CN102858437A - 用于固定功能性物质的底物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

用于固定功能性分子的具有在其上布置的化合物的底物，每一化合物具有链，所述链包含：与底物化学结合的R部分，所述R部分选自醚、酯、羰基、碳酸酯、硫醚、二硫化物、亚磺酰基、磺酰基和硫代羰基；以及通过包含至少一个亲核基团的连接物与R部分结合的含环氧化物的部分。还公开了制备所述底物的方法和所述底物的用途。

Description

用于固定功能性物质的底物及其制备方法

技术领域

本发明通常涉及用于固定功能性物质的底物。本发明还涉及制备所述底物的方法。

背景

分析地或制备地用于研究目的、临床目的、诊断目的和工业目的的生物和化学检验和方法通常需要将功能性物质定位或固定在固体支持物(或底物)上。这种定位通常改善了物质的稳定性和多功能性而不危害其效能和活性，并且能够重复使用所述物质。例如，当在酶催化的工业加工中使用时，包括诸如酶的生物物质的功能性物质通常固定在惰性支持物上，例如二氧化硅或聚丙烯酰胺凝胶，从而改善其对抗改变pH或温度条件的稳定性，并且促进其从反应产物的后续分离。这使固定的酶能够重新使用并且显著促进产品纯化，这导致更划算的过程。

可以通过物理固定或化学固定实现包括生物物质在内的功能性物质的固定。物理固定的一种形式为物理吸附(物理吸附(physisorption))，其中功能性物质或生物物质通过包封或静电、疏水或范德华力与底物连接。尽管物理吸附提供了相对简单的固定方法，其具有对全范围的功能性物质和/或生物物质的广泛适用性，但其通常不提供足够地稳定固定并且易于浸出固定的功能性物质和/或生物物质。

固定功能性物质和/或生物物质的更稳定的方法为化学固定，由于化学反应其使功能性物质和/生物物质共价连接至底物。化学固定通常导致功能性物质和/或生物物质的改进的活性、降低的非特异性吸附和较高的稳定性。然而，化学固定通常需要功能性和/或生物物质或底物的化学修饰以促进其有效的结合。

为了改善其与功能性物质和/或生物物质的结合，固体支持材料的表面修饰或固体支持物的“预活化”典型地涉及在通常为弱反应性聚合材料的表面上加入反应性化学部分。能够通过物理方法或化学方法实现表面修饰，所述物理方法例如亲和性间隔物的非共价连接，所述化学方法例如戊二醛活化、溴化氰活化、溴乙酰化、重氮化、电离辐射诱导的氧化和化学接枝。

然而，亲和性间隔物的非共价连接与较差的再现性和/或与底物表面的不稳定连接有关。某些共价连接，最值得注意的是亚胺，较少值得注意的是酯，能在用于酶反应的反应条件下被水解，这导致固定的酶的部分损失以及酶向反应介质的渗入。其中，这样的问题可以影响基于戊二醛活化和溴乙酰化的固定方法。尽管重氮化、溴化氢活化、电离辐射诱导的氧化和化学接枝产生了比非共价键更稳定的共价键，但这些方法涉及使用有害的、昂贵的、复杂的和/或苛刻的反应条件。

这些方法中的某些还导致固体支持物上的高净电荷，这导致在生物/化学过程的后续步骤中功能性物质和/或生物物质的不期望的非特异性静电结合。在使用苛刻的反应条件时遇到的另一常见问题是表面性质的不利修饰，这可以限制功能性物质和/或生物物质的连接，特别是大聚合物质。这能够导致功能性物质和/或生物物质在底物上的低负载。某些可商购的活性固体支持物遇到的其他问题为低稳定性、明显的毒性和缺乏生物相容性，这导致短的保存期、难以操作和对医疗用途的有限适用性。

这些方法的某些依赖于用环氧硅烷偶合剂对“预活化”支持物进行进一步修饰，以用于亲水分子的固定。其他方法依赖于通过使双环氧环氧乙烷连接物反应来将分子固定于底物，从而制备底物。这些方法中使用的脂肪族连接物导致可用于固定的反应性基团的量降低，生物相容性降低并且再现性降低。

亟需提供制备克服或至少改善上述缺点的一个或多个的用于固定功能性物质和生物物质的底物的方法。

亟需提供方便的、便宜的、稳健的和可靠的制备用于固定功能性物质和生物物质的底物的方法。

还亟需提供稳定的、易于操作的、便宜的、无毒的、生物相容的并且生物可降解的用于固定功能性活性物质和生物活性物质的底物，并且其能够用于以高装填密度来固定广泛的物质，并具有改进的活性和反应性。

概述

根据本发明的第一方面，提供了用于固定功能性分子的具有布置在其上的化合物的底物，每一化合物具有的链包含：化学结合至底物的R部分，所述R部分选自醚、酯、羰基、碳酸酯、硫醚、二硫化物、亚磺酰基、磺酰基和硫代羰基(carbonothioyl)；以及通过含至少一个亲核基团的连接物与R部分结合的含环氧化物的部分。

在一个实施方案中，底物包含与所述链结合的额外的含环氧化物的基团。在另一实施方案中，额外的含环氧化合物的基团的数量选自数量1、2、3、4和5。在一个实施方案中，连接物包含所述额外的亲核基团，使额外的含环氧化物的基团通过其与所述链结合。这是有利的，因为可用于与功能性分子反应的含环氧化物的基团的密度增加，并且因此可用于固定物质的固定位点的数量也增加。

本公开的一个优势是连接物增加了功能性分子和底物之间的系链的长度并且促进了功能性分子与底物的结合。

在另一实施方案中，连接物包含双亲核物质。在一个实施方案中，双亲核连接物选自烷基-二胺和烯烃-二胺的至少一种。有利地，二胺连接物可以引入额外的用于环氧活化的位点。不受理论的限制，认为高至五个分子的含环氧化物的化合物(例如，表氯醇)能够与一个分子的二胺连接物反应。这是有利的，因为例如这允许含环氧化物的化合物密度的增加并由此增加可用于固定功能性分子的固定位点的数量。

在另一实施方案中，连接物包含多亲核物质。在另一实施方案中，多亲核物质可以为多胺，例如腐胺、亚精胺、精胺、尸胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺和四氢糠胺。

连接物的胺基的引入还有利地充当固定的物质的内部pH缓冲剂。还有利地，胺基还能够用作离子交换剂以向固定的物质提供稳定条件。还有利地，胺基是强亲核性的，使得第一和第二含环氧化物的化合物的结合比诸如OH基团的其他亲核基团更有效。连接物的胺基的强亲核性是进一步有利的，因为这允许使用长连接物，同时保持与含环氧化物的化合物的反应性。这是进一步有利的，因为使用更长的连接物允许底物和固定的物质之间的位阻进一步降低。更有利地，与其他连接物相比，诸如己二胺的二胺是较便宜的，并且是可商购的商品材料。己二胺的低成本确保了能够以较低成本大量生产公开的底物。

还有利地，含环氧化物的化合物和己二胺连接物之间形成的烷基-胺键在生理学条件下是抗水解的，使得其能够用于水性系统，例如透析装置。还有利地，本公开的底物是生物惰性的。

根据第二方面，提供了在底物上固定功能性分子的方法，其包括将功能性分子暴露于本公开的底物的步骤。

根据第三方面，提供了制备用于在其上固定功能性分子的底物的方法，所述方法包括下列步骤：(i)提供与底物表面结合的亲电子化合物；(ii)使亲电子化合物进行亲核取代反应以在其上提供亲核基团并由此增加底物表面的亲核性；(iii)使亲核基团与另一亲电子化合物进行亲核取代反应以在底物表面上提供亲电子基团并由此增加底物的亲电子性。

所述方法的优势是与底物的亲电子基团连接的延长的间隔物提供了增加的功能性化合物到亲电子基团的可达性，并且同时允许亲电子基团对功能性分子的密度和反应性的增加，由此将功能性分子固定在底物上。还有利地，方法的步骤(iii)还提供了功能性分子到亲电子基团的增加的可达性以用于在底物上的后续固定。

在一个实施方案中，将步骤(ii)和(iii)重复n次以在所述底物上形成n代亲电子基团。这是有利的，因为这允许间隔物的延长并且增加亲电子基团的密度并由此增加可用于将功能性分子固定于底物的固定位点的数量。

还有利地，方法的步骤(iii)允许在连接物和第二亲电子化合物之间的较快反应。这导致亲电子化合物的降低的水解速率以及非水解的亲电子基团到底物上的较高加入。这还是有利的，因为这还允许增加亲电子基团在底物上的密度以用于固定功能性分子。

方法的另一优势是相对于底物替换了亲电子基团，使得相对于仅具有一个直接结合至底物的亲电子化合物的底物，功能性分子被固定在其上的能力增加。还有利地，这种相对的替换还允许功能性分子到亲电子基团的增加的可达性，从而用于在底物上的后续固定。

根据第四方面，提供了用于透析装置的吸附剂盒，所述吸附剂盒包含本文所述的底物以用于固定尿素酶。

根据第五方面，提供了透析方法，其包括下列步骤：将含尿素的透析液暴露于本文所述的底物，并且从所述底物移除透析液。

根据第六方面，提供了用于透析装置的透析器，所述透析器包括本文所述的底物以用于固定尿素酶。因此，尿素酶可以被固定在透析膜上，例如包含在透析器内的醋酸纤维素膜过滤器。

根据第六方面，提供了修饰透析膜以在其上固定功能性分子的方法，所述方法包括下列步骤：

(i)将亲电子化合物结合于膜表面；

(ii)使亲电子化合物进行亲核取代反应以在其上提供亲核基团并且由此增加膜表面的亲核性；以及

(iii)使亲核基团与另一亲电子化合物进行亲核取代反应以在膜表面上提供亲电子基团并且由此增加膜表面的亲电子性以用于在其上固定功能性分子。

在一个实施方案中，所述膜是醋酸纤维素膜。

有利地，所述方法能够用于修饰透析器的现成的透析膜，例如醋酸纤维素膜。当用于透析器时，这种修饰步骤使透析膜的表面具有在其上固定功能性分子、例如透析液酶的增加的能力。

根据第八方面，提供了本文所述的底物在透析装置中的用途。

在一个实施方案中，提供了制备用于在其上固定功能性物质的底物的方法，所述方法包括下述步骤：将第一亲电子化合物化学结合至底物；以及将第二亲电子化合物化学结合至已与底物结合的第一亲电子化合物，其中当结合至所述第一亲电子化合物时，所述第二亲电子化合物被设定为固定其上的功能性物质。

有利地，选择第一和第二亲电子化合物以互相替换，使得相对于仅具有一个结合至底物的亲电子化合物的底物，功能性物质被固定在其上的能力增加。更有利地，选择第一和第二亲电子化合物以互相替换，使得第二亲电子体附近的位阻效应降低或最小化，从而增加功能性物质与所用第二亲电子化合物的结合。

更有利地，第一和/或第二亲电子化合物可以为有效将弱亲核底物转化为强亲电子底物的二亲电子体。这构成了底物的极性和反应性的变化。

更有利地，与由已知方法制备的底物相比，所述方法是制备与在其上固定的功能性物质具有较高反应性的底物的简单且划算的方式。更有利地，第二亲电子化合物能够稳定地结合至功能性物质，其包括诸如酶的生物物质。甚至更有利地，第二亲电子化合物提供了用于功能性物质的连接位点，其位于离底物的适当距离以使位阻降低。在一个实施方案中，每克底物中亲电子基团的密度为约0.1mmol/g至约1mmol/g。

这反过来降低了固定功能性物质期间的障碍，并且允许功能性物质容易通过第二含环氧化物的化合物而固定在底物上。这还增加了结合物质(酶)的可达性和结构柔性，由此增加其活性。公开的方法还能够制备能够固定手性配体、亲和性配体和/或离子交换颗粒的底物。

在一个实施方案中，第一和第二亲电子化合物为含环氧化物的化合物。在一个实施方案中，公开的方法包括使用连接物将第二含环氧化物的化合物结合至第一含环氧化物的化合物的步骤。这增加了活性环氧乙烷位点和底物之间的系链长度，并且促进了功能性物质与环氧乙烷位点的结合。这还增加了可达性，并由此增加了诸如酶的结合物质的活性。有利地，连接物可以包含额外的官能团以将期望的化学性质给予底物。例如，连接物可以包含具有缓冲性质的胺基，当将底物用于诸如透析装置的应用时，其可以为有利的。连接物还可以包含能够用作抗氧化剂或金属清除剂的基团，其补充了底物在某些应用中的功能。更有利地，连接物还可以提供增加的位点以用于结合第二亲电子化合物和/或后续含环氧化物的化合物。实际上，连接物可以增加结合至底物的含环氧化物的化合物的数量，其反过来增加固定功能性物质的可能性和强度。连接物还可以为中性和惰性的，其未消极地影响与其连接的功能性物质或生物物质的功能或生物性质。

在一个实施方案中，连接物不包含环氧化物基团。功能连接物还可以包含亲核基团。有利地，亲核基团为反应性的并且能够化学结合至亲电子(含环氧化物)的化合物。在一个实施方案中，功能性连接物为双亲核连接物。两个亲核基团的存在使连接物结合至第一和第二含环氧化物的化合物二者，形成两个含环氧化物的化合物之间的桥。在一个实施方案中，双亲核连接物的至少一个亲核体选自NH、NR、NHO、NRO、O、S、Se、COO、CONH、CONR、CSS、COS、CONHO、CONRO、CONHNH、CONRNH、CONR¹NR²、CNO、Ph和PR，其中R、R¹和R²独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。

双亲核连接物也可以具有通式(I)：

通式(I)

其中：

X和Y独立地选自NH、NR、NHO、NRO、O、S、Se、COO、CONH、CONR、CSS、COS、CONHO、CONRO CONHNH、CONRNH、CONRNR、CNO、PH和PR；

R选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

n为0至25的整数。

在另一实施方案中，所述双亲核连接物具有通式(II)：

通式(II)

其中：

X和Y独立地选自NH、NR、NHO、NRO、O、S、Se、COO、CONH、CONR、CSS、COS、CONHO、CONRO CONHNH、CONRNH、CONRNR、CNO、PH、PR；

其中R、R¹、R²、R³、R⁴独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

m、n、p和q为独立地选自0至25的整数。

在一个实施方案中，所述双亲核连接物为烷基-二胺，例如己二胺或乙烯二胺。有利地，二胺连接物可以引入额外的用于环氧活化的位点。不受理论的限制，认为高至五分子的含环氧化物的化合物(例如，表氯醇)能够与一分子的二胺连接物反应。这是有利的，因为这允许增加例如含环氧化物的化合物的密度，并由此增加可用于固定物质的固定位点的数量。连接物的胺基的引入还有利地充当固定的物质的内部pH缓冲剂。还有利地，胺基还能用作离子交换剂以提供用于固定的物质的稳定条件。还有利地，胺基是强亲核的，使第一和第二含环氧化物的化合物的结合比其他亲核基团更有效。连接物的胺基的强亲核性是进一步有利的，因为这允许使用长连接物，同时保持与含环氧化物的化合物的反应性。这是进一步有利的，因为更长连接物的使用允许进一步降低底物和固定的物质之间的位阻。更有利地，与其他连接物相比，己二胺是较便宜的，并且是可商购的商品材料。己二胺的低成本确保了能够以较低成本大量生产公开的底物。还有利地，当使用己二胺连接物时形成的烷基胺键在生理学条件下是抗水解的，使得其能够用于水性系统，例如透析装置。己二胺连接物的其他优势是其为生物相容的和生物可降解的。

在一个实施方案中，亲电子化合物和第二亲电子化合物的至少一个是表卤代醇。优选地，表卤代醇是表氯醇。类似地，与其他表卤代醇相比，表氯醇是较便宜的并且是容易得到的，因为它是可商购的商品材料。此外，表氯醇的低成本确保了能够以较低成本大量生产公开的底物。表氯醇还倾向于非常快且彻底地反应，仅产生无毒性的产物(丙三醇和氨基-丙三醇)，因此适于在制备最终用于医疗用途的底物中的用途。此外，因为表氯醇与水部分地混合并且与醇完全混合，所以能够通过用水和/或醇洗涤底物而相对容易地除去任意过量的表氯醇。此外，表氯醇及其水解产物是易挥发的，并且能够因此通过蒸发而有效地除去。

在一个实施方案中，所述方法包括选择弱反应性的底物。公开的方法的底物可以为珠、微米尺寸(micro-sized)的颗粒、纳米尺寸的颗粒、膜、网、支架或任意固体支持物，其能够使用公开的方法而制备以在其上固定包括生物物质在内的功能性物质。在一个实施方案中，底物选自聚酯底物、聚酰胺底物、环氧树脂底物、聚丙烯酸酯底物、羟基-功能化底物和基于多糖的底物。所述基于多糖的底物可以选自棉绒、棉浆、棉织物、纤维素纤维、纤维素珠、纤维素粉末、微晶纤维素、纤维素膜、人造丝、玻璃纸、醋酸纤维素、醋酸纤维素膜、壳聚糖、壳质、葡聚糖衍生物和琼脂糖衍生物。底物还可以为生物可降解的，并且由此为环境友好的，其允许它们在环境敏感性应用中的应用，例如农业应用或废物处理应用。底物还可以为生物相容的，使得当将底物植入人体或与人体连接时，例如在透析中，较少引起或不引起不利的健康影响。

可以在-30°C至100°C的温度下，优选在0°C至100°C的温度下进行公开的方法的化学结合步骤。在一个实施方案中，在约50°C至60°C的温度下进行将第一亲电子化合物化学结合至底物的步骤；在约20°C至40°C的温度下进行将连接物化学结合至第一亲电子化合物的步骤；在约20°C至40°C的温度下进行将第二亲电子化合物化学结合至连接物的步骤；在约2°C至6°C的温度下进行将功能性物质化学结合至第二亲电子化合物的步骤。有利地，能够在诸如室温和常压的温和条件下生产和/或制备底物。这再次转化为较低的生产成本和增加的操作容易度。更有利地，能够在非常温和的条件下，例如在水性缓冲液中、在2°C至6°C和常压下，进行最终固定反应，并且不需要任何额外的试剂。这消除了例如在其他固定方法中可能成问题的，由极端条件或强试剂失活生物活性物质或使生物活性物质变性的风险。甚至更有利地，因为能够在环境温度下进行所述方法，也可以同时或在活化底物之后进行生物活性物质在底物上的固定。

在一个实施方案中，功能性物质是生物活性物质，例如酶，如尿素酶。有利地，当将尿素酶固定在底物上时，含固定的尿素酶的底物能够用于透析应用，例如用于再生腹膜透析液或血液透析液。所述酶也可以为尿酸酶、肌酸酐酶、脂肪醚、酯酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、过氧化氢酶、酰基转移酶、青霉素酰胺酶、蛋白酶-K的至少一种。

在一个实施方案中，公开的方法还包括下列步骤：将一种或多种后续亲电子化合物化学结合至第一和第二亲电子化合物二者，其中所述后续亲电子化合物当与所述第一和第二亲电子化合物二者结合时被设定为固定其上的功能性物质。例如，第三、第四、第五、第六亲电子化合物等可以与第一和第二亲电子化合物二者结合。本文公开的亲电子基团可以包含至少一个环氧化物基团。

在另一实施方案中，提供了在底物上固定功能性分子的方法，所述方法包括下列步骤：提供由本公开的方法制备的在其上具有化合物的底物，每一所述化合物包含与底物化学结合的含醚的部分以及与醚部分结合的含环氧化物的部分；以及将含所述功能性分子的溶液引入布置在所述底物上的所述化合物，其中所述含环氧化物的部分与所述功能性分子形成化学键以固定其中的功能性分子。

有利地，这种化学键可以为不可水解的共价键，例如胺键。因此，功能性分子将被固定在具有足够稳定性的底物上，并且不能从底物被容易地除去。

第二方面的方法可以进一步包括下列步骤：将稳定添加剂的基本均匀的混合物涂覆到底物表面上以稳定所述功能性分子。在一个实施方案中，将添加剂的基本均匀的混合物涂覆到底物上的步骤包括蒸发添加剂溶液的溶剂。稳定添加剂可以选自诸如葡萄糖的糖、诸如乙二胺四乙酸的有机酸、诸如半胱氨酸的氨基酸，和诸如抗坏血酸的糖酸，以及诸如巯基乙醇的硫醇。

在另一实施方案中，提供了具有在其上布置的化合物的底物以用于固定功能性分子，每一化合物包含与底物化学结合的含醚的部分以及通过包含至少一个亲核基团的连接物与醚部分结合的含环氧化物的部分，由此从所述含醚的部分布置所述含环氧化物的部分以将功能性分子固定于所述含环氧化物的部分，而没有由所述含醚的部分或底物导致的大量位阻。有利地，当与能够有效固定功能性物质的已知底物相比时，底物具有改进的稳定性并且能够以较低成本生产。更有利地，由于生物分子和含环氧化物的部分之间的结合的高稳定性，所以能够重复地再利用底物，而不显著损失其的酶性质。另外，由于没有潜在有害的物质的浸出，所以该底物适于在医疗应用中的用途，例如用于腹膜透析。

在一个实施方案中，连接物为非烃，例如肼、羟胺、氨、水或硫化氢。

在一个实施方案中，连接物为具有2至18个碳原子、2至16个碳原子、2至14个碳原子、2至12个碳原子、或2至10个碳原子、2至8个碳原子、2至6个碳原子和2至4个碳原子的饱和或不饱和脂肪链。在一个实施方案中，连接物为具有4至8个碳原子、更优选为6个碳原子的饱和脂肪链。所述连接物的亲核基团可以位于脂肪链的末端之一或者位于脂肪链的末端之间。在一个实施方案中，所述连接物的亲核基团可以通过从其延伸的支链而化学地结合于脂肪链。在一个实施方案中，在所述连接物上布置两个亲核基团，优选在脂肪链的末端。在一个实施方案中，在脂肪链的末端上布置至少一个亲核基团，并且结合至醚或含环氧化物的部分，所述结合通过它们之间的次级脂肪连接物链。所述次级脂肪连接物链可以具有1至3个碳原子。

底物可以进一步包含布置在所述底物上的涂层，所述涂层包含稳定添加剂的基本均匀的混合物。稳定添加剂可以选自诸如葡萄糖的糖、诸如乙二胺四乙酸的有机酸、诸如半胱氨酸的氨基酸和诸如抗坏血酸的糖酸。

在另一实施方案中，提供了用于透析装置的吸附剂盒，所述吸附剂盒包括具有在其上布置的化合物的底物，所述化合物包括固定的尿素酶，每一化合物包括与底物化学结合的含醚的部分和通过包含至少一个亲核基团的连接物而与醚部分结合的含环氧化物的部分，由此从所述含醚的部分布置所述含环氧化物的部分以将尿素酶分子固定至所述底物，而没有由所述含醚的部分或底物导致的大量位阻。

在另一实施方案中，提供了透析方法，其包括下列步骤：将含尿素的透析液暴露于具有在其上布置的化合物的底物，所述化合物包括固定的尿素酶，每一化合物包括与底物化学结合的含醚的部分和通过包含至少一个亲核基团的连接物而与醚部分结合的含环氧化物的部分，由此从所述含醚的部分布置所述含环氧化物的部分以将尿素酶分子固定至所述底物，而没有由所述含醚的部分或底物导致的大量位阻；并且在分解至少一部分的所述尿素之后，从所述底物除去透析液。

在另一实施方案中，提供了本公开的底物在透析装置中的用途。有利地，所述底物能够在透析装置中用于从透析液有效并安全地除去毒素。

定义

本文所用的下列词语和术语应具有给出的含义：

术语“环氧化物”、“环氧基团”或“环氧乙烷”描述了由两个碳原子和一个氧原子的三元环布置组成的化学官能团。可以独立取代三元环中的两个碳原子。术语“环氧化物”也可以描述包括至少一个环氧基团的分子或化合物。

术语“含环氧化物的化合物”是指为环氧化物的任意化合物，或者包含环氧化物部分的化合物。示例性的含环氧化物的化合物为：环氧烷烃，并且特别是低级环氧烷烃，例如环氧乙烷、环氧丙烷、环氧丁烷；诸如环氧丙醇的环氧醇；以及表卤代醇，例如表氯醇、表溴醇、表碘醇，1,2-环氧基-4-氯丁烷、l,2-环氧基-4-溴丁烷、1,2-环氧基-4-碘丁烷、2,3-环氧基-4-氯丁烷、2,3-环氧基-4-溴丁烷、2,3-环氧基-4-碘丁烷、2,3-环氧基-5-氯戊烷、2,3-环氧基-5-溴戊烷、1,2-环氧基-5-氯戊烷等；环氧化合物，例如2,2-双(对-1,2-环氧丙氧基苯基)-丙烷、1,4-双(1,2-环氧丙氧基)苯、N,N’-双(2,3-环氧丙基)哌嗪等。

如本文所用的术语“亲电子基团”、“亲电子体”等是指能够接受电子对以形成共价键的原子或原子团。如本文所用的“亲电子基团”包括但不限于卤化物、羰基和含环氧化物的化合物。常见亲电子体可以为：卤化物，例如硫光气、二氯甘油、邻苯二甲酰氯、琥珀酰氯、氯乙酰氯、氯琥珀酰氯等；酮，例如氯丙酮、溴丙酮等；醛，例如乙二醛等；异氰酸酯，例如，六亚甲基二异氰酸酯、甲苯二异氰酸酯、间-亚二甲苯基二异氰酸酯、环己基甲烷-4,4-二异氰酸酯等，以及这些化合物的衍生物。

如本文所用的术语“亲核基团”、“亲核体”等是指具有能够形成共价键的电子对的原子或原子团。这种类型的基团可以为作为阴离子基团而反应的可电离基团。如本文所用的“亲核基团”包括但不限于羟基、伯胺、肿胺、叔胺和硫醇。

术语“醚”或“含醚的”是指一类通式R-O-R的有机化合物，其中R为碳。如本文所用的术语“醚”或“含醚的”旨在排除其中R不为碳的那些化合物，例如唾液酸化醚(sialyl ether)、Si-O-Si。

术语“多胺”是指具有至少两个带正电的氨基的有机化合物，所述氨基选自伯氨基、仲氨基和叔氨基。因此，多胺包括二胺、三胺和更高级的胺。

如本文所用的术语“生物可降解的”或“生物可降解的聚合物”是指可降解的和/或可作堆肥的环境友好的材料。这样的材料可以由多种活体有机体或者可由暴露于光和/或氧而为降解的/可作堆肥的。因此，如本文所用的术语“生物可降解的”应被理解为包括为氧生物可降解的、光生物可降解的和微生物生物可降解的材料。

术语“生物相容的”或“生物相容的聚合物”是指当以所用量与诸如血浆或血液的生物液体接触时，为无毒的、非迁移的、化学惰性的和基本无免疫原性的聚合物。适当的“生物相容的聚合物”包括例如多糖，例如纤维素或壳多糖。

术语“生物聚合物”是指由活体有机体产生或衍生自活体有机体的聚合物。示例性的生物聚合物包括多肽、核酸和多糖，例如纤维素和壳多糖。

当用于描述分子或物质时，术语“功能性”是指以确定物质和与其连接的分子的化学性质的方式而排列的原子团。功能性基团的实例包括卤素原子、酰胺基、羟基、羧酸基团等。

术语“靶分子”是指要被检测、分离或探测的并能够与诸如生物物质的功能性物质反应或结合的分子。示例性的靶分子包括蛋白质、多糖、糖蛋白、激素、受体、脂质、小分子、药物、代谢物、辅因子、过渡态类似物和毒素，或不与其同源核酸互补的任意核酸。靶分子可以为体内、体外、原位或离体的。

本文使用的术语“功能性物质”等宽泛地指具有能够与靶分子反应或结合或者具有与靶分子亲和性的位点的分子或活性物质。术语“功能性物质”等宽泛地包括生物物质和生物分子。

本文使用的术语“生物物质”或“生物分子”等是指基本为生物起源的任意物质和化合物。因此，该术语不仅包括天然分子，例如能从自然起源分离的那些，而且还包括从其衍生的形态、片段和衍生物，以及重组形态和人造分子，只要存在天然分子的至少一种性质。因此，该术语包括由活体有机体产生的有机分子，包括大聚合分子，例如蛋白、多糖和核酸，以及小分子，例如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。

本文使用的术语“生物活性物质(biologically active substance)”、“生物活性物质(bioactive substance)”等宽泛地指具有能够与靶分子反应或结合或者具有与靶分子亲和性的位点的生物分子或生理学活性物质。其包括但不限于：具有催化活性位点的物质，例如酶；具有能够与具体化合物或具体种类的化合物结合的位点的物质，例如核酸寡核苷酸、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或凝集素、维生素、肽、蛋白质、激素、内分泌干扰化学物、糖、脂质等。

术语“弱反应性底物”是指由在化学上或生物上不与上述功能性物质或生物物质显著反应的材料组成的底物。在某些实施方案中，功能性物质或生物物质可以包括生物分子，并且非反应性底物由为生物相容的材料组成，因为底物材料不为有毒的并且不对人体导致任何不利的健康影响。也为生物相容的非反应性底物通常是一般为不溶的、柔性的聚合材料，并且其能够符合许多不同形状，包括曲面。应当注意，术语“聚合物”用于表示具有高分子量的由许多通过共价键连接在一起的结构单元组成的化学化合物。一个示例性的为非反应性并与上述生物物质生物相容的聚合材料是多糖纤维素。

如本文所用的术语“连接物”和“间隔物”是指连接化合物的两个部分的有机部分。

如本文所用的术语“烷基”在其含义内包括单价(“烷基”)和二价(“亚烷基”)的直链或支链或环状饱和脂肪族基团，其具有1至25个碳原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碳原子。例如，术语烷基包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、戊基、1,2-二甲基丙基、1,1-二甲基丙基、戊基、异戊基、己基、4-甲基戊基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、1,2,2-三甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、庚基、1-甲基己基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊基、1,2-二甲基戊基、1,3-二甲基戊基、1,4-二甲基戊基、1,2,3-三甲基丁基、1,1,2-三甲基丁基、1,1,3-三甲基丁基、5-甲基庚基、1-甲基庚基、辛基、壬基、癸基等。低级烷基是上述具有1至6个碳原子、优选1至4个碳原子的烷基。

如本文所用的术语“烯基”在其含义内包括单价(“烯基”)和二价(“亚烯基”)的直链或支链或环状不饱和脂肪族烃基团，其具有2至25个碳原子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碳原子并且若适当地，在烷基链的任意位置至少一个双键，其为E、Z、顺式或反式的立体化学。烯基的实例包括但不限于乙烯基、烯丙基、1-甲基乙烯基、1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、2-甲基-1-丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基、1,3-丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1,3-戊二烯基、2,4-戊二烯基、1,4-戊二烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、2-甲基戊基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、1-壬烯基、1-癸烯基等。低级烯基是上述具有2至6个碳原子、优选2至4个碳原子的烯基。

如本文所用的术语“炔基”在其含义内包括单价(“炔基”)和二价(“亚炔基”)的直链或支链或环状不饱和脂肪族烃基，其具有2至10个碳原子，并且在碳链的任意位置具有至少一个叁键。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-甲基-2丁炔基、3-甲基-1-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、甲基戊炔基、1-庚炔基、2-庚炔基、1-辛炔基、2-辛炔基、1-壬炔基、1-癸炔基等。低级炔基是上述具有2至6个碳原子、优选2至4个碳原子的炔基。

如本文所用的术语“芳基”是指具有一个或多个芳香环的单-或多-环的碳环体系，其包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。芳基(包括双环芳基)能够为未取代的或被一个至五个取代基或更多取代基(典型地，对于单环芳基为一至五个取代基，并且对于双环/寡环芳基为多于五个取代基)取代，所述取代基独立地选自烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、巯基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰基氨基、氨基酰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、叠氮基、氰基、卤素、硝基、甲醛、羧基、甲酰胺、脲、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、膦和受保护的羟基。另外，取代的芳基包括四氟苯基和五氟苯基。

无论单独使用或作为另一基团的一部分，术语“杂芳基”是指取代的或未取代的芳香族杂环体系(单环或双环)。杂芳基能够具有例如约3至约50个碳原子。杂芳基通常包括芳香族杂环体系，其具有约4至约14个环原子并且包含碳原子和1、2、3或4个选自氧、氮或硫的杂原子。典型的杂芳基包括但不限于呋喃、噻吩、吲哚、氮杂吲哚、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、咪唑、N-甲基咪唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、吡咯、N-甲基吡咯、吡唑、N-甲基吡唑、1,3,4-噁二唑、1,2,4-三唑、1-甲基-1,2,4-三唑、1H-四唑、1-甲基四唑、苯并噁唑、苯并噻唑、苯并呋喃、苯并异噁唑、苯并咪唑、N-甲基苯并咪唑、氮杂苯并咪唑、吲唑、喹唑啉、喹啉和异喹啉。双环芳香族杂芳基包括苯基、吡啶、嘧啶或哒嗪(pyridizine)环，其为(a)与具有一个氮原子的6元芳香族(不饱和)杂环稠合的；(b)与具有两个氮原子的5-或6-元芳香族(不饱和)杂环稠合的；(c)与具有一个氮原子以及一个氧原子或一个硫原子的5元芳香族(不饱和)杂环稠合的；或者(d)与具有一个选自O、N或S的杂原子的5元芳香族(不饱和)杂环稠合的。术语“杂芳基”还包括例如被1至5个取代基取代的芳香族杂环，所述取代基独立地选自烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、硫代烷氧基、羟基、巯基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰基氨基、氨基酰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、叠氮基、氰基、卤素、硝基、甲醛、羧基、甲酰胺、脲、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、膦和受保护的羟基。

如本文所用的术语“任选取代的”是指该术语所指的基团可以为未取代的，或者可以被一个或多个基团取代，所述基团独立地选自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、硫代烷基、环烷基、环烯基、杂环烷基、卤素、羧基、羧基烷基、卤代烷基、卤代炔基、羟基、烷氧基、硫代烷氧基、巯基、烯氧基、卤代烷氧基、卤代烯氧基、硝基、氨基、硝基烷基、硝基烯基、硝基炔基、硝基杂环基、烷基氨基、二烷基氨基、烯基胺、炔基氨基、酰基、烯酰基、炔酰基、酰基氨基、二酰基氨基、氨基酰基、酰氧基、烷基磺酰氧基、杂环氧基、杂环氨基、卤代杂环烷基、烷氧基碳基、芳氧基羰基、叠氮基、甲醛、羧基、甲酰胺、脲、氨基甲酸酯、肟、羟胺、硫酸酯、磺酸酯、亚磺酸酯、烷基亚磺酰基、烷基羰氧基、烷硫基、酰硫基、诸如磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯和膦的含磷基团、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、氰基、氰酸酯、异氰酸酯、-C(O)NH(烷基)、-C(O)N(烷基)₂和-C(O)NR’R”，其中R’和R”独立地为本文定义的氢、烷基、芳基或杂芳基。

如本文所用的术语“卤素”或诸如“卤化物”或“卤代”的变体是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用的术语“氨基”或“胺”是指-NR_aR_b形式的基团，其中R_a和R_b单独选自下列基团，其包括但不限于氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基和任选取代的芳基。

术语“化学结合的”和“化学结合”及其语法变体是指分子的共价和非共价结合，并且具体但不排外地包括共价结合、静电结合、氢键结合和范德华键结合。该术语包括分子的间接和直接结合两种。因此，如果第一化合物与第二化合物化学结合，则该连接可以通过直接化学结合或通过与其他化合物、连接物或结合物的间接化学结合。

如本文所用的术语“尿素酶单元”或尿素酶“酶单元”[U]是指酶(尿素酶)的量，其导致在23°C和pH 7.5下每分钟释放一微摩尔的氨。

词语“基本”不排除“完全”，例如“基本没有”Y的组合物可以完全没有Y。若需要，可以从本发明的定义中删去词语“基本”。

除非另外指明，术语“包括(comprising)”和“包括(comprise)”及其语法变体旨在表示“开放的”或“涵括的”表达方式，使得它们包括引用的元素而且允许包括额外的未引用的元素。

在制剂组分的浓度的语境中，如本文所用的术语“约”通常表示指定值的+/-5%，更通常为指定值的+/-4%，更通常为指定值的+/-3%，更通常为指定值的+/-2%，甚至更通常为指定值的+/-1%，并且甚至更通常为指定值的+/-0.5%。

在整个本公开中，可以以范围形式公开某些实施方案。应当理解范围形式的说明书仅是为了方便和简洁的目的，并且不应被理解为对所公开范围的范围的不可变限制。因此，范围的描述应被理解为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，诸如1至6的范围描述应该被理解为已经具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围以及该范围内的单个值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度这均适用。

实施方案的详细内容

现在公开制备用于在其上固定功能性物质的底物和用于在其上固定功能性分子的底物的方法的示例性、非限制性实施方案。

底物具有在其上布置的用于固定功能性分子的化合物，每一化合物具有链，其包括与底物化学结合的R部分，所述R部分选自醚、酯、羰基、碳酸酯、硫醚、二硫化物、亚磺酰基、磺酰基和硫代羰基；以及通过包括至少一个亲核基团的连接物与R部分连接的含环氧化物的部分。

在一个实施方案中，R部分进一步选自胺、酰胺、脲、尿素和胍。

在一个实施方案中，亲核基团排除了含氧的部分和含硫的部分中的至少一个。

在另一实施方案中，底物包括与链结合的额外的含环氧化物的基团。在一个实施方案中，额外的含环氧化物的基团的数量选自数量1、2、3、4和5。在另一实施方案中，至少一个额外的含环氧化物的基团通过所述连接物的亲核基团与所述链结合。

连接物可以包括所述额外的亲核基团，额外的含环氧化物的基团通过其与所述链结合。在另一实施方案中，额外的含环氧化物的基团可以通过与所述连接物的额外的亲核基团连接而从所述链分枝。

在一个实施方案中，所述连接物的亲核基团为胺。连接物可以选自饱和及不饱和的脂肪族和芳香族的胺、二胺和三胺。在一个实施方案中，所述胺的脂肪族基团为烷基。

在另一实施方案中，连接物可以包含环氧化物基团。

在另一实施方案中，连接物包含双亲核物质。双亲核连接物可以选自烷基-二胺和烯烃-二胺的至少一个。在一个实施方案中，双亲核连接物选自乙烷-二胺、丙烷-二胺、丁烷-二胺、戊烷-二胺、己烷-二胺的至少一个。在一个实施方案中，双亲核连接物为己烷-二胺。

在另一实施方案中，通过表卤代醇与所述连接物的亲核基团的反应产生含环氧化物的化合物。

在一个实施方案中，底物可以对由所述含环氧化物的基团而固定的功能性分子为惰性的。

在另一实施方案中，底物可以为聚合物。所述聚合物可以为生物相容的聚合物。在另一实施方案中，所述生物相容的聚合物可以选自聚酯底物、聚酰胺底物、聚丙烯酸酯底物和基于多糖的底物。在一个实施方案中，聚合物为基于多糖的底物，其可以选自棉绒、棉浆、棉织物、纤维素纤维、纤维素珠、纤维素粉末、微晶纤维素、纤维素膜、人造丝、玻璃纸、醋酸纤维素、醋酸纤维素膜、壳聚糖、壳质、葡聚糖衍生物和琼脂糖衍生物。

在另一实施方案中，聚合物为生物聚合物。生物聚合物可以选自纤维素、壳聚糖、壳质、葡聚糖、琼脂糖及其衍生物。

在另一实施方案中，底物可以包括在所述底物上布置的涂层，所述涂层包括选定用于稳定所述功能性分子的稳定添加剂的基本均匀的混合物。在一个实施方案中，所述稳定添加剂可以选自糖、有机酸、氨基酸、糖酸和硫醇。

在另一实施方案中，提供了在底物上固定功能性分子的方法。所述方法包括将功能性分子暴露于本文所述的底物的步骤。

在一个实施方案中，功能性分子选自亲和性配体、螯合剂、催化剂、离子交换剂、染料、指示剂和生物分子。在另一实施方案中，功能性分子为手性的。在另一实施方案中，功能性分子为生物分子。生物分子可以为酶。酶可以选自尿素酶、尿酸酶、肌酸酐酶、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、过氧化氢酶、酰基转移酶、过氧化氢酶、酯酶、青霉素酰胺酶、蛋白酶-K。

在另一实施方案中，该方法进一步包括下列步骤：将稳定添加剂的基本均匀的混合物涂覆于底物表面以稳定所述功能性分子。将添加剂的基本均匀的混合物涂覆到底物上的步骤包括蒸发所述添加剂的溶液的溶剂。在一个实施方案中，稳定添加剂选自糖、有机酸、氨基酸、糖酸和硫醇。

在另一实施方案中，还提供了制备用于在其上固定功能性分子的底物的方法。所述方法包括下列步骤：(i)提供与所述底物的表面连接的亲电子化合物；(ii)使所述亲电子化合物进行亲核取代反应以在其上提供亲核基团，并由此增加所述底物表面的亲核性；(iii)使所述亲核基团与另一亲电子化合物进行亲核取代反应以在所述底物表面上提供亲电子基团，并由此增加所述底物的亲电子性。

在一个实施方案中，可以将步骤(ii)和(iii)重复n次以在所述底物上形成n代亲电子基团。在一个实施方案中，重复步骤(ii)和(iii)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多次。

在一个实施方案中，所述提供与底物表面结合的亲电子化合物的步骤包括将第一亲电子化合物化学地结合至底物。

在另一实施方案中，步骤(ii)包括使亲核体与第一亲电子化合物反应。在另一实施方案中，步骤(iii)包括将第二亲电子化合物化学结合至亲核体。

亲电子化合物可以为含环氧化物的化合物。在一个实施方案中，亲电子化合物可以选自环氧化合物，例如环氧烷烃、环氧醇和表卤代醇、卤化物。亲电子化合物也可以包括酮、醛、异氰酸酯以及这些化合物的衍生物。

在另一实施方案中，含环氧化物的化合物为表卤代醇。在一个实施方案中，表卤代醇可以选自表氯醇、表溴醇、表碘醇、1,2-环氧基-4-氯丁烷、1,2-环氧基-4-溴丁烷、1,2-环氧基-4-碘丁烷、2,3-环氧基-4-氯丁烷、2,3-环氧基-4-溴丁烷、2,3-环氧基-4-碘丁烷、2,3-环氧基-5-氯戊烷、2,3-环氧基-5-溴戊烷、1,2-环氧基-5-氯戊烷。在一个实施方案中，表卤代醇是表氯醇。

在一个实施方案中，亲核体是双亲核体或多亲核体。在另一实施方案中，亲核体包括胺。胺可以选自饱和及不饱和脂肪族或芳香族的胺、二胺、三胺和高级多胺。在一个实施方案中，所述胺的脂肪族基团选自烷基。在一个实施方案中，胺可以选自乙烷-二胺、丙烷-二胺、丁烷-二胺、戊烷-二胺、己烷-二胺中的至少一个。在一个实施方案中，胺为己烷-二胺。

底物可以包括聚合物。所述聚合物可以为生物相容的聚合物。在一个实施方案中，生物相容的聚合物可以选自聚酯底物、聚酰胺底物、聚丙烯酸酯底物和基于多糖的底物。

在一个实施方案中，底物为基于多糖的底物。基于多糖的底物可以选自棉绒、棉浆、棉织物、纤维素纤维、纤维素珠、纤维素粉末、微晶纤维素、纤维素膜、人造丝、玻璃纸、醋酸纤维素、醋酸纤维素膜、壳聚糖、壳质、葡聚糖衍生物和琼脂糖衍生物。

在另一实施方案中，聚合物可以为生物聚合物。生物聚合物可以选自纤维素、壳聚糖、壳质、葡聚糖、琼脂糖及其衍生物。

在另一实施方案中，功能性分子可以选自亲和性配体、螯合剂、催化剂、离子交换剂、染料、指示剂和生物分子。在一个实施方案中，功能性分子可以为手性的。在另一实施方案中，功能性分子为生物分子。生物分子可以为酶，其选自尿素酶、尿酸酶、肌酸酐酶、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、过氧化氢酶、酰基转移酶、过氧化氢酶、酯酶、青霉素酰胺酶、蛋白酶-K。

在另一实施方案中，方法可以进一步包括下列步骤：将稳定添加剂的基本均匀的混合物涂覆于底物表面，其中选择所述稳定添加剂以稳定所述功能性分子。将添加剂的基本均匀混合物涂覆到底物上的步骤可包括蒸发所述添加剂的溶液的溶剂。在一个实施方案中，稳定添加剂可以选自糖、有机酸、氨基酸、糖酸和硫醇。

还提供了用于透析装置的吸附剂盒，所述吸附剂盒包括本文所述的用于固定尿素酶的底物。

还提供了用于透析装置的透析器，所述透析器包括本文所述的用于固定尿素酶的底物。

还提供了透析方法，其包括下列步骤：将含尿素的透析液暴露于本文所述的底物；以及从所述底物除去所述透析液。

还提供了本文所述的底物在透析装置中的用途。

在另一实施方案中，提供了将本公开的底物作为固相材料用于色谱(包括手性色谱和亲和色谱)的用途。在另一实施方案中，本公开提供了底物在传感器和生物传感器中的用途。

在另一实施方案中，提供了制备用于在其上固定功能性物质的底物的方法，所述方法包括下列步骤：将第一亲电子化合物化学地结合于底物；以及将第二亲电子化合物化学地结合于已与底物结合的第一亲电子化合物，其中当结合于所述第一亲电子化合物时，所述第二亲电子化合物被设定为在其上固定功能性物质。在一个实施方案中，第一亲电子化合物为双亲电子体，并且由于在双亲电子体的一个亲电子基团和底物上的亲核基团之间的亲核取代反应而化学地结合于底物。

作为第一反应的结果，弱反应性(亲核的)底物被转化为强反应性(亲电子的)底物。双亲电子试剂可以为表卤代醇。其也可以为溴化氰、溴乙酸、戊二醛等中的一种。第二亲电子化合物可以为直接化学结合于第一亲电子化合物，例如通过化学连接。第二亲电子化合物也可以间接地化学结合于第一亲电子化合物，例如通过连接物。在一个实施方案中，第一和第二亲电子化合物为单体。

在将第一亲电子化合物化学结合于底物的步骤之前，所述方法可以包括功能化底物的步骤，使得底物包括能够化学结合于第一亲电子化合物的官能团。

在一个实施方案中，所述方法包括使用连接物将第二亲电子化合物结合于第一亲电子化合物的步骤。连接物也可以为不带电荷的。在一个实施方案中，连接物也可以包括饱和或不饱和、直链或支链的任选取代的脂肪族C_1-25链，并且其中所述链的碳能够任选被-C(O)-、-C(O)C(O)-、-C(O)NR^*-、-C(O)NR^*NR^*-、-CO₂-、-OC(O)-、-NR^*CO₂-、-O-、-NR^*C(O)NR^*-、-OC(O)NR^*-、-NR^*NR^*-、-NR^*C(O)-、-S-、-SO-、-SO₂-、-NR^*-、-SO₂NR^*-、-NR^*SO₂-、-C(O)NRO-或-NRC(NR)NR-替换，其中R^*选自氢或C_1-10脂肪族；其中C_1-10脂肪族能够为取代或未取代的。

在一个实施方案中，连接物不包含环氧化物基团。连接物也可以包括至少一个亲核基团。连接物可以为多亲核连接物，即，连接物可以包含多于一个的亲核基团。在一个实施方案中，连接物为双亲核连接物。当连接物为双亲核连接物时，双亲核连接物的至少一个亲核体可以选自NH、NR、NHO、NRO、O、S、Se、COO、CONH、CONR、CSS、COS、CONHO、CONRO、CONHNH、CONRNH、CONR¹NR²、CNO、PH和PR，

其中R、R¹和R²独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基。

当功能性连接物不包含环氧化物基团且为双亲核连接物时，连接物可以具有通式(I)：

通式(I)

其中：

X和Y独立地选自NH、NR、O、S、COO、CONH和CONR；

R选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

n为0至25的整数。

在另一实施方案中，双亲核连接物具有通式(II)：

通式(II)

其中：

X和Y独立地选自NH、NR、NHO、NRO、O、S、Se、COO、CONH、CONR、CSS、COS、CONHO、CONRO、CONHNH、CONRNH、CONRNR、CNO、PH、PR；

R、R¹、R²、R³、R⁴独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

m、n、p和q为整数，其独立地选自0至25。

通式(II)的和

基团的位置可以互换，并且这些基团也可以存在于多于一个的位置，如本领域技术人员所理解的。

在另一实施方案中，双亲核连接剂具有通式(IIa)：

通式(IIa)

其中：

X和Y独立选自NR¹R²、NRO、OR、SR、SeR、COOR、CONR、CSSR、COSR、CONRO、CONRNR¹R²、CNOR和PR¹R²，以及可以形成阳离子加合物的任何其他取代基；

R、R¹和R²独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

n为0至25的整数。

在一个实施方案中，变量X和Y也可以为能够与环氧化物基团反应形成化学键的任意亲核基团。

双亲核连接物可以包括烷基-二胺基团。在一个实施方案中，双亲核连接物为乙烯-二胺和己二胺中的至少一个。在另一实施方案中，连接物可以为带电的化合物，其包括亲核体，例如NR¹R²，其中R¹和R²为如上所定义的。连接物也可以为小化合物，其选自H₂O、H₂S、H₂Se、PH₃、PH₂R、NH₃、NH₂R和NHR¹R²，其中R、R¹和R²为如上所定义的。

连接物可以为或可以不为含环氧化物的化合物。在一个实施方案中，当连接物为含环氧化物的化合物时，连接物可以具有通式(Ia)：

其中：

X选自NH、NR、O、S、Se、COO、CONR¹NR²、CONRO、CONH和CONR；R¹和R²独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

n为0至25的整数。

在另一实施方案中，含环氧化物的连接物具有通式(Ib)：

通式(Ib)

其中：

X选自NH、NR、NHO、NRO、O、S、Se、COO、CONH、CONR、CSS、COS、CONHO、CONRO CONHNH、CONRNH、CONRNR、CNO、PH、PR；

R、R¹、R²、R³、R⁴独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

m、n、p和q为整数，其独立地选自0至25。

通式(II)的和

基团的位置可以互换，并且这些基团也可以存在于多于一个的位置，如本领域技术人员所理解的。

在一个实施方案中，变量X也可以为能够与环氧化物基团反应形成化学键的任意亲核基团。

含环氧的连接物可以包括羟基-环氧乙烷。在一个实施方案中，含环氧的连接物为环氧丙醇。

公开的方法也可以进一步包括通过上述功能性连接物将后续亲电子化合物或双性(ambiphilic)化合物直接或间接地与在前亲电子化合物化学结合的步骤。可以重复地进行化学结合后续亲电子化合物的这些额外的步骤，直至实现期望的链长度。有利地，通过重复这些步骤，用于与生物物质结合的诸如活性环氧乙烷位点的亲电子位点的数量可以增加，由此增加生物物质与底物的可能性和亲和性。在一个实施方案中，当连接物为双性化合物时，连接物包括环氧丙醇。

在一个实施方案中，本文公开的亲电子化合物包括含环氧化物的化合物。例如，第一亲电子化合物和第二亲电子化合物可以为第一含环氧化物的化合物和第二含环氧化物的化合物。在一个实施方案中，第一含环氧化物的化合物和第二含环氧化物的化合物中的至少一个为表卤代醇。表卤代醇可以选自表氯醇、表溴醇和表碘醇。在一个实施方案中，所述方法包括选择弱反应性底物。所述底物可以选自聚酯底物、聚酰胺底物、环氧树脂底物、聚丙烯酸酯底物、羟基-功能化底物和基于多糖的底物。在一个实施方案中，基于多糖的底物选自棉绒、棉浆、棉织物、纤维素纤维、纤维素珠、纤维素粉末、微晶纤维素、纤维素膜、人造丝、玻璃纸、醋酸纤维素、醋酸纤维素膜、壳聚糖、壳质、葡聚糖衍生物和琼脂糖衍生物。

在一个实施方案中，在约-30°C至约100°C、约0°C至约70°C、约4°C至约30°C，或约10°C至约27°C、约40°C至约70°C、约23°C至约35°C以及约23°C至约30°C的温度范围下进行化学结合步骤。

功能性底物可以为生物活性的，并且可以包括生物物质和/或生物分子。在一个实施方案中，所述生物物质为酶。所述方法可以包括将酶化学地结合至已与第一亲电子化合物结合的第二亲电子化合物的步骤。将酶化学地结合至所述第二亲电子化合物的步骤可以包括提供稳定和活化添加剂，例如糖、硫醇、抗氧化剂和螯合剂。

酶可以选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶和连接酶。氧化还原酶催化氧化-还原反应，并且氧化的底物被认为是氢或电子供体。转移酶催化官能团从一个分子到另一分子的转移。水解酶催化多个键的水解裂解。裂解酶催化通过除了水解或氧化以外的其他方法的多个键的裂解，意味着例如它们催化从双键除去基团或将基团加入双键，或者涉及电子重排的其他裂解。异构酶催化分子内重排，意味着一个分子内的变化。连接酶催化其中连接两个分子的反应。

在一个实施方案中，酶为氧化还原酶，其可以对不同的供体基团起作用，例如CH-OH基团、醛或氧代基团、CH-CH基团、CH-NH₂基团、CH-NH基团、NADH或NADPH、含氮的化合物、硫基团、血红素基团、双酚和相关物质、氢、加入分子氧的单一供体、加入或减去分子氧的配对供体，或者其它的基团。氧化还原酶也可以对CH₂基团或X-H和Y-H起作用以形成X-Y键。通常属于氧化还原酶基团的酶可以是指氧化酶、加氧酶、氢化酶、脱氢酶、还原酶等。示例性的氧化还原酶包括：氧化酶，例如苹果酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、芳基-醇氧化酶、醇氧化酶、长链醇氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、聚乙烯醇氧化酶、D-阿拉伯糖酸(arabinono)-l,4-内酯氧化酶、D-甘露醇氧化酶、木糖醇氧化酶、草酸氧化酶、一氧化碳氧化酶、4-羟基苯基丙酮酸氧化酶、二氢尿嘧啶氧化酶、乙醇胺氧化酶、L-天冬氨酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、尿酸氧化酶、甲硫醇氧化酶、3-羟基氨基苯甲酸氧化酶、漆酶、过氧化氢酶、脂肪酸过氧化物酶、过氧化物酶、二芳基丙烷过氧化物酶、亚铁氧化酶、蝶啶氧化酶、非洲防己碱氧化酶等。氧化还原酶也可以包括加氧酶，例如儿茶酚1,2-双加氧酶、龙胆酸1,2-双加氧酶、尿黑酸1,2-双加氧酶、脂肪氧合酶、抗坏血酸2,3-双加氧酶、3-羧基乙基儿茶酚2,3-双加氧酶、吲哚2,3-双加氧酶、咖啡酸3,4-双加氧酶、花生四烯酸5-脂肪氧合酶、联苯基-2,3-二醇1,2-双加氧酶、亚油酸11-脂肪氧合酶、乙酰丙酮-裂解酶、乳酸2-单加氧酶、苯基丙氨酸2-单加氧酶、肌醇加氧酶等。氧化还原酶还可以包括脱氢酶，例如醇脱氢酶、甘油脱氢酶、丙二醇-磷酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶、甘油酸脱氢酶、葡萄糖1-脱氢酶、半乳糖1-脱氢酶、烯丙基醇脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、辛醇脱氢酶、芳基-醇脱氢酶、环戊醇脱氢酶、长链-3-羟基酰基-CoA脱氢酶、L-乳酸脱氢酶、D-乳酸脱氢酶、丁醛脱氢酶、对苯二甲酸1,2-顺式-二氢二醇酯脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、甘氨酸脱氢酶、氢脱氢酶、4-甲酚脱氢酶、膦酸脱氢酶等。属于氧化还原酶基团的还原酶也可以包括酶，例如2-甲基-3-氧代琥珀酸二乙酯还原酶、莨菪酮还原酶、长链-脂肪酰基-CoA还原酶、羧酸还原酶、D-脯氨酸还原酶、甘氨酸还原酶、诸如细胞色素的血红素蛋白，等。在一个实施方案中，所述酶为裂解酶，其可以属于下列基团中的任意一个：碳-碳裂解酶、碳-氧裂解酶、碳-氮裂解酶、碳-硫裂解酶、碳-卤化物裂解酶、磷-氧裂解酶和其他的裂解酶。

碳-碳裂解酶也可以包括羧基-裂解酶、醛-裂解酶、含氧酸裂解酶和其他的裂解酶。属于这些基团的某些具体的实例为草酸脱羧酶、乙酰乳酸脱羧酶、天冬氨酸4-脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、芳香族-L-氨基酸脱羧酶、甲基丙二酰基-CoA脱羧酶、肉毒碱脱羧酶、吲哚-3-甘油-磷酸合酶、没食子酸脱羧酶、支链-2-含氧酸脱羧酶、酒石酸脱羧酶、芳基丙二酸脱羧酶、果糖-双磷酸醛缩酶、2-脱氢-3-脱氧-磷酸葡萄糖酸醛缩酶、三甲胺-氧化物醛缩酶、羟己酮(propioin)合酶、乳酸醛缩酶、香兰素合酶、异柠檬酸裂解酶、羟甲基戊二酰基-CoA裂解酶、3-羟基天冬氨酸醛缩酶、色氨酸酶、脱氧核糖二嘧啶光-裂解酶、十八醛脱羰基酶(decarbonylase)等。

碳-氧裂解酶可以包括氢-裂解酶、对多糖、磷酸盐起作用的裂解酶以及其他的裂解酶。一些具体实例是碳酸脱水酶、延胡索酸脱水酶、乌头酸脱水酶、柠檬酸脱水酶、阿拉伯糖酸脱水酶、半乳糖酸脱水酶、阿卓糖酸脱水酶、甘露糖酸脱水酶、二羟酸脱水酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、丙二醇脱水酶、甘油脱水酶、马来酸脱水酶、油酸脱水酶、果胶酸裂解酶、聚(β-D-甘露糖醛酸)裂解酶、寡半乳糖醛酸苷裂解酶、聚(α-L-古罗糖醛酸)裂解酶、黄原胶裂解酶、乙醇胺-磷酸膦裂解酶、羧甲基氧化琥珀酸裂解酶等。

碳-氮裂解酶可以包括氨-裂解酶、对酰胺、脒等起作用的裂解酶、胺-裂解酶等。这些裂解酶基团的具体实例为天冬氨酸氨-裂解酶、苯基丙氨酸氨-裂解酶、乙醇胺氨-裂解酶、葡糖氨酸氨-裂解酶、精氨酸琥珀酸裂解酶、腺苷酸琥珀酸裂解酶、酰脲乙醇酸裂解酶和3-酮井冈羟胺C-N-裂解酶。

碳-硫裂解酶可以包括二甲基丙酰噻亭脱硫甲基酶、蒜氨酸裂解酶、乳酰谷胱苷肽裂解酶和半胱氨酸裂解酶。

碳-卤化物裂解酶可以包括3-氯-D-丙氨酸脱氯化氢酶和二氯甲烷脱卤素酶。

磷-氧裂解酶可以包括腺苷酸环化酶、胞苷酸环化酶、糖基磷脂酰肌醇甘油二酯-裂解酶。

在另一实施方案中，酶是水解酶，其选自糖基化酶、对酸酐起作用的酶和对诸如酯键、醚键、碳-氮键、肽键、碳-碳键、卤化物键、磷-氮键、硫-氮键、碳-磷键、硫-硫键或者碳-硫键的特定键起作用的酶。

糖基化酶可以为糖苷酶，其能够水解O-和S-糖基化合物或N-糖基化合物。糖基化酶还可以包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡聚糖1,4-α-葡萄糖苷酶、纤维素酶、内-l,3(4)-β-葡聚糖酶、菊糖酶、内-l,4-β-木聚糖酶、寡-1,6-葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、壳多糖酶、果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、溶菌酶、果聚糖酶、槲皮苷酶(quercitrinase)、半乳糖醛酸1,4-α-半乳糖醛酸酶(galacturonidase)、异淀粉酶、葡聚糖1,6-α葡萄糖苷酶、葡聚糖内-l,2-β-葡萄糖苷酶、地衣聚糖酶(licheninase)、琼脂酶、外-聚-α-半乳糖苷酶、κ-卡拉胶酶、甾醇基-β-葡萄糖苷酶、长春花碱β-葡萄糖苷酶、甘露糖基-寡糖类葡糖苷酶、乳糖酶、寡-木葡聚糖β-糖苷酶、聚甘露糖醛酸(polymannuronate)水解酶、脱乙酰壳多糖酶、聚(ADP-核糖)糖水解酶、嘌呤核苷酶、肌苷核苷酶、尿苷核苷酶、腺苷核苷酶等。

对所述酸酐起作用的酶可以为例如对含磷的或含磺酰基的酐起作用的那些。对酸酐起作用的示例性的酶包括无机的二磷酸酶、三偏磷酸酶、腺苷-三磷酸酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、核苷-二磷酸酶、酰基磷酸酶、核苷酸二磷酸酶、内聚磷酸酶、外聚磷酸酶、核苷磷酸-酰基水解酶、三磷酸酶、CDP-甘油二酯二磷酸酶、十一碳二烯酸二磷酸酶、长醇二磷酸酶、寡糖-二磷酸多萜醇二磷酸酶、异源三聚G-蛋白GTP酶、小单聚GTP酶、发动蛋白GTP酶、微管蛋白GTP酶、二磷酸肌醇多聚磷酸二磷酸酶、H⁺-输出ATP酶、单糖-转运ATP酶、麦芽糖-转运ATP酶、甘油-3-磷酸-转运ATP酶、寡肽-转运ATP酶、聚胺-转运ATP酶、肽-转运ATP酶、脂肪-酰基-CoA-转运ATP酶、蛋白-分泌ATP酶等。

对酯键起作用的酶可以包括酯酶、脂肪酶、羧酸酯水解酶、硫代酸酯水解酶、磷脂水解酶、硫酯水解酶和核糖核酸酶。对酯键起作用的示例性的酶包括乙酰基-CoA水解酶、棕榈酰基-CoA水解酶、琥珀酰基-CoA水解酶、3-羟基异丁酰基-CoA水解酶、羟基-甲基戊二酰基-CoA水解酶、羟基酰基谷胱甘肽水解酶、谷胱甘肽巯酯酶、甲酰基-CoA水解酶、乙酰乙酰基-CoA水解酶、S-甲酰基谷胱甘肽水解酶、5-琥珀酰基谷胱甘肽水解酶、油酰基-[酰基-载体-蛋白]水解酶、泛素巯酯酶、[柠檬酸-(pro-35)-裂解酶]巯酯酶、(S)-甲基-丙二酰基-CoA水解酶、ADP-依赖性短链-酰基-CoA水解酶、ADP-依赖性中链-酰基-CoA水解酶、酰基-CoA水解酶、十二烷酰基-[酰基-载体蛋白]水解酶、棕榈酰基-(蛋白质)水解酶、4-羟基-苯甲酰基-CoA巯酯酶、2-(2-羟基苯基)苯-亚磺酸水解酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、磷酸丝氨酸磷酸酶、磷脂酸磷酸酶、5’-核苷酸酶、3’-核苷酸酶、3’(2’),5’-二磷酸核苷酸酶、3-肌醇六磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶、甘油-2-磷酸酶、磷酸甘油酸磷酸酶、甘油-1-磷酸酶、甘露醇-1-磷酸酶、糖-磷酸酶、蔗糖-磷酸酶、肌醇-1(或4)-单磷酸酶、4-肌醇六磷酸酶、磷脂酰甘油磷酸酶、ADP磷酸甘油酸磷酸酶、N-酰基-神经氨酸-9-磷酸酶、核苷酸酶、多核苷酸3’-磷酸酶、糖原-合酶-D磷酸酶、丙酮酸脱氢酶(硫辛酰胺)磷酸酶、乙酰基-CoA羧化酶磷酸酶、3-脱氧-甘露-辛酮糖酸-8-磷酸酶、多核苷酸5’-磷酸酶、糖-终端-磷酸酶、烷基乙酰基甘油磷酸酶、2-脱氧葡萄糖-6-磷酸酶、葡糖甘油3-磷酸酶、5-肌醇六磷酸酶、磷酸二酯酶I、甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶、磷脂酶C、磷脂酶D、磷酸肌醇磷脂酶C、鞘磷脂磷酸二酯酶、甘油磷酸胆碱胆碱磷酸二酯酶、烷基甘油磷酸乙醇胺磷酸二酯酶、甘油磷酸肌醇甘油-磷酸二酯酶、芳基-硫酸酯酶、甾醇基-硫酸酯酶、糖-硫酸酯酶、胆碱-硫酸酯酶、纤维素-多硫酸酯酶、单甲基-硫酸酯酶、D-乳酸-2-硫酸酯酶、葡糖醛酸-2-硫酸酯酶、异戊二烯基-二磷酸酶、芳基二烷基磷酸酶、二异丙基-氟磷酸酶、寡核苷酸酶、聚(A)-特异性核糖核酸酶、酵母核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶(嘧啶二聚体)、多头绒泡菌核糖核酸酶、核糖核酸酶α、曲霉属核酸酶S1、粘质沙雷菌核酸酶、羧酸酯酶、芳基酯酶、三酰基甘油脂酶、磷脂酶A2、溶血磷脂酶、乙酰酯酶、乙酰胆碱酯酶、胆碱脂酶、托品酯酶、果胶酯酶、甾醇酯酶、叶绿素酶、L-阿拉伯糖内酯酶、葡糖酸内酯酶、尿内酯酶、鞣酸酶、棕榈酸视黄酯酶、羟基丁酸-二聚体水解酶、酰基甘油脂酶、3-氧代己二酸烯醇-内酯酶、1,4-内酯酶、半乳糖脂酶、4-吡哆醇内酯酶、酰基肉毒碱水解酶、氨酰-tRNA水解酶、D-阿拉伯糖内酯酶、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、磷脂酶A1、6-乙酰基葡萄糖脱乙酰酶、脂蛋白脂肪酶、二氢香豆素水解酶、柠檬苦素-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸-内酯酶、放射菌素内酯酶、苔色酸-缩酚酸水解酶、头孢菌素-C脱乙酰酶、氯原酸水解酶、α-氨基酸酯酶、4-甲基草酰乙酸酯酶、羧亚甲基丁烯羟酸内酯酶、脱氧柠檬酸-A-环内酯酶、1-烷基-2-乙酰基甘油磷酰胆碱酯酶、镰孢氨酸-C-鸟氨酸酯酶、芥子酸胆碱酯酶、蜡酯水解酶、佛波醇-二酯水解酶、磷脂酰肌醇脱酰酶、唾液酸O-乙酰酯酶、乙酰氧基丁炔基二噻吩脱乙酰酶、乙酰水杨酸脱乙酰酶、甲基伞形酮(umbelliferyl)-乙酸脱乙酰酯、2-吡喃酮-4,6-二羧酸内酯酶、N-乙酰基半乳糖胺聚糖脱乙酰酶、保幼激素酯酶、双(2-乙基-己基)邻苯二甲酸酯酶、蛋白质-谷氨酸甲酯酶、11-顺式-棕榈酸视黄酯水解酶、全反式-棕榈酸视黄酯水解酶、L-鼠李糖酸(rhamnono)-1,4-内酯酶、5-(3,4-二乙酰氧基丁-l-炔基)-2,2’-二噻吩脱乙酰酶、脂肪酰基-乙酯合酶、木糖酸-1,4-内酯酶、西曲酸酯苄基酯酶、乙酰基烷基甘油乙酰基-水解酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿魏酰基(feruloyl)酯酶、角质酶、聚(3-羟基丁酸酯)解聚酶、聚(3-羟基辛酸酯)解聚酶酰氧基酰基水解酶、酰氧基酰基水解酶、聚精胺-醛酯酶等。

对醚键起作用的酶可以包括三烷基锍水解酶和醚水解酶。对醚键起作用的酶可以在硫醚键和氧等价物上都发生作用。属于这些基团的具体酶实例为腺苷高半胱氨酸酶、腺苷甲硫氨酸水解酶、异分支酸酶、烯基甘油磷酸胆碱水解酶、环氧化物水解酶、trarcs-环氧琥珀酸酯水解酶、烯基甘油磷酸乙醇胺水解酶、白细胞三烯-A4水解酶、肝氧蛋白-环氧化物水解酶和柠檬烯-1,2-环氧化物水解酶。

对碳-氮键起作用的酶可以水解线性酰胺、环状酰胺、线性脒、环状脒、线性脲(尿素)、环状脲(尿素)、腈和其他化合物。属于这些基团的具体实例为尿素酶、酰胺酶(酰基转移酶)、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、ω-酰胺酶、β-酰脲丙酸酶、芳基甲酰胺酶、生物素酶、芳基-酰基酰胺酶、氨基酰基转移酶、天门冬酰基酶、乙酰基-鸟氨酸脱乙酰酶、酰基-赖氨酸脱乙酰酶、琥珀酰-二氨基庚二酸酯脱琥珀酰酶、泛酸酶、神经酰胺酶、胆酰甘氨酸水解酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、2-(乙酰氨基亚甲基)-琥珀酸水解酶、5-氨基戊酰胺酶、甲酰甲硫氨酸去甲酰酶、马尿酸水解酶、N-乙酰葡糖胺脱乙酰酶、D-谷氨酰胺酶、N-甲基-2-氧化戊二酸水解酶、谷氨酰胺(天冬氨酸)酶、烷基酰胺酶、酰基胍丁胺酰胺酶、壳质脱乙酰酶、肽基-谷氨酰胺酶、N-氨基甲酰-肌氨酸酰胺酶、N-(长链酰基)乙醇胺脱酰酶、mimosinase、乙酰基腐胺脱乙酰酶、4-乙酰氨基丁酸脱乙酰酶、茶氨酸水解酶、2-(羟基甲基)-3-(乙酰氨基亚甲基)琥珀酸水解酶、4-亚甲基谷氨酰胺酶、N-甲酸基谷氨酸盐去甲酰酶、鞘糖脂脱酰酶、阿库来菌素(aculeacin)-A脱酰酶、肽去甲酰酶、二氢嘧啶酶、二氢乳清酸酶、羧基甲基-乙内酰脲酶、肌酸酐酶、L-赖氨酸-内酰胺酶、精氨酸酶、胍基乙酰酶、肌酸脱水酶、尿囊酸酶、胞嘧啶脱氨酶、核黄素酶(riboflavinase)、硫胺酶、1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶等。

在一个实施方案中，固定酶是对肽键起作用的酶，其的基团也称为肽酶。肽酶能够进一步分为仅对多肽链的末端附近起作用的肽链端解酶和在多肽链内部起作用的肽链内切酶。对肽键起作用的酶可以包括选自氨基肽酶、二肽酶、二或三肽基肽酶、肽基二肽酶、丝氨酸型羧肽酶、金属羧肽酶、半胱氨酸型羧肽酶、ω肽酶、丝氨酸肽链内切酶、半胱氨酸肽链内切酶、天冬氨酸肽酶、金属肽链内切酶和苏氨酸肽链内切酶的酶。属于这些基团的酶的某些具体实例为半胱氨酰氨基肽酶、三肽氨基肽酶、脯氨酰基氨基肽酶、精氨酰基氨基肽酶、谷氨酰基氨基肽酶、胞液丙氨酰基氨基肽酶、赖氨酰基氨基肽酶、Met-X二肽酶、非立体特异性二肽酶、胞液非特异性二肽酶、膜二肽酶、二肽酶E、二肽基-肽酶I、二肽基-二肽酶、三肽基-肽酶I、三肽基-肽酶II、X-Pro二肽基-肽酶、肽基-二肽酶A、溶酶体Pro-X羧肽酶、羧肽酶C、酰基氨基酰基-肽酶、肽基-甘氨酸酰胺酶、β-天冬氨酰基-肽酶、泛素水解酶1、糜蛋白酶、糜蛋白酶C、metridin、胰岛素、凝血酶、血浆酶、肠肽酶、精子酵素、α-裂解肽链内切酶(α-Lytic endopeptidase)、谷氨酰基肽链内切酶、组织蛋白酶G、黄瓜素、脯氨酰基寡肽酶、brachyurin、血浆激肽释放酶、组织激肽释放酶、胰弹性蛋白酶、白细胞弹性蛋白酶、胃促胰酶、塞里维辛(cerevisin)、皮蝇素C(hypoderminC)、赖氨酰基肽链内切酶、肽链内切酶La、γ-肾素、venombin AB、亮氨酰基肽链内切酶、类胰蛋白酶、黄芩甙(scutelarin)、kexin、枯草杆菌蛋白酶、水稻素、肽链内切酶K、嗜热霉菌素、嗜热蛋白酶、肽链内切酶So、t-血浆酶原激活物、蛋白质C (激活的)、胰腺肽链内切酶E、胰弹性蛋白酶II、IgA-特异性丝氨酸肽链内切酶、u-纤溶酶原激活物、腹蛇毒素A(venombin A)、弗林蛋白酶、成髓细胞、semenogelase、颗粒酶A、颗粒酶B、streptogrisin A、streptogrisin B、谷氨酰肽链内切酶II、寡肽酶B、omptin、togavirin、flavivirin、肽链内切酶Clp、前蛋白转化酶1、前蛋白转化酶2、lactocepin、次晶蛋白、hepacivirin、spermosin、pseudomonalisin、xanthomonalisin、C-端加工肽酶、physarolisin、组织蛋白酶B、木瓜蛋白酶、ficain、木瓜凝乳蛋白酶、萝藦蛋白酶、梭菌蛋白酶、streptopain、奇异果蛋白酶、组织蛋白酶L、组织蛋白酶H、组织蛋白酶T、甘氨酰肽链内切酶、癌症促凝剂、组织蛋白酶S、picornain 3C、picornain 2A、caricain、ananain、茎菠萝蛋白酶、果实菠萝蛋白酶、legumain、histolysain、胱天蛋白酶-1、牙龈菌蛋白酶R、组织蛋白酶K、adenain、博来霉素水解酶、组织蛋白酶F、组织蛋白酶O、组织蛋白酶V、核内含体-a肽链内切酶、辅助成分蛋白酶、蛋白酶K、L-蛋白酶、牙龈菌蛋白酶K、staphopain、分离酶、V-cath肽链内切酶、cruzipain、钙蛋白酶-1、钙蛋白酶-2、胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃亚蛋白酶、凝乳酶、组织蛋白酶D、猪笼草蛋白酶、肾素、阿黑皮素原转化酶、曲霉胃蛋白酶I、曲霉胃蛋白酶II、青霉胃蛋白酶、rhizopuspepsin、endothiapepsin、mucorpepsin、candidapepsin、saccharopepsin、rhodotorulapepsin、acrocylindropepsin、polyporopepsin、pycnoporopepsin、scytalidopepsin A、scytalidopepsin B、组织蛋白酶E、barrierpepsin、信号肽酶II、plasmepsin I、plasmepsin II、phytepsin、酵母天冬酶1、thermopsin、前菌毛素肽酶、诺达病毒肽链内切酶、膜天冬氨酸蛋白酶1、膜天冬氨酸蛋白酶2、衲脊蛇溶血素A、微生物胶原酶、白细胞溶素、基质溶解素1、甲基多巴A、原骨胶原C-肽链内切酶、虾红素、pseudolysin、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶(bacillolysin)、aureolysin、coccolysin、mycolysin、白明胶酶B、利什曼溶蛋白、saccharolysin、gametolysin、serralysin、horrilysin、ruberlysin、bothropasin、寡肽酶A、内皮素-肽转化酶、ADAM 10肽链内切酶等。

对碳-碳键起作用的酶可以包括但不限于草酰乙酸酶、延胡索酰乙酰乙酸酶、犬尿氨酸酶、根皮素水解酶、酰基丙酮酸水解酶、乙酰基丙酮酸水解酶、β-二酮水解酶、2,6-二氧代-6-苯基六-3-烯醇水解酶、2-羟基粘糠酸酯-半醛水解酶和环己烷-l,3-二酮水解酶。

对卤化物键起作用的酶可以包括烷基卤化酶、2-卤酸脱卤素酶、卤代乙酸脱卤素酶、甲状腺素脱碘酶、卤代烷脱卤素酶、4-氯苯甲酸脱卤素酶、4-氯苯甲酰基-CoA脱卤素酶、莠去津氯代水解酶等。

本文公开的固定的酶还可以包括对具体键起作用的酶，例如磷酰胺酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶、甜蜜素磺基水解酶、磷酸乙醛水解酶、磷酸乙酸水解酶、连三硫酸水解酶、UDP磺基异鼠李糖合酶等。

优选地，酶是尿素酶。酶可以化学结合至已与第一含环氧化物的化合物结合的第二含环氧化物的化合物。其也可以直接结合至第一含环氧化物的化合物。

从用于在其上固定生物物质的所述方法而获得的底物具有含醚的化合物，其具有与底物结合的一个部分和与含环氧化物的化合物结合的另一部分。底物可以用于透析装置，例如腹膜透析装置或血液透析装置。在一个实施方案中，底物用于血液透析装置的吸附剂。

附图简述

附图例示了公开的实施方案并用于解释公开的实施方案的原理。然而，应当理解，附图被设计为仅为了例示的目的，并且不作为本发明限制的定义。

图1a是使用双亲核连接物的公开方法的一个实施方案的图示。

图1b是显示可以从图1a所示的方法的相同实施方案得到的另一可能修饰的底物的图示。

图2是使用环氧乙烷功能化连接物的公开方法的另一实施方案的图示。

图3是当将己二胺用作连接物并将表氯醇用作第一和第二含环氧化物的化合物时，图1a所示的方法的具体实例的图示。

图4是当将缩水甘油用作连接物时，图1b所示方法的具体实例的图示。

附图详述

参照图1a，显示了使用双亲核连接物的公开方法100的一个实施方案的图示。在不溶聚合物110的表面上的游离(伯)羟基首先与步骤A-1所示的表卤代醇反应。反应导致释放表卤代醇上的卤素和羟基上的质子，形成醚键，使得所得的修饰底物112现在与环氧化物基团在末端化学地结合。然后，在步骤A-2中，含环氧化物基团的底物112与具有通式(II)的双亲核连接物反应，得到连接物修饰的底物114作为产物。

通式(II)

其中：

X和Y独立地选自NH、NR、NHO、NRO、O、S、Se、COO、CONH、CONR、CSS、COS、CONHO、CONRO CONHNH、CONRNH、CONRNR、CNO、PH、PR；

其中R、R¹、R²、R³、R⁴独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

m、n、p和q为独立地选自0至25的整数。

在步骤A-2中的与连接物基团反应之后，修饰的底物114现在在其末端包含亲核基团Y。然后，在步骤A-3中，亲核基团Y与另一表卤代醇反应。通过亲核取代，存在于表卤代醇上的卤素被亲核基团Y取代，导致修饰的底物116，其现在具有分别由连接物144结合的醚部分140、末端环氧部分142。在步骤A-4中，修饰的底物116的环氧化物末端基团然后与酶120形式的生物物质反应，其包含亲核基团Z。酶在底物上变为固定的，以得到总产物130。还可以在步骤A-4中添加诸如硫醇的稳定剂。

参照图1b，显示了表示可以从图1a所示的方法的相同实施方案获得的另一产品的图示200。在图1b中采取的步骤与图1a相同。然而，在步骤B-3中，多于一个的表卤代醇分子在亲核基团X和Y都进行亲核取代，导致底物具有多个环氧化物基团。因此，获得的最终修饰的底物(216)与修饰的底物116不同，因为底物216在亲核基团X和Y包含额外的环氧部分242。修饰的底物216然后能够进行与图1a的步骤B-4类似的固定反应。

参照图2，显示了使用环氧乙烷功能化连接物的公开方法300的一个实施方案的图示。包含羟基的底物310首先与步骤C-1所示的表卤代醇反应。反应导致释放表卤代醇上的卤素并且氢形成羟基，使得所得修饰的底物312现在在末端与环氧化物基团连接。含环氧化物基团的底物312然后在步骤C-2与具有通式(Ib)的环氧乙烷功能化连接物的至少一个单元反应：

通式(Ib)

其中：

X选自NH、NR、NHO、NRO、O、S、Se、COO、CONH、CONR、CSS、COS、CONHO、CONRO CONHNH、CONRNH、CONRNR、CNO、PH、PR；

R、R¹、R²、R³、R⁴独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的芳基和任选取代的杂芳基；以及

m、n、p和q为整数，其独立地选自0至25。

在步骤C-2中与连接物反应之后，所得的修饰的底物314现在在其末端包含环氧乙烷功能化连接物的环氧化物基团。在步骤C-3中，环氧化物末端基团然后与包含亲核基团Z的生物物质320反应。最后，生物物质固定在底物上以得到总产物330。

参照图3，显示了当将己二胺用作步骤D-2的连接物并且将表氯醇用作步骤D-1和D-3的第一和第二含环氧化物的化合物时，图1a所示方法的具体实例的图示400。如底物416所例示的，所得修饰的底物包含一个醚部分440和至少一个环氧部分442。其还可以包含多个环氧部分，如修饰的底物450和452所示。

参照图4，显示了当将缩水甘油用作步骤E-2的连接物时，图1b所示方法的具体实例的图示500。获得的所得产物由参照数字514表示。

实施例

参照具体实施例来更详细地描述本发明的非限制性实施方案和比较例，其不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

环氧功能化底物的制备

通过在55°C用30ml表氯醇处理5.0g纤维素的100ml 2.4M氢氧化钠的剧烈搅拌悬浮液4小时，从而进行纤维素的丝光处理和环氧功能化。通过抽吸过滤反应混合物并用超纯水(3×50ml)洗涤固体残留物(“初级环氧纤维素”)。干燥初级环氧纤维素的环氧基团负载为125μmol/g(参见表1)。

在23°C，使初级环氧纤维素(15.3g的潮湿材料)在100ml甲醇中与15ml的己二胺(70%水溶液)反应4小时。通过抽吸过滤反应混合物并用100ml甲醇洗涤一次以得到9.8g的潮湿“氨基纤维素”。通过其与茚三酮的反应来定性地评价在产品上存在的初级氨基。

然后，在23°C，使氨基纤维素(9.6g的潮湿材料)在100ml甲醇中与30ml表氯醇反应4小时。通过抽吸过滤获得反应产物(“二次环氧纤维素”)并用冷水(3×100ml)洗涤。干燥的二次环氧纤维素产物的环氧基团负载为108μmol/g(参见表1)。

确定环氧基团负载的方法

将含环氧基团的材料的样品(约1g的潮湿材料)悬浮在5ml水中。若需要，用0.01N HCl滴定悬浮液以中和pH。用5ml的1.3M硫代硫酸钠水溶液处理中性悬浮液，然后孵育15分钟，并且偶尔摇动。然后，用0.01N HCl对溴酚蓝来滴定悬浮液。存在于样本中的环氧基团的总量与在滴定中消耗的HCl的量相当。基于潮湿材料的已知水含量(LOD)计算干燥材料的环氧负载。在表1中总结典型的实验值。

实施例2

尿素酶的固定

在pH 7.5的Jack Bean尿素酶(4.2g)的150ml的1.0M磷酸钾缓冲液的冷却溶液中悬浮在实施例1中制备的二次环氧纤维素(12.5g的潮湿材料)。在4°C下，在孵育摇床中进行固定反应24小时。

然后，通过抽吸过滤反应混合物，并用冷超纯水洗涤残留物(“固定的尿素酶”)3次(3×150ml)。

固定的尿素酶的后固定处理

将固定的尿素酶浸入半胱氨酸(5mg/ml)、乙二胺四乙酸(EDTA,1.0mM)和葡萄糖(0.2g/ml)的水溶液中10分钟，然后通过抽吸过滤并冻干24小时。

比较例

表

应用

制备底物的公开方法是制备能够在其上固定功能性物质的底物的廉价且有效的方式。有利地，所述方法确保了由该方法制备的底物使诸如酶的功能性物质稳定地固定在其上。更有利地，当酶稳定地连接于底物时，底物能够在长时间内重复使用而基本不损失其的酶活性。

由于公开的方法还能与低成本的起始材料一起操作，所以如果所述方法用于大规模生产底物，则总生产成本显著降低。此外，在诸如固体支持物的底物和功能性物质之间的化学连接物是不可水解的。更有利地，连接物的惰性还促进了固定的功能性物质的稳定性，因为由不期望化学反应导致的连接物断裂的可能性降低。

公开的方法还能使使用者改变活性环氧乙烷基团与底物的距离。当活性环氧乙烷基团处于与底物的适当距离时，由于降低的位阻，所以其对固定功能性物质的反应性可以增加。另外，可以选择连接物以确保反应性环氧化物基团的高负载，其反过来转化为功能性物质的高负载。更有利地，还可以选择连接物，使得其固有地具有某些期望的化学性质。例如，当选择二胺连接物时，最终获得的底物可以具有内在pH-缓冲性质。这在诸如腹膜透析的应用中是尤其有用的，其中吸附剂的寿命和效力可以被高或低的pH不利地影响。

该方法还允许诸如具有尿素酶的基于醋酸纤维素的透析膜的现成透析膜易于组装后修饰。能够在组装后固定尿素酶，并且还能够仅固定在膜的一侧。

从公开方法获得的底物还允许在其上固定生物物质以简单、稳健和用户友好的方式进行。例如，能够容易地在实验室水平进行生物物质的固定。这是因为能够在环境温度(例如，室温)下，在水/缓冲溶液中进行生物物质的固定，而不需要额外的化学物或试剂。有利地，缺少额外的化学物或试剂显著促进了固定的产物的纯化。从公开的方法获得的固定的功能性材料还能够为无毒、可生物降解和生物相容的。有利地，这允许底物用于医疗应用，例如在透析应用中作为吸附剂以从人体除去不期望的废料产物。此外，这些性质还允许产物用于环境应用，例如水处理、土壤处理或废物处理。

另外，公开的方法和底物还可以用于下列应用中的任一种：亲和色谱、用于色谱(手性)的固相材料、分子印迹、固定染料、传感器、生物传感器、用于选择性毒素吸收的有机过滤器、药物应用(包衣和黏合)、固相离子交换剂、固相金属清除剂和抗氧化剂。

尽管使用合理的尝试来描述本发明的等同实施方案，但在阅读前述公开后，对本领域技术人员显而易见的是可以在其中进行本发明的多种其他修改和改编而不偏离本发明的精神和范围，并且旨在将所有这样的修改和改编包括在附属权利要求的范围内。

Claims (62)

1.用于固定功能性分子的具有在其上布置的化合物的底物，每一化合物具有链，所述链包含：

与所述底物化学结合的R部分，所述R部分选自醚、酯、羰基、碳酸酯、硫醚、二硫化物、亚磺酰基、磺酰基和硫代羰基；以及

通过含至少一个亲核基团的连接物与所述R部分结合的含环氧化物的部分。

2.如权利要求1所述的底物，其中所述R部分进一步选自胺、酰胺、脲、尿素和胍。

3.如权利要求1或2所述的底物，其包含与所述链结合的额外的含环氧化物的基团。

4.如权利要求3所述的底物，其中所述额外的含环氧化物的基团的数量选自1、2、3、4和5。

5.如权利要求3或4所述的底物，其中所述额外的含环氧化物的基团的至少一个通过所述连接物的亲核基团与所述链结合。

6.如权利要求4或5所述的底物，其中所述连接物包含额外的亲核基团，所述额外的含环氧化物的基团通过其与所述链结合。

7.如权利要求6所述的底物，其中所述额外的含环氧化物的基团通过与所述连接物的额外的亲核基团结合而从所述链分枝。

8.如前述权利要求中任一权利要求所述的底物，其中所述连接物的亲核基团为胺。

9.如前述权利要求中任一权利要求所述的底物，其中所述连接物选自饱和和不饱和的脂肪族和芳香族的胺、二胺和三胺。

10.如权利要求9所述的底物，其中所述胺的脂肪族基团为烷基。

11.如前述权利要求中任一权利要求所述的底物，其中所述连接物包含环氧化物基团。

12.如前述权利要求中任一权利要求所述的底物，其中所述连接物包含双亲核物质和多亲核物质中的至少一种。

13.如权利要求12所述的底物，其中所述连接物选自烷基二胺和烯烃二胺中的至少一种。

14.如权利要求13所述的底物，其中所述连接物选自乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺中的至少一种。

15.如前述权利要求中任一权利要求所述的底物，其中通过表卤代醇与所述连接物的亲核基团的反应得到所述含环氧化物的化合物。

16.如前述权利要求中任一权利要求所述的底物，其中所述底物包括聚合物。

17.如权利要求16所述的底物，其中所述聚合物为生物相容性聚合物。

18.如权利要求17所述的底物，其中所述生物相容性聚合物选自聚酯底物、聚酰胺底物、聚丙烯酸酯底物和基于多糖的底物。

19.如权利要求17所述的底物，其中所述基于多糖的底物选自棉绒、棉浆、棉织物、纤维素纤维、纤维素珠、纤维素粉末、微晶纤维素、纤维素膜、人造丝、玻璃纸、醋酸纤维素、醋酸纤维素膜、壳聚糖、壳质、葡聚糖衍生物和琼脂糖衍生物。

20.如权利要求16所述的底物，其中所述聚合物为生物聚合物。

21.如前述权利要求中任一权利要求所述的底物，其还包括在所述底物上布置的涂层，所述涂层包括为稳定所述功能性分子而选择的稳定添加剂的基本均匀的混合物。

22.如权利要求21所述的底物，其中所述稳定添加剂选自糖、有机酸、氨基酸、糖酸和硫醇。

23.在底物上固定功能性分子的方法，其包括将所述功能性分子暴露于权利要求1至22中任一权利要求所述的底物的步骤。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述功能性分子选自亲和性配体、螯合剂、催化剂、离子交换剂、染料、指示剂。

25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述功能性分子为手性的。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述功能性分子为生物分子。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述生物分子为酶。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述酶选自尿素酶、尿酸酶、肌酸酐酶、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、过氧化氢酶、酰基转移酶、过氧化氢酶、酯酶、青霉素酰胺酶、蛋白酶-K。

29.如权利要求23至28中任一权利要求所述的方法，其还包括将稳定添加剂的基本均匀的混合物涂覆于所述底物表面的步骤，其中选择所述添加剂以稳定所述功能性分子。

30.如权利要求29所述的方法，其中向所述底物上涂覆所述添加剂的基本均匀的混合物的步骤包括蒸发所述添加剂的溶液的溶剂。

31.如权利要求29或30所述的方法，其中所述稳定添加剂选自糖、有机酸、氨基酸、糖酸和硫醇。

32.制备用于在其上固定功能性分子的底物的方法，所述方法包括下列步骤：

(i)提供与所述底物表面结合的亲电子化合物；

(ii)使所述亲电子化合物进行亲核取代反应以在其上提供亲核基团，并由此增加所述底物表面的亲核性；

(iii)使亲核基团与另一亲电子化合物进行亲核取代反应以在所述底物表面上提供亲电子基团，并由此增加所述底物的亲电子性。

33.如权利要求32所述的方法，其中将步骤(ii)和(iii)重复n次以在所述底物上形成n代亲电子基团。

34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述提供与所述底物表面结合的亲电子化合物的步骤包括将第一亲电子化合物化学地结合于所述底物。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述步骤(ii)包括使亲核体与所述第一亲电子化合物反应的步骤。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述步骤(iii)包括将第二亲电子化合物化学地结合于所述亲核体。

37.如权利要求32至36中任一权利要所述的方法，其中所述亲电子化合物为含环氧化物的化合物。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述含环氧化物的化合物为表卤代醇。

39.如权利要求32至38中任一权利要所述的方法，其中所述亲核体为双亲核体。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述亲核体包括胺。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述胺选自饱和和不饱和的脂肪族或芳香族的胺和多胺。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述胺和多胺的脂肪族基团选自烷基。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述多胺选自乙二胺、丙二胺、丁二胺、戊二胺、己二胺中的至少一种。

44.如权利要求32至43中任一权利要所述的方法，其中所述底物包括聚合物。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述聚合物为生物相容性聚合物。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述生物相容性聚合物选自聚酯底物、聚酰胺底物、聚丙烯酸酯底物和基于多糖的底物。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述基于多糖的底物选自棉绒、棉浆、棉织物、纤维素纤维、纤维素珠、纤维素粉末、微晶纤维素、纤维素膜、人造丝、玻璃纸、醋酸纤维素、醋酸纤维素膜、壳聚糖、壳质、葡聚糖衍生物和琼脂糖衍生物。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述聚合物为生物聚合物。

49.如权利要求33至49中任一权利要所述的方法，其中所述功能性分子选自亲和性配体、螯合剂、催化剂、离子交换剂、染料和指示剂。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述功能性分子为手性的。

51.如权利要求49所述的方法，其中所述功能性分子为生物分子。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述生物分子为酶。

53.如权利要求52所述的方法，其中所述酶选自尿素酶、尿酸酶、肌酸酐酶、脂肪酶、酯酶、纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、过氧化氢酶、酰基转移酶、过氧化氢酶、酯酶、青霉素酰胺酶、蛋白酶-K。

54.如权利要求32至53中任一权利要所述的方法，其还包括将稳定添加剂的基本均匀的混合物涂覆于所述底物表面的步骤，其中选择所述稳定添加剂以稳定所述功能性分子。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述向所述底物上涂覆所述添加剂的基本均匀的混合物的步骤包括蒸发所述添加剂的溶液的溶剂。

56.如权利要求54或55所述的方法，其中所述稳定添加剂选自糖、有机酸、氨基酸、糖酸和硫醇。

57.用于透析装置的吸附剂盒，所述吸附剂盒包括用于固定尿素酶的权利要求1至23中任一权利要求所述的底物。

58.用于透析装置的透析仪，所述透析仪包括用于固定尿素酶的权利要求1至22中任一权利要求所述的底物。

59.透析方法，其包括下列步骤：

将含尿素的透析液暴露于权利要求1至22中任一权利要求所述的底物，以及

从所述底物除去所述透析液。

60.权利要求1至22中任一权利要求所述的底物在透析装置中的用途。

61.修饰用于在其上固定功能性分子的透析膜的方法，所述方法包括下列步骤：

(iv)将亲电子化合物结合于所述膜表面；

(v)使所述亲电子化合物进行亲核取代反应以在其上提供亲核基团，并由此增加所述膜表面的亲核性；以及

(vi)使所述亲核基团与另一亲电子化合物进行亲核取代反应以在所述膜表面上提供亲电子基团，并由此增加用于在其上固定功能性分子的所述膜表面的亲电子性。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述膜为醋酸纤维素膜。

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