JP7105307B2 - トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用 - Google Patents
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Description
部位特異的な突然変異とは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などの方法で標的DNA断片(ゲノムであってもよいし、プラスミドであってもよい)に、塩基の添加、削除、部位突然変異などを含む所望の変化(一般的には、有利な方向への変化を表徴する)を導入することを指す。部位特異的な突然変異は、DNAで発現された標的タンパク質の性状及び表徴を迅速で効率的に向上させることができ、遺伝子研究において非常に有用な方法である。
本願は、クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)に由来するトランスアミナーゼを改善して、酵素活性が向上したR416T突然変異体であって、アミノ酸配列がSEQ ID NO:1に示されている如きR416T突然変異体を得る。該酵素は、活性が高いが、安定性は理想的ではない。該酵素の安定性を向上させるために、更にR416T突然変異体を鋳型として、Q78C+A330C、V137C+G313C、A217C+Y252C、T7C+S47C、L295C+328Cという5組の二重点突然変異が設計され、プライマー配列は、QuikChange Primer Designウェブページで設計されたものである。全プラスミドPCRの方式により、突然変異体R416Tに突然変異部位を導入して、pET-22b(+)を発現ベクターとし、新たな突然変異部位を有する突然変異プラスミドを得る。
2.1トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体(CLEAs)の製造
本願において、R416T+T7C+S47Cという雌親突然変異体、雌親突然変異体に基づいてクリーニングされた単一点突然変異体及び組み合わせ突然変異体のトランスアミナーゼに対して架橋法による固定化を行って、トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体を製造する。
CLEAsは、担体の支持がなく、固定化酵素の粒子が小さく(<10μm)、機械的強度が低く、酵素を濾過し回収する過程において酵素が硬化しやすく、次回に使用する場合に、反応系においてうまく分散することができない。この問題を解決するために、架橋及び包埋の2種の技術を組み合わせてグルタルアルデヒドを架橋剤として用いて、酵素液、アクリルアミド及びメチレンビスアクリルアミドの混合液に、グルタルアルデヒドを滴下して自由酵素とでシッフ塩基を形成して架橋酵素凝集体が製造され、そして、開始剤である過硫酸アンモニウムを添加してポリアクリルアミドゲルを形成し、架橋酵素凝集体がポリアクリルアミドゲルマトリックス内に包埋されて、安定した固定化酵素を得る。
酵素分子と水不溶性担体を静電作用、水素結合、疎水性作用及び他の方式により吸着し結合して吸着固定化酵素を製造することができる。該方法は、条件が温和であり、酵素の変性を引き起こしにくいが、水溶液において酵素が担体から容易に解離してしまい、回収して再利用できないため、吸着法により製造された固定化酵素は、主に、有機溶媒における反応に応用される。
酵素の共有結合固定化は、酵素タンパク質の非必須基と水不溶性担体を共有結合により不可逆な結合を形成することであり、温和な条件でカップリング可能なタンパク質基は、アミノ基、カルボキシル基、システインのメルカプト基、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのフェノール基、セリンの水酸基及びスレオニンの水酸基を含む。担体と共有結合される基は、一般的に、酵素が活性を生かすことに必要な基であってはいけない。
固定化酵素担体は、シリカ、ガラス、ミネラル及び珪藻土などのような無機材料であってもよく、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、アガロース、ペクチン、キトサンなどのような天然有機材料であってもよく、ポリスチレン樹脂、ポリメタクリレート樹脂、又はスチレン及びメタクリル酸エステルの共重合体などのような非天然有機合成ポリマーであってもよい。これらの担体は、タンパク質分子との結合に有利になるように、さらに官能基化し、例えば、担体にアミノ基、ヒドロキシル基、エポキシ基、オクタデシル基などの官能基を添加してもよい。そのうち、アミノ基及びヒドロキシル基が官能基化された担体は、酵素タンパク質分子と、イオン結合により結合でき、アミノ基型担体は、さらに酵素タンパク質分子と共有結合により結合でき、エポキシ基の官能基の担体は、主に、酵素タンパク質と、共有結合により結合され、オクタデシル基の官能基の担体は、酵素タンパク質と、疎水性作用により結合される。担体は、フィルム、チューブ、シート、ビーズ、粒子、チップ、光ファイバーなどのような任意の形状又は形態として用いることができる。
本願は、R416T+T7C+S47Cという雌親突然変異体、雌親突然変異体に基づいてクリーニングされて得られた単一点突然変異体及び組み合わせ突然変異体のトランスアミナーゼに対してそれぞれ共有結合方法による固定化を行う。
多孔質ガラスは、材料が不活性であり、透水性が高いなどの特徴のため、酵素固定化のマトリックスに非常に適用される。ガラス及びそのチャネルの表面のシラノール基は、結合部位として酵素と結合され、固定化を実現するが、従来のガラスの表面のシラノール基の密度が限られ、不均一に分布し、酵素が結合することに対する立体障害が大きく、タンパク質担持量が低く(Science,2010,329,305-309、JChromatogr,1976,125,115-127)、また、酵素が失活になりやすい。多孔質ガラスの内外表面に一層の有機ポリマーフィルムを被覆し、酵素固定化により役立つ環境を形成することができる(Langmuir,2004,20,10639-10647)。ポリマーフィルムは、必要に応じて、さらに修飾し、表面に固定化に適する各種の官能基を添加してもよい。
本願の固定化トランスアミナーゼは、基質1及び基質2で示されるアミノ基受容体を対応する第一級アミンに転換することができ、使用されるアミノ基供与体がイソプロピルアミンである。
30℃、pH9.5、50%DMSOに対する突然変異体の耐性の検出
粗酵素を30℃、pH9.5、DMSO濃度50%の環境で1h処理して、10mLの反応フラスコに、0.1gの基質を添加し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩及び0.6~1mgのPLP(ピリドキサール5'-リン酸)を添加して、上記処理された酵素を5mg添加し、30℃、pH9.5、DMSO濃度50%の環境で16h一定温度で撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、突然変異体の反応データを表12で示す。
45℃、pH10、50%のDMSOに対する突然変異体の耐性の検出
粗酵素を45℃、pH10、DMSO濃度50%の環境で1h処理して、10mLの反応フラスコに、0.1gの基質1を添加し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩及び0.6~1mgのPLP(ピリドキサール5'-リン酸)を添加して、上記処理された酵素を5mg添加し、45℃、pH10、DMSO濃度50%の環境で、16h一定温度で撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、突然変異体の反応データを表13で示す。
30℃、pH8、35%のメタノールに対する突然変異体の耐性の検出
粗酵素を30℃、pH8、MeOH濃度35%の環境で1h処理して、10mLの反応フラスコに、0.1gの基質1を添加し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩及び0.6-1mgのPLP(ピリドキサール5'-リン酸)を添加して、上記処理された酵素を5mg添加し、30℃、pH8、MeOH濃度35%の環境で、16h一定温度で連続的に撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、突然変異体の反応データを表14で示す。
45℃、pH8、40%のメタノールに対する突然変異体の耐性の検出
粗酵素を45℃、pH8、MeOH濃度40%の環境で1h処理して、10mLの反応フラスコに、0.1gの基質1を添加し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩及び0.6-1mgのPLP(ピリドキサール5'-リン酸)を添加して、上記処理された酵素を5mg添加し、45℃、pH8、MeOH濃度40%の環境で、16h一定温度で連続的に撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、突然変異体の反応データを表15で示す。
架橋固定化
0.1gの酵素粉末を2mLのリン酸緩衝液(0.1MのPB、pH7.0~8.0、0.4~1mg/mLのPLP(ピリドキサール5'-リン酸)を含有する。)で溶解し、氷水浴で撹拌し18mLのエタノール又は18mLのイソプロパノール又は硫酸アンモニウム(最終飽和度が90%)を沈殿剤としてゆっくりと添加し、10min撹拌した後に、1.1-2.7mLの25%グルタルアルデヒド溶液(最終濃度200~500mM)を添加し、氷水浴で30~40min撹拌して、遠心分離又は濾過し、沈殿物をリン酸緩衝液で3回洗浄して、4℃で貯蔵し、水相反応において直接的に応用することができる。又は架橋酵素凝集体を凍結乾燥させ、凍結乾燥後に得られた架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末は、水相及び有機相反応において応用することができる。
架橋酵素凝集体の水相反応の活性検出
10mLの反応フラスコに0.3mLのDMSOを添加し、0.1gの基質1を溶解し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩と1.0mgのPLP(ピリドキサール5’-リン酸)を添加し、反応溶液の最終容量が1mLになるまでに0.1MのPB7.0を追加して、5mgの酵素又は5mgの酵素で製造される架橋酵素凝集体の湿潤酵素又は架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末を添加し、45℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表16で示す。
架橋酵素の有機相反応の活性検出
10mLの反応フラスコに1mLの水飽和メチルtert-ブチルエーテルを添加して、10mgの基質1及び4eqのイソプロピルアミンを添加して、10mgの酵素粉末で製造される架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末を添加し、30℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表17で示す。
トランスアミナーゼの包埋-架橋固定化酵素の水相反応の活性検出
10mLの反応フラスコに0.4mLのDMSO(DMSO最終濃度が40%である)を添加し、0.1gの基質1を溶解し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩と1.0mgのPLP(ピリドキサール5’-リン酸)を添加し、反応溶液の最終容量が1mLになるまでに0.1MのPB7.0を追加して、5mgの酵素又は5mgの酵素で製造される包埋-架橋固定化酵素を添加し、45℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表18で示す。
トランスアミナーゼの包埋-架橋固定化酵素の35%MeOHの水溶液における反応の活性検出
10mLの反応フラスコに0.35mLのメタノール(メタノール最終濃度が40%である)を添加し、0.1gの基質1を溶解し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩と1.0mgのPLP(ピリドキサール5’-リン酸)を添加し、反応溶液の最終容量が1mLになるまでに0.1MのPB7.0を追加して、10mgの酵素又は10mgの酵素で製造される包埋-架橋固定化酵素を添加し、30℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表19で示す。
トランスアミナーゼの吸着固定化方法
担体において4mLの0.4mg/mLのPLP含有のPB緩衝液(100mM、pH7.0)を添加するとともに、0.1gの酵素を添加し、20℃で80rpmの低速度で一晩越し撹拌する。上清液を除去し、沈殿物を緩衝液で3~4回洗浄し、更に上清液を除去し、沈殿物を窒素ガスで通風乾燥させるか、又は凍結乾燥法で乾燥させ、4℃で貯蔵する。
トランスアミナーゼの吸着固定化酵素の有機相反応の活性検出
10mLの反応フラスコに1mLの水飽和メチルtert-ブチルエーテルを添加して、10mgの基質1及び4eqのイソプロピルアミンを添加して、20mgの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、30℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表20で示す。
キトサンが担体である固定化トランスアミナーゼ
キトサン担体の製造:5gのキトサン(分子量が300KDa~500KDaである)を250mLの1%酢酸溶液に添加し、電子レンジで加熱溶解して水相を調製する。300mLのトルエンを2.2gのスパン80及び1.2mLのn-ヘキサノールと均一に混合し、室温で2h撹拌して油相を調製する。水相を撹拌しながら油相にゆっくりと滴下して乳剤を調製して、乳剤を1.5Lの12%のNaOH溶液に注ぎ、3h撹拌し、1Lのエタノールを添加し、濾過し、濾過ケークを純水で十分に洗浄して約40gの湿潤担体を得て、湿潤担体を140mLの純水に浸して4℃で貯蔵する。
C6型アミノ基担体の固定化トランスアミナーゼ
活性化担体:1gの担体ECR8409を20mMの低イオン強度の緩衝液で1~2回洗浄し、上清液を除去し、4mLの2%グルタルアルデヒド(20mMの低イオン強度の緩衝液で試薬グレードの25%グルタルアルデヒドを希釈して調製される)を添加し、20℃で、80rpmで1h活性化し、20mMの緩衝液で1~2回洗浄し、上清液を除去する。
エポキシ基担体の固定化トランスアミナーゼ
1gの担体ECR8285を100mMのPB緩衝液で1~2回洗浄し、上清液を除去し、4mLのBuffer(100mMのPB、pH7.0、1MのNaClを含有する。)を添加するとともに、0.1g~0.2gの酵素を添加し、20℃で80rpmの低速度で一晩越し撹拌して(18~20h)、4℃で20h静置する。上清液を除去し、沈殿物をBufferで3~4回洗浄し、窒素ガスで通風乾燥させ、4℃で貯蔵する。
共有結合固定化トランスアミナーゼの水相反応の活性検出
10mLの反応フラスコに0.4mLのDMSO(DMSO最終濃度が40%である)を添加し、0.1gの基質1を溶解し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩と1.0mgのPLP(ピリドキサール5’-リン酸)を添加し、反応溶液の最終容量が1mLになるまでに0.1MのPB7.0を追加して、5mgの酵素又は5mgの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、45℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表21で示す。
共有結合固定化トランスアミナーゼの35%MeOHの水溶液における反応の活性検出
10mLの反応フラスコに0.35mLのメタノール(メタノール最終濃度が40%である)を添加し、0.1gの基質1を溶解し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩と1.0mgのPLP(ピリドキサール5’-リン酸)を添加し、反応溶液の最終容量が1mLになるまでに0.1MのPB7.0を追加して、10mgの酵素又は10mgの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、30℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表22で示す。
共有結合固定化トランスアミナーゼの有機相反応の活性検出
10mLの反応フラスコに1mLの水飽和酢酸イソプロピルを添加して、10mgの基質1及び4eqのイソプロピルアミンを添加して、20mgの酵素又は20mgの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、30℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表23で示す。
共有結合固定化トランスアミナーゼの充填層での連続的な反応(メタノールを基質の溶解補助剤とする)
75gの突然変異体R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297LをECR8409担体に固定化する固定化酵素を反応器に充填し、カラム容量(CV)が150mLで、プランジャーポンプを使用して2CVの緩衝液(0.1MのPB7.0、5mg/mLのPLP、2Mのイソプロピルアミン塩酸塩を含有する)を充填層に注入する。調製される反応液(0.5Mの基質1、2Mのイソプロピルアミン塩酸塩、5mg/mLのPLP、35%のMeOH)をプランジャーポンプで充填層に注入し、40℃の水浴で、流速が0.25mL/minで、保持時間が約600minで、転換率が>98%で、240h連続的に操作し、転換率が低下しない。
ガラス担体のキレート化トランスアミナーゼ
1gのEziG-101、EziG-102又はEziG-103多孔質ガラス担体を緩衝液(20mMのTris-Cl 8.5)で1~2回洗浄し、上清液を除去し、担体に20mLのBufferを追加するとともに、酵素粉末又は酵素液を添加し、20℃で、80rpmの低速で1h撹拌し、上清液を除去し、沈殿物をBufferで3~4回洗浄し、濾過し、真空乾燥させ、4℃で貯蔵する。
EziG-101多孔質ガラス担体にキレートされた固定化トランスアミナーゼの水相反応の活性検出
10mLの反応フラスコに0.2mLのDMSOを添加し、0.1gの基質1を溶解し、4eqのイソプロピルアミン塩酸塩と0.5mgのPLP(ピリドキサール5’-リン酸)を添加し、反応溶液の最終容量が1mLになるまでに0.1MのPB7.0を追加して、0.1gの酵素粉末又は0.1gの酵素粉末からEziG-101担体キレート法で製造される固定化酵素を添加し、45℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表24で示す。
多孔質ガラス担体にキレートされた固定化トランスアミナーゼの有機相反応の活性検出
10mLの反応フラスコに1mLの水飽和メチルtert-ブチルエーテルを添加して、10mgの基質1及び4eqのイソプロピルアミンを添加して、20mgの酵素又は20mgの酵素で製造される固定化トランスアミナーゼを添加し、30℃で16h撹拌する。体系について、HPLCにより転換率を検出し、反応データを表25で示す。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する:
[実施形態1]SEQ ID NO:1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、前記アミノ酸突然変異が発生した部位がT7C+S47C部位を含むことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
[実施形態2]前記アミノ酸突然変異が発生した部位は、M356L、F364L、C404L、M430L、R405E/A、K90G、K219T、K304D、K51R、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F/A(「/」は「又は」を表す)、G110P、K69N、G201C、Q380L、K193I、I297L、R305H、F111Y、K190E及びA286Tのうちの任意の1つ以上をさらに含むことを特徴とする実施形態1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
[実施形態3]前記アミノ酸突然変異が発生した部位は、K51R+W187Y、R405E+A95P、R405E+A95P+K304D、R405E+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+D371G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E246A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T402P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107F、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+G110P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+A286T、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及びR405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286Tの突然変異部位組み合わせのいずれか1つをさらに含むことを特徴とする実施形態1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
[実施形態4]実施形態1~3のいずれかに記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするDNA分子。
[実施形態5]実施形態4に記載のDNA分子が結合されていることを特徴とする組換えプラスミド。
[実施形態6]実施形態1~3のいずれかに記載のトランスアミナーゼ突然変異体を含むことを特徴とする固定化トランスアミナーゼ。
[実施形態7]前記トランスアミナーゼ突然変異体のトランスアミナーゼ架橋酵素凝集体であり、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体を沈殿させてトランスアミナーゼ凝集体が得られて、前記トランスアミナーゼ凝集体中の遊離しているアミノ基、フェノール基、イミダゾール基又はメルカプト基を、グルタルアルデヒド、N,N’-メチレンビスアクリルアミド、ビスマレイミド及びデキストランから選択される任意の1種の架橋剤と架橋させて、前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体が得られ、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体は、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A及びT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297Lのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の架橋酵素凝集体であり、
好ましくは、前記デキストランの分子量は、6KDa~200KDaであり、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体をエタノールで沈殿させて前記トランスアミナーゼ凝集体が得られ、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ凝集体中の遊離アミノ基をグルタルアルデヒドと架橋させて前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体が得られることを特徴とする実施形態6に記載の固定化トランスアミナーゼ。
[実施形態8]トランスアミナーゼ包埋-架橋固定化酵素であり、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ包埋-架橋固定化酵素は、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、及びT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297Lのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の包埋-架橋固定化酵素であり、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ突然変異体中の遊離アミノ基とグルタルアルデヒドとでシッフ塩基を生成して架橋してトランスアミナーゼ架橋酵素が得られて、前記トランスアミナーゼ架橋酵素をポリアクリルアミドゲルマトリックスに包埋して前記トランスアミナーゼ包埋-架橋固定化酵素が得られることを特徴とする実施形態6に記載の固定化トランスアミナーゼ。
[実施形態9]前記トランスアミナーゼ突然変異体を担体に共有結合させた共有結合固定化酵素であり、
好ましくは、前記共有結合固定化酵素は、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+Q380L、T7C+S47C+R405E、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+A95P+K304D、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A及びT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286Tのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の共有結合固定化酵素であり、
好ましくは、前記担体は、キトサン担体、又は樹脂担体であり、
より好ましくは、前記キトサン担体は、ヒドロキシル基及び/又はアミノ基により前記トランスアミナーゼ突然変異体と共有結合されて前記共有結合固定化酵素を形成し、
より好ましくは、前記樹脂担体は、スチレンとメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリスチレン樹脂及びポリメタクリレート樹脂から選択される任意の1種であるマトリックスと、C2の短鎖アミノ基、C4の中鎖アミノ基、C6の長鎖アミノ基又はエポキシ基から選択される、前記マトリックスに結合される官能基とを含み、さらに好ましくは、前記樹脂担体は、ECR8309、ECR8315、EC-HFA、LX-1000HA、LX-1000EA、ECR8409、ECR8415、EC-EP、EC EP403、EXE119、LX-1000EP、Immobead-150A、Immobead-150P、Immobead350A、ECR8206、ECR8209、ECR8215又はECR8285から選択されることを特徴とする実施形態6に記載の固定化トランスアミナーゼ。
[実施形態10]前記トランスアミナーゼ突然変異体及び担体を金属イオンによりキレート化して形成されるキレート化固定化酵素であり、
好ましくは、前記キレート化固定化酵素は、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C及びT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286Tのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体のキレート化固定化酵素であり、
好ましくは、前記担体は、多孔質ガラス担体であり、
さらに好ましくは、前記多孔質ガラス担体は、EziG-101、EziG-102又はEziG-103であることを特徴とする実施形態6に記載の固定化トランスアミナーゼ。
[実施形態11]前記固定化トランスアミナーゼは、前記トランスアミナーゼ突然変異体及び担体を物理的吸着によって結合させた吸着固定化酵素であり、
好ましくは、前記吸着固定化酵素は、SEQ ID NO:1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T及びT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201Cのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の吸着固定化酵素であり、
好ましくは、前記担体は、樹脂担体であり、
より好ましくは、前記樹脂担体は、スチレンとメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリスチレン樹脂及びポリメタクリレート樹脂から選択される任意の1種であるマトリックスと、オクタデシル基の前記マトリックスに結合される官能基とを含み、さらに好ましくは、前記樹脂担体は、ECR8806、ECR1030、ECR1090、ECR1061、ECR1091、ECR8804、Immobead-EC1、Immobead-S60S、Immobead-S861、X17S0409、EXE120又はDiaion HP2MGから選択されることを特徴とする実施形態6に記載の固定化トランスアミナーゼ。
[実施形態12]実施形態1~3のいずれかに記載のトランスアミナーゼ突然変異体又は実施形態6~11のいずれかに記載の固定化トランスアミナーゼを用いて、ケトン化合物及びアミノ基供与体に対してアミノ基転移反応を触媒するステップを含むことを特徴とするキラルアミンの製造方法。
[実施形態13]前記トランスアミナーゼは、実施形態1~3のいずれかに記載のトランスアミナーゼ突然変異体であり、前記方法は、バッチ反応であり、好ましくは、前記バッチ反応の反応系は、水相反応系であることを特徴とする実施形態12に記載の方法。
[実施形態14]前記トランスアミナーゼは、実施形態6~11のいずれかに記載の固定化トランスアミナーゼであり、前記方法は、連続的な反応であり、好ましくは、前記連続的な反応の反応系は、有機相反応系であることを特徴とする実施形態12に記載の方法。
[実施形態15]前記ケトン化合物は、
Claims (36)
- 配列番号1で示される配列にアミノ酸突然変異が発生した配列を有し、前記アミノ酸突然変異が発生した部位が、T7C+S47C部位であるか、あるいは、T7C+S47Cと、M356L、F364L、C404L、M430L、R405E、R405A、K90G、K219T、K304D、K51R、A95P、E368P、Q346E、H333K、D371G、E246A、C328A、N412G、T402P、T107F、T107A、G110P、K69N、G201C、Q380L、K193I、I297L、R305H、F111Y、K190E、A286T、K51R+W187Y、R405E+A95P、R405E+A95P+K304D、R405E+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+D371G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E246A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T402P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107F、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+G110P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+A286T、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C又はR405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286Tのうちのいずれか1つとを含むことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
- 請求項1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするDNA分子。
- 請求項2に記載のDNA分子が結合されていることを特徴とする組換えプラスミド。
- 請求項1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体を含むことを特徴とする固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ突然変異体のトランスアミナーゼ架橋酵素凝集体であることを特徴とする請求項4に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ突然変異体を沈殿させてトランスアミナーゼ凝集体が得られて、前記トランスアミナーゼ凝集体中の遊離しているアミノ基、フェノール基、イミダゾール基又はメルカプト基を、グルタルアルデヒド、N,N’-メチレンビスアクリルアミド、ビスマレイミド及びデキストランから選択される任意の1種の架橋剤と架橋させて、前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体が得られることを特徴とする請求項5に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+K69N、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+C328A又はT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297Lのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の架橋酵素凝集体であることを特徴とする請求項5に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記デキストランの分子量は、6KDa~200KDaであることを特徴とする請求項6に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ突然変異体をエタノールで沈殿させて前記トランスアミナーゼ凝集体が得られることを特徴とする請求項6に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ凝集体中の遊離アミノ基をグルタルアルデヒドと架橋させて前記トランスアミナーゼ架橋酵素凝集体が得られることを特徴とする請求項6に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- トランスアミナーゼ包埋-架橋固定化酵素であることを特徴とする請求項4に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ包埋-架橋固定化酵素は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、又はT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297Lのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の包埋-架橋固定化酵素であることを特徴とする請求項11に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ突然変異体中の遊離アミノ基とグルタルアルデヒドとでシッフ塩基を生成して架橋してトランスアミナーゼ架橋酵素が得られて、前記トランスアミナーゼ架橋酵素をポリアクリルアミドゲルマトリックスに包埋して前記トランスアミナーゼ包埋-架橋固定化酵素が得られることを特徴とする請求項11に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ突然変異体を担体に共有結合させた共有結合固定化酵素であることを特徴とする請求項4に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記共有結合固定化酵素は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+Q380L、T7C+S47C+R405E、T7C+S47C+K51R+W187Y、T7C+S47C+R405E+A95P+K304D、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+E368P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A又はT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286Tのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の共有結合固定化酵素であることを特徴とする請求項14に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記担体は、キトサン担体、又は樹脂担体であることを特徴とする請求項14に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記キトサン担体は、ヒドロキシル基及び/又はアミノ基により前記トランスアミナーゼ突然変異体と共有結合されて前記共有結合固定化酵素を形成することを特徴とする請求項16に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記樹脂担体は、スチレンとメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリスチレン樹脂及びポリメタクリレート樹脂から選択される任意の1種であるマトリックスと、C2の短鎖アミノ基、C4の中鎖アミノ基、C6の長鎖アミノ基又はエポキシ基から選択される、前記マトリックスに結合される官能基とを含むことを特徴とする請求項16に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記樹脂担体は、ECR8309、ECR8315、EC-HFA、LX-1000HA、LX-1000EA、ECR8409、ECR8415、EC-EP、EC EP403、EXE119、LX-1000EP、Immobead-150A、Immobead-150P、Immobead350A、ECR8206、ECR8209、ECR8215又はECR8285から選択されることを特徴とする請求項18に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記トランスアミナーゼ突然変異体及び担体を金属イオンによりキレート化して形成されるキレート化固定化酵素であることを特徴とする請求項4に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記キレート化固定化酵素は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201C又はT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286Tのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体のキレート化固定化酵素であることを特徴とする請求項20に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記担体は、多孔質ガラス担体であることを特徴とする請求項20に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記多孔質ガラス担体は、EziG-101、EziG-102又はEziG-103であることを特徴とする請求項22に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記固定化トランスアミナーゼは、前記トランスアミナーゼ突然変異体及び担体を物理的吸着によって結合させた吸着固定化酵素であることを特徴とする請求項4に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記吸着固定化酵素は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を基に、T7C+S47C、T7C+S47C+A95P、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+H333K、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+Q346E、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+N412G、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A、T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+A286T又はT7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L+E368P+T107A+G201Cのアミノ酸突然変異部位を有するトランスアミナーゼ突然変異体の吸着固定化酵素であることを特徴とする請求項24に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記担体は、樹脂担体であることを特徴とする請求項24に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記樹脂担体は、スチレンとメタクリル酸エステルとの共重合体、ポリスチレン樹脂及びポリメタクリレート樹脂から選択される任意の1種であるマトリックスと、オクタデシル基の前記マトリックスに結合される官能基とを含むことを特徴とする請求項26に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 前記樹脂担体は、ECR8806、ECR1030、ECR1090、ECR1061、ECR1091、ECR8804、Immobead-EC1、Immobead-S60S、Immobead-S861、X17S0409、EXE120又はDiaion HP2MGから選択されることを特徴とする請求項27に記載の固定化トランスアミナーゼ。
- 請求項1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体又は請求項4~28のいずれか1項に記載の固定化トランスアミナーゼを用いて、ケトン化合物及びアミノ基供与体に対してアミノ基転移反応を触媒するステップを含むことを特徴とするキラルアミンの製造方法。
- 前記方法では、請求項1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体を用いて前記アミノ基転移反応を触媒し、前記方法は、バッチ反応であることを特徴とする請求項29に記載の方法。
- 前記バッチ反応の反応系は、水相反応系であることを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 前記方法では、請求項4~28のいずれか1項に記載の固定化トランスアミナーゼを用いて前記アミノ基転移反応を触媒し、前記方法は、連続的な反応であることを特徴とする請求項29に記載の方法。
- 前記連続的な反応の反応系は、有機相反応系であることを特徴とする請求項32に記載の方法。
- 前記ケトン化合物は、
- アミノ基供与体は、イソプロピルアミンであることを特徴とする請求項34に記載の方法。
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