CN110669756B - 一种蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物功能材料领域，公开了一种蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物及其制备方法。将锌盐溶液、有机配体和多糖分子加入到溶剂中进行反应，产物经分离、洗涤、干燥，得到掺杂多糖的金属有机骨架复合物；或将锌盐溶液、有机配体、多糖分子和蛋白质分子加入到溶剂中进行反应，产物经分离、洗涤、干燥，得到蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物。本发明的制备方法操作简便，条件温和，所得产品生物兼容性好，蛋白稳定性高，蛋白的生物活性得到较大程度保留。

Description

一种蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物功能材料领域，具体涉及一种蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物及其制备方法。
背景技术
蛋白分子凭借其丰富的功能性，在工业催化、生物医药、医学检测等领域都具有广阔的应用前景，将蛋白与有机或无机材料相结合，有助于提高酶分子在非生理条件下的稳定性。金属-有机框架化合物(Metal Organic Frameworks，简称MOFs)是通过金属离子与有机配体相结合形成的一类纳米复合物，具有丰富的孔结构以及较好的结构稳定性，在催化等领域具有重要的应用前景。利用金属有机材料与蛋白分子相结合，用于构建金属有机骨架-蛋白复合物，在生物医药、工业催化和可再生能源等领域均有应用潜力。
已有的蛋白质-金属有机骨架复合物的构建方法主要分为两大类。一类是两步法。通过合成与蛋白分子相匹配的介孔金属有机骨架，再通过吸附将蛋白质固定到介孔金属有机骨架内部。中国专利CN108396023A公开了一种磁性MOF材料固定酶的方法，以氧化锌和2-甲基咪唑以及Fe3O4磁性纳米粒子为原料合成磁性Fe3O4@ZIF-8材料，然后用该材料固定脂肪酶，通过两步法构建脂肪酶-金属有机骨架复合物。另一类是一步法，利用金属离子、蛋白质和有机配体在溶剂中一步反应获得蛋白质-金属有机骨架复合物。文献(J.Am.Chem.Soc.,2015,137,4276-4279)报道了一种一步合成MOF-酶复合物的方法，以硝酸锌和2-甲醛咪唑以及过氧化氢酶为原料，通过一步原位包埋法构建过氧化氢酶-金属有机骨架复合物。第一类制备方法中，介孔型金属有机骨架的制备通常要求先合成复杂的有机配体，而复杂有机配体的合成需要多步有机反应，步骤繁琐，效率低下，收率低。而一步法目前仅限于微孔型金属有机骨架，其微孔结构一方面不利于蛋白质维持其天然构象，另一方面，也不利于催化反应过程中底物和产物的传递，因此，所获得的蛋白质-金属有机骨架复合物活性较低。现有方法仍难以通过一步法获得具有高活性的蛋白质-金属有机骨架复合物。
因此，寻求一种简单高效的蛋白质-金属有机骨架复合物构建方法具有重要的研究意义。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物的制备方法。该方法通过一步反应即可完成，具有条件温和、操作简便、普适性好、所得复合物催化活性高等特点。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物的制备方法，包括如下制备步骤：
将锌盐溶液、有机配体和多糖分子加入到溶剂中进行反应，产物经分离、洗涤、干燥，得到掺杂多糖的金属有机骨架复合物；或将锌盐溶液、有机配体、多糖分子和蛋白质分子加入到溶剂中进行反应，产物经分离、洗涤、干燥，得到蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物。
进一步地，所述锌盐为硝酸锌和醋酸锌中的至少一种，但不限于此。
进一步地，所述有机配体为2-甲基咪唑、4-甲基咪唑、1-甲基咪唑、苯并咪唑和咪唑中的至少一种，但不限于此。
进一步地，所述多糖分子为海藻酸钠、果胶和黄原胶中的至少一种，但不限于此。
进一步地，所述蛋白质分子为细胞色素C、酪氨酸酶、细胞色素P450、辣根过氧化物酶、乙醇脱氢酶、脂肪酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、绿色荧光蛋白、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碳酸酐酶、醛酮还原酶、淀粉酶、蔗糖酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶中的至少一种，但不限于此。
进一步地，所述溶剂为水、甲醇、二甲基甲酰胺、叔丁醇、乙醇、二甲基亚砜、乙腈和丙酮中的一种或两种以上的混合，但不限于此。
进一步地，所述反应温度为0～40℃，反应时间为0.5～48h。
进一步地，所述锌盐溶液中锌离子浓度为0.5～500mmol/L。
进一步地，所述锌盐溶液中锌离子与所述有机配体的摩尔比为1:(5～30)。
进一步地，所述多糖分子与有机配体的质量比为1:(50～200)。
进一步地，所述锌盐溶液中锌离子与所述蛋白质分子的质量比为1:(0.5～10)。
进一步地，所述分离、洗涤、干燥是指离心分离、去离子洗涤、冷冻干燥。
一种掺杂多糖的金属有机骨架复合物或蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物，通过上述方法制备得到。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
本发明的制备方法操作简便，条件温和，所得产品生物兼容性好，蛋白稳定性高，蛋白的生物活性得到较大程度保留。
附图说明
图1为本发明实施例1中所得掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物(ZIF-8@海藻酸钠)和ZIF-8的X-射线衍射谱图。
图2为本发明实施例1中所得掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物(ZIF-8@海藻酸钠)、海藻酸锌和ZIF-8的红外光谱图。
图3为本发明实施例1中所得掺杂海藻酸钠的金属有机骨架化合物的扫描电镜图(a～e为不同放大倍数)。
图4为本发明实施例5中酪氨酸酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物(酪氨酸酶-ZIF-8@多糖复合物)和酪氨酸酶-ZIF-8复合物的活性对比图。
图5为本发明实施例6中漆酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物(漆酶-ZIF-8@多糖复合物)和漆酶-ZIF-8复合物的活性对比图。
图6为本发明实施例7中脂肪酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物(脂肪酶-ZIF-8@多糖复合物)和脂肪酶-ZIF-8复合物的活性对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例掺杂多糖的金属有机骨架化合物的制备：
(1)按照2-甲基咪唑:水质量比为1:15配置2-甲基咪唑水溶液；配置2mg/mL的海藻酸钠水溶液和100mmol/L的醋酸锌水溶液。
(2)取步骤(1)中5mL 2-甲基咪唑水溶液、2mL海藻酸钠水溶液和3mL醋酸锌水溶液混合，25℃下搅拌反应30分钟。
(3)将步骤(2)中所得产物通过离心分离，用去离子水重悬洗涤3次，将洗涤后产品进行冷冻干燥12小时，得到掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物。
本实施例制备的掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的X射线衍射图谱如图1所示，可以看出复合物含有典型的ZIF-8的晶体，但峰强较弱，结晶度较差。
本实施例制备的掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的红外光谱图如图2所示，可以看出复合物含有海藻酸钠的特征吸收峰，但峰强较弱，说明复合物中存在一定含量的海藻酸钠。
本实施例制备的掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的扫描电镜图如图3所示(a～e为不同放大倍数)，可见所得复合物呈现不规则的正十二面体形状，粒径为300～500nm之间。
实施例2
本实施例掺杂多糖的金属有机骨架复合物的制备：
(1)按照2-甲基咪唑:水质量比为1:15配置2-甲基咪唑水溶液；配置2mg/ml的海藻酸钠水溶液和200mmol/L的醋酸锌水溶液。
(2)取步骤(1)中5mL 2-甲基咪唑水溶液、2mL海藻酸钠水溶液和3mL醋酸锌水溶液混合，25℃下搅拌反应30分钟。
(3)将步骤(2)中所得产物通过离心分离，用去离子水重悬洗涤3次，将洗涤后产品进行冷冻干燥12小时，得到掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物。
实施例3
本实施例掺杂多糖的金属有机骨架复合物的制备：
(1)按照2-甲基咪唑:水质量比为1:15配置2-甲基咪唑水溶液；配置2mg/ml的海藻酸钠水溶液和100mmol/L的醋酸锌水溶液。
(2)取步骤(1)中5mL 2-甲基咪唑水溶液、2mL海藻酸钠水溶液和3mL醋酸锌水溶液混合，25℃下搅拌反应60分钟。
(3)将步骤(2)中所得产物通过离心分离，用去离子水重悬洗涤3次，将洗涤后产品进行冷冻干燥12小时，得到掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物。
实施例4
本实施例掺杂多糖的金属有机骨架复合物的制备：
(1)按照2-甲基咪唑:水质量比为1:15配置2-甲基咪唑水溶液；配置4mg/mL的海藻酸钠水溶液和100mmol/L的硝酸锌水溶液。
(2)取步骤(1)中5mL 2-甲基咪唑水溶液、2mL海藻酸钠水溶液和3mL硝酸锌水溶液混合，25℃下搅拌反应30分钟。
(3)将步骤(2)中所得产物通过离心分离，用去离子水重悬洗涤3次，将洗涤后产品进行冷冻干燥12小时，得到掺杂海藻酸钠的金属有机骨架化合物。
实施例5
本实施例蛋白质与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的制备：
(1)按照2-甲基咪唑:水质量比为1:15配置2-甲基咪唑水溶液；配置2mg/mL的海藻酸钠水溶液、100mmol/L的醋酸锌水溶液和10mg/mL的酪氨酸酶水溶液。
(2)取步骤(1)中5mL 2-甲基咪唑水溶液、2mL海藻酸钠水溶液、3mL醋酸锌水溶液和1mL酪氨酸酶水溶液混合，25℃下搅拌反应30分钟。
(3)将步骤(2)中所得产物通过离心分离，用去离子水重悬洗涤3次，将洗涤后产品进行冷冻干燥12小时，得到酪氨酸酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物，所得复合物中蛋白的包埋率为97％。
本实施例所得酪氨酸酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的蛋白质活性测定：酪氨酸酶酶活测定以单位质量的酪氨酸酶在单位时间内催化L-多巴氧化生成多巴醌的摩尔量来计算。具体方法为：取400μL L-多巴溶液(10mM)，600μL Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4，50mM)，混合均匀，加入50μL酶液，反应5min后，用紫外分光光度计测定混合溶液在475nm处吸光值。以游离酶活性为100％参照，结果如图4所示。ZIF-8固定酪氨酸酶的活性为游离酶的2％，本实施例所得酪氨酸酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的活性为游离酶的29％，为ZIF-8固定酪氨酸酶活性的14.5倍，说明掺杂多糖的金属有机骨架复合物用于酪氨酸酶的一步包埋能显著提高酪氨酸酶的活性。
实施例6
本实施例蛋白质与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的制备：
(1)按照2-甲基咪唑:水质量比为1:15配置2-甲基咪唑水溶液；配置2mg/mL的海藻酸钠水溶液、100mmol/L的醋酸锌水溶液和10mg/mL的漆酶水溶液。
(2)取步骤(1)中5mL 2-甲基咪唑水溶液、2mL海藻酸钠水溶液、3mL醋酸锌水溶液和1mL漆酶水溶液混合，25℃下搅拌反应30分钟。
(3)将步骤(2)中所的产物通过离心分离，用去离子水重悬洗涤3次，将洗涤后产品进行冷冻干燥12小时，得到漆酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物，所得复合物中蛋白的包埋率为95％。
本实施例所得漆酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的蛋白质活性测定：漆酶酶活的测定方法以单位质量漆酶在单位时间内ABTS氧化产物的生成量来计算。将100μL漆酶溶液加入到900μL ABTS溶液(0.5mM)，混合均匀，反应5min，用紫外分光光度计测定混合溶液在420nm处的吸光值。以同等质量游离漆酶的催化活性为100％参照，结果如图5所示，漆酶-ZIF-8复合物的活性为游离酶的8％，本实施例所得漆酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的活性为游离酶的23％，为ZIF-8固定漆酶活性的2.9倍，说明掺杂多糖的金属有机骨架化合物用于漆酶的一步包埋能显著提高漆酶的活性。
实施例7
本实施例蛋白质与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的制备：
(1)按照2-甲基咪唑:水质量比为1:15配置2-甲基咪唑水溶液；配置2mg/mL的海藻酸钠水溶液、100mmol/L的醋酸锌水溶液和10mg/mL的脂肪酶水溶液。
(2)取步骤(1)中5mL 2-甲基咪唑水溶液、2mL海藻酸钠水溶液、3mL醋酸锌水溶液和1mL脂肪酶水溶液混合，25℃下搅拌反应30分钟。
(3)将步骤(2)中所的产物通过离心分离，用去离子水重悬洗涤3次，将洗涤后产品进行冷冻干燥12小时，得到脂肪酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物，所得复合物中蛋白的包埋率为95％。
本实施例所得脂肪酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的蛋白质活性测定：脂肪酶酶活的测定方法以单位质量脂肪酶在单位时间内对硝基苯酸的生成量来计算。将100μL漆酶溶液加入到900μL对硝基苯棕桐酸酯溶液(8mM)，混合均匀，反应5min，加入95％乙醇终止反应，用紫外分光光度计测定混合溶液在410nm处的吸光值。以同等质量游离漆酶的催化活性为100％参照，结果如图6所示，脂肪酶-ZIF-8复合物的活性为游离酶的5.2％，本实施例所得脂肪酶与掺杂海藻酸钠的金属有机骨架复合物的活性为游离酶的30.8％，为ZIF-8固定漆酶活性的6倍，说明掺杂多糖的金属有机骨架化合物用于脂肪酶的一步包埋能显著提高脂肪酶的活性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种一步法制备蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物的方法，其特征在于包括如下制备步骤：
将锌盐溶液、有机配体、多糖分子和蛋白质分子同时加入到水中混合，搅拌进行反应，产物经分离、洗涤、干燥，得到蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物；
所述锌盐为硝酸锌和醋酸锌中的至少一种；所述锌盐溶液中锌离子浓度为0.5～500mmol/L；
所述有机配体为2-甲基咪唑；所述锌盐溶液中锌离子与所述有机配体的摩尔比为1:(5～30)；所述锌盐溶液中锌离子与所述蛋白质分子的质量比为1:(0.5～10)；
所述多糖分子为海藻酸钠；所述多糖分子与有机配体的质量比为1:(50～200)；
所述反应的温度为0～40℃，反应时间为0.5～48h。
2.根据权利要求1所述的一种一步法制备蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物的方法，其特征在于：所述蛋白质分子为细胞色素C、酪氨酸酶、细胞色素P450、辣根过氧化物酶、乙醇脱氢酶、脂肪酶、乙酰胆碱酯酶、漆酶、绿色荧光蛋白、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碳酸酐酶、醛酮还原酶、淀粉酶、蔗糖酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种一步法制备蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物的方法，其特征在于：所述分离、洗涤、干燥是指离心分离、去离子洗涤、冷冻干燥。
4.一种蛋白质与掺杂多糖的金属有机骨架复合物，其特征在于：通过权利要求1～3任一项所述的方法制备得到。
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