CN112852766B - 一种合成乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种1，3‑二羟基丙酮或丙酮醛在碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物的催化下转化为乳酸的方法，该方法可在常温常压和大气环境中进行。上述方法与甲醛到1，3‑二羟基丙酮的生物催化反应相结合，可实现甲醛到乳酸的生物化学转化，该转化可在常温常压下和大气环境中进行，方法简单，成本低，产物收率高，具有较好的应用前景。

Description

一种合成乳酸的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年2月24日提交的申请号为202010113441.8的中国发明专利申请的优先权和权益，其整体内容通过引用的方式纳入本文。
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种由1,3-二羟基丙酮、丙酮醛或者甲醛到乳酸的合成方法。
背景技术
乳酸是一种用途广泛的有机酸，在食品工业，乳酸可以被用来作为酸味剂、风味剂等食品添加剂；在医药领域，乳酸盐(铁、钙、钠等)可以用来为人体补充金属元素；在化妆品领域，乳酸可以添加到护肤品中用来作为保湿剂；在纺织领域，乳酸可以用来处理纺织物；在化工领域，乳酸可以作为中间化合物合成绿色有机溶剂乳酸酯，也可以合成聚乳酸。聚乳酸具有生物可降解性、生物相容性、较好的弹性以及优异的物化性，是未来理想的高分子材料。由于其广泛的用途和较高的需求量，乳酸的合成显得尤为重要。
乳酸生产的方法主要有化学合成法和微生物发酵法，此外还有甘油转化法。化学合成法首先利用乙醛和氢氰酸经过高压反应合成乳腈，然后乳腈经硫酸水解生成乳酸。该方法虽然产生的乳酸纯度高，但是由于原料中采用了乙醛和剧毒的氢氰酸等物质，存在较大的污染和生产危险性。微生物发酵法是以糖、淀粉、木质纤维素为原料利用各种细菌或真菌经过生物转化合成乳酸。微生物发酵法以淀粉或糖为原料发酵，其次后续的灭菌和下游乳酸的分离纯化都会导致乳酸生产成本较高，此外还存在不能连续生产、产品性质不稳定等问题。这些问题都是限制微生物发酵法大规模应用的原因。以甘油为原料合成乳酸，主要是甘油在无机碱(NaOH、CaO)的作用下，在高温条件下反应得到乳酸，该方法存在的问题是：反应过程需要较高的温度，高温的碱性环境对于设备要求较高。
一碳化合物(如：甲酸、甲醇、甲醛等)可以用来合成基本的有机化工原料、燃料和其他高附加值化学品。因其廉价易得的特性，一碳化合物成为替代石油制备高价值化合物最有发展前景的化合物，在医药、食品、化工领域具有重要的科学意义和开发价值。甲醛来源广泛、价格低廉，在工业生物技术中具有广泛的应用前景。因此，发展转化一碳化合物甲醛或其衍生物到乳酸的温和高效的方法具有极大的理论意义和应用价值。
发明内容
本发明提供了一种制备乳酸的方法，包括如下步骤：以1,3-二羟基丙酮或丙酮醛为底物，用碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物产生乳酸。
根据本发明，所述碱金属氢氧化物可以为氢氧化钠、氢氧化钾，碱土金属氢氧化物可以为氢氧化钙、氢氧化钡。
根据本发明，所述碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比可以为(1～100):1，例如(2～80):1。特别地，所述碱金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比可以为(5～80):1，例如(10～60):1，(15～50):1，(20～40):1；所述碱土金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比可以为(1～20):1，例如(2～10):1，(2～6):1。
根据本发明，所述碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛产生乳酸的反应不在惰性气体保护条件下进行。换言之，所述反应在大气环境中进行即可。
根据本发明，所述碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛产生乳酸的反应可以在10～50℃的范围内进行，优选在20～30℃的范围内进行，例如在室温下进行。
根据本发明，所述碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛产生乳酸的反应的时间可以为6～80小时，例如为12～60小时，24～48小时。
根据本发明，所述底物1,3-二羟基丙酮可以以甲醛为底物，用甲醛转化蛋白催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮；其中所述甲醛转化蛋白具有催化甲醛转化为1,3-二羟基丙酮的功能。具体地，在用甲醛转化突变蛋白催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮时，包括如下步骤：将甲醛转化突变蛋白与甲醛接触，催化甲醛生成1,3-二羟基丙酮。
在本发明的上下文中，本发明中“甲醛转化蛋白”是指能催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮的蛋白，只要其具有催化甲醛转化为1,3-二羟基丙酮的功能即可，对其氨基酸序列和来源没有特别限制。仅作为实例但并非限制性地，其可以是例如，来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的苯酰甲酸脱羧酶(benzoylformate decarboxylases，BFD)和来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens biovar I)的苯甲醛裂合酶(benzaldehydelyase，BAL)，以及它们经过氨基酸突变后得到具有上述功能的蛋白。例如，可使用苯甲醛裂合酶或其突变体，例如其氨基酸序列为SEQ ID NO:21所示的序列，还可以为202010113441.8中所描述的甲醛转化突变蛋白，在对应于SEQ ID NO:1的S26、L43、F66、R86、T87、G109、A204、H281、A322、F397、M460、W463、V467、V473、S525位中至少一个位置处的氨基酸残基发生突变，例如，其氨基酸序列具体可以为如下1)-18)中任一种：
1)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:3)；
2)SEQ ID NO:1的第86位精氨酸突变为半胱氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:4)；
3)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:5)；
4)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第397位苯丙氨酸突变为亮氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:6)；
5)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第473位缬氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:7)；
6)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第43位亮氨酸突变为谷氨酰胺，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:8)；
7)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第66位苯丙氨酸突变为亮氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:9)；
8)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第109位的甘氨酸突变为丝氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:10)；
9)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第204位丙氨酸突变为缬氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:11)；
10)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第397位苯丙氨酸突变为丝氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:12)；
11)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第463位色氨酸突变为精氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:13)；
12)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第467位缬氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:14)；
13)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第87位苏氨酸突变为丙氨酸，且将第322位丙氨酸突变为苏氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:15)；
14)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第463位色氨酸突变为精氨酸，且将第109位的甘氨酸突变为丝氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:16)；
15)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第397位苯丙氨酸突变为丝氨酸，且将第109位的甘氨酸突变为丝氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:17)；
16)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第460位蛋氨酸突变为苏氨酸，且将第525位丝氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:18)；
17)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第397位苯丙氨酸突变为丝氨酸，且将第109位的甘氨酸突变为丝氨酸，且将第322位丙氨酸突变为苏氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:19)；
18)SEQ ID NO:1的第281位组氨酸突变为酪氨酸，且将第26位丝氨酸突变为苯丙氨酸，且将第463位色氨酸突变为精氨酸，且将第109位的甘氨酸突变为丝氨酸，且将第397位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，其他氨基酸残基保持不变，得到的氨基酸序列(其核苷酸序列为SEQ ID NO:20)。
根据本发明，所述底物1,3-二羟基丙酮可以以甲醛为底物，用包含所述甲醛转化蛋白和/或编码所述蛋白的多核苷酸的重组载体、转基因细胞系或重组菌株催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮。具体地，在催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮时，包括如下步骤：将包含所述甲醛转化蛋白和/或所述多核苷酸的重组载体、转基因细胞系或重组菌株与甲醛接触，催化其生成1,3-二羟基丙酮。
根据本发明，所述碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛产生乳酸的反应以如下方式进行：将含有底物的溶液缓慢添加到含有碱金属氢氧化物的水溶液或者碱土金属氢氧化物的水悬浊液中。其中“缓慢添加”或“缓慢加入”与“直接混合”或“倾倒”相对，“缓慢添加”或“缓慢加入”可按照本领域的通常方式进行，可以少量多次地加入，也可以匀速地加入，而不是将含底物的溶液一次性地倾倒入含有碱金属氢氧化物的水溶液或者碱土金属氢氧化物的水悬浊液中。作为优选方案，所述底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛缓慢添加的速率可以为每小时的添加量小于或等于10mol，即添加速率小于或等于10mol/h；例如，添加速率可以小于或等于5mol/h，小于或等于2.5mol/h，小于或等于1mol/h。本领域技术人员可以理解，如果不考虑生产效率的话，添加速率可以更缓慢，例如添加速率甚至可以小于或等于100mmol/h或者更小，但是不宜超过上述上限速率。在本发明教导的上述范围内，本领域技术人员可以根据实际情况确定缓慢添加的速率。本领域技术人员可以理解“缓慢添加”可按照本领域的通常方式进行，可以少量多次地添加，也可以基本匀速地添加，而不是将含底物的溶液一次性地倾倒入含有碱金属氢氧化物的水溶液或者碱土金属氢氧化物的水悬浊液中。对于含底物的溶液中底物的浓度没有特别限制，可以为1～10000mM，例如可以直接使用经上述甲醛经甲醛转化蛋白、或者包含所述甲醛转化蛋白和/或所述多核苷酸的重组载体、转基因细胞系或重组菌株催化合成1,3-二羟基丙酮所得的反应液进行。
有益效果
现有技术文献CN105777523A中公开了一种温和条件下由糖类制备乳酸的方法，所用催化剂为碱金属或碱土金属氢氧化物，糖类包括葡萄糖、二羟基丙酮、丙酮醛等，但是其方法要求必须在惰性气体保护下进行，否则难以实现的底物转化率和乳酸产率。而本发明通过对反应方法的优化，采用缓慢添加含有底物的溶液的方式大大提高了由1,3-二羟基丙酮或丙酮醛在碱金属氢氧化物及碱土金属氢氧化物催化转化为乳酸的产率，并且不必要求在惰性气体保护下进行，在大气环境中进行即可，也不要求高温和高压，在常温常压下进行即可，方法更加简单，成本更低，同时乳酸产率很高。
发明人分析认为，文献CN105777523A中必须要求在惰性气体保护下进行的原因可能在于抑制副反应；在含底物的溶液与含碱金属或碱土金属氢氧化物催化剂的溶液直接混合的情况下，如果不采用惰性气体保护，则反应直接暴露在空气中，氧气的存在会使反应的副产物增多，乳酸的产率就会降低。而本发明的方法中，缓慢地加入底物，使少量的底物在催化剂体系中快速的转化为产物乳酸，避免了副反应的产生，因此，在不使用惰性气体进行保护的条件下，仍然是实现了乳酸的高产率。
本发明的利用碱金属氢氧化物及碱土金属氢氧化物催化1,3-二羟基丙酮转化为乳酸的方法还可以与生物催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮的方法相结合，创建了一条新的甲醛合成乳酸的途径。通过催化两步法即可实现由甲醛到乳酸的转化，此途径路径短并且在常温常压下进行，具有较好的应用前景。
附图说明
图1：实施例2中HPLC检测碱金属氢氧化物催化1,3-二羟基丙酮产生乳酸的图谱。
图2：实施例2中HPLC检测碱土金属氢氧化物催化1,3-二羟基丙酮产生乳酸的图谱。
图3：实施例3中HPLC检测碱(土)金属氢氧化物催化丙酮醛产生乳酸的图谱。
图4：实施例5中HPLC检测甲醛转化蛋白催化甲醛产生1,3-二羟基丙酮的图谱。
图5：实施例6中HPLC检测碱金属氢氧化物催化甲醛转化蛋白催化甲醛产生的1,3-二羟基丙酮产生的终产物乳酸的图谱。
图6：实施例6中HPLC检测碱土金属氢氧化物催化甲醛转化蛋白催化甲醛产生的1,3-二羟基丙酮产生的终产物乳酸的图谱。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1缓慢添加方法与直接混合方法碱土金属氢氧化物催化乳酸产率的对比
配制8份25mL 100mM的1,3-二羟基丙酮溶液，配制2份25mL 250mM Ba(OH)2悬浊液，2份25mL 250mM Ca(OH)2悬浊液，2份25mL 2MNaOH溶液，2份25mL 2M KOH溶液。其中将4份25mL的1,3-二羟基丙酮溶液分别与上述的氢氧化钡悬浊液、氢氧化钙悬浊液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液直接混合(即将25mL的1,3-二羟基丙酮溶液一次性倒入碱金属氢氧化物溶液或碱土金属氢氧化物的悬浊液中)，然后在室温下反应48h；另外4份25mL的1,3-二羟基丙酮溶液分别缓慢加入(历时5小时)到上述的氢氧化钡悬浊液、氢氧化钙悬浊液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液中，在室温下搅拌反应48h。反应结束后调节pH值到1.0-2.0之间，离心过0.22μm滤膜，进行HPLC检测。
对于采用碱金属氢氧化物催化所得产物液的HPLC检测条件如下：色谱柱：AminexHPX-87H，300mm×7.8mm(Bio-Rad)；流动相：0.010MH2SO4；示差检测器；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL。
对于采用碱土金属氢氧化物催化所得产物液的HPLC检测条件如下：色谱柱：Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm(Bio-Rad)；流动相：0.0025MH2SO4；紫外210nm；流速：0.5mL/min；柱温：65℃；进样量：5μL。
经分析可知，四种反应体系均生成乳酸，计算得到乳酸的产率如表1所示。
表1缓慢添加和直接混合两种方式下，碱土金属氢氧化物催化1,3-二羟基丙酮到乳酸的产率
Figure GDA0003301852750000101
由表1中的数据可以看出，与直接混合方式的反应相比，将1,3-二羟基丙酮缓慢添加到碱土金属氢氧化物悬浊液(Ba(OH)2，Ca(OH)2)和碱金属氢氧化物(NaOH，KOH)溶液中乳酸的产率明显更高。
实施例2碱金属氢氧化物及碱土金属氢氧化物催化1,3-二羟基丙酮产生乳酸
配制4份25mL 100mM的1,3-二羟基丙酮溶液，配置25mL 250mM Ba(OH)2悬浊液，25mL 250mM Ca(OH)2悬浊液，25mL 2M NaOH溶液，25mL 2M KOH溶液。将25mL的1,3-二羟基丙酮溶液分别缓慢加入(历时5小时)到上述的氢氧化钡悬浊液，氢氧化钙悬浊液，氢氧化钠溶液，氢氧化钾溶液中，在室温下搅拌反应48h，反应结束后调节pH值到1.0-2.0之间，离心过0.22μm滤膜，进行HPLC检测。
对于采用碱金属氢氧化物催化所得产物液的HPLC检测条件：色谱柱：Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm(Bio-Rad)；流动相：0.010M H2SO4；示差检测器；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL。
对于采用碱土金属氢氧化物催化所得产物液的HPLC检测条件：色谱柱：AminexHPX-87H，300mm×7.8mm(Bio-Rad)；流动相：0.0025M H2SO4；紫外210nm；流速：0.5mL/min；柱温：65℃；进样量：5μL。
HPLC检测结果如图1和图2所示，碱金属氢氧化物(NaOH，KOH)和碱土金属氢氧化物(Ba(OH)2，Ca(OH)2)均能催化1,3-二羟基丙酮生成乳酸，且HPLC检测出峰时间与乳酸标准品的出峰时间一致。
计算得到的乳酸的产率如表2所示。
表2碱金属/碱土金属氢氧化物催化1,3-二羟基丙酮到乳酸的产率
Figure GDA0003301852750000111
由表2中的数据可以看出，氢氧化钙催化1,3-二羟基丙酮到乳酸的产率为25.22％，氢氧化钡催化1,3-二羟基丙酮到乳酸的产率为50.68％，而氢氧化钠和氢氧化钾催化1,3-二羟基丙酮到乳酸的产率分别为99.84％和99.74％。
实施例3碱金属氢氧化物及碱土金属氢氧化物催化丙酮醛产生乳酸
配制2份25mL 50mM的丙酮醛溶液，25mL 200mM氢氧化钡悬浊液，25mL 2M氢氧化钠溶液，将上述丙酮酸溶液分别缓慢加入(历时3小时)到氢氧化钡悬浊液和氢氧化钠溶液中，室温下搅拌反应48h，反应结束后调节pH值到1.0-2.0之间，离心过0.22μm滤膜，进行HPLC检测。
HPLC检测条件：色谱柱：Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm(Bio-Rad)；流动相：0.0025M H2SO4；紫外210nm；流速：0.5mL/min；柱温：65℃；进样量：5μL。
HPLC检测结果如图3所示，经分析可知，碱金属氢氧化物(NaOH)，碱土金属氢氧化物(Ba(OH)2)均能催化丙酮醛生成乳酸，且HPLC检测出峰时间与乳酸标准品的出峰时间一致。经过计算乳酸的产率如表3所示。
表3碱金属/碱土金属氢氧化物催化丙酮醛到乳酸的产率
Figure GDA0003301852750000121
由表3中的数据可以看出，碱金属氢氧化物(NaOH)能够催化丙酮醛生成乳酸，且乳酸的产率为98.54％，碱土碱土金属氢氧化物(Ba(OH)2)也能够催化丙酮醛生成乳酸，且乳酸的产率为86.46％。
实施例4甲醛转化蛋白的纯化
本实施例所用甲醛转化蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。将突变体单克隆挑至5mL含有硫酸卡那霉素抗生素的LB培养基中过夜培养，作为种子液，按照1:100的比例转接至100mL的含有硫酸卡那霉素抗生素的LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入0.1mM的IPTG在30℃诱导24h。诱导完成后，4000rpm离心20min收集菌体。菌体用25mL磷酸钾缓冲液(50mM K2HPO4和KH2PO4，5mM MgSO4，pH 8.0)重悬，在冰浴中超声破菌，离心收集上清，利用Ni2+层析柱对上述表达的甲醛转化蛋白进行亲和层析纯化，用咪唑洗脱后经脱盐柱脱盐，纯化后的蛋白保存在磷酸钾缓冲液中备用。
实施例5甲醛转化生成1,3-二羟基丙酮的反应
用50mM磷酸钾缓冲液将实施例4中纯化后的蛋白浓度稀释至15mg/mL。在反应体系中先取一定体积的纯酶，然后加入等量的甲醛溶液(600mM甲醛，1mM TPP，50mM K2HPO4和KH2PO4，5mM MgSO4，pH 7.4))，30℃反应1h。反应结束后，取一定体积的反应液加入等体积的乙腈终止反应，离心过0.22μm滤膜，进行HPLC检测。
HPLC检测条件：
色谱柱：Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm(Bio-Rad)；流动相：0.010M H2SO4；紫外吸收210nm；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL。
HPLC检测结果如图4所示，经分析可知，甲醛转化蛋白可以催化甲醛生成1,3-二羟基丙酮，且HPLC检测出峰时间与1,3-二羟基丙酮标准品的出峰时间一致。
经过计算得出，甲醛转化蛋白催化甲醛产生1,3-二羟基丙酮的产率如表4所示。
表4甲醛转化蛋白催化甲醛产生1,3-二羟基丙酮的产率
Figure GDA0003301852750000131
实施例6碱金属氢氧化物及碱土金属氢氧化物催化突变蛋白催化产生的1,3-二羟基丙酮到乳酸的转化
去除实施例5中反应体系中的酶，取17.5mL的溶液缓慢加入(历时1小时)至17.5mL2M NaOH或KOH溶液，室温下反应24h，反应结束后调节溶液的pH值到1.0-2.0之间。过0.22μm的有机滤膜，进行HPLC检测。
HPLC检测条件：色谱柱：Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm(Bio-Rad)；流动相：0.010M H2SO4；示差检测器；流速：0.5mL/min；柱温：35℃；进样量：20μL。
HPLC检测结果如图5所示，碱金属氢氧化物(NaOH，KOH)都可以进一步催化甲醛转化蛋白催化甲醛产生的1,3-二羟基丙酮转化为乳酸。
去除实施例5中反应体系中的酶，取17.5mL的溶液缓慢加入(历时1小时)至17.5ml氢氧化钙(250mM)悬浊液中，室温下反应24h，反应结束后调节溶液的pH值到1.0-2.0之间。过0.22μm的有机滤膜，进行HPLC检测。
HPLC检测条件：色谱柱：Aminex HPX-87H，300mm×7.8mm(Bio-Rad)流动相：0.0025M H2SO4，紫外吸收波长：210nm，流速：0.5mL/min，柱温：65℃，进样量：5μL。
HPLC检测结果如图6所示，经分析可知，碱土金属氢氧化物(Ca(OH)2)可以进一步催化甲醛转化蛋白催化甲醛产生的1,3-二羟基丙酮转化为乳酸。
经过计算从甲醛经过甲醛转化蛋白，及碱金属氢氧化物(NaOH，KOH)或碱土金属氢氧化物(Ca(OH)2)催化产生的乳酸的产率如表5所示。
表5从甲醛到乳酸的转化率
Figure GDA0003301852750000141
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种合成乳酸的方法
<130> CPCN20111231
<150> 2020101134418
<151> 2020-02-24
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 528
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Ser Val His Gly Thr Thr Tyr Glu Leu Leu Arg Arg Gln Gly
1 5 10 15
Ile Asp Thr Val Phe Gly Asn Pro Gly Ser Asn Glu Leu Pro Phe Leu
20 25 30
Lys Asp Phe Pro Glu Asp Phe Arg Tyr Ile Leu Ala Leu Gln Glu Ala
35 40 45
Cys Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Gln Ala Ser Arg Lys Pro
50 55 60
Ala Phe Ile Asn Leu His Ser Ala Ala Gly Thr Gly Asn Ala Met Gly
65 70 75 80
Ala Leu Ser Asn Ala Arg Thr Ser His Ser Pro Leu Ile Val Thr Ala
85 90 95
Gly Gln Gln Thr Arg Ala Met Ile Gly Val Glu Ala Gly Glu Thr Asn
100 105 110
Val Asp Ala Ala Asn Leu Pro Arg Pro Leu Val Lys Trp Ser Tyr Glu
115 120 125
Pro Ala Ser Ala Ala Glu Val Pro His Ala Met Ser Arg Ala Ile His
130 135 140
Met Ala Ser Met Ala Pro Gln Gly Pro Val Tyr Leu Ser Val Pro Tyr
145 150 155 160
Asp Asp Trp Asp Lys Asp Ala Asp Pro Gln Ser His His Leu Phe Asp
165 170 175
Arg His Val Ser Ser Ser Val Arg Leu Asn Asp Gln Asp Leu Asp Ile
180 185 190
Leu Val Lys Ala Leu Asn Ser Ala Ser Asn Pro Ala Ile Val Leu Gly
195 200 205
Pro Asp Val Asp Ala Ala Asn Ala Asn Ala Asp Cys Val Met Leu Ala
210 215 220
Glu Arg Leu Lys Ala Pro Val Trp Val Ala Pro Ser Ala Pro Arg Cys
225 230 235 240
Pro Phe Pro Thr Arg His Pro Cys Phe Arg Gly Leu Met Pro Ala Gly
245 250 255
Ile Ala Ala Ile Ser Gln Leu Leu Glu Gly His Asp Val Val Leu Val
260 265 270
Ile Gly Ala Pro Val Phe Arg Tyr His Gln Tyr Asp Pro Gly Gln Tyr
275 280 285
Leu Lys Pro Gly Thr Arg Leu Ile Ser Val Thr Cys Asp Pro Leu Glu
290 295 300
Ala Ala Arg Ala Pro Met Gly Asp Ala Ile Val Ala Asp Ile Gly Ala
305 310 315 320
Met Ala Ser Ala Leu Ala Asn Leu Val Glu Glu Ser Ser Arg Gln Leu
325 330 335
Pro Thr Ala Ala Pro Glu Pro Ala Lys Val Asp Gln Asp Ala Gly Arg
340 345 350
Leu His Pro Glu Thr Val Phe Asp Thr Leu Asn Asp Met Ala Pro Glu
355 360 365
Asn Ala Ile Tyr Leu Asn Glu Ser Thr Ser Thr Thr Ala Gln Met Trp
370 375 380
Gln Arg Leu Asn Met Arg Asn Pro Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ala Ala
385 390 395 400
Gly Gly Leu Gly Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ile Gly Val Gln Leu Ala
405 410 415
Glu Pro Glu Arg Gln Val Ile Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Ala Asn
420 425 430
Tyr Ser Ile Ser Ala Leu Trp Thr Ala Ala Gln Tyr Asn Ile Pro Thr
435 440 445
Ile Phe Val Ile Met Asn Asn Gly Thr Tyr Gly Met Leu Arg Trp Phe
450 455 460
Ala Gly Val Leu Glu Ala Glu Asn Val Pro Gly Leu Asp Val Pro Gly
465 470 475 480
Ile Asp Phe Arg Ala Leu Ala Lys Gly Tyr Gly Val Gln Ala Leu Lys
485 490 495
Ala Asp Asn Leu Glu Gln Leu Lys Gly Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ser
500 505 510
Ala Lys Gly Pro Val Leu Ile Glu Val Ser Thr Val Ser Pro Val Lys
515 520 525
<210> 2
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180
tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240
gctctgtcta acgctcgtac ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300
cgtgctatga tcggtgttga agctggtgaa accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360
ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420
cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480
gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540
tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600
tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660
gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720
ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780
tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840
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atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020
ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080
accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140
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ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440
atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500
gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560
gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587
<210> 3
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
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tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840
taccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900
gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960
atgacttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020
ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080
accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140
gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactt ctgcgctgct 1200
ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260
caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320
gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtatg 1380
ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440
atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500
gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560
gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587
<210> 16
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60
ttcggtaacc cgggttttaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120
tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180
tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240
gctctgtcta acgctcgtac ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300
cgtgctatga tcggtgttga agctagtgaa accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360
ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420
cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480
gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540
tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600
tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660
gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720
ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780
tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840
taccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900
gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960
atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020
ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080
accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140
gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactt ctgcgctgct 1200
ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260
caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320
gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtatg 1380
ctgcgtcggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440
atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500
gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtccgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560
gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587
<210> 17
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60
ttcggtaacc cgggttttaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120
tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180
tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240
gctctgtcta acgctcgtac ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300
cgtgctatga tcggtgttga agctagtgaa accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360
ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420
cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480
gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540
tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600
tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660
gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720
ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780
tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840
taccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900
gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960
atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020
ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080
accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140
gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactc ctgcgctgct 1200
ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260
caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320
gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtatg 1380
ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440
atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500
gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560
gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587
<210> 18
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60
ttcggtaacc cgggttttaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120
tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180
tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240
gctctgtcta acgctcgtac ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300
cgtgctatga tcggtgttga agctggtgaa accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360
ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420
cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480
gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540
tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600
tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660
gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720
ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780
tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840
taccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900
gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960
atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020
ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080
accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140
gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactt ctgcgctgct 1200
ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260
caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320
gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtacg 1380
ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440
atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500
gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560
gtttctaccg ttgctccggt taaataa 1587
<210> 19
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60
ttcggtaacc cgggttttaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120
tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180
tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240
gctctgtcta acgctcgtac ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300
cgtgctatga tcggtgttga agctagtgaa accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360
ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420
cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480
gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540
tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600
tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660
gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720
ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780
tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840
taccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900
gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960
atgacttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020
ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080
accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140
gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactc ctgcgctgct 1200
ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260
caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320
gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtatg 1380
ctgcgttggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440
atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500
gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtctgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560
gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587
<210> 20
<211> 1587
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
atggcttctg ttcacggtac cacctacgaa ctgctgcgtc gtcagggtat cgacaccgtt 60
ttcggtaacc cgggttttaa cgaactgccg ttcctgaaag acttcccgga agacttccgt 120
tacatcctgg ctctgcagga agcttgcgtt gttggtatcg ctgacggtta cgctcaggct 180
tctcgtaaac cggctttcat caacctgcac tctgctgctg gtaccggtaa cgctatgggt 240
gctctgtcta acgctcgtac ctctcactct ccgctgatcg ttaccgctgg tcagcagacc 300
cgtgctatga tcggtgttga agctagtgaa accaacgttg acgctgctaa cctgccgcgt 360
ccgctggtta aatggtctta cgaaccggct tctgctgctg aagttccgca cgctatgtct 420
cgtgctatcc acatggcttc tatggctccg cagggtccgg tttacctgtc tgttccgtac 480
gacgactggg acaaagacgc tgacccgcag tctcaccacc tgttcgaccg tcacgtttct 540
tcttctgttc gtctgaacga ccaggacctg gacatcctgg ttaaagctct gaactctgct 600
tctaacccgg ctatcgttct gggtccggac gttgacgctg ctaacgctaa cgctgactgc 660
gttatgctgg ctgaacgtct gaaagctccg gtttgggttg ctccgtctgc tccgcgttgc 720
ccgttcccga cccgtcaccc gtgcttccgt ggtctgatgc cggctggtat cgctgctatc 780
tctcagctgc tggaaggtca cgacgttgtt ctggttatcg gtgctccggt tttccgttac 840
taccagtacg acccgggtca gtacctgaaa ccgggtaccc gtctgatctc tgttacctgc 900
gacccgctgg aagctgctcg tgctccgatg ggtgacgcta tcgttgctga catcggtgct 960
atggcttctg ctctggctaa cctggttgaa gaatcttctc gtcagctgcc gaccgctgct 1020
ccggaaccgg ctaaagttga ccaggacgct ggtcgtctgc acccggaaac cgttttcgac 1080
accctgaacg acatggctcc ggaaaacgct atctacctga acgaatctac ctctaccacc 1140
gctcagatgt ggcagcgtct gaacatgcgt aacccgggtt cttactactc ctgcgctgct 1200
ggtggtctgg gtttcgctct gccggctgct atcggtgttc agctggctga accggaacgt 1260
caggttatcg ctgttatcgg tgacggttct gctaactact ctatctctgc tctgtggacc 1320
gctgctcagt acaacatccc gaccatcttc gttatcatga acaacggtac ctacggtatg 1380
ctgcgtcggt tcgctggtgt tctggaagct gaaaacgttc cgggtctgga cgttccgggt 1440
atcgacttcc gtgctctggc taaaggttac ggtgttcagg ctctgaaagc tgacaacctg 1500
gaacagctga aaggttctct gcaggaagct ctgtccgcta aaggtccggt tctgatcgaa 1560
gtttctaccg tttctccggt taaataa 1587
<210> 21
<211> 528
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Met Ala Ser Val His Gly Thr Thr Tyr Glu Leu Leu Arg Arg Gln Gly
1 5 10 15
Ile Asp Thr Val Phe Gly Asn Pro Gly Phe Asn Glu Leu Pro Phe Leu
20 25 30
Lys Asp Phe Pro Glu Asp Phe Arg Tyr Ile Leu Ala Leu Gln Glu Ala
35 40 45
Cys Val Val Gly Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Gln Ala Ser Arg Lys Pro
50 55 60
Ala Phe Ile Asn Leu His Ser Ala Ala Gly Thr Gly Asn Ala Met Gly
65 70 75 80
Ala Leu Ser Asn Ala Arg Thr Ser His Ser Pro Leu Ile Val Thr Ala
85 90 95
Gly Gln Gln Thr Arg Ala Met Ile Gly Val Glu Ala Ser Glu Thr Asn
100 105 110
Val Asp Ala Ala Asn Leu Pro Arg Pro Leu Val Lys Trp Ser Tyr Glu
115 120 125
Pro Ala Ser Ala Ala Glu Val Pro His Ala Met Ser Arg Ala Ile His
130 135 140
Met Ala Ser Met Ala Pro Gln Gly Pro Val Tyr Leu Ser Val Pro Tyr
145 150 155 160
Asp Asp Trp Asp Lys Asp Ala Asp Pro Gln Ser His His Leu Phe Asp
165 170 175
Arg His Val Ser Ser Ser Val Arg Leu Asn Asp Gln Asp Leu Asp Ile
180 185 190
Leu Val Lys Ala Leu Asn Ser Ala Ser Asn Pro Ala Ile Val Leu Gly
195 200 205
Pro Asp Val Asp Ala Ala Asn Ala Asn Ala Asp Cys Val Met Leu Ala
210 215 220
Glu Arg Leu Lys Ala Pro Val Trp Val Ala Pro Ser Ala Pro Arg Cys
225 230 235 240
Pro Phe Pro Thr Arg His Pro Cys Phe Arg Gly Leu Met Pro Ala Gly
245 250 255
Ile Ala Ala Ile Ser Gln Leu Leu Glu Gly His Asp Val Val Leu Val
260 265 270
Ile Gly Ala Pro Val Phe Arg Tyr Tyr Gln Tyr Asp Pro Gly Gln Tyr
275 280 285
Leu Lys Pro Gly Thr Arg Leu Ile Ser Val Thr Cys Asp Pro Leu Glu
290 295 300
Ala Ala Arg Ala Pro Met Gly Asp Ala Ile Val Ala Asp Ile Gly Ala
305 310 315 320
Met Ala Ser Ala Leu Ala Asn Leu Val Glu Glu Ser Ser Arg Gln Leu
325 330 335
Pro Thr Ala Ala Pro Glu Pro Ala Lys Val Asp Gln Asp Ala Gly Arg
340 345 350
Leu His Pro Glu Thr Val Phe Asp Thr Leu Asn Asp Met Ala Pro Glu
355 360 365
Asn Ala Ile Tyr Leu Asn Glu Ser Thr Ser Thr Thr Ala Gln Met Trp
370 375 380
Gln Arg Leu Asn Met Arg Asn Pro Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ala Ala
385 390 395 400
Gly Gly Leu Gly Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ile Gly Val Gln Leu Ala
405 410 415
Glu Pro Glu Arg Gln Val Ile Ala Val Ile Gly Asp Gly Ser Ala Asn
420 425 430
Tyr Ser Ile Ser Ala Leu Trp Thr Ala Ala Gln Tyr Asn Ile Pro Thr
435 440 445
Ile Phe Val Ile Met Asn Asn Gly Thr Tyr Gly Met Leu Arg Trp Phe
450 455 460
Ala Gly Val Leu Glu Ala Glu Asn Val Pro Gly Leu Asp Val Pro Gly
465 470 475 480
Ile Asp Phe Arg Ala Leu Ala Lys Gly Tyr Gly Val Gln Ala Leu Lys
485 490 495
Ala Asp Asn Leu Glu Gln Leu Lys Gly Ser Leu Gln Glu Ala Leu Ser
500 505 510
Ala Lys Gly Pro Val Leu Ile Glu Val Ser Thr Val Ser Pro Val Lys
515 520 525

Claims (15)

1.一种制备乳酸的方法，包括如下步骤：以1,3-二羟基丙酮或丙酮醛为底物，用碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物产生乳酸，其中所述方法以如下方式进行：将含有底物的溶液缓慢加添加到含有碱金属氢氧化物的水溶液或者碱土金属氢氧化物的水悬浊液中；其中碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比为(2～80):1；并且其中所述底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛缓慢添加的速率小于或等于5mol/h；
其中所述碱金属氢氧化物为氢氧化钠或氢氧化钾，碱土金属氢氧化物为氢氧化钡。
2.根据权利要求1的方法，其中所述碱金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比为(5～80):1。
3.根据权利要求2的方法，其中所述碱金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比为(10～60):1。
4.根据权利要求2的方法，其中所述碱金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比为(15～50):1。
5.根据权利要求4的方法，其中所述碱金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比为(20～40):1。
6.根据权利要求1的方法，其中所述碱土金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比为(2～10):1。
7.根据权利要求6的方法，其中所述碱土金属氢氧化物与底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的摩尔比为(2～6):1。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛产生乳酸的反应在10～50℃的范围内进行。
9.根据权利要求8的方法，其中所述碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛产生乳酸的反应在20～30℃的范围内进行。
10.根据权利要求9的方法，其中所述碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛产生乳酸的反应在室温下进行。
11.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述底物1,3-二羟基丙酮可以以甲醛为底物，用甲醛转化蛋白催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮；其中所述甲醛转化蛋白具有催化甲醛转化为1,3-二羟基丙酮的功能。
12.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述底物1,3-二羟基丙酮可以以甲醛为底物，用包含具有催化甲醛转化为1,3-二羟基丙酮的功能的甲醛转化蛋白和/或表达该蛋白的多核苷酸的重组载体、转基因细胞系或重组菌株催化甲醛合成1,3-二羟基丙酮。
13.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述碱金属氢氧化物和/或碱土金属氢氧化物催化底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛产生乳酸的反应不在惰性气体保护条件下进行。
14.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的添加速率小于或等于2.5mol/h。
15.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述底物1,3-二羟基丙酮或丙酮醛的添加速率小于或等于1mol/h。
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