CN110951718A - 共固定化酶、其制备方法及其应用 - Google Patents

共固定化酶、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种共固定化酶、其制备方法及其应用。该共固定化酶包括:氨基树脂载体以及主酶和辅酶,主酶和辅酶共固定于氨基树脂载体上,其中,主酶共价固定于氨基树脂载体上,辅酶通过共价和/或非共价方式固定于氨基树脂载体上;主酶选自如下任意一种酶:转氨酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、酮还原酶、烯还原酶及单加氧酶。将主酶及其辅酶共固定于氨基树脂载体上共固定化,提高酶的活性及循环使用效率。

Description

共固定化酶、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及固定化酶领域,具体而言,涉及一种共固定化酶、其制备方法及其应用。
背景技术
微生物细胞或分离的酶或工程酶的应用使得生物催化取得了重大进展,且使得制造方式发生了转变。许多种类的酶如酰基转移酶、酰胺酶、转氨酶、酮还原酶、氧化酶、单加氧酶及水解酶等被用于生产涉及抗生素、除草剂、医药中间体和新时代治疗剂的反应中。
当游离酶用作生物催化剂时,会有很大的酶浪费,因为回收水溶性酶非常困难。而水不溶性固定化酶,在每个循环后,通过非常简单的过滤就可以容易地回收。
现有技术中已经有报道单一酶的固定化方法,但不同的酶所适合的固定化方法是不同的。比如Bolivar等(Biomacromol.2006,7,669-673)研究了来自假单胞菌SP101的FDH的共价固定化,包括共价固定于改性琼脂糖、CNBr活化的琼脂糖、Sepabeads(葡聚糖)及乙醛琼脂糖的各种载体上。其得出的结论是:固定化于溴化物,聚乙烯亚胺,戊二醛等活化的载体上并不会促进酶在热灭活下的任何稳定作用。然而,高度活化的乙二醛琼脂糖的优化的酶被证明是具有很高的热稳定性、pH稳定性并且在具有增强的稳定性情况下具有超过50%的活性。
Kim et al(J.Mol.Catal B:Enzy 97(2013)209–214)报道了使用交联酶聚集体(CLEA)的方法来固定来自Candida boidinii.的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH),并认为葡聚糖多醛(dextran polyaldehyde)作为交联剂代替戊二醛(glutaraldehyde)对于固定化酶更好,经过10次重复使用后残留活性超过95%。此外,葡聚糖多醛形成的交联酶聚集体(Dex-CLEA)的热稳定性比游离酶的热稳定性提高了3.6倍。
Binay et al(Beilstein J.Org.Chem.2016,12,271–277)报道了高活性的来源于Candida methylica的FDH的固定化酶。FDH共价固定到环氧活化Immobead 150载体上,Immobead 150载体先经过乙二胺(ethylenediamin)修饰,然后依次经过戊二醛活化(FDHIGLU)及醛基官能化(FDHIALD)。当使用醛基官能化的Immobead 150作为载体时,分别获得最高的固定化产率和活性产率,分别为90%和132%。在35℃下,游离FDH,FDHI150,FDHIGLU和FDHIALD的半衰期(t1/2)分别计算为10.6、28.9、22.4和38.5小时。FDHI150,FDHIGLU和FDHIALD在10次重复使用后分别保留了其初始活动的69%,38%和51%。
Jackon等(Process Biochem.Vol.1,9,Sep 2016,1248-1255)报道了采用乙二醛-琼脂糖对LDH的固定化。与其可溶性对应物相比,固定化LDH获得的热稳定因子大1600倍。
也有些报道了两种酶的共固定化,比如Valikhani等(Biotech.Bioengg.2018;115:2416–2425)报道了细胞色素P450单加氧酶(色素P450s)与来源于B.megaterium的葡萄糖脱氢酶的共固定化。Delgrove等人(Appl.Catal.A:Gen.Vol.572,25Feb.2019,134-141)发表了共固定化的Baeyer-Villiger单加氧酶(BVMO)和葡萄糖脱氢酶用于ε-己内酯衍生物的合成。将来自Thermocrispum municipale的热稳定环己酮单加氧酶(TmCHMO)与来自Thermoplasma acidophilum的葡萄糖脱氢酶(GDH)(GDH-Tac)共固定化到氨基官能化琼脂糖基载体(MANA-琼脂糖)上。共固定化被证明是最有效的生物催化剂,在3,3,5-三甲基环己酮的合成中,在15个重复循环中平均转化率为83%。
综上可知,现有技术中仍存在大量的酶还没有有效的固定化酶形式,尤其是某些共同参与同一生物催化反应的酶,这些酶的共固定化以提高酶的可循环利用性便成了亟待解决的问题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种共固定化酶、其制备方法及其应用,以解决现有技术此类酶难以循环利用的问题。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种共固定化酶,该共固定化酶包括:氨基树脂载体以及主酶和辅酶,辅酶为一种或多种,主酶和辅酶共固定于氨基树脂载体上,其中,主酶共价固定于氨基树脂载体上,辅酶通过共价和/或非共价方式固定于氨基树脂载体上;主酶选自如下任意一种酶:转氨酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、酮还原酶、烯还原酶及单加氧酶。
进一步地,转氨酶为来源于B.thuringiensis或Vibrio fluvialis strain JS17的转氨酶;优选地,氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus或Bacillus sphaericus的氨基酸脱氢酶;优选地,亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp或Bacillus cereus的亚胺还原酶;优选地,酮还原酶为来源于Sporobolomyces salmonicolor的酮还原酶或者Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶,更优选地,来源于Acetobacter sp.CCTCCM209061的酮还原酶为具有SEO ID NO:1或SEO IDNO:2序列的突变体;优选地,烯还原酶为来源于Chryseobacterium sp.CA49或Sewanella oneidensis MR-1的烯还原酶;优选地,单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶,或者来源于Brachymonaspetroleovorans的环己酮单加氧酶,或来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶;更优选地,来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEO ID NO:4序列或SEOID NO:5序列的突变体;来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEO IDNO:7序列或SEO ID NO:8序列的突变体。
进一步地,辅酶选自如下至少一种:乳酸脱氢酶(LDH)、甲酸铵脱氢酶(FDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)及醇脱氢酶;优选地,乳酸脱氢酶为来源于Lactobacillus helveticus的D-乳酸脱氢酶;优选地,甲酸铵脱氢酶为来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶;优选地,葡萄糖脱氢酶为来源于Lysinibacillus sphaericus G10的葡萄糖1-脱氢酶;优选地,醇脱氢酶为来源于Thermoanaerobium brockii的醇脱氢酶;优选地,共固定化酶的循环利用次数为4~25次。
进一步地,氨基树脂载体为戊二醛活化的氨基树脂载体;优选地,氨基树脂载体为带有C2或C4连接臂的氨基树脂载体,更优选地,氨基树脂载体选自如下任意一种:
Figure BDA0002299660450000031
LX1000EA、LX1000HA、LX1000NH、HFA、LX1000EPN、HM100D、
Figure BDA0002299660450000032
LifetechTMECR8309、ECR8409、ECR8305、ECR8404、ECR8315、ECR8415、
Figure BDA0002299660450000033
ESR-1、ESR-3、ESR-5及ESR-8。
进一步地,共固定化酶中,主酶与辅酶的质量比为1~20:1~10;优选地,主酶和辅酶的质量和记为N1,氨基树脂载体的质量记为N2,N1/N2为50~200mg:1g,进一步地,为80~120mg:1g。
进一步地,主酶和辅酶均共价固定于氨基树脂载体上;或者主酶共价固定于氨基树脂载体上,辅酶以离子吸附的方式非共价固定于氨基树脂载体上;优选通过PEI将辅酶吸附于氨基树脂载体上。
进一步地,辅酶包括第一酶和第二酶,主酶与第二酶共价固定于氨基树脂载体上,第一酶以离子吸附的方式固定于氨基树脂载体上。
在本申请的第二个方面,提供了一种上述任一种共固定化酶的制备方法,该制备方法包括:将氨基树脂载体进行活化,得到活化氨基载体;将主酶共价固定于活化氨基载体上,并将主酶对应的辅酶通过共价和/或非共价的方式固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶;其中,主酶对应的辅酶的数量为一个或多个。
进一步地,将主酶及辅酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶包括:将主酶与辅酶混合,得到第一混合酶;将第一混合酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶。
进一步地,辅酶包括第一酶,将主酶及辅酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶包括:将主酶固定于活化氨基载体上,得到初固定化酶;将第一酶与初固定化酶进行固定,得到共固定化酶。
进一步地,辅酶还包括第二酶,将主酶及辅酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶包括:将主酶和第二酶同固定于活化氨基载体上,得到初固定化酶;将第一酶与初固定化酶进行固定,得到共固定化酶。
进一步地,通过表面包覆PEI的方式,将第一酶与初固定化酶进行固定,得到共固定化酶;优选地,向初固定化酶中添加PEI至PEI的终浓度为0.5w/v%~5w/v%,得到PEI-初固定化酶;然后将第一酶于PEI-初固定化酶结合,得到共固定化酶。
进一步地,按照质量比为50~150mg:1g的质量比将第一混合酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶。
进一步地,主酶与第一酶的质量比为1~20:1~10。
进一步地,主酶与第二酶的质量比为1~20:1~10。
进一步地,主酶为转氨酶,辅酶具有两种辅因子,两种辅因子为LDH(乳酸脱氢酶)与FDH(甲酸铵脱氢酶),或者LDH(乳酸脱氢酶)与GDH(葡萄糖脱氢酶),上述制备方法包括如下任意一种:
(1)将转氨酶、LDH与FDH进行混合,得到第一酶混物;将第一酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;
(2)将转氨酶、LDH与GDH进行混合,得到第二酶混物;将第二酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;
(3)将转氨酶与LDH进行混合,得到第三酶混物;将第三酶混物固定到活化氨基载体上,得到初固定转氨酶;通过对初固定转氨酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
进一步地,主酶为氨基酸脱氢酶,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:
(1)将氨基酸脱氢酶与FDH或GDH混合,得到氨基酸脱氢酶混物;将氨基酸脱氢酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;
(2)将氨基酸脱氢酶固定到活化氨基载体上,得到初固定氨基酸脱氢酶;
通过对初固定氨基酸脱氢酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
进一步地,主酶为亚胺还原酶,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:
(1)将亚胺还原酶、FDH或GDH进行混合,得到亚胺酶混物;将亚胺酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;
(2)将亚胺还原酶固定到活化氨基载体上,得到初固定亚胺还原酶;通过对初固定亚胺还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
进一步地,主酶为酮还原酶,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:
(1)将酮还原酶、FDH或GDH进行混合,得到酮还原酶混物;将酮还原酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;
(2)将酮还原酶固定到活化氨基载体上,得到初固定酮还原酶;通过对初固定酮还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
进一步地,主酶为烯还原酶,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:
(1)将烯还原酶、FDH或GDH进行混合,得到烯还原酶混物;将烯还原酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;
(2)将烯还原酶固定到活化氨基载体上,得到初固定烯还原酶;通过对初固定烯还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
进一步地,主酶为环己酮单加氧酶,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:
(1)将环己酮单加氧酶、FDH或GDH进行混合,得到单加氧酶混物;将单加氧酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;
(2)将环己酮单加氧酶固定到活化氨基载体上,得到初固定环己酮单加氧酶;通过对初固定环己酮单加氧酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
进一步地,采用戊二醛对氨基树脂载体进行活化,得到活化氨基载体。
根据本申请的第三个方面,提供了上述任一种共固定化酶,或者上述任一种共固定化酶的制备方法所制备的共固定化酶在生物催化反应中的应用。
进一步地,生物催化反应为间歇性的生物催化反应或连续化的生物催化反应;优选地,共固定化酶应用于连续的流化床中或固定床的生物催化反应中;优选地,共固定化酶在连续化的生物催化反应中的循环利用次数为4~25次。
应用本发明的技术方案,本申请通过将上述主酶及其辅酶共固定于氨基树脂载体上,实现了这些主酶及其辅酶的共固定化,从而有利于提高酶的活性及循环使用效率。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
Polyethylene imine,简称PEI,聚乙烯亚胺。
在本申请一种典型的实施方式中,提供了一种共固定化酶,该共固定化酶包括:氨基树脂载体以及主酶和辅酶,主酶和辅酶共固定于氨基树脂载体上,其中,主酶共价固定于氨基树脂载体上,辅酶通过共价和/或非共价方式固定于氨基树脂载体上;主酶选自如下任意一种酶:转氨酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、酮还原酶、烯还原酶及单加氧酶。
本申请通过将上述主酶及其辅酶共固定于氨基树脂载体上,实现了这些主酶及其辅酶的共固定化,从而有利于提高酶的活性及循环使用效率。
上述各种主酶根据来源的不同,具体的种类和活性也有所不同。在一次优选的实施例中,转氨酶为来源于B.thuringiensis或Vibrio fluvialis strain JS17的转氨酶;优选地,氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus或Bacillus sphaericus的氨基酸脱氢酶;优选地,亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp或Bacillus cereus的亚胺还原酶;优选地,酮还原酶为来源于Sporobolomyces salmonicolor的酮还原酶或者Acetobacter sp.CCTCCM209061的酮还原酶,更优选地,来源于Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶为具有SEO ID NO:1或SEO ID NO:2序列的突变体;优选地,烯还原酶为来源于Chryseobacteriumsp.CA49或Sewanella oneidensis MR-1的烯还原酶;优选地,单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶,或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶,或来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶;更优选地,来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEO ID NO:4序列或SEO ID NO:5序列的突变体;来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEO ID NO:7序列或SEO IDNO:8序列的突变体。
根据上述主酶种类的不同,选择各自对应的辅酶,优选这些辅酶是能进行NAD(P)+和NADPH循环再生的辅酶。在一次优选的实施例中,辅酶选自如下至少一种:辅酶选自如下至少一种:乳酸脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖脱氢酶及醇脱氢酶;优选地,乳酸脱氢酶为来源于Lactobacillus helveticus的D-乳酸脱氢酶;优选地,甲酸铵脱氢酶为来源于Candidaboidinii的甲酸脱氢酶;优选地,葡萄糖脱氢酶为来源于Lysinibacillus sphaericus G10的葡萄糖1-脱氢酶;优选地,醇脱氢酶为来源于Thermoanaerobium brockii的醇脱氢酶。在另一优选的实施例中,共固定化酶的循环利用次数为4~25次。
上述优选实施例中,转氨酶对应的辅酶是乳酸脱氢酶和甲酸铵脱氢酶,或者是乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。氨基酸脱氢酶对应的辅酶是甲酸铵脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。亚胺还原酶对应的辅酶是甲酸铵脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。酮还原酶对应的辅酶是甲酸铵脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。烯还原酶对应的辅酶是甲酸铵脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。单加氧酶对应的辅酶是醇脱氢酶或甲酸铵脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。
在一次优选的实施例中,乳酸脱氢酶为来源于Lactobacillus helveticus的D-乳酸脱氢酶(简称LDH);优选地,甲酸铵脱氢酶为来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶(简称FDH);优选地,葡萄糖脱氢酶为来源于Lysinibacillus sphaericus G10的葡萄糖1-脱氢酶(简称GDH);优选地,醇脱氢酶为来源于Thermoanaerobium brockii的醇脱氢酶。
现有技术中都没有对上述优选实施例中各来源的主酶及辅酶的共固定化酶,将这些主酶和辅酶共固定化,有助于提高这些酶的循环利用效率。
上述共固定化酶的载体为氨基树脂载体,可以采用现有的各种氨基树脂载体。在一次优选的实施例中,氨基树脂载体为戊二醛活化的氨基树脂载体;优选地,氨基树脂载体为带有C2或C4连接臂的氨基树脂载体,更优选地,氨基树脂载体选自如下任意一种:
Figure BDA0002299660450000061
LX1000EA、LX1000HA、LX1000NH、LX1000EPN、HFA、HM100D、
Figure BDA0002299660450000062
LifetechTMECR8309、ECR8409、ECR8305、ECR8404、ECR8315、ECR8415、
Figure BDA0002299660450000063
ESR-1、ESR-3、ESR-5及ESR-8。上述根据所固定的主酶和辅酶的不同,可以选择不同的氨基树脂载体。
上述共固定化酶中,主酶和辅酶的用量比根据所催化底物的不同而有所不同。在一次优选的实施例中,上述共固定化酶中,主酶与辅酶的质量比为1~20:1~10。优选地,主酶和辅酶的质量和记为N1,氨基树脂载体的质量记为N2,N1/N2为50~200mg:1g,进一步地,为80~120mg:1g。
将主酶与辅酶的质量比控制在上述范围内,使得上述所有主酶与辅酶的共固定化酶能够催化绝大部分的底物。且酶与载体的质量比控制在50~200mg:1g的范围内,能够实现对上述所有主酶与辅酶的共固定化。
在一些更优选的实施例中,转氨酶与其辅酶乳酸脱氢酶的质量比为5~7:1;转氨酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为5~7:1~3;转氨酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为5~7:1~2;氨基酸脱氢酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为8~10:1;氨基酸脱氢酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为5~6:1;亚胺还原酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为4~8;1;亚安还原酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为6~8:1;酮还原酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为4~8:1;同还原酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为1:3~10;烯还原酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为6~10:1;烯还原酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为12~20:1;及单加氧酶与其辅酶醇脱氢酶的质量比为甲酸铵脱氢酶的质量比为2~3:2~3;单加氧酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为2~3:1。将上述各主酶与其对应的不同辅酶的质量比控制在上述范围内,能够使得主辅酶的尽可能按照化学计量比进行配置,从而提高共固定化酶的催化活性及效率。
上述共固定化酶中,主酶与辅酶都固定在载体上,对于两者在载体上的具体固定方式不限。在一次优选的实施例中,主酶和辅酶均共价固定于氨基树脂载体上。在另一优选的实施例中,主酶共价固定于氨基树脂载体上,辅酶以离子吸附的方式非共价固定于氨基树脂载体上;优选通过PEI将辅酶吸附于氨基树脂载体上。上述两种不同的共固定化方式可以采用不同的共固定化方法得到。
上述共固定化酶中,有些主酶只有一种辅酶,有些主酶有两种辅酶。两者的共固定化方式同上,可以相同,也可以有所不同,根据具体的辅酶的性质特点而定。在一次优选的实施例中,辅酶包括第一酶和第二酶,主酶与第二酶共价固定于氨基树脂载体上,第一酶以离子吸附的方式固定于氨基树脂载体上。此处第一酶是指对共固定化过程中的某些试剂,比如交联剂戊二醛等比较敏感的酶,为了减少第一酶在共固定化过程中活性降低,从而影响共固定化酶的活性及后续的循环利用效率,上述优选实施例中通过离子吸附的方式将第一酶非共价固定于氨基树脂载体上。
转氨酶TA-Bt(具体见表1)与LDH及FDH在最优比例下共固定化至载体LX1000HA,最高使用次数可达15次;转氨酶TA-Bt与LDH及GDH在最优比例下共固定化至载体LX1000HA,最高使用次数可达20~25次;单加氧酶CHMO-Rs与GDH在最优比例下共固定化至载体LX1000HA,最高使用次数达13次,单加氧酶CHMO-Rs与ADH在最优比例下共固定化至载体LX1000HA,最高使用次数达13~15次,共固定化至ECR8409载体,最高使用次数达16次;CHMO-Rs的突变体V1与ADH共固定化至载体LX1000HA,最高使用次数达17次,突变体V2与ADH共固定化至载体LX1000HA,最高使用次数达17次;CHMO-Bp与ADH或GDH共固定化至LX1000HA载体,使用次数达14-15次;CHMO-Bp突变体V1与ADH共固定化至LX1000HA载体,使用次数达19次;CHMO-Bp突变体V1与ADH共固定化至LX1000HA载体,使用次数达21次;AADH-Bc与FDH最优比例下共固定化至载体LX1000HA,最高使用次数达12次;AADH-Bs与GDH最优比例下共固定化至载体LX1000HA,最高使用次数达15次;KRED-Ac与FDH共固定化至载体ECR8409,最高使用次数达18次;KRED-Ac-V1与FDH共固定化至载体ECR8409,最高使用次数达24次;KRED-Ac与GDH共固定化至载体ECR8409,最高使用次数达14次;ERED-Sc与FDH最优比例下固定化至载体LX1000HA,最高使用次数达17次;ERED-Sc与GDH最优比例下固定化至载体LX1000HA,最高使用次数达21次;ERED-Chr最优比例下固定化至载体LX1000EPN,最高使用次数达21次;IRED-Str与FDH最优比例下固定化至载体LX1000EPN,最高使用次数达17次;IRED-Bc与GDH最优比例下固定化至载体LX1000EPN,最高使用次数达19次。
在本申请第二种典型的实施方式中,提供了上述任一种共固定化酶的制备方法,该制备方法包括:将氨基树脂载体进行活化,得到活化氨基载体;将主酶共价固定于活化氨基载体上,并将主酶对应的辅酶通过共价和/或非共价的方式固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶。
上述共固定化酶的方法,通过先对氨基树脂载体进行活化,再将上述任一种主酶及其辅酶共固定于活化氨基载体上即可得共固定化酶。
对上述主酶与辅酶共固定于活化的氨基载体上的具体方法,可以根据辅酶的种类及性质不同而选择合适的步骤进行。
在一次优选的实施例中,将主酶及辅酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶包括:将主酶与辅酶混合,得到第一混合酶;将第一混合酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶。
该优选方法中,不论辅酶有几种,都可以通过与主酶一起混合后,固定至载体上。根据不同的主酶及辅酶,各自混合的比例有所不同。优选地,按照前述主酶与辅酶的质量比1~20:1~10的比例,将主酶与辅酶混合,得到第一混合酶;并按照前述N1/N2的比例,将第一混合酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶。
在一次优选的实施例中,辅酶包括第一酶,将主酶及辅酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶包括:将主酶固定于活化氨基载体上,得到初固定化酶;将第一酶与初固定化酶进行固定,得到共固定化酶。
当辅酶只有一种的时候,可以采用上述与主酶混合后一起固定的方法,也可以采用上述分步固定的方法。对于某些对活化氨基载体步骤中的戊二醛敏感的辅酶的共固定化来说,优选采用分步固定的方法,这样能够更大程度上保留辅酶的活性,从而提高共固定化酶的循环利用效率。
在一次优选的实施例中,辅酶还包括第二酶,将主酶及辅酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶包括:将主酶和第二酶同固定于活化氨基载体上,得到初固定化酶;将第一酶与初固定化酶进行固定,得到共固定化酶。
当辅酶不仅只有一种时,根据辅酶与戊二醛等活化剂的敏感性程度,可以采用上述部分与主酶一起混合后固定于活化氨基载体上,第二步再将敏感性高的辅酶固定到载体上,这样能够提高敏感性酶的活性,从而提高所制备的共固定化酶的整体活性及循环回收效率。上述优选实施例中,第一酶为对戊二醛比较敏感的酶,第二酶的敏感性相对低,因而将第二酶与主酶混合固定,再将第一酶进行单独固定。
在上述分步固定化的步骤中,第二次固定化均是出于提高所欲固定的辅酶的活性考虑而进行的,因次,任何能够实现提高该类辅酶的活性,且能实现对其固定的方式均适用于本申请。在一次优选的实施例中,利用PEI将第一酶与初固定化酶进行固定,得到共固定化酶。在另一些优选的实施例中,向初固定化酶中添加PEI至PEI的终浓度(质量体积浓度)为0.5%~5%,得到PEI-初固定化酶;向PEI-初固定化酶中添加第一酶进行孵育,得到共固定化酶。
PEI为聚乙烯亚胺,可以作为一种非固体形式的支撑物,其通过离子吸附的方式将待固定的辅酶吸附于载体上,具体所添加的PEI的量可以根据实际需要进行合理调整。将PEI的添加的终浓度达到0.5%~5%时,能够实现上述所有种类的辅酶的固定化。
当主酶为转氨酶时,辅酶具有两种辅因子LDH与FDH,或者为LDH与GDH,其制备方法包括一步固定法或分步固定法。一步固定法是通过将不同组合的两种辅因子与转氨酶混合,分别得到第一酶混物或第二酶混物,然后将第一酶混物或第二酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶。分步固定法:将转氨酶与LDH进行混合,得到第三酶混物;将第三酶混物固定到活化氨基载体上,得到初固定转氨酶;通过对初固定转氨酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
当主酶为氨基酸脱氢酶时,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:将氨基酸脱氢酶与FDH或GDH混合,得到氨基酸脱氢酶混物;将氨基酸脱氢酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;或者,将氨基酸脱氢酶固定到活化氨基载体上,得到初固定氨基酸脱氢酶;通过对初固定氨基酸脱氢酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
当主酶为亚胺还原酶时,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:将亚胺还原酶、FDH或GDH进行混合,得到亚胺酶混物;将亚胺酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;或者,将亚胺还原酶固定到活化氨基载体上,得到初固定亚胺还原酶;通过对初固定亚胺还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
当主酶为酮还原酶时,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:将酮还原酶、FDH或GDH进行混合,得到酮还原酶混物;将酮还原酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;或者将酮还原酶固定到活化氨基载体上,得到初固定酮还原酶;通过对初固定酮还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
当主酶为烯还原酶时,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:将烯还原酶、FDH或GDH进行混合,得到烯还原酶混物;将烯还原酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;或者,将烯还原酶固定到活化氨基载体上,得到初固定烯还原酶;通过对初固定烯还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
当主酶为环己酮单加氧酶时,辅酶为FDH或GDH,制备方法包括如下任意一种:将环己酮单加氧酶、FDH或GDH进行混合,得到单加氧酶混物;将单加氧酶混物固定到活化氨基载体上,得到共固定化酶;或者,将环己酮单加氧酶固定到活化氨基载体上,得到初固定环己酮单加氧酶;通过对初固定环己酮单加氧酶进行PEI表面包覆的方式,进而将GDH或FDH进行固定,得到共固定化酶。
上述各种主酶及其辅酶的共固定化的制备方法中,PEI包面包覆的方式与前述向“初固定化酶中添加PEI至PEI的终浓度为0.5w/v%~5w/v%,得到PEI-初固定化酶复合物;然后将第一酶与PEI-初固定化酶复合物结合,得到共固定化酶”的操作相同,此处不再赘述。
上述对氨基载体进行活化的步骤中,可以采用现有的活化剂进行活化。在一次优选的实施例中,采用戊二醛对氨基树脂载体进行活化,得到活化氨基载体。戊二醛的应用范围广且最常见。
上述共固定化的步骤中,根据共固定化方法及共固定化的辅酶的种类及数量的不同,共固定化的酶的总质量与活化氨基载体的总质量之比也有所不同。相应地,主酶与辅酶的质量比也有所不同,且当辅酶有两种时,主酶与第一种辅酶和第二种辅酶的质量比也有所不同,可以根据实际需要进行合理调整。
在一次优选的实施例中,按照质量比为50~150mg:1g的质量比将第一混合酶固定于活化氨基载体上,得到共固定化酶。
在一次优选的实施例中,主酶与第一酶的质量比为1~20:1~10。
在一次优选的实施例中,主酶与第二酶的质量比为1~20:1~10。
优选地,在上述共固定化的步骤中,转氨酶与其辅酶乳酸脱氢酶的质量比为5~7:1;转氨酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为5~7:1~3;转氨酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为5~7:1~2;氨基酸脱氢酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为8~10:1;氨基酸脱氢酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为4~6:1;亚胺还原酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶.的质量比为4~6;1;亚安还原酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为5~6:1;酮还原酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为4~6:1;酮还原酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为1:5~10;烯还原酶与其辅酶甲酸铵脱氢酶的质量比为6~8:1;烯还原酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为18~20:1;及单加氧酶与其辅酶醇脱氢酶的质量比为2~3:2~3;单加氧酶与其辅酶葡萄糖脱氢酶的质量比为2~3:1。
将上述各主酶与其对应的不同辅酶的质量比控制在上述范围内,能够使得主辅酶的尽可能按照化学计量比进行配置,从而提高共固定化酶的催化活性及效率。
在本申请第三种典型的实施方式中,还提供了上述任一种共固定化酶,或者上述任一种共固定化酶的制备方法所制备的共固定化酶在生物催化反应中的应用。优选地,生物催化反应为连续化的生物催化反应。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
以下实施例中用到的酶及其来源见下表1,表2至表4显示的是部分酶的序列。
表1:
Figure BDA0002299660450000111
表2:
Figure BDA0002299660450000112
Figure BDA0002299660450000121
表3:
Figure BDA0002299660450000122
表4:
Figure BDA0002299660450000123
Figure BDA0002299660450000131
下列实施例中的PB代表磷酸缓冲液的意思。
实施例1
用4~5mL 0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)洗涤1g氨基树脂,用4mL 0.1M磷酸缓冲液(pH7.5)重悬,滴加25%~50%(w/v)戊二醛水溶液,使戊二醛终浓度为2%(w/v),在20℃温和振荡下孵育1小时,过滤并用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)洗涤3次。
将含有100~120mg蛋白质的4mL酶溶液(调节适当比例的TA和LDH)加入到戊二醛活化树脂中,在20-25℃温和振荡下孵育后,用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)过滤并洗涤3次。
通过用硼氢化物还原亚胺双键可以实现更稳定的连接。将1g固定化酶用4mL缓冲液(50mM NaHCO3-Na 2CO3,pH 8.0~10.0)重悬,并在5-15℃下加入NaBH4,使NaBH4终浓度为1mg/mL。在5-15℃搅拌1-2小时后,过滤并用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.5)洗涤3次。
TA和LDH的共固定化活性测试,通过利用游离的FDH来实现NADH的再生进行测试。使用以下底物1进行测试:
Figure BDA0002299660450000132
将5mL 0.1M磷酸缓冲液(pH 8.0)加入10mL反应器中,然后加入100mg上述底物1,80mg甲酸铵(FDH),5mg PLP,调节pH至pH 7.5-8.0,然后加入5mg NAD+和30mg FDH游离酶,100mg共固定酶(湿酶,含50~80%的水)。在30℃下反应16-20小时,通过HPLC检测转化率,结果见下表。
表5:
Figure BDA0002299660450000133
Figure BDA0002299660450000141
实施例2 TA-Bt、LDH及FDH的共固定化
方法1:一步共固定化
用1-2mL 0.1M PB(PH 7.5)洗涤1g氨基树脂,用4mL 0.1M PB(PH 7.5)重悬,将浓度为25(w/v)%~50(w/v)%的戊二醛水溶液滴加入重悬液中使戊二醛的终浓度为2(w/v)%。在20℃温和振荡下孵育1小时,随后过滤并用0.1M PB(PH 7.5)洗涤3次。将含有100-120mg蛋白质的4mL酶溶液(调节适当比例的TA和LDH和FDH)加入到戊二醛活化树脂中,在20-25℃温和振荡下孵育后,过滤并用0.1M PB(pH 7.5)洗涤3次。
方法2:两步共固定化
为提高FDH的活性和稳定性,1g共固定化的TA和LDH由0.1M的PB(pH为7.0-7.5)重悬,并加入PEI溶液(终浓度2%),随后加入20mg的FDH,在20-25℃下温和振荡孵育后,过滤并用0.1M PB(pH7.5)洗涤3次。
共固定化的TA,LDH及FDH的活性通过以下反应进行检测:
5mL的0.1M PB(pH 8.0)装入10ml的反应器中,随后通过加入100mg上述底物1、80mg甲酸铵及5mg PLP,调节pH至pH 7.5-8.0,然后加入5mg NAD+和100mg共固定化酶(湿的,含有50~80%的水)。在30℃下反应16-20小时,测试转化率。测试结果见下表。
表6:
Figure BDA0002299660450000142
Figure BDA0002299660450000151
实施例3 TA-Bt、LDH及GDH的共固定化
方法1和方法2,除了用GDH替代FDH外,其余步骤都与实施例2相同。
共固定化的TA,LDH及GDH的活性通过以下反应进行检测:
5mL的0.1M PB(pH 8.0)装入10ml的反应器中,随后通过加入100mg上述底物1、120mg葡萄糖及5mg PLP,调节pH至pH 7.5-8.0,然后加入5mg NAD+和100mg共固定化酶(湿的,含有50~80%的水)。在30℃下反应16-20小时,测试转化率。测试结果见表7。
表7:
Figure BDA0002299660450000152
Figure BDA0002299660450000161
实施例4CHMO与ADH及GDH的共固定化
采用实施例2中的方法1和方法2,除了将主酶和辅酶替换为CHMO与ADH、GDH外,其余步骤都相同。
CHMO与ADH、GDH共固定化酶的活性通过利用以下底物2进行反应来检测:
Figure BDA0002299660450000162
CHMO与GDH共固定化酶的活性通过以下反应来检测:
3mL的0.1M PB(pH 8.0)装入10ml的反应瓶中,随后通过加入50毫克底物2、100mg葡萄糖及5mg NADP+,然后加入200-300mg的CHMO与GDH的共固定化酶(湿的,含有50~80%的水)。在30℃下反应16-20小时,测试转化率。
CHMO与ADH共固定化酶的活性通过以下反应来检测:
0.3mL的异丙醇装入10ml的反应瓶中,随后加入500mg的底物2,然后加入3mL含有5mg NADP+的0.1M PB(pH 8.0)及100-200mg的CHMO与ADH的共固定化酶(湿的,含有50~80%的水)。在30℃下反应16-20小时,测试转化率。测试结果见表8。
表8:
Figure BDA0002299660450000163
Figure BDA0002299660450000171
实施例5 AADH与FDH/GDH的共固定化
方法1:
除了酶不同外,其余步骤都与实施例2中的方法1相同。
方法2:
用1-2mL 0.1M PB(PH 7.5)洗涤1g氨基树脂,用4mL 0.1M PB(PH 7.5)重悬,将质量浓度为25%~50%的戊二醛水溶液滴加入重悬液中使戊二醛的终浓度为2%。在20℃温和振荡下孵育1小时,随后过滤并用0.1M PB(PH 7.5)洗涤3次。
将含有50-100mg蛋白质(仅AADH)的4mL酶溶液加入到戊二醛活化树脂中,在20-25℃温和振荡下孵育后,过滤并用0.1M PB(pH 7.5)洗涤3次。用0.1M的PB(pH为7.0-7.5)重悬后,加入PEI溶液(终浓度2%),随后加入20-50mg的GDH/FDH,在20-25℃下温和振荡孵育后,过滤并用0.1M PB(pH7.5)洗涤3次。
AADH及FDH共固定化酶的活性通过以下底物的反应进行检测:
Figure BDA0002299660450000172
将5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0-9.0)加入10mL反应器中,然后加入100mg底物3或4,或1,108mg氯化铵,调节pH至pH 7.5-8.0,然后加入10-50mg NAD+,80mg甲酸铵和100mg共固定化酶。在30℃下反应16-20小时后,进行转化试验。
AADH及FDH共固定化酶的活性检测方法如下:
将5mL 0.1M Tris-Cl缓冲液(pH 8.0-9.0)加入10mL反应器中,然后加入100mg底物5或6,或7,108mg氯化铵,调节pH至pH 7.5-8.0,然后加入10-50mg NAD+,150mg葡萄糖和100mg共固定化酶。在30℃下反应16-20小时后,进行转化试验。检测结果见表9。
Figure BDA0002299660450000181
表9:
Figure BDA0002299660450000182
实施例6 KRED与FDH/GDH的共固定化
除酶不同外,其余的方法1和2的步骤均与实施例5相同。
KRED与FDH共固定化酶的活性通过以下底物5或6的反应进行检测:
3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应器中,随后通过加入100mg的底物5或6,接着加入10-50mg NAD(P)+,80mg甲酸铵及100mg的共固定化酶。在30℃下反应16-20小时,测试转化率。
KRED与GDH共固定化酶的活性通过以下反应来检测:
3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应器中,随后通过加入100mg的底物5或6,接着加入10-50mg NAD(P)+,120mg葡萄糖及100mg的共固定化酶。在30℃下反应16-20小时,测试转化率。
测试结果见表10。
Figure BDA0002299660450000191
Figure BDA0002299660450000201
实施例7 ERED与FDH/GDH的共固定化
除酶不同外,其余的方法1和2的步骤均与实施例5相同。
ERED与FDH共固定化酶的活性通过与底物7的反应进行检测:
3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应器中,随后通过加入100mg的底物7,接着加入10-50mg NAD(P)+,80mg甲酸铵及100mg的共固定化酶。在30℃下反应16-20小时,测试转化率。
ERED与GDH共固定化酶的活性通过以下反应来检测:
3mL的0.1M PB(pH7.0-8.0)装入10ml的反应器中,随后通过加入100mg的底物7,接着加入10-50mg NAD(P)+,120mg葡萄糖及100mg的共固定化酶。在30℃下反应16-20小时,测试转化率。
测试结果见表11。
Figure BDA0002299660450000202
Figure BDA0002299660450000211
实施例8 IRED与FDH/GDH的共固定化
除酶不同外,其余的方法1和2的步骤均与实施例5相同。
IRED和FDH共固定化酶的活性采用以下底物8,并按以下方法测试:
Figure BDA0002299660450000212
将2mL 0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应器中,然后加入100mg上述底物,然后加入10-50mg NAD(P)+,60mg甲酸铵和100mg共固定酶。在30℃下反应16-20小时后,进行转化试验。
IRED和GDH共固定化酶的活性以下方法测试:
3mL的0.1M PB缓冲液(pH 7.0-8.0)加入10mL反应器中,随后加入100mg底物,再加入10-50mg NAD(P)+,100mg葡萄糖和100mg共固定化酶。在30℃下反应16-20小时后,进行转化试验。
测试结果见表12。
Figure BDA0002299660450000213
实施例9共固定化酶在填充床连续反应中的应用
按实施例2中的方法2,转氨酶TA-Bt与辅酶LDH及FDH共固定化至载体LX1000HA,所得共固定化酶填充于10mL柱体积的柱状反应器中,固定化酶用量5.9g。
500g底物5,108mg氯化铵,用4.5L的PB缓冲液(0.1M,pH8.0)溶解,氢氧化钠溶液调节pH至pH 7.5-8.0,然后加入10-50mg NAD+,80mg甲酸铵,最后用PB缓冲液定容至5L。
设置流速0.1mL/min,即保留时间100min,进行连续化反应,出口端流出液检测转化率,转化率>98%,持续运行300h,转化率无降低,运行348h,转化率降低值88.4%。具体见表13。
表13.TA-Bt+LDH+FDH共固定化酶在填充床连续反应中的反应结果
Figure BDA0002299660450000221
实施例10共固定化酶在连续搅拌罐反应中的应用
使用同实施例9的共固定化酶,200mL反应器中加入50g转氨酶TA-Bt与辅酶LDH,FDH的共固定化酶,加入150mL磷酸缓冲液。
500g底物5,108mg氯化铵,用4.5L的PB缓冲液(0.1M,pH8.0)溶解,氢氧化钠溶液调节pH至pH 7.5-8.0,然后加入10-50mg NAD+,80mg甲酸铵,最后用PB缓冲液定容至5L。
以0.8mL/min的速度向连续搅拌罐中连续添加底物(即保留时间250min),同时以同样的流速在出口抽出反应体系(管道末端加过滤头,防止将固定化酶抽出)。在该条件下,转化率可达92%以上,且连续运行400h,转化率基本无降低。结果如表14所示。
表14.TA-Bt+LDH+FDH共固定化酶在连续搅拌罐连续反应中的反应结果
Figure BDA0002299660450000222
实施例11每克载体负载蛋白量的调查
同实施例1,活化氨基载体后,对每克载体中加入蛋白的量进行考察,以转氨酶TA-Bt与其辅酶乳酸脱氢酶LDH的共固定化为例,加入不同的蛋白量,检测蛋白负载量和反应重复使用次数。结果见表15。
同实施例4,以单加氧酶CHMO-Rs与其辅酶ADH和GDH的共固定化为例,加入不同的蛋白量,检测蛋白负载量和反应重复使用次数,结果见表16。结果显示,每克所选载体可负载的蛋白范围50~200mg,蛋白负载率在50%~100%。
表15.TA-Bt与LDH混和酶在不同载体上负载蛋白量的考察
Figure BDA0002299660450000231
表16.CHMO-Rs和ADH混和酶在不同载体上蛋白负载量的考察
Figure BDA0002299660450000241
从表15,16的数据可见,针对绝大多数载体,蛋白上样量为50-100mg时,蛋白负载率在90%以上。在相同蛋白负载率的情况下,不同载体所形成的共固定化酶的重复使用次数不同。从该表中,可以看出,LX1000HA,LX1000EPN和ECR8409这几种载体所体现的固定化酶活性和稳定性较好。
实施例12PEI终浓度的调查
同实施例2,方法2(两步法),制备转氨酶TA-Bt与其辅酶乳酸脱氢酶LDH和甲酸铵脱氢酶FDH的共固定化酶,TA-Bt与LDH的混和酶与载体结合后,加入不同量的PEI,再加入第二辅酶FDH,考察PEI的浓度范围,结果见表17。
表17.TA-Bt与其辅酶LDH及FDH两步固定法中PEI用量的考察
载体 PEI的终浓度 重复使用次数
LX1000HA 0.3% 10
LX1000HA 0.5% 12
LX1000HA 1% 12
LX1000HA 3% 12
LX1000HA 5% 12
HFA 1% 9
HFA 3% 9
HFA 5% 9
HFA 7% 7
ECR8409 2% 13
ECR8409 5% 13
ECR8409 7% 13
ESR-1 0.5% 10
ESR-1 2% 11
ESR-1 5% 11
从表17的数据可以看出,PEI的浓度在1%~5%的范围内效果基本一致,超出这个范围,固定化酶的稳定性有所下降。
从以上的描述中,可以看出,本发明上述的实施例实现了如下技术效果:本申请通过将上述主酶及其辅酶共固定于氨基树脂载体上,实现了这些主酶及其辅酶的共固定化,从而有利于提高酶的活性及循环使用效率。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 吉林凯莱英医药化学有限公司
<120> 固定化酶、其制备方法及其应用
<130> PN110370KLY
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> 酮还原酶(Acetobacter sp. )
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(253)
<223> KRED-Ac-V2
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(253)
<223> E144S+A94T+N156T
<400> 1
Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala
35 40 45
Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val
50 55 60
Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Ser
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Thr Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 2
<211> 253
<212> PRT
<213> 酮还原酶(Acetobacter sp. )
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(253)
<223> KRED-Ac-V1
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(253)
<223> E144S+A94N+N156V
<400> 2
Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala
35 40 45
Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val
50 55 60
Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Asn Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Ser
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Val Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 3
<211> 253
<212> PRT
<213> 酮还原酶(Acetobacter sp. )
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(253)
<223> KRED-Ac-母本
<400> 3
Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn
1 5 10 15
Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys
20 25 30
Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala
35 40 45
Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val
50 55 60
Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser
100 105 110
Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala
115 120 125
Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Glu
130 135 140
Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Asn Ala Ser Lys Gly
145 150 155 160
Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser
165 170 175
Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr
180 185 190
Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys
195 200 205
Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile
210 215 220
Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
<210> 4
<211> 541
<212> PRT
<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus sp. Phi1)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(541)
<223> CHMO-Rs-V2
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(541)
<223> F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V
<400> 4
Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln
20 25 30
Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr
35 40 45
Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His
50 55 60
Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
85 90 95
Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
100 105 110
Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
165 170 175
Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
180 185 190
Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe
195 200 205
Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr
210 215 220
Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
245 250 255
Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu
260 265 270
Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Val Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly
275 280 285
Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys
305 310 315 320
Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
325 330 335
Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp
355 360 365
Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp
370 375 380
Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
385 390 395 400
Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly
405 410 415
Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn
420 425 430
Gly Pro Asn Ser Asn Ala Pro Pro Val Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp
435 440 445
Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile
450 455 460
Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp
465 470 475 480
Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly
485 490 495
Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Tyr Tyr Val Gly Gly
500 505 510
Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr
515 520 525
Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala
530 535 540
<210> 5
<211> 541
<212> PRT
<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus sp. Phi1)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(541)
<223> CHMO-Rs-V1
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(541)
<223> F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V
<400> 5
Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln
20 25 30
Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr
35 40 45
Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His
50 55 60
Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
85 90 95
Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
100 105 110
Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
165 170 175
Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
180 185 190
Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe
195 200 205
Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr
210 215 220
Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
245 250 255
Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu
260 265 270
Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Val Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly
275 280 285
Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys
305 310 315 320
Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
325 330 335
Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp
355 360 365
Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp
370 375 380
Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
385 390 395 400
Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly
405 410 415
Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn
420 425 430
Gly Pro Asn Ser Asn Ala Pro Pro Val Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp
435 440 445
Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile
450 455 460
Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp
465 470 475 480
Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly
485 490 495
Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Tyr Tyr Leu Gly Gly
500 505 510
Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr
515 520 525
Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala
530 535 540
<210> 6
<211> 541
<212> PRT
<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus sp. Phi1)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(541)
<223> CHMO-Rs-母本
<400> 6
Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly
1 5 10 15
Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln
20 25 30
Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr
35 40 45
Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His
50 55 60
Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp
65 70 75 80
Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser
85 90 95
Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu
100 105 110
Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser
115 120 125
Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val
130 135 140
Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr
145 150 155 160
Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn
165 170 175
Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln
180 185 190
Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe
195 200 205
Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr
210 215 220
Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp
225 230 235 240
Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu
245 250 255
Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu
260 265 270
Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Phe Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly
275 280 285
Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile
290 295 300
Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys
305 310 315 320
Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly
325 330 335
Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys
340 345 350
Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp
355 360 365
Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp
370 375 380
Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly
385 390 395 400
Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly
405 410 415
Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn
420 425 430
Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp
435 440 445
Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile
450 455 460
Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp
465 470 475 480
Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly
485 490 495
Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gly
500 505 510
Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr
515 520 525
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530 535 540
<210> 7
<211> 603
<212> PRT
<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus ruber-SD1)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(603)
<223> CHMO-Rr-V2
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(603)
<223> Y559M+P190L+P504V
<400> 7
Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg
20 25 30
Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Met Pro Ile Thr
35 40 45
Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly
50 55 60
Gly Phe Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Arg Leu Arg Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Glu Ser Val Arg Ile Ile Asp Lys Ala Gly Asp Phe Gly Gly Val Trp
85 90 95
Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Met Cys Asp Thr Ala Ala Met Val
100 105 110
Tyr Met Pro Leu Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Met Pro Thr Glu Lys Tyr
115 120 125
Ala His Gly Pro Glu Ile Leu Glu His Cys Gln Arg Ile Gly Lys His
130 135 140
Tyr Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Leu Phe His Thr Glu Val Thr Asp Leu
145 150 155 160
Val Trp Gln Glu His Asp Gln Arg Trp Arg Ile Ser Thr Asn Arg Gly
165 170 175
Asp His Phe Thr Ala Gln Phe Val Gly Met Gly Thr Gly Leu Leu His
180 185 190
Val Ala Gln Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile Glu Ser Phe Arg Gly Lys
195 200 205
Ser Phe His Thr Ser Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Thr Gly Gly Asp Ala
210 215 220
Leu Gly Ala Pro Met Asp Lys Leu Ala Asp Lys Arg Val Ala Val Ile
225 230 235 240
Gly Thr Gly Ala Thr Ala Val Gln Cys Val Pro Glu Leu Ala Lys Tyr
245 250 255
Cys Arg Glu Leu Tyr Val Val Gln Arg Thr Pro Ser Ala Val Asp Glu
260 265 270
Arg Gly Asn His Pro Ile Asp Glu Lys Trp Phe Ala Gln Ile Ala Thr
275 280 285
Pro Gly Trp Gln Lys Arg Trp Leu Asp Ser Phe Thr Ala Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Val Leu Thr Asp Pro Ser Glu Leu Ala Ile Glu His Glu Asp Leu
305 310 315 320
Val Gln Asp Gly Trp Thr Ala Leu Gly Gln Arg Met Arg Ala Ala Val
325 330 335
Gly Ser Val Pro Ile Glu Gln Tyr Ser Pro Glu Asn Val Gln Arg Ala
340 345 350
Leu Glu Glu Ala Asp Asp Glu Gln Met Glu Arg Ile Arg Ala Arg Val
355 360 365
Asp Glu Ile Val Thr Asp Pro Ala Thr Ala Ala Gln Leu Lys Ala Trp
370 375 380
Phe Arg Gln Met Cys Lys Arg Pro Cys Phe His Asp Asp Tyr Leu Pro
385 390 395 400
Ala Phe Asn Arg Pro Asn Thr His Leu Val Asp Thr Gly Gly Lys Gly
405 410 415
Val Glu Arg Ile Thr Glu Asn Gly Val Val Val Ala Gly Val Glu Tyr
420 425 430
Glu Val Asp Cys Ile Val Tyr Ala Ser Gly Phe Glu Phe Leu Gly Thr
435 440 445
Gly Tyr Thr Asp Arg Ala Gly Phe Asp Pro Thr Gly Arg Asp Gly Val
450 455 460
Lys Leu Ser Glu His Trp Ala Gln Gly Thr Arg Thr Leu His Gly Met
465 470 475 480
His Thr Tyr Gly Phe Pro Asn Leu Phe Val Leu Gln Leu Met Gln Gly
485 490 495
Ala Ala Leu Gly Ser Asn Ile Val His Asn Phe Val Glu Ala Ala Arg
500 505 510
Val Val Ala Ala Ile Val Asp His Val Leu Ser Thr Gly Thr Ser Ser
515 520 525
Val Glu Thr Thr Lys Glu Ala Glu Gln Ala Trp Val Gln Leu Leu Leu
530 535 540
Asp His Gly Arg Pro Leu Gly Asn Pro Glu Cys Thr Pro Gly Met Tyr
545 550 555 560
Asn Asn Glu Gly Lys Pro Ala Glu Leu Lys Asp Arg Leu Asn Val Gly
565 570 575
Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Ala Phe Phe Arg Met Met Asp His Trp Leu
580 585 590
Ala Ala Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Phe Arg
595 600
<210> 8
<211> 603
<212> PRT
<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus ruber-SD1)
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(603)
<223> CHMO-Rr-V1
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (1)..(603)
<223> P190L + Y559M + C249V + C393V + C257A + M45T
<400> 8
Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg
20 25 30
Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Thr Pro Ile Thr
35 40 45
Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly
50 55 60
Gly Phe Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Arg Leu Arg Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Glu Ser Val Arg Ile Ile Asp Lys Ala Gly Asp Phe Gly Gly Val Trp
85 90 95
Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Met Cys Asp Thr Ala Ala Met Val
100 105 110
Tyr Met Pro Leu Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Met Pro Thr Glu Lys Tyr
115 120 125
Ala His Gly Pro Glu Ile Leu Glu His Cys Gln Arg Ile Gly Lys His
130 135 140
Tyr Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Leu Phe His Thr Glu Val Thr Asp Leu
145 150 155 160
Val Trp Gln Glu His Asp Gln Arg Trp Arg Ile Ser Thr Asn Arg Gly
165 170 175
Asp His Phe Thr Ala Gln Phe Val Gly Met Gly Thr Gly Leu Leu His
180 185 190
Val Ala Gln Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile Glu Ser Phe Arg Gly Lys
195 200 205
Ser Phe His Thr Ser Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Thr Gly Gly Asp Ala
210 215 220
Leu Gly Ala Pro Met Asp Lys Leu Ala Asp Lys Arg Val Ala Val Ile
225 230 235 240
Gly Thr Gly Ala Thr Ala Val Gln Val Val Pro Glu Leu Ala Lys Tyr
245 250 255
Ala Arg Glu Leu Tyr Val Val Gln Arg Thr Pro Ser Ala Val Asp Glu
260 265 270
Arg Gly Asn His Pro Ile Asp Glu Lys Trp Phe Ala Gln Ile Ala Thr
275 280 285
Pro Gly Trp Gln Lys Arg Trp Leu Asp Ser Phe Thr Ala Ile Trp Asp
290 295 300
Gly Val Leu Thr Asp Pro Ser Glu Leu Ala Ile Glu His Glu Asp Leu
305 310 315 320
Val Gln Asp Gly Trp Thr Ala Leu Gly Gln Arg Met Arg Ala Ala Val
325 330 335
Gly Ser Val Pro Ile Glu Gln Tyr Ser Pro Glu Asn Val Gln Arg Ala
340 345 350
Leu Glu Glu Ala Asp Asp Glu Gln Met Glu Arg Ile Arg Ala Arg Val
355 360 365
Asp Glu Ile Val Thr Asp Pro Ala Thr Ala Ala Gln Leu Lys Ala Trp
370 375 380
Phe Arg Gln Met Cys Lys Arg Pro Val Phe His Asp Asp Tyr Leu Pro
385 390 395 400
Ala Phe Asn Arg Pro Asn Thr His Leu Val Asp Thr Gly Gly Lys Gly
405 410 415
Val Glu Arg Ile Thr Glu Asn Gly Val Val Val Ala Gly Val Glu Tyr
420 425 430
Glu Val Asp Cys Ile Val Tyr Ala Ser Gly Phe Glu Phe Leu Gly Thr
435 440 445
Gly Tyr Thr Asp Arg Ala Gly Phe Asp Pro Thr Gly Arg Asp Gly Val
450 455 460
Lys Leu Ser Glu His Trp Ala Gln Gly Thr Arg Thr Leu His Gly Met
465 470 475 480
His Thr Tyr Gly Phe Pro Asn Leu Phe Val Leu Gln Leu Met Gln Gly
485 490 495
Ala Ala Leu Gly Ser Asn Ile Pro His Asn Phe Val Glu Ala Ala Arg
500 505 510
Val Val Ala Ala Ile Val Asp His Val Leu Ser Thr Gly Thr Ser Ser
515 520 525
Val Glu Thr Thr Lys Glu Ala Glu Gln Ala Trp Val Gln Leu Leu Leu
530 535 540
Asp His Gly Arg Pro Leu Gly Asn Pro Glu Cys Thr Pro Gly Met Tyr
545 550 555 560
Asn Asn Glu Gly Lys Pro Ala Glu Leu Lys Asp Arg Leu Asn Val Gly
565 570 575
Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Ala Phe Phe Arg Met Met Asp His Trp Leu
580 585 590
Ala Ala Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Phe Arg
595 600
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<211> 603
<212> PRT
<213> 环己酮单加氧酶(Rhodococcus ruber-SD1)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(603)
<223> CHMO-Rr-母本
<400> 9
Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu
1 5 10 15
Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg
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Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Met Pro Ile Thr
35 40 45
Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly
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Val Ala Gln Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile Glu Ser Phe Arg Gly Lys
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Val Val Ala Ala Ile Val Asp His Val Leu Ser Thr Gly Thr Ser Ser
515 520 525
Val Glu Thr Thr Lys Glu Ala Glu Gln Ala Trp Val Gln Leu Leu Leu
530 535 540
Asp His Gly Arg Pro Leu Gly Asn Pro Glu Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr
545 550 555 560
Asn Asn Glu Gly Lys Pro Ala Glu Leu Lys Asp Arg Leu Asn Val Gly
565 570 575
Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Ala Phe Phe Arg Met Met Asp His Trp Leu
580 585 590
Ala Ala Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Phe Arg
595 600

Claims (24)

1.一种共固定化酶,其特征在于,所述共固定化酶包括:
氨基树脂载体,以及
主酶和辅酶,所述辅酶为一种或多种,所述主酶和所述辅酶共固定于所述氨基树脂载体上,其中,所述主酶共价固定于所述氨基树脂载体上,所述辅酶通过共价和/或非共价方式固定于所述氨基树脂载体上;
所述主酶选自如下任意一种酶:转氨酶、氨基酸脱氢酶、亚胺还原酶、酮还原酶、烯还原酶及单加氧酶。
2.根据权利要求1所述的共固定化酶,其特征在于,所述转氨酶为来源于B.thuringiensis或Vibrio fluvialis strain JS17的转氨酶;
优选地,所述氨基酸脱氢酶为来源于Bacillus cereus或Bacillus sphaericus的氨基酸脱氢酶;
优选地,所述亚胺还原酶为来源于Streptomyces sp或Bacillus cereus的亚胺还原酶;
优选地,所述酮还原酶为来源于Sporobolomyces salmonicolor的酮还原酶或者Acetobacter sp.CCTCC M209061的酮还原酶,更优选地,所述来源于Acetobactersp.CCTCC M209061的酮还原酶为具有SEO ID NO:1或SEO ID NO:2序列的突变体;
优选地,所述烯还原酶为来源于Chryseobacterium sp.CA49或Sewanella oneidensisMR-1的烯还原酶;
优选地,所述单加氧酶为来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶,或者来源于Brachymonas petroleovorans的环己酮单加氧酶,或来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶;更优选地,所述来源于Rhodococcus sp.Phi1的环己酮单加氧酶为具有SEOID NO:4序列或SEO ID NO:5序列的突变体;所述来源于Rhodococcus ruber-SD1的环己酮单加氧酶为具有SEO ID NO:7序列或SEO ID NO:8序列的突变体。
3.根据权利要求1所述的共固定化酶,其特征在于,所述辅酶选自如下至少一种:乳酸脱氢酶、甲酸铵脱氢酶、葡萄糖脱氢酶及醇脱氢酶;
优选地,所述乳酸脱氢酶为来源于Lactobacillus helveticus的D-乳酸脱氢酶;
优选地,所述甲酸铵脱氢酶为来源于Candida boidinii的甲酸脱氢酶;
优选地,所述葡萄糖脱氢酶为来源于Lysinibacillus sphaericus G10的葡萄糖1-脱氢酶;
优选地,所述醇脱氢酶为来源于Thermoanaerobium brockii的醇脱氢酶;
优选地,所述共固定化酶的循环利用次数为4~25次。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的共固定化酶,其特征在于,所述氨基树脂载体为戊二醛活化的氨基树脂载体;
优选地,所述氨基树脂载体为带有C2或C4连接臂的氨基树脂载体,更优选地,所述氨基树脂载体选自如下任意一种:
Figure FDA0002299660440000021
LX1000EA、LX1000HA、LX1000NH、HFA、LX1000EPN、HM100D、
Figure FDA0002299660440000022
LifetechTMECR8309、ECR8409、ECR8305、ECR8404、ECR8315、ECR8415、
Figure FDA0002299660440000023
ESR-1、ESR-3、ESR-5及ESR-8。
5.根据权利要求1所述的共固定化酶,其特征在于,所述共固定化酶中,所述主酶与所述辅酶的质量比为1~20:1~10;
优选地,所述主酶和所述辅酶的质量和记为N1,所述氨基树脂载体的质量记为N2,N1/N2为50~200mg:1g,进一步地,为80~120mg:1g。
6.根据权利要求1或5所述的共固定化酶,其特征在于,
所述主酶和所述辅酶均共价固定于所述氨基树脂载体上;或者
所述主酶共价固定于所述氨基树脂载体上,所述辅酶以离子吸附的方式非共价固定于所述氨基树脂载体上;优选通过PEI将所述辅酶吸附于所述氨基树脂载体上。
7.根据权利要求6所述的共固定化酶,其特征在于,所述辅酶包括第一酶和第二酶,所述主酶与所述第二酶共价固定于所述氨基树脂载体上,所述第一酶以离子吸附的方式固定于所述氨基树脂载体上。
8.权利要求1至7中任一项所述的共固定化酶的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括:
将氨基树脂载体进行活化,得到活化氨基载体;
将主酶共价固定于所述活化氨基载体上,并将所述所述主酶对应的辅酶通过共价和/或非共价的方式固定于所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶;
其中,所述主酶对应的所述辅酶的数量为一个或多个。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,将所述主酶及所述辅酶固定于所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶包括:
按照权利要求5所述的共固定化酶中的所述主酶与所述辅酶的质量比,将所述主酶与所述辅酶混合,得到第一混合酶;
按照权利要求5所述的共固定化酶中的所述N1/N2的比例,将所述第一混合酶固定于所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶。
10.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述辅酶包括第一酶,将所述主酶及所述辅酶固定于所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶包括:
将所述主酶固定于所述活化氨基载体上,得到初固定化酶;
将所述第一酶与所述初固定化酶进行固定,得到所述共固定化酶。
11.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于,所述辅酶还包括第二酶,将所述主酶及所述辅酶固定于所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶包括:
将所述主酶和所述第二酶同固定于所述活化氨基载体上,得到所述初固定化酶;
将所述第一酶与所述初固定化酶进行固定,得到所述共固定化酶。
12.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,通过表面包覆PEI的方式,将所述第一酶与所述初固定化酶进行固定,得到所述共固定化酶;
优选地,向所述初固定化酶中添加PEI至所述PEI的终浓度为0.5w/v%~5w/v%,得到PEI-初固定化酶复合物;
然后将所述第一酶与所述PEI-初固定化酶复合物结合,得到所述共固定化酶。
13.根据权利要求10所述的制备方法,其特征在于,按照质量比为50~150mg:1g的质量比将所述第一混合酶固定于所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶。
14.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,所述主酶与所述第一酶的质量比为1~20:1~10。
15.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,所述主酶与所述第二酶的质量比为1~20:1~10。
16.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述主酶为转氨酶,所述辅酶具有两种辅因子,两种所述辅因子为LDH与FDH,或者为LDH与GDH,所述制备方法包括如下任意一种:
(1)将所述转氨酶、所述LDH与FDH进行混合,得到第一酶混物;将所述第一酶混物固定到所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶;
(2)将所述转氨酶、所述LDH与GDH进行混合,得到第二酶混物;将所述第二酶混物固定到所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶;
(3)将所述转氨酶与所述LDH进行混合,得到第三酶混物;将所述第三酶混物固定到所述活化氨基载体上,得到初固定转氨酶;通过对所述初固定转氨酶进行PEI表面包覆的方式,进而将所述GDH或所述FDH进行固定,得到所述共固定化酶。
17.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述主酶为氨基酸脱氢酶,所述辅酶为FDH或GDH,所述制备方法包括如下任意一种:
将氨基酸脱氢酶与FDH或GDH混合,得到氨基酸脱氢酶混物;将所述氨基酸脱氢酶混物固定到所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶;
或者
将所述氨基酸脱氢酶固定到所述活化氨基载体上,得到所述初固定氨基酸脱氢酶;
通过对所述初固定氨基酸脱氢酶进行PEI表面包覆的方式,进而将所述GDH或所述FDH进行固定,得到所述共固定化酶。
18.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述主酶为亚胺还原酶,所述辅酶为FDH或GDH,所述制备方法包括如下任意一种:
将所述亚胺还原酶、所述FDH或所述GDH进行混合,得到亚胺酶混物;
将所述亚胺酶混物固定到所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶;
或者
将所述亚胺还原酶固定到所述活化氨基载体上,得到初固定亚胺还原酶;
通过对所述初固定亚胺还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将所述GDH或所述FDH进行固定,得到所述共固定化酶。
19.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述主酶为酮还原酶,所述辅酶为FDH或GDH,所述制备方法包括如下任意一种:
将所述酮还原酶、所述FDH或所述GDH进行混合,得到酮还原酶混物;
将所述酮还原酶混物固定到所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶;
或者
将所述酮还原酶固定到所述活化氨基载体上,得到初固定酮还原酶;
通过对所述初固定酮还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将所述GDH或所述FDH进行固定,得到所述共固定化酶。
20.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述主酶为烯还原酶,所述辅酶为FDH或GDH,所述制备方法包括如下任意一种:
将所述烯还原酶、所述FDH或所述GDH进行混合,得到烯还原酶混物;
将所述烯还原酶混物固定到所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶;
或者
将所述烯还原酶固定到所述活化氨基载体上,得到初固定烯还原酶;
通过对所述初固定烯还原酶进行PEI表面包覆的方式,进而将所述GDH或所述FDH进行固定,得到所述共固定化酶。
21.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述主酶为环己酮单加氧酶,所述辅酶为FDH或GDH,所述制备方法包括如下任意一种:
将所述环己酮单加氧酶、所述FDH或所述GDH进行混合,得到单加氧酶混物;
将所述单加氧酶混物固定到所述活化氨基载体上,得到所述共固定化酶;
或者
将所述环己酮单加氧酶固定到所述活化氨基载体上,得到初固定环己酮单加氧酶;
通过对所述初固定环己酮单加氧酶进行PEI表面包覆的方式,进而将所述GDH或所述FDH进行固定,得到所述共固定化酶。
22.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,采用戊二醛对所述氨基树脂载体进行活化,得到所述活化氨基载体。
23.权利要求1至7中任一项所述的共固定化酶,或者权利要求8至22中任一项所述的共固定化酶的制备方法所制备的共固定化酶在生物催化反应中的应用。
24.根据权利要求23所述的应用,其特征在于,所述生物催化反应为间歇性的生物催化反应或连续化的生物催化反应;
优选地,所述共固定化酶应用于连续的流化床中或固定床的生物催化反应中;
优选地,所述共固定化酶在所述连续化的生物催化反应中的循环利用次数为4~25次。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111826370A (zh) * 2020-04-29 2020-10-27 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 Pei固定化酶、其制备方法及其应用
CN113337496A (zh) * 2020-07-16 2021-09-03 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 Pva膜固定化酶及其制备方法
CN113621603A (zh) * 2021-08-18 2021-11-09 南京工业大学 一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法
CN114107275A (zh) * 2021-11-19 2022-03-01 辽宁凯莱英医药化学有限公司 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法
CN114369583A (zh) * 2022-01-12 2022-04-19 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 固定化酶及其在连续化生产中的应用
CN114875106A (zh) * 2022-04-01 2022-08-09 南京工业大学 一种在微流场中利用烯还原酶生成(s)-2-甲基环己酮的方法
EP3909972B1 (en) * 2015-06-19 2024-02-14 Kobold, Sebastian Pd1-cd28 fusion proteins and their use in medicine

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103608355A (zh) * 2011-06-24 2014-02-26 默沙东公司 固定化转氨酶和生产及使用固定化转氨酶的方法
CN106191150A (zh) * 2015-05-06 2016-12-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种利用共固定化酶合成d-丙氨酸的方法
CN108384767A (zh) * 2018-02-05 2018-08-10 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 转氨酶突变体及其应用
CN110241107A (zh) * 2019-06-11 2019-09-17 中国科学院南海海洋研究所 一种使用氨基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶
CN110423741A (zh) * 2019-07-16 2019-11-08 浙江工业大学 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103608355A (zh) * 2011-06-24 2014-02-26 默沙东公司 固定化转氨酶和生产及使用固定化转氨酶的方法
CN106191150A (zh) * 2015-05-06 2016-12-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种利用共固定化酶合成d-丙氨酸的方法
CN108384767A (zh) * 2018-02-05 2018-08-10 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 转氨酶突变体及其应用
CN110241107A (zh) * 2019-06-11 2019-09-17 中国科学院南海海洋研究所 一种使用氨基树脂固定化脂肪酶的方法及由该方法制得的固定化脂肪酶
CN110423741A (zh) * 2019-07-16 2019-11-08 浙江工业大学 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
何华: "戊二醛和胺类分子在氨基载体固定头孢菌素C酰化酶中的应用", 《2013中国化工学会年会论文集》 *
郑剑峰: "通过聚乙烯亚胺共沉淀技术制备海藻糖合酶交联聚集体及对其性质的研究", 《南开大学硕士专业学位论文 万方数据知识服务平台》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3909972B1 (en) * 2015-06-19 2024-02-14 Kobold, Sebastian Pd1-cd28 fusion proteins and their use in medicine
CN111826370A (zh) * 2020-04-29 2020-10-27 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 Pei固定化酶、其制备方法及其应用
EP4144842A4 (en) * 2020-04-29 2023-08-30 Asymchem Life Science (Tianjin) Co., Ltd. IMMOBILIZED PEI ENZYME AND METHOD OF PRODUCTION THEREOF AND USE THEREOF
CN113337496A (zh) * 2020-07-16 2021-09-03 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 Pva膜固定化酶及其制备方法
CN113621603A (zh) * 2021-08-18 2021-11-09 南京工业大学 一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法
CN113621603B (zh) * 2021-08-18 2024-01-26 南京工业大学 一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法
CN114107275A (zh) * 2021-11-19 2022-03-01 辽宁凯莱英医药化学有限公司 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法
CN114107275B (zh) * 2021-11-19 2024-05-17 辽宁凯莱英医药化学有限公司 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法
CN114369583A (zh) * 2022-01-12 2022-04-19 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 固定化酶及其在连续化生产中的应用
WO2023133957A1 (zh) * 2022-01-12 2023-07-20 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 固定化酶及其在连续化生产中的应用
CN114875106A (zh) * 2022-04-01 2022-08-09 南京工业大学 一种在微流场中利用烯还原酶生成(s)-2-甲基环己酮的方法
CN114875106B (zh) * 2022-04-01 2023-11-24 南京工业大学 一种在微流场中利用烯还原酶生成(s)-2-甲基环己酮的方法

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