综上所述，构建一个可重复使用、耐受性好、高效实用的多酶级联催化反应系统具有重要意义。因此，以廉价易得的淀粉为原料，利用多酶级联体系的协同反应和底物通道效应，构建双酶与金纳米粒子共固定化体系级联催化淀粉生产葡萄糖酸，可完成由反应物到产物的一步转化，有效提高催化效率，在生产葡萄糖酸的实际应用中具有重要价值。
发明内容
本发明的目的在于构建双酶和金纳米粒子共固定化系统以促进生物催化过程，能够在较短时间内获得较高的葡萄糖酸转化率并可进行多次重复使用，制备过程简单易行、成本低廉、能耗低、环境友好，更适合工业化应用。
本发明的技术方案概述如下：
本发明以核锥结构花状硅球(SiO2)为主体，对其进行巯基化后利用金硫键(Au-S)将Au纳米粒子吸附于孔道内，再通过金硫键(Au-S)对葡萄糖淀粉酶(GA)与葡萄糖氧化酶(GOx)进行定向固定，从而实现天然酶-纳米酶共固定。在GA的作用下，淀粉转化为葡萄糖，在GOx的催化下，葡萄糖被氧化为葡萄糖酸，但在此过程中产生了H2O2，H2O2具有强氧化性，会对天然酶的活性造成一定的影响，甚至使其完全失活，因此利用Au纳米粒子降解H2O2并产生氧气，降低其对酶活性造成的影响，同时产生的氧气可促进GOx对葡萄糖的氧化。
本发明将天然酶葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶(GA&GOx)与金纳米酶(Au)进行共固定并参与多酶级联催化反应的制备方法，步骤如下：
1)硅球巯基化(SiO2-SH)的方法：利用3-巯丙基三甲氧基硅烷(TMMPS)对SiO2进行修饰，得到巯基化载体SiO2-SH；
2)Au纳米酶的固定化方法：以SiO2-SH为载体，利用金硫键(Au-S)，将Au纳米酶固定于SiO2-SH表面，制得SiO2-Au；
3)天然酶的固定化(GA&GOx@Au-SiO2)方法：以SiO2-Au为载体，利用金硫键(Au-S)，将GA与GOx同时固定于SiO2-Au表面，制得固定化酶GA&GOx@Au-SiO2。
本发明所述1)硅球巯基化(SiO2-SH)的方法，其特征是步骤如下：
引用DOI号为10.1002/smll.201501449的文献制备具有核锥结构的介孔二氧化硅纳米粒子，类似于大丽花状，称之为核锥结构花状硅球SiO2，将SiO2溶于甲苯溶液中，使得SiO2浓度为4-10mg/mL，超声分散后，加入3-巯丙基三甲氧基硅烷，于70-90℃回流8-16h，离心收集产物，并用无水乙醇洗涤，烘干。
上述步骤中SiO2:TMMPS＝200:1-400:1(mg:mL)。
本发明所述2)Au纳米粒子的固定化(SiO2-Au)方法，其特征是步骤如下：
引用DOI号为10.1039/c3ra40774h的文献制备Au纳米酶溶液，并将Au纳米酶冻干。取Au纳米酶溶解在中性pH的PBS缓冲液中，将SiO2-SH加入其中，并使Au纳米酶与SiO2-SH的质量比为2:1-4:1，将混合液置于23-27℃的恒温水浴摇床中反应，离心收集产物，并用无水乙醇与去离子水分别洗涤，烘干。
上述步骤中置于23-27℃的恒温水浴摇床中120-180rpm反应6-12h。
本发明所述3)天然酶的固定化(GA&GOx@Au-SiO2)方法，其特征是步骤如下：
取GA和GOx(GA&GOx)添加到中性pH的PBS缓冲液中，得到GA&GOx混合液，并将SiO2-Au加入其中，SiO2-Au与GA&GOx的质量比为7:1-12:1，将混合液置于23-27℃的恒温水浴摇床中反应，离心收集产物，并用PBS缓冲液洗涤，储存。
上述步骤中GA&GOx混合液浓度为1.2-1.4mg/mL。
上述步骤中GA&GOx混合液GA与GOx添加量的比值为1:1.5-1:4.5。
上述步骤中置于23-27℃的恒温水浴摇床中120-180rpm反应4-6h。
本发明设计的GA&GOx@Au-SiO2在作用于淀粉时，其葡萄糖酸转化率高于游离酶催化体系，可在较短时间内获得较高的葡萄糖酸转化率，30min时，淀粉转化为葡萄糖酸的转化率为97.8％，表现出增强的催化产率；催化反应过程中，由于Au纳米酶的作用，H2O2的分解率有所提高，在30min时达到了79.4％，促进了级联反应过程的发生，减小了H2O2对天然酶的损害。而且GA&GOx@Au-SiO2具有较强的重复使用性，重复使用10次后，相对酶活仍可保留83.9％，促进了葡萄糖酸的持续高效生产。综上所述，本发明构建的GA&GOx@Au-SiO2催化体系在实际应用中展现出巨大的潜力。
附图说明
图1为固定化酶GA&GOx@Au-SiO2的制备流程图。
图2为级联反应过程中各成分的含量变化图。
图3为级联反应过程中淀粉消耗率、葡萄糖酸转化率及H2O2分解率变化图。
图4为重复使用10次时目标产物葡萄糖酸的转化率。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体的实例将对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本发明以核锥结构花状硅球(SiO2)为主体，对其进行巯基化后利用金硫键(Au-S)将Au纳米粒子吸附于孔道内，再通过金硫键(Au-S)对葡萄糖淀粉酶(GA)与葡萄糖氧化酶(GOx)进行定向固定，从而实现天然酶-纳米酶共固定(GA&GOx@Au-SiO2)。其制备流程图如图1所示。
本发明所述1)硅球巯基化(SiO2-SH)的方法，其特征是步骤如下：
引用DOI号为10.1002/smll.201501449的文献制备具有核锥结构的介孔二氧化硅纳米粒子，类似于大丽花状，称之为核锥结构花状硅球SiO2，将SiO2溶于甲苯溶液中，使得SiO2浓度为4-10mg/mL，超声分散后，加入3-巯丙基三甲氧基硅烷，于70-90℃回流8-16h，离心收集产物，并用无水乙醇洗涤，烘干。
上述步骤中SiO2:TMMPS＝200:1-400:1(mg:mL)。
本发明所述2)Au纳米粒子的固定化(SiO2-Au)方法，其特征是步骤如下：
引用DOI号为10.1039/c3ra40774h的文献制备Au纳米酶溶液，并将Au纳米酶冻干。取Au纳米酶溶解在中性pH的PBS缓冲液中，将SiO2-SH加入其中，并使Au纳米酶与SiO2-SH的质量比为2:1-4:1，将混合液置于23-27℃的恒温水浴摇床中反应，离心收集产物，并用无水乙醇与去离子水分别洗涤，烘干。
上述步骤中置于23-27℃的恒温水浴摇床中120-180rpm反应6-12h。
本发明所述3)天然酶的固定化(GA&GOx@Au-SiO2)方法，其特征是步骤如下：
取GA和GOx(GA&GOx)添加到中性pH的PBS缓冲液中，得到GA&GOx混合液，并将SiO2-Au加入其中，SiO2-Au与GA&GOx的质量比为7:1-12:1，将混合液置于23-27℃的恒温水浴摇床中反应，离心收集产物，并用PBS缓冲液洗涤，储存。
上述步骤中GA&GOx混合液浓度为1.2-1.4mg/mL。
上述步骤中GA&GOx混合液GA与GOx添加量的比值为1:1.5-1:4.5(mg:mg)。
上述步骤中置于23-27℃的恒温水浴摇床中120-180rpm反应4-6h。
实施例1：
1)引用DOI号为10.1002/smll.201501449的文献制备硅球SiO2，取200mg SiO2和50mL甲苯添加到100mL三口烧瓶中，超声分散30min后，将1mL 3-巯丙基三甲氧基硅烷(TMMPS)加入三口烧瓶中，并于80℃，350rpm回流8h，10000rpm离心收集产物，并用无水乙醇洗涤三次，置于60℃烘箱内干燥12h，储存于4℃备用，制备得到SiO2-SH。
2)引用DOI号为10.1039/c3ra40774h的文献制备Au纳米酶溶液，并将Au纳米酶冻干。取50mg SiO2-SH与100mg Au纳米酶溶解于20mL中性pH的PBS缓冲液中，将混合液置于25℃，120rpm下反应12h，10000rpm离心收集产物，并用无水乙醇与去离子水分别洗涤三次，置于60℃烘箱内干燥12h，于4℃储存备用，制备得到SiO2-Au。
3)将50.4mg SiO2-Au与6mL 1.2mg/mL GA&GOx混合液(pH6.8,GA:GOx＝1:1.5)添加到25mL锥形瓶中，于25℃，120rpm下反应6h，10000rpm离心收集产物，并用100mM PBS缓冲液(pH 5.0)洗涤三次，GA&GOx负载量为29.3mg/g(GA:GOx＝1.44:1)，置于4℃储存备用，制备得到GA&GOx@Au-SiO2。
4)将上述天然酶(GA&GOx)-纳米酶(Au)固定化催化剂添加到1.1mL 0.5mg/mL淀粉溶液(pH5.0)中，于40℃反应3h(GA&GOx浓度为53.27μg/mL)，并在10min，20min，30min，40min，50min，60min，90min，120min，180min时取样，研究催化反应过程中体系内各成分含量的变化，其中利用酶标仪检测淀粉、葡萄糖及H2O2的含量，利用高效液相色谱仪检测葡萄糖酸的含量。高效液相色谱检测时将NaOH溶液加入催化反应体系中，使葡萄糖酸完全转化为葡萄糖酸钠，检测条件为TC-C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，流动相为甲醇-水-1％磷酸(2:48:50,v/v/v)，检测波长210nm，进样量20μL，流速1mL/min。催化反应过程中，体系内各成分的含量变化如图2所示，淀粉消耗率、葡萄糖酸转化率及H2O2分解率的变化如图3所示，其中30min内，淀粉的消耗率达到了98.7％，葡萄糖酸转化率为97.8％，对H2O2的分解率接近80％；30min后，各成分的含量变化趋于稳定，表明葡萄糖酸未发生分解。而游离GA与游离GOx体系内，在相同酶添加量下，30min内淀粉的转化率为99.7％，但葡萄糖酸的转化率仅为63.2％。
实施例2：
探究实施例1中制备得到的GA&GOx@Au-SiO2的重复使用性情况。在每次反应结束后，通过11000rpm离心回收GA&GOx@Au-SiO2，并将回收的GA&GOx@Au-SiO2用pH 5.0PBS缓冲液洗涤3次，并按照上述方法测定体系中葡萄糖酸的含量。结果如图4所示，在重复使用10次后，GA&GOx@Au-SiO2仍保留83.9％的初始活性，说明天然酶(GA&GOx)-纳米酶(Au)共固定化为葡萄糖酸的可持续生产创造了一个高效稳定的级联生物催化体系，在工业上具有一定的应用潜力。
实施例3：
1)引用DOI号为10.1002/smll.201501449的文献制备硅球SiO2，取350mg SiO2和50mL甲苯添加到100mL三口烧瓶中，超声分散30min后，将1.17mL 3-巯丙基三甲氧基硅烷(TMMPS)加入三口烧瓶中，并于70℃，350rpm回流12h，10000rpm离心收集产物，并用无水乙醇洗涤三次，置于60℃烘箱内干燥12h，储存于4℃备用，制备得到SiO2-SH。
2)引用DOI号为10.1039/c3ra40774h的文献制备Au纳米酶溶液，并将Au纳米酶冻干。取50mg SiO2-SH与100mg Au纳米酶溶解于20mL中性pH的PBS缓冲液中，将混合液置于25℃，120rpm下反应12h，10000rpm离心收集产物，并用无水乙醇与去离子水分别洗涤三次，置于60℃烘箱内干燥12h，于4℃储存备用，制备得到SiO2-Au。
3)将84mg SiO2-Au与5mL 1.4mg/mL GA&GOx混合液(pH6.8,GA:GOx＝1:4.5)添加到25mL锥形瓶中，于23℃，180rpm下反应4h，10000rpm离心收集产物，并用100mM PBS缓冲液(pH 5.0)洗涤三次，置于4℃储存备用，制备得到GA&GOx@Au-SiO2。
4)将上述天然酶(GA&GOx)-纳米酶(Au)固定化催化剂添加到1.1mL 0.5mg/mL淀粉溶液(pH5.0)中，于40℃反应3h(GA&GOx浓度为53.64μg/mL)，并在10min，20min，30min，40min，50min，60min，90min，120min，180min时取样，研究催化反应过程中体系内各成分含量的变化，其中利用酶标仪检测淀粉、葡萄糖及H2O2的含量，利用高效液相色谱仪检测葡萄糖酸的含量。高效液相色谱检测时将NaOH溶液加入催化反应体系中，使葡萄糖酸完全转化为葡萄糖酸钠，检测条件为TC-C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，流动相为甲醇-水-1％磷酸(2:48:50,v/v/v)，检测波长210nm，进样量20μL，流速1mL/min。在30min内，淀粉的转化率为98.9％，葡萄糖酸转化率为98.1％，对H2O2的分解率接近80％；30min后各成分的含量变化不大。重复使用10次后，GA&GOx@Au-SiO2保留了84.7％的初始活性。
实施例4：
1)引用DOI号为10.1002/smll.201501449的文献制备硅球SiO2，取500mg SiO2和50mL甲苯添加到100mL三口烧瓶中，超声分散30min后，将1.25mL 3-巯丙基三甲氧基硅烷(TMMPS)加入三口烧瓶中，并于90℃，350rpm回流16h，10000rpm离心收集产物，并用无水乙醇洗涤三次，置于60℃烘箱内干燥12h，储存于4℃备用，制备得到SiO2-SH。
2)引用DOI号为10.1039/c3ra40774h的文献制备Au纳米酶溶液，并将Au纳米酶冻干。取50mg SiO2-SH与200mg Au纳米酶溶解于20mL中性pH的PBS缓冲液中，将混合液置于23℃，120rpm下反应6h，10000rpm离心收集产物，并用无水乙醇与去离子水分别洗涤三次，置于60℃烘箱内干燥12h，于4℃储存备用，制备得到SiO2-Au。
3)将74.1mg SiO2-Au与6mL 1.3mg/mL GA&GOx混合液(pH6.8,GA:GOx＝1:3)添加到25mL锥形瓶中，于27℃，150rpm下反应5h，10000rpm离心收集产物，并用100mM PBS缓冲液(pH 5.0)洗涤三次，置于4℃储存备用，制备得到GA&GOx@Au-SiO2。
4)将上述天然酶(GA&GOx)-纳米酶(Au)固定化催化剂添加到1.1mL 0.5mg/mL淀粉溶液(pH5.0)中，于40℃反应3h(GA&GOx浓度为54.12μg/mL)，并在10min，20min，30min，40min，50min，60min，90min，120min，180min时取样，研究催化反应过程中体系内各成分含量的变化，其中利用酶标仪检测淀粉、葡萄糖及H2O2的含量，利用高效液相色谱仪检测葡萄糖酸的含量。高效液相色谱检测时将NaOH溶液加入催化反应体系中，使葡萄糖酸完全转化为葡萄糖酸钠，检测条件为TC-C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，流动相为甲醇-水-1％磷酸(2:48:50,v/v/v)，检测波长210nm，进样量20μL，流速1mL/min。在30min内，淀粉的转化率为99.1％，葡萄糖酸转化率为98.3％，对H2O2的分解率接近80％；30min后各成分的含量无明显变化。重复使用10次后，GA&GOx@Au-SiO2保留了84.3％的初始活性。
实施例5：
1)引用DOI号为10.1002/smll.201501449的文献制备硅球SiO2，取500mg SiO2和50mL甲苯添加到100mL三口烧瓶中，超声分散30min后，将1.25mL 3-巯丙基三甲氧基硅烷(TMMPS)加入三口烧瓶中，并于80℃，350rpm回流16h，10000rpm离心收集产物，并用无水乙醇洗涤三次，置于60℃烘箱内干燥12h，储存于4℃备用，制备得到SiO2-SH。
2)引用DOI号为10.1039/c3ra40774h的文献制备Au纳米酶溶液，并将Au纳米酶冻干。取50mg SiO2-SH与150mg Au纳米酶溶解于20mL中性pH的PBS缓冲液中，将混合液置于27℃，150rpm下反应9h，10000rpm离心收集产物，并用无水乙醇与去离子水分别洗涤三次，置于60℃烘箱内干燥12h，于4℃储存备用，制备得到SiO2-Au。
3)将50.4mg SiO2-Au与6mL 1.2mg/mL GA&GOx混合液(pH6.8,GA:GOx＝1:1.5)添加到25mL锥形瓶中，于25℃，120rpm下反应6h，10000rpm离心收集产物，并用100mM PBS缓冲液(pH 5.0)洗涤三次，置于4℃储存备用，制备得到GA&GOx@Au-SiO2。
5)将上述天然酶(GA&GOx)-纳米酶(Au)固定化催化剂添加到1.1mL 0.5mg/mL淀粉溶液(pH5.0)中，于40℃反应3h(GA&GOx浓度为53.89μg/mL)，并在10min，20min，30min，40min，50min，60min，90min，120min，180min时取样，研究催化反应过程中体系内各成分含量的变化，其中利用酶标仪检测淀粉、葡萄糖及H2O2的含量，利用高效液相色谱仪检测葡萄糖酸的含量。高效液相色谱检测时将NaOH溶液加入催化反应体系中，使葡萄糖酸完全转化为葡萄糖酸钠，检测条件为TC-C18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，流动相为甲醇-水-1％磷酸(2:48:50,v/v/v)，检测波长210nm，进样量20μL，流速1mL/min。在30min内，淀粉的转化率为99.3％，葡萄糖酸转化率为98.4％，对H2O2的分解率接近80％；30min后各成分的含量无明显变化。重复使用10次后，GA&GOx@Au-SiO2保留了85.1％的初始活性。
实施例6：
以实施例1为例，将制备得到的GA&GOx@Au-SiO2与以往文献的数据进行比较。如表1所示，GA&GOx@Au-SiO2生产葡萄糖酸的产率几乎均高于之前报道的淀粉生产葡萄糖酸的体系，说明本发明制备的GA&GOx@Au-SiO2具有较高的催化活性，在实际生产葡萄糖酸方面具有很大的潜力。
表1.本发明与文献数据对葡萄糖酸生产的比较
本发明涉及双酶和金纳米粒子共固定化级联催化淀粉生产葡萄糖酸的方法；包括对核锥结构花状硅球SiO2进行巯基化的方法，并利用金硫键(Au-S)将Au纳米粒子吸附于SiO2孔道内，再通过金硫键(Au-S)对葡萄糖淀粉酶(GA)与葡萄糖氧化酶(GOx)进行定向固定，从而实现双酶(GA&GOx)与金纳米粒子的共固定。与其他体系相比，GA&GOx@Au-SiO2表现出增强的催化产率，这是由于底物通道效应所致。而且GA&GOx@Au-SiO2具有较强的重复使用性，促进了葡萄糖酸的持续高效生产。GA&GOx@Au-SiO2的制备过程简单方便、成本低廉，在葡萄糖酸生产的实际应用领域具有一定的潜力与竞争性。
综上所述，本发明提出的双酶(GA&GOx)和金纳米粒子共固定化不仅利于提高整体催化活性，促进淀粉向葡萄糖酸的转化，而且还有助于改善酶催化剂的重复使用性，在生产葡萄糖酸的实际应用中具有一定的优势。除此之外，GA&GOx和金纳米粒子共固定催化体系的整个制备过程简单易行、成本低廉、环境友好，进一步促进了该双酶(GA&GOx)-纳米酶(Au)级联催化体系在工业领域的高效应用。
本发明提出的双酶和金纳米粒子共固定化级联催化淀粉生产葡萄糖酸的方法，已通过现场较佳实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
Claims (7)
1.一种双酶和金纳米粒子共固定化的方法，其特征是步骤如下：
1)利用3-巯丙基三甲氧基硅烷对核锥结构花状硅球SiO2进行修饰，得到巯基化载体SiO2-SH；加入的SiO2与3-巯丙基三甲氧基硅烷的质量体积比是200:1-400:1；
2)以SiO2-SH为载体，利用金硫键，将Au纳米酶固定于SiO2-SH表面，制得SiO2-Au；加入的Au纳米酶与SiO2-SH的质量比为2:1-4:1；
3)以SiO2-Au为载体，利用金硫键，将葡萄糖淀粉酶GA和葡萄糖氧化酶GOx同时固定于SiO2-Au表面，制得固定化酶GA&GOx@Au-SiO2；加入的GA&GOx混合液中GA与GOx添加量的比值为1:1.5-1:4.5，并且加入的SiO2-Au与GA&GOx的质量比为7:1-12:1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤1)的巯基化载体SiO2-SH制备方法，其特征步骤是：将核锥结构花状硅球SiO2溶于甲苯溶液中，使得SiO2浓度为4-10mg/mL，超声分散后，加入3-巯丙基三甲氧基硅烷，于70-90℃回流8-16h，离心收集产物，并用无水乙醇洗涤，烘干。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤2)的SiO2-Au制备方法：取Au纳米酶溶解在中性pH的PBS缓冲液中，加入SiO2-SH，于23-27℃的恒温水浴摇床中反应，离心收集产物，并用无水乙醇与去离子水分别洗涤，烘干。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述步骤中置于23-27℃的恒温水浴摇床中120-180rpm反应6-12h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤3)的GA&GOx@Au-SiO2制备方法：取GA&GOx添加到中性pH的PBS缓冲液中，得到GA&GOx混合液，并将SiO2-Au加入其中；将混合液置于23-27℃的恒温水浴摇床中反应，离心收集产物，并用PBS缓冲液洗涤，储存。
6.如权利要求5所述的方法，其特征是GA&GOx混合液浓度为1.2-1.4mg/mL。
7.如权利要求5所述的方法，其特征是所述步骤中置于23-27℃的恒温水浴摇床中120-180rpm反应4-6h。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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