CN111117996A

CN111117996A - 固定化酶、其制备方法及应用

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Publication number: CN111117996A
Application number: CN202010038661.9A
Authority: CN
Inventors: 洪浩; 詹姆斯·盖吉; 肖毅; 罗杰斯卡·维亚撒·威廉姆斯; 崔瑜霞; 张娜; 赵佳东; 高妍妍
Original assignee: Asymchem Laboratories Jilin Co Ltd
Current assignee: Asymchem Laboratories Jilin Co Ltd
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2020-05-08

Abstract

本发明公开了一种固定化酶、其制备方法及应用。其中，该制备方法包括以下步骤：采用聚乙二醇修饰交联剂，得到聚乙二醇修饰的交联剂；将游离的酶沉淀，然后加入聚乙二醇修饰的交联剂进行交联固定得到固定化酶。应用本发明的技术方案，采用聚乙二醇修饰的交联剂对酶进行固定，固定后作为无载体固定化酶具有更好的稳定结构，具有更强的机械稳定性。

Description

固定化酶、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，具体而言，涉及一种固定化酶、其制备方法及应用。

背景技术

生物催化已经成为重要药物部分、结构单元和中间体的绿色合成最有前景和最有利的技术之一，特别是为手性合成提供了独特的替代途径。合成化学家对连续流合成的兴趣日益增加，现在引起了对生物转化的关注。在工业过程中越来越多地使用酶作为催化剂导致对固定化形式的酶的需求增加，因为它提供了独特的工艺和成本优势。通常称为“生物催化剂”的固定化酶广泛用于工业有机合成和生物转化。

生物催化剂可以使用全活细胞、死细胞、粗酶或纯化酶来生产，这取决于酶的类型和应用。酶的可扩大生产和蛋白质工程的进步使得生物催化剂有可能实现商业化应用，并且具有较好的经济价值。

新型固定化平台的出现使得固定化酶在连续流动生物催化中完美整合。新型高效酶的发现和进化、强调生物催化的新型反向合成方法、降低的重组蛋白成本和酶固定化策略等都是生物催化在连续合成中应用的良好基础。

从概念上讲，制备固定化酶所用的固定主要包括物理吸附、载体结合、包埋和交联等方法。其中，物理吸附依赖于酶与载体的亲和力，虽然简单，但相互作用很弱，酶很容易被解吸和丢失；载体结合涉及通过离子键或共价键将酶连接到水不溶性载体上，该方法具有由于强化学键而使酶分子部分失活的缺点，目标酶也需要更纯化的形式，这最终增加了催化剂生产的成本。

近年来，在各种固定技术中，无载体，自交联酶固定化变得越来越重要。在过去的几十年中，无载体交联酶技术成为增强酶稳定性的有吸引力的方法[Roy et al，2004]。在该技术中，酶通过双功能交联剂交联，形成稳定的多相生物催化剂，明显优于常规固定化酶。通常使用各种载体的固定化酶是“载体结合的生物催化剂”，并且大部分非催化载体(总质量的约90～99％)的存在导致其体积活性的稀释。而被称为“无载体生物催化剂”的交联酶每单位体积表现出非常高的催化活性，从而使体积生产率和时空产率最大化[Sheldon等2005]。

目前，有关于固定脂肪酶、青霉素酰基转移酶、蛋白酶及氨基酰化酶等的无载体方法的已有报道，但是在其他敏感酶或新出现的酶如单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、转氨酶、酮还原酶、氨基酸脱氢酶及腈水解酶等制作成固定化酶的应用几乎没有报道。

另外，目前无载体固定化酶的缺点包括：在没有固体支持的情况下，无载体固定化酶尚不能完全扩展到大批量生产，因为它们对剪切应力和苛刻的搅拌条件表现出低机械稳定性，并且还可能引起过滤问题。当在分批搅拌反应中进行生物转化时，STY(空间-时间产率)相当低，这将导致相对低的生产率，而连续流动反应可以显着改善STY，从而得到更高的生产率、可控性及环境友好性。

因此，继续开发一种具有较强机械稳定性的无载体固定化酶。

发明内容

本发明旨在提供一种固定化酶、其制备方法及应用，以提高固定化酶的机械稳定性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种固定化酶的制备方法。该制备方法包括以下步骤：采用聚乙二醇修饰交联剂，得到聚乙二醇修饰的交联剂；将游离的酶共沉淀，同时加入聚乙二醇修饰的交联剂进行交联固定得到固定化酶。

进一步地，采用聚乙二醇修饰交联剂的步骤包括：交联剂与聚乙二醇混合，得到聚乙二醇修饰的交联剂；优选的，聚乙二醇为PEG 2000～PEG 6000；优选的，聚乙二醇与所以交联剂的质量比为1:5～5:1，更有选的，质量比为1:2～3:1；优选的，交联剂为戊二醛或醛基化右旋糖苷；优选的，在室温下混合3～20小时。

进一步地，酶为ω-转氨酶、酮还原酶、环己酮单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、亮氨酸脱氢酶或腈水解酶。

进一步地，将游离的酶沉淀包括：将沉淀剂滴加至含游离酶的溶液中，或将含游离酶的溶液滴加至沉淀剂中；优选的，将游离酶沉淀操作包括将沉淀剂滴加至含游离酶的溶液中，或将含游离酶的溶液滴加至沉淀剂中搅拌。

进一步地，沉淀剂为选自由硫酸铵、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈、PEG 2000-6000和丙酮组成的组中的一种或多种；其中，作为沉淀剂，硫酸铵的浓度为20～70g/100mL，优选为30～60g/100mL；乙醇的浓度为60～90g/100mL，优选为70～90g/100mL；正丙醇的浓度为50～90g/100mL，优选为60～80g/100mL；乙腈的浓度为50～90g/100mL，优选为60～70g/100mL；丙酮的浓度为50～90g/100mL，优选为60～80g/100mL；PEG 2000-6000的浓度为10～60g/100mL，优选为20～40g/100mL。

进一步地，聚乙二醇修饰的交联剂在酶沉淀和聚乙二醇修饰的交联剂进行交联的反应体系中的浓度为20mM～300mM，更优选为50～250mM；优选的，反应体系的温度为2～30℃；优选的，搅拌反应体系0.5～20h后抽滤，用缓冲液洗得到的固定化酶，优选的，缓冲液为磷酸盐缓冲液。

根据本发明的另一个方面，提供一种固定化酶。该固定化酶通过上述任一项的制备方法制备得到。

进一步地，固定化酶为ω-转氨酶、酮还原酶、环己酮单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、亮氨酸脱氢酶或腈水解酶的固定化酶。

进一步地，ω-转氨酶为来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或来源于B.thuringiensis的转氨酶；优选地，酮还原酶为来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶，或者来源于Candidamacedoniensis AKU4588的酮还原酶；优选地，单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶；

优选地，氨裂解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶；优选地，烯还原酶为来源于Saccharomycescerevisiae的烯还原酶和来源于Chryseobacterium sp.CA49的烯还原酶；优选地，亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp或Bacillus cereus的亚胺还原酶；优选地，氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶或者来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；优选地，腈水解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurospora crassa OR74A的腈水解酶。优选地，来源于Chromobacterium violaceumDSM30191的转氨酶为具SEO ID NO.2序列或具有SEO ID NO.3的突变体；来源于Arthrobacter citreus的转氨酶为具有SEO ID NO.5序列或SEO ID NO.6序列的突变体；来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶为具有SEO ID NO.8序列或SEO ID NO.9序列的突变体；来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEO ID NO.11序列或SEO ID NO.12序列的突变体；来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEO ID NO.14序列或SEO ID NO.15序列的突变体。

根据本发明的再一个方面，提供一种上述固定化酶在水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系中的应用。

进一步地，水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系在填充床反应器或连续搅拌釜反应器中进行反应应用。

应用本发明的技术方案，采用聚乙二醇修饰的交联剂对酶进行固定，固定后作为无载体固定化酶具有更好的稳定结构，具有更强的机械稳定性。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

名词解释及缩写：

SCE：Self-Cross Linked Enzyme，自交联酶。

GA：Glutaraldehyde，戊二醛。

DA:Dextran aldehyde,醛基化右旋糖酐

PEG:Polyethylene Glycol，聚乙二醇。

PVA：Polyvinyl alchohol，聚乙烯醇。

CSTR：Continuous stirred tank reactor，连续搅拌釜反应器。

PBR：Packed bed reactor，填充床反应器。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种固定化酶的制备方法。该固定化酶的制备方法包括以下步骤：采用聚乙二醇修饰交联剂，得到聚乙二醇修饰的交联剂；将游离的酶共沉淀，同时加入聚乙二醇修饰的交联剂进行交联固定得到固定化酶。

在本发明一种典型的实施方式中，采用聚乙二醇修饰交联剂的步骤包括：用水稀释交联剂，加入聚乙二醇在室温下混合，得到聚乙二醇修饰的交联剂。如此修饰后，交联过程也得到改善，具有更好的缓冲，能够实现更高的活性恢复和稳定性。优选的，交联剂用水稀释后的浓度为2～10％w/v；聚乙二醇为PEG 2000～PEG 6000。

典型的，交联剂为戊二醛或醛基化右旋糖苷。众所周知，广泛用作接头的戊二醛(GA)可引起酶变性，在本发明中，交联过程也得到显着改善，实现了更高的活性恢复和稳定性。GA与PEG或PEI一起使用或之后用于酶活性保护，改善了酶活性和稳定性。戊二醛的醛基与PEG的羟基或PEI的氨基发生共价结合，最后形成分散有醛基、氨基/羟基的网状结构，这种网状结构中的各官能团与酶蛋白间通过共价作用、氢键作用、离子作用、以及疏水作用等多种方式结合，而不是像戊二醛那样仅仅是共价结合，避免了仅仅是共价键作用破坏酶的活性。优选的，在室温下混合3～20小时。

根据本发明一种典型的实施方式，酶为ω-转氨酶、酮还原酶、环己酮单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、亮氨酸脱氢酶或腈水解酶。采用本发明方法生产的固定化转氨酶、酮还原酶、环己酮单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、亮氨酸脱氢酶或腈水解酶，作为独立的酶催化剂或作为共固定化的融合酶催化剂，表现出更高的活性和机械稳定性，并且在各个模型反应中重复使用>10个循环，显示出增强的操作稳定性。当这些酶的固定化酶应用于底物转化时，在最佳固定条下，即使用聚乙二醇或硫酸铵做沉淀剂，用聚乙二醇修饰的戊二醛做交联剂，聚乙二醇与戊二醛的比例为PEG6000:GA＝2:1，聚乙二醇修饰的交联剂在酶沉淀和聚乙二醇修饰的交联剂进行交联的反应体系中的浓度为200mM，反应体系的温度为20℃；搅拌反应体系60min后抽滤，用缓冲液洗得到的固定化酶，可获得超过30％的活性，并且在使用10个循环后没有明显的活性下降。其中转氨酶TA-Cv的突变体用乙腈做沉淀剂，用PEG修饰的戊二醛(PEG6000:GA＝2:1)做交联剂，交联剂在酶沉淀和聚乙二醇修饰的交联剂进行交联的反应体系中的浓度为200mM，交联60min，所得固定化酶在水相反应中应用可以重复使用21次之多，在有机相反应中应用可以重复使用18次。在沉淀期间将沉淀剂滴加至酶液中，或将酶液滴加至沉淀剂乙腈中，均可达到理想的效果。

根据本发明一种典型的实施方式，将游离的酶沉淀包括：将沉淀剂滴加至含游离酶的溶液中，或将含游离酶的溶液滴加至沉淀剂中；优选的，将游离酶沉淀操作在2～10℃下进行；在此条件下，游离的酶能够有效地沉淀和交联。更优选的，将游离酶沉淀操作包括将沉淀剂滴加至含游离酶的溶液中，或将含游离酶的溶液滴加至沉淀剂中搅拌1～2小时。

典型的，沉淀剂为选自由硫酸铵、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈、PEG 2000-6000和丙酮组成的组中的一种或多种；其中，作为沉淀剂，硫酸铵的浓度为20～70g/100mL，优选为30～60g/100mL；乙醇的浓度为60～90g/100mL，优选为70～90g/100mL；正丙醇的浓度为50～90g/100mL，优选为60～80g/100mL；乙腈的浓度为50～90g/100mL，优选为60～70g/100mL；丙酮的浓度为50～90g/100mL，优选为60～80g/100mL；PEG 2000-6000的浓度为10～60g/100mL，优选为20～40g/100mL。也就是说，在本申请各种沉淀剂可以单独使用，也可以与其它共溶剂和共沉淀剂组合使用。当PEG用作沉淀剂时，上述列举的酶都具有增强的活性和稳定性。优选地，聚乙二醇修饰的交联剂在酶沉淀和聚乙二醇修饰的交联剂进行交联的反应体系中的浓度为20mM～200mM；更优选的，反应体系的温度为2～20℃；搅拌反应体系30～60min后抽滤，用缓冲液洗得到的固定化酶，优选的，缓冲液为磷酸盐缓冲液。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种固定化酶。该固定化酶通过上述任一种制备方法制备得到。固定化酶可以为ω-转氨酶、脂肪酶、酮还原酶、环己酮单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、亮氨酸脱氢酶或腈水解酶的固定化酶等，优选地，ω-转氨酶为来源于B.thuringiensis的D-氨基酸转氨酶或者来源于Vibrio fluvialis strainJS17的丙酮酸转氨酶，优选地，酮还原酶为来源于Sporobolomyces salmonicolor的酮还原酶，或者来源于Candida macedoniensis AKU4588的酮还原酶；优选地，单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶；优选地，氨裂解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶；优选地，烯还原酶为来源于Bacilluscereus的烯还原酶和来源于Bacillus sphaericus的烯还原酶；优选地，亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp或Bacillus cereus的亚胺还原酶；优选地，氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶或者来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；优选地，腈水解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurosporacrassa OR74A的腈水解酶。

根据本发明一种典型的实施方式，提供如上述固定化酶在水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系中的应用。典型的，水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系在填充床反应器或连续搅拌釜反应器中进行反应应用。由于良好的机械稳定性和操作稳定性，这些固定华美可以在没有高背压的PBR(填充床反应器)中使用，也可以应用于CSTR(连续搅拌釜反应器)而没有过滤问题。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种固定化酶的制备方法。该制备方法包括以下步骤：将游离的酶沉淀，然后加入交联剂进行交联固定得到固定化酶，酶为ω-转氨酶、脂肪酶、酮还原酶、环己酮单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、亮氨酸脱氢酶或腈水解酶的固定化酶。本发明进一步提供了上述酶的固定化酶的形式。在本发明已典型的实施方式中，将游离的酶沉淀包括：将沉淀剂滴加至含游离酶的溶液中，或将含游离酶的溶液滴加至沉淀剂中；优选的，将游离酶沉淀操作在2～10℃下进行；优选的，将游离酶沉淀操作包括将沉淀剂滴加至含游离酶的溶液中，或将含游离酶的溶液滴加至沉淀剂中搅拌1～2小时；优选的，沉淀剂为选自由硫酸铵、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈、PEG 2000-6000和丙酮组成的组中的一种或多种。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种固定化酶，固定化酶通过上述制备方法制备得到。

以下将结合实施例和对比例进一步说明本申请的有益效果。

以下实施例中用到的酶及其来源见下表1-1～1-5(突变体见表1-2～1-5下部分，其余为野生型，具体序列见GeneBank)。

表1-1：

表1-2：

突变体序列

表1-3：

表1-3：

表1-4：

表1-5：

上述酶所参与反应的化学过程简述如下：

上述反应式中的R，R₁和R₂可以各自独立的选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基，或R1与其所连接的杂环形成稠环体系。

实施例1

酶分子自身交联共价固定化(SCE)

3mg/mL PLP(5’-磷酸吡哆醛)溶解至10mL转氨酶TA-Cv酶液中，冰水浴搅拌下缓慢将20mL乙腈加入到酶液中，或将酶液缓慢滴加至20mL乙腈中，加毕，搅拌60min后，再加入25％或50％戊二醛溶液(使终浓度为200mM)，冰水浴搅拌30～40min后离心或过滤，沉淀用磷酸缓冲液洗3次后，4℃保存，可直接应用于水相反应。或将交联酶聚集体冻干，冻干后得到的交联酶聚集体冻干粉可在水相和有机相反应中应用。

实施例2

优化的酶分子自身交联共价固定化(SCE)

PEG修饰的GA(PEG-GA)的制备：用水稀释戊二醛(GA)，使其最终浓度为20％(w/v，20g/100mL)，并加入PEG 2000或PEG 6000，是PEG与GA的质量比为2：1，在室温下混合1～3小时，保持直至使用。

3mg/mL PLP(5’-磷酸吡哆醛)溶解至10mL酶液中，冰水浴搅拌下将乙腈加入到酶液中，加毕，搅拌1-2h后，再加入PEG修饰的GA(GA终浓度200mM)，冰水浴搅拌30～40min后离心或过滤，沉淀用磷酸缓冲液洗3次后，4℃保存，可直接应用于水相反应。或将交联酶聚集体冻干，冻干后得到的交联酶聚集体冻干粉可在水相和有机相反应中应用

实施例3

醛基化右旋糖酐(DA)做交联剂制备固定化酶

10mL酮还原酶KRED-Ac酶液中，冰浴条件下加入约5g硫酸铵固体，加毕，搅拌60min后，再加入醛基化右旋糖酐(使终浓度为100mM)，冰水浴搅拌30～40min后离心或过滤，沉淀用磷酸缓冲液洗3次后，4℃保存，可直接应用于水相反应。或将交联酶聚集体冻干，冻干后得到的交联酶聚集体冻干粉可在水相和有机相反应中应用。

实施例4

优化的醛基化右旋糖酐交联剂制备固定化酶

PEG修饰的DA(PEG-DA)的制备：用水稀释戊二醛(GA)，使其最终浓度为20％w/v，并加入PEG 2000或PEG 6000，使PEG与DA的质量比为3：1，在室温下混合1～3小时，保持直至使用。

3mg/mL PLP(5’-磷酸吡哆醛)溶解至10mL酶液中，冰水浴搅拌下将乙腈加入到酶液中，加毕，搅拌1-2h后，再加入PEG修饰的DA(DA终浓度100mM)，冰水浴搅拌30～40min后离心或过滤，沉淀用磷酸缓冲液洗3次后，4℃保存，可直接应用于水相反应。或将交联酶聚冻干，冻干后得到的交联酶聚集体冻干粉可在水相和有机相反应中应用

实施例5

PEG修饰交联剂温度与时间考察，具体参数见表2。

表2

实施例6

转氨酶自身交联共价固定化酶水相反应验活

在10mL的反应瓶中，加入0.3mL MeOH，溶解0.1g上述主原料1或主原料2，并加入4eq异丙胺盐酸盐和1.0mg PLP(5’-磷酸吡哆醛)，补加0.1M PB 7.0至反应液终体积为1mL，再加入5mg酶粉或由10mg酶粉制备的交联酶聚集体湿酶或交联酶聚集体冻干粉，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下(表3，表4)：

表3.转氨酶TA-Cv自身交联固定化酶水相反应概况

表4.转氨酶TA-Ac自身交联固定化酶水相相反应概况

表5.TA-Bt交联酶聚集体水相反应验活结果

实施例7

自身交联共价固定化酶有机相反应验活

在10mL的反应瓶中，加入1mL水饱和甲基叔丁基醚，再加入100mg主原料1及4eq异丙胺，然后加入20mg酶或由20mg酶制备的交联酶聚集体冻干粉，30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下(表6)

表6.TA-Cv自身交联固定化酶有机相反应概况

实施例8

自身交联共价固定化酶水相-有机相两相反应验活

在10mL的反应瓶中，加入1mL水饱和甲基叔丁基醚，再加入100mg主原料及4eq异丙胺盐酸盐，然后加入5mg酶或由20mg酶制备的交联酶，30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下(表7)

表7.TA-Ac自身交联固定化酶水相-有机相两相反应概况

实施例9

酮还原酶自身交联固定化酶聚集体水相反应验活

交联酶制备方法同实施例1～4

在10mL的反应瓶中，加入0.5mL异丙醇(IPA)，溶解0.1g主原料3或4，并加入0.5mL0.1M PB 7.0和1mg NAD+，再加入5mg酶或由20mg酶制备的固定化酶，在30℃搅拌16-20h。体系经GC检测转化率，游离酶转化率>99％，固定化酶反应数据如下表8。

表8.酮还原酶共价固定化酶水相反应概况

实施例10

酮还原酶自身交联固定化酶有机相反应

在10mL的反应瓶中，加入1mL水饱和甲基叔丁基醚，再加入100mg主原料3及0.1mL异丙醇，然后加入100mg游离酶冻干粉或100mg酶粉制备的交联酶聚集体冻干粉(PEG6000做沉淀剂，PEG6000:GA＝2:1做交联剂)，30℃搅拌16h。体系经HPLC检测转化率，结果如表9。

表9

实施例11

氨基酸脱氢酶GP共价固定化酶聚集体水相反应验活

将5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0-9.0)加入10mL反应瓶中，然后加入100mg主原料5、6，或7，108mg氯化铵，调节pH至pH 7.5～8.0，然后加入10主原料50mg NAD+，和5mgGDH，和10mg AADH或由30mg游离酶制成的固定化AADH。在30℃下反应16-20小时后，进行转化试验。游离酶转化率99％。

氨基酸脱氢酶GP共价固定化酶水相反应概况见表10。

表10

实施例12

烯还原酶自身交联共价固定化酶水相反应验活

在10mL的反应瓶中，加入50mg上述主原料8，并加入甲酸铵80mg和FDH 10mg以及NAD⁺、NADP⁺各0.6mg，补加0.1M PB 7.5至反应液终体积为2.4mL，再加入10mg酶或由30mg酶制备的交联酶聚集体湿酶或交联酶聚集体，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下(表11)：

表11.烯还原酶自身交联固定化酶水相反应概况

实施例13

氨裂解酶自身交联共价固定化酶水相反应验活

在20mL的反应瓶中，加入0.1g上述主原料和2mL纯化水混匀，后加入4M氨基甲酸铵4mL，再加入10mg酶或由30mg酶制备的交联酶聚集体湿酶或交联酶聚集体，在30℃搅拌40-48h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下(表12)：

表12.氨裂解酶自身交联固定化酶水相反应概况

实施例14

亚胺还原酶自身交联共价固定化酶水相反应验活

在10mL的反应瓶中，加入0.1g上述主原料，加入葡萄糖0.36g和NAD⁺3mg、NADP⁺3mg，以及GDH 5mg，补加0.1MPB 7.5至反应液终体积为5mL，并加入10mg酶或由30mg酶制备的交联酶聚集体湿酶或交联酶聚集体，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下(表13)：

表13.亚胺还原酶自身交联固定化酶水相反应概况

实施例15

腈水解酶自身交联共价固定化酶水相反应验活

在10mL的反应瓶中，加入0.1g上述主原料，以及0.1MPB 7.5 3mL，并加入10mg酶粉或由30mg酶粉制备的交联酶聚集体湿酶或交联酶聚集体，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下(表14)：

表14.腈水解酶自身交联固定化酶水相反应概况

实施例16

单加氧酶自身交联共价固定化酶水相反应验活

在10mL的反应瓶中，加入0.1g上述主原料，并加入异丙醇0.3mL和NADP⁺10mg，以及ADH酶粉2mg，补加0.1M KPB 8.0至反应液终体积为4mL，再加入20mg酶或由40mg酶制备的交联酶聚集体湿酶或交联酶聚集体，在30℃搅拌16-20h。体系经HPLC检测转化率，反应数据如下(表15)：

表15.单加氧酶自身交联固定化酶水相反应概况

实施例17

转氨酶交联酶聚集体在填充床连续反应中的应用

实施例6中转氨酶TA-Cv-V1，以乙腈为沉淀剂，PEG修饰的戊二醛(PEG2000:GA＝3:1)做交联剂，所得交联酶填充至100mL柱体积的柱状反应器中，固定化酶用量60g。

500g底物1，用1.5L的甲醇溶解，并加入4eq的异丙胺盐酸盐(1.8L的6M异丙胺盐酸盐水溶液)和5g PLP，不加PB缓冲液(0.1M,pH8.0)定容至5L。

设置流速0.8mL/min，即保留时间125min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞97％，持续运行424h，转化率无降低，运行436h，转化率降低至90％。见表16。

表16

实施例18

转氨酶固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用

TA-Ac-V2，以硫酸铵为沉淀剂，PEG修饰的戊二醛(PEG6000:GA＝2:1)做交联剂。200mL反应器中加入50g转氨酶TA-Ac-V2的交联酶聚集体，加入150mL磷酸缓冲液。

以0.5mL/min的速度向反应瓶中连续添加底物溶液(即保留时间400min)，同时以同样的流速在出口抽出反应体系(管道末端加过滤头，防止将固定化酶抽出)。在该条件下，转化率可达92％以上，且连续运行480h，转化率基本无降低。结果如表17所示。

表17

实施例19

氨裂解酶固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用

氨裂解酶PAL-Ss以硫酸铵为沉淀剂，PEG修饰的戊二醛(PEG6000:GA＝2:1)做交联剂，所得固定化酶6g填充至10mL柱状反应器。

500g底物9，用4.5L的氨基甲酸铵水溶液(4M,pH9.0～9.5)溶解。

设置流速0.03mL/min，即保留时间330min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率80％，持续运行400h，转化率无降低，运行412h，转化率降低至76％。见表18。

表18

实施例20

酮还原酶交联酶在连续反应搅拌罐中的应用

酮还原酶KRED-Ac以PEG6000为沉淀剂，PEG修饰的醛基化右旋糖酐(PEG6000:DA＝3:1)做交联剂，所得固定化酶6.2g填充至10mL柱状反应器。。

100g底物3，用0.3L的异丙醇溶解，加入0.7L PB缓冲液(0.1M,pH7.0)溶解，然后加入0.1g NAD+。

设置流速0.05mL/min，即保留时间200min，进行连续化反应，出口端流出液检测转化率，转化率＞90％，持续运行180h，转化率无降低，运行200h，转化率降低至84％。见表19。

表19.KRED-Ac-V1交联酶聚集体在填充床连续反应中的反应结果

实施例21

沉淀剂及沉淀剂浓度筛选

固定化酶制备同实施例2。PEG修饰的GA(PEG-GA)的制备：用水稀释戊二醛(GA)，使其最终浓度为20％(w/v，20g/100mL)，并加入PEG 2000或PEG 6000，是PEG与GA的质量比为2：1，在室温下混合1～3小时，保持直至使用。

3mg/mL PLP(5’-磷酸吡哆醛)溶解至10mL酶液中，冰水浴搅拌下将沉淀剂加入到酶液中，加毕，搅拌1-2h后，再加入PEG修饰的GA(GA终浓度200mM)，冰水浴搅拌30～40min后离心或过滤，沉淀用磷酸缓冲液洗3次后，4℃保存，直接应用于水相反应。沉淀剂类型和个沉淀剂的浓度对收率、酶活和使用次数的影响见表20。沉淀剂浓度过低会影响收率，重复使用次数也会稍差。有机溶剂类沉淀剂浓度过高也会影响酶的重复使用次数。硫酸铵、PEG浓度高于一定值时，继续提高对收率、酶活和重复使用次数没有过多影响，考虑到成本，无需进一步提高沉淀剂浓度。

表20.沉淀剂及沉淀剂浓度对收率、酶活和重复使用稳定性的影响

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 吉林凯莱英医药化学有限公司

<120> 固定化酶、其制备方法及应用

<130> PN112093KLY

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 459

<212> PRT

<213> Chromobacterium violaceum DSM30191

<400> 1

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<212> PRT

<213> Arthrobacter citreus

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595 600

Claims

1.一种固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用聚乙二醇修饰交联剂，得到聚乙二醇修饰的交联剂；

将游离的酶共沉淀，同时加入所述聚乙二醇修饰的交联剂进行交联固定得到所述固定化酶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述采用聚乙二醇修饰交联剂的步骤包括：交联剂与聚乙二醇混合，得到所述聚乙二醇修饰的交联剂；

优选的，所述聚乙二醇为PEG 2000～PEG 6000；

优选的，所述聚乙二醇与所以交联剂的质量比为1:5～5:1，更有选的，质量比为1:2～3:1；

优选的，所述交联剂为戊二醛或醛基化右旋糖苷

优选的，在室温下混合3～20小时。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶为ω-转氨酶、酮还原酶、环己酮单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、亮氨酸脱氢酶或腈水解酶。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将游离的酶沉淀包括：

将沉淀剂滴加至含游离酶的溶液中，或将含游离酶的溶液滴加至沉淀剂中；

优选的，所述将游离酶沉淀操作包括将沉淀剂滴加至含游离酶的溶液中，或将含游离酶的溶液滴加至沉淀剂中搅拌。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述沉淀剂为选自由硫酸铵、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈、PEG 2000-6000和丙酮组成的组中的一种或多种；其中，作为沉淀剂，硫酸铵的浓度为20～70g/100mL，优选为30～60g/100mL；乙醇的浓度为60～90g/100mL，优选为70～90g/100mL；正丙醇的浓度为50～90g/100mL，优选为60～80g/100mL；乙腈的浓度为50～90g/100mL，优选为60～70g/100mL；丙酮的浓度为50～90g/100mL，优选为60～80g/100mL；PEG 2000-6000的浓度为10～60g/100mL，优选为20～40g/100mL。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇修饰的交联剂在酶沉淀和聚乙二醇修饰的交联剂进行交联的反应体系中的浓度为20mM～300mM，更优选为50～250mM；

优选的，所述反应体系的温度为2～30℃；

优选的，搅拌所述反应体系0.5～20h后抽滤，用缓冲液洗得到的固定化酶，优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液。

7.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶通过如权利要求1至6中任一项所述的制备方法制备得到。

8.根据权利要求7所述的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶为ω-转氨酶、酮还原酶、环己酮单加氧酶、氨裂解酶、烯还原酶、亚胺还原酶、亮氨酸脱氢酶或腈水解酶的固定化酶。

9.根据权利要求8所述的固定化酶，其特征在于，所述ω-转氨酶为来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶或者来源于Arthrobacter citreus的转氨酶，或来源于B.thuringiensis的转氨酶；

优选地，所述酮还原酶为来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶，或者来源于Candida macedoniensis AKU4588的酮还原酶；

优选地，所述单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶，或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶；

优选地，所述氨裂解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的氨裂解酶和来源于Solenostemon scutellarioides的氨裂解酶；

优选地，所述烯还原酶为来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶和来源于Chryseobacterium sp.CA49的烯还原酶；

优选地，所述亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp或Bacillus cereus的亚胺还原酶；

优选地，所述亮氨酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus的亮氨酸脱氢酶或者来源于Bacillus sphaericus的苯丙氨酸脱氢酶；

优选地，所述腈水解酶为来源于Aspergillus niger CBS 513.88的腈水解酶和来源于Neurospora crassa OR74A的腈水解酶；

优选地，所述来源于Chromobacterium violaceum DSM30191的转氨酶为具SEO IDNO.2序列或具有SEO ID NO.3的突变体；所述来源于Arthrobacter citreus的转氨酶为具有SEO ID NO.5序列或SEO ID NO.6序列的突变体；所述来源于Acetobacter sp.CCTCCM209061的酮还原酶为具有SEO ID NO.8序列或SEO ID NO.9序列的突变体；所述来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEO ID NO.11序列或SEO ID NO.12序列的突变体；所述来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEO ID NO.14序列或SEO ID NO.15序列的突变体。

10.如权利要求7所述的固定化酶在水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述水性缓冲液反应体系或有机溶剂反应体系在填充床反应器或连续搅拌釜反应器中进行反应应用。