CN113694964B - 一种基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系及其制备方法与应用。该仿生漆酶体系以金属离子作为催化活性中心，以多糖和多巴胺和/或多巴胺衍生物为有机骨架组成，具有类漆酶活性；所述金属离子与所述多糖类和多巴胺及其衍生物之间通过配位连接。它的构建方法通过多糖、所述多巴胺和/或多巴胺衍生物与所述金属离子三者混合反应进行组装得到；或者多糖与所述多巴胺和/或多巴胺衍生物先混合反应，形成组装体，然后与所述金属离子进行配位，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系。本发明多巴胺基仿生酶具有制备方法简单、组装条件温和、稳定性好、可生物降解、可循环利用等优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系及其制备方法与应用，属于酶制备技术领域。
背景技术
漆酶(Laccase)，是一种含铜的多酚氧化酶，是多酚氧化酶的一种，主要以酚类化合物和芳香胺类化合物为底物，氧化底物的同时伴随分子氧还原成水。漆酶的反应活性中心及催化过程非常复杂，因此研究人员一直致力于构建具有漆酶活性的仿生酶的研究。仿生酶被定义为人工构筑的具有酶功能的材料，与天然酶相比，仿生酶具有更高的催化活性以及更高的稳定性等优势，从而引起了国内外科研团队的广泛研究。
多巴胺是一种广泛存在于神经系统中的儿茶酚胺类的神经递质。自2007年，Messersmith教授及其团队证明多巴胺能在弱碱性水溶液中氧化自聚合形成聚多巴胺并且将聚多巴胺作为一种表面修饰材料进行应用以来，多巴胺基微纳米材料得到了广泛的关注和研究。目前，研究者们已经构建了丰富的多巴胺基微纳米材料，包括纳米颗粒、核/壳结构、微胶囊、聚多巴胺薄膜、纳米纤维等。这些微纳米材料具有良好的生物相容性、易修饰性、荧光性、光热转换性能等优异的物理化学特性，已经被广泛应用于生物医药领域，如药物输送、癌症治疗、组织工程等。
针对现有仿生漆酶制备难度大、催化效率低、稳定性差、难以回收再利用等缺点，现亟需构建一种新的仿漆酶体系，以克服上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系及其制备方法与应用。本发明多巴胺基仿生酶具有制备方法简单、组装条件温和、稳定性好、可生物降解、可循环利用等优势。
本发明提供的一种基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系，该仿生漆酶体系以金属离子作为催化活性中心，以多糖和多巴胺和/或多巴胺衍生物为有机骨架组成，具有类漆酶活性；
所述金属离子与所述多糖和多巴胺和/或多巴胺衍生物之间通过配位连接。
上述的仿生漆酶体系中，所述金属离子选自Fe3+、Fe2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+中的至少一种，具体可为Cu2+。
上述的仿生漆酶体系中，所述多糖包括壳聚糖、肝素、海藻酸钠、纤维素和及其它们被氧化得到的多糖衍生物中的至少一种；所述多糖衍生物为壳聚糖、肝素、海藻酸钠或纤维素的部分或全部羟基被氧化而得到的衍生物；
所述多巴胺衍生物包括3-甲氧基色胺(MOA)、N-3,4-二羟基苯乙基甲基丙烯酰胺(DMA)和盐酸多巴胺中的至少一种，具体可为盐酸多巴胺。
上述的仿生漆酶体系中，所述多糖衍生物具体包括壳聚糖、肝素和纤维素分别被高碘酸钠氧化后得到的二醛壳聚糖、二醛肝素、二醛海藻酸钠、二醛纤维素；更具体可为纤维素(PF)或二醛纤维素。
本发明还提供了一种构建上述的基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系的方法，包括如下1)或2)的步骤：
1)将所述多糖、所述多巴胺和/或多巴胺衍生物与所述金属离子三者混合反应，进行组装，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系；
2)将所述多糖与所述多巴胺和/或多巴胺衍生物先混合反应，形成组装体；然后与所述金属离子进行配位，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系。
上述的方法中，步骤1)的操作步骤如下：
将所述多糖加入中性偏碱性缓冲溶液中混合，得到缓冲体系；向所述缓冲体系中加入所述金属离子的盐溶液混合，得到含多糖及金属离子的缓冲体系；将多巴胺和/或多巴胺衍生物加入所述含多糖及金属离子的缓冲体系中混合，进行反应，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系。
上述的方法中，所述中性偏碱性缓冲溶液为三羟甲基胺基甲烷缓冲液，其pH为7.0～9.0。
上述的方法中，步骤2)的操作步骤如下：
a)将多糖的水溶液与高碘酸盐水溶液混合，避光静置反应后水洗，得到被高碘酸盐氧化的材料；b)所述的材料与所述多巴胺和/或多巴胺衍生物的水溶液混合反应，然后加入所述高碘酸盐水溶液，进行避光反应后加入还原剂，静置后水洗，得到多糖/多巴胺复合膜材料；c)所述多糖/多巴胺复合膜材料中加入所述金属离子的盐溶液静置后水洗，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系。
上述的方法中，所述多糖在最终体系中的浓度为0.2～20mg/mL，具体可为0.5～10mg/mL；
所述多巴胺和/或多巴胺衍生物在最终体系中的浓度可为0.2～20mg/mL，具体可为0.5～10mg/mL。
上述的方法中，所述金属离子在最终体系中的浓度可为0.2～20mM，具体可为0.5～10mM；所述金属离子的盐中阴离子为本领域常规的阴离子；
所述高碘酸盐在最终体系中的浓度为0.1～10mg/mL，具体可为1～5mg/mL；所述高碘酸盐中阳离子为本领域常规的阳离子。
上述的方法中，步骤2)中a)-c)中，所述静置的条件如下：温度为室温，时间可为1～30h，具体可为4～24h。
本发明所述的基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系应用于作为氧化反应催化剂。
上述的应用中，所述氧化反应具体为将酚类氧化成醌类的反应。
本发明所述的基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系应用于作为氧化剂在工业中酚类去除、废水处理、纺织漂白和生物检测中至少一种领域中。
本发明具有以下优点：
1、本发明通过温和、快速的方法构建了一种基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系。
2、本发明构建的基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系相比于天然漆酶，具有催化效率高、稳定性好、可循环利用等优势。
3、本发明基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系能对苯酚类进行催化氧化，因此在工业中苯酚类的去除、废水处理、纺织品漂白、生物检测等方面具有一定应用前景。
附图说明
图1为实施例1、实施例2构建的基于纤维素/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系SEM图像，其中图1中(a)为实施例1的SEM图像，(b)为实施例2的SEM图像。
图2为实施例1、实施例2反应体系在412nm处的紫外吸收值随仿生漆酶复合膜加入时间变化的折线图。
图3为实施例1、实施例2构建的基于纤维素/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系与天然漆酶相同反应时间的催化活性对比图。
图4为实施例1、实施例2构建的基于纤维素/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系与天然漆酶的稳定性对比图。
图5为实施例1、实施例2构建的基于纤维素/多巴胺复合膜的循环利用效果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中，天然漆酶商购于中国诺维信生物技术有限公司，食品级。
下述实施例中所采用的测试多糖/多巴胺复合膜材料的仿生漆酶活性的方法为：
称量19mg 5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)粉末溶解于去离子水中，然后向其中加入30mg的硼氢化钠粉末，避光静置1小时后，可得5-硝基-2-巯基苯甲酸(简称TNB)水溶液，其浓度为2～50mM。利用上述得到的5-硝基-2-巯基苯甲酸溶液作为指示剂，其在特定波长412nm处有强烈的紫外吸收，指示剂溶液浓度为0.1～10mM。利用对苯二酚作为氧化反应的底物，称取一定量的对苯二酚粉末，溶解于水中得到对苯二酚溶液，其浓度为0.1～10mM。将上述指示剂溶液与底物溶液以1:2的体积比混合，随后加入到一定量的磷酸缓冲溶液中，使得指示剂与对苯二酚的浓度为0.01～1mM，调节溶液的pH为5.0～8.0。将制备的仿漆酶复合膜材料裁剪1～10mg加入到上述制备的磷酸缓冲溶液中。将加入复合膜材料的混合溶液进行紫外光谱测试，记录加入复合膜材料后不同时刻溶液的吸光度，并绘制曲线，即可得到仿漆酶复合膜材料的催化活性。
实施例1、
一种基于纤维素/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系(Cu/PDA@PF膜)构建方法，包括以下步骤：
将无灰定量滤纸(即纤维素，0.2g)加入超纯水(100mL)中，强烈搅拌30min。然后将盐酸多巴胺(2mg/mL)、Tris缓冲溶液(三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，反应总体系中其浓度为50mM，pH＝8.5，50mM)和CuSO4(5mM)/H2O2(19.6mM)加入上述分散液中，室温下搅拌30min。最后，在真空干燥箱中干燥，得到基于纤维素/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系，又称聚多巴胺(PDA)包覆的滤纸膜(记为Cu/PDA@PF膜)。
测试复合膜材料仿漆酶催化活性：
称量19mg 5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)粉末溶解于去离子水中，然后向其中加入30mg的硼氢化钠粉末，避光静置1小时后，可得5-硝基-2-巯基苯甲酸(简称TNB)水溶液，其浓度为10mM。称量2mg对苯二酚粉末，直接加入水中溶解，得到对苯二酚溶液，使得其浓度为5mM。将上述两种溶液以体积比1:2混合，并加入到pH为6.8的磷酸缓冲溶液中，使得TNB与对苯二酚的浓度为0.05mM。将上述制备的Cu/PDA@PF复合膜材料8mg加入到反应体系中。随后将混合溶液放入紫外光谱中进行测试，记录加入复合膜材料后不同时刻溶液于412nm处的吸光度，并绘制曲线，即可得到仿漆酶复合膜材料(Cu/PDA@PF膜)的催化活性。
图1中(a)为制备得到的Cu/PDA@PF膜扫描电子显微镜图像，由图1可知，在纤维素表面成功形成了负载铜离子的聚多巴胺涂层(即铜离子作为催化活性中心，以纤维素和盐酸多巴胺为有机骨架)。
图2为反应体系在412nm处紫外吸收值随仿漆酶复合膜材料(Cu/PDA@PF膜)加入时间而变化的曲线图。由图可知，加入复合膜材料后不同时间，指示剂5-硝基-2-巯基苯甲酸TNB在412nm处的紫外吸收值随时间的推移而降低，证明本发明Cu/PDA@PF膜催化氧化苯酚成苯醌，产物与指示剂结合导致指示剂的吸收值降低。
图3为仿漆酶复合膜材料与天然漆酶相同反应时间的催化活性对比图，由图可知，在相同反应时间，本发明仿漆酶复合膜材料(Cu/PDA@PF膜)的表观催化活性均高于天然漆酶。
图4为仿漆酶复合膜材料与天然漆酶的稳定性对比图，由图可知，经过在室温(25℃)下放置一周后，本发明Cu/PDA@PF膜仍保持良好的催化活性，但是天然漆酶的催化作用几乎完全消失。
图5为仿漆酶复合膜材料的循环利用效果图，由图5可知，经过5次循环后构建的本发明Cu/PDA@PF膜仍具有仿漆酶催化活性，并且催化活性无明显变化。
实施例2、
一种基于纤维素/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系(DAC/PDA/Cu@PF膜)构建方法，包括以下步骤：
在超纯水(100mL)中加入无灰定量滤纸(0.2g)和高碘酸钠(3.3mg/mL)，用锡箔纸包裹烧杯使得之后的反应均在避光条件下进行，搅拌10min后静置反应24h。反应结束后将所得DAC(二醛纤维素)用超纯水洗涤三次。随后在超纯水(100mL)中加入洗涤后的DAC和盐酸多巴胺(2mg/mL)，搅拌10min后静置反应，4h后加入高碘酸钠(3.3mg/mL)，搅拌10min后静置反应，待反应24h后加入过量乙二醇以除去未反应的高碘酸钠，将反应制得的膜用超纯水洗涤三次后于硫酸铜溶液(5mM)中浸泡1h。最后用超纯水将DAC/PDA/Cu@PF膜洗涤后放入真空干燥箱中干燥，得到基于纤维素/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系，又称聚多巴胺(PDA)包覆的PF膜(记为DAC/PDA/Cu@PF膜)。
测试复合膜材料仿漆酶催化活性：
称量19mg 5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)粉末溶解于去离子水中，然后向其中加入30mg的硼氢化钠粉末，避光静置1小时后，可得5-硝基-2-巯基苯甲酸(简称TNB)水溶液，其浓度为10mM。称量2mg对苯二酚粉末，直接加入水中溶解，得到对苯二酚溶液，使得其浓度为5mM。将上述两种溶液以体积比1:2混合，并加入到pH为6.8的磷酸缓冲溶液中，使得TNB与对苯二酚的浓度为0.05mM。将上述制备的DAC/PDA/Cu@PF膜复合膜材料8mg加入到反应体系中。随后将混合溶液放入紫外光谱中进行测试，记录加入复合膜材料后不同时刻溶液于412nm处的吸光度，并绘制曲线，即可得到仿漆酶复合膜材料(DAC/PDA/Cu@PF膜)的催化活性
图1(b)表明在本发明纤维素表面成功形成了负载铜离子的聚多巴胺涂层。
图2表明加入本发明DAC/PDA/Cu@PF膜后不同时间，指示剂5-硝基-2-巯基苯甲酸TNB在412nm处的紫外吸收值随时间的推移而降低，证明本发明DAC/PDA/Cu@PF膜催化氧化苯酚成苯醌，产物与指示剂结合导致指示剂的吸收值降低。
图3表明，在相同反应时间，本发明仿漆酶复合膜材料(DAC/PDA/Cu@PF膜)的表观催化活性均高于天然漆酶。
图4表明，经过在室温下放置一周后，本发明DAC/PDA/Cu@PF膜仍保持良好的催化活性，但是天然漆酶的催化作用几乎完全消失。
图5表明，经过5次循环后构建的本发明DAC/PDA/Cu@PF膜仍具有仿漆酶催化活性，并且催化活性无明显变化。
由上述实验结果可知，本发明实施例2制备得到的仿漆酶复合膜材料其催化剂活性、稳定性、可循环利用性与实施例1类似。
申请人申明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才可以实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系，其特征在于：该仿生漆酶体系以金属离子作为催化活性中心，以多糖和多巴胺和/或多巴胺衍生物为有机骨架组成；
所述金属离子与所述多糖和多巴胺和/或多巴胺衍生物之间通过配位连接；
所述金属离子选自Fe3+、Fe2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+中的至少一种；
所述多糖包括壳聚糖、肝素、海藻酸钠、纤维素及其它们被氧化得到的多糖衍生物中的至少一种；
所述多糖衍生物包括壳聚糖、肝素、海藻酸钠和纤维素分别被高碘酸钠氧化后得到的二醛壳聚糖、二醛肝素、二醛海藻酸钠、二醛纤维素；
所述多巴胺衍生物包括3-甲氧基色胺和盐酸多巴胺中的至少一种。
2.一种构建权利要求1所述的基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系的方法，包括如下1）或2）的步骤：
1）将所述多糖、所述多巴胺和/或多巴胺衍生物与所述金属离子三者混合反应，进行组装，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系；
2）将所述多糖与所述多巴胺和/或多巴胺衍生物先混合反应，形成组装体；然后与所述金属离子进行配位，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1）的操作步骤如下：
将所述多糖加入中性偏碱性缓冲溶液中混合，得到缓冲体系；向所述缓冲体系中加入所述金属离子的盐溶液混合，得到含多糖及金属离子的缓冲体系；将多巴胺和/或多巴胺衍生物加入所述含多糖及金属离子的缓冲体系中混合，进行反应，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述中性偏碱性缓冲溶液为三羟甲基胺基甲烷缓冲液，其pH为7.0~9.0。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）的操作步骤如下：
a）将多糖的水溶液与高碘酸盐水溶液混合，避光静置反应后水洗，得到被高碘酸盐氧化的材料；b）所述的材料与所述多巴胺和/或多巴胺衍生物的水溶液混合反应，然后加入所述高碘酸盐水溶液，进行避光反应后加入还原剂，静置后水洗，得到多糖/多巴胺复合膜材料；c）所述多糖/多巴胺复合膜材料中加入所述金属离子的盐溶液静置后水洗，即得到所述基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述多糖在最终体系中的浓度为0.2~20mg/mL；
所述多巴胺和/或多巴胺衍生物在最终体系中的浓度为0.2~20 mg/mL；和/或
所述金属离子在最终体系中的浓度为0.2~20 mM；
所述高碘酸盐在最终体系中的浓度为0.1~10 mg/mL；
步骤2）中a）-c）中，所述静置的条件如下：温度为室温，时间为1~30 h。
7.权利要求1所述的基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系作为氧化反应催化剂的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述氧化反应为将酚类氧化成醌类的反应。
9.权利要求1所述的基于多糖/多巴胺复合膜的仿生漆酶体系作为氧化剂在工业中酚类去除、废水处理、纺织漂白和生物检测中至少一种领域中的应用。
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