JPH02109979A - エポキシ活性化ビーズに固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼ - Google Patents
エポキシ活性化ビーズに固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼInfo
- Publication number
- JPH02109979A JPH02109979A JP1152454A JP15245489A JPH02109979A JP H02109979 A JPH02109979 A JP H02109979A JP 1152454 A JP1152454 A JP 1152454A JP 15245489 A JP15245489 A JP 15245489A JP H02109979 A JPH02109979 A JP H02109979A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- immobilized
- pnpase
- epoxy
- polynucleotide
- beads
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 24
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 24
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 239000011324 bead Substances 0.000 title abstract description 32
- 101001066878 Homo sapiens Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 21
- 102000002681 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 10
- -1 water-insoluble Substances 0.000 claims description 18
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 25
- 239000011148 porous material Substances 0.000 abstract description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 6
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 5
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 abstract description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 3
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 2
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract 1
- 102100034410 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Human genes 0.000 description 45
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 21
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 6
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 6
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 6
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 5
- 230000006854 communication Effects 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- STMDPCBYJCIZOD-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dinitroanilino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O STMDPCBYJCIZOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 4
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 4
- 125000000466 oxiranyl group Chemical group 0.000 description 4
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 3
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JPXZQMKKFWMMGK-KQYNXXCUSA-N IDP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 JPXZQMKKFWMMGK-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N bisphenol A Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004679 hydroxides Chemical class 0.000 description 2
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 2
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- VRJATDXLLGJJBP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;urea Chemical compound NC(N)=O.C=CC1=CC=CC=C1C=C VRJATDXLLGJJBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TURITJIWSQEMDB-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-[(2-methylprop-2-enoylamino)methyl]prop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NCNC(=O)C(C)=C TURITJIWSQEMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N CDP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 101710128017 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOGRQMPFHUHIGU-UHFFFAOYSA-N Uridylic acid Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 FOGRQMPFHUHIGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910021502 aluminium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000004020 conductor Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003055 glycidyl group Chemical group C(C1CO1)* 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- RPQRDASANLAFCM-UHFFFAOYSA-N oxiran-2-ylmethyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OCC1CO1 RPQRDASANLAFCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002924 oxiranes Chemical class 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 230000035922 thirst Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/084—Polymers containing vinyl alcohol units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/087—Acrylic polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼ
(以下PNPアーゼと略記)K関する。
(以下PNPアーゼと略記)K関する。
ポリヌクレオチドホスホリラーゼはマグネシウムイオン
の存在下にリボヌクレオチPジホスヘート(NDP)か
らの−重鎖ポリリボヌクレオチr(ポリリボヌクレオシ
rモノホスヘート、ポリNMPまたは鹿Pnとも呼ばれ
る)の合成に触媒作用を及ぼす細菌性酵素である。
の存在下にリボヌクレオチPジホスヘート(NDP)か
らの−重鎖ポリリボヌクレオチr(ポリリボヌクレオシ
rモノホスヘート、ポリNMPまたは鹿Pnとも呼ばれ
る)の合成に触媒作用を及ぼす細菌性酵素である。
NDP + (lJMP)n−< <−−> (N
Mp)n+Pi(式中、nは整数でありモしてPlはホ
スヘートイオンを表す)、各NDPはあらかじめ形成さ
れたポリリボヌクレオチf (NMP)。pHの遊離の
3′−とPロキシル末端に連続的に付加される。しばし
ば、(NMP)n−、のプライマー鎖が反応の開始時に
用いられる。反応の平衡はホスヘートイオン濃度を高め
ることKより、ポリリボヌクレオチドが分解する方向に
シフトさせることができる。
Mp)n+Pi(式中、nは整数でありモしてPlはホ
スヘートイオンを表す)、各NDPはあらかじめ形成さ
れたポリリボヌクレオチf (NMP)。pHの遊離の
3′−とPロキシル末端に連続的に付加される。しばし
ば、(NMP)n−、のプライマー鎖が反応の開始時に
用いられる。反応の平衡はホスヘートイオン濃度を高め
ることKより、ポリリボヌクレオチドが分解する方向に
シフトさせることができる。
即ち、PNPアーゼはポリリボヌクレオチドの加りん酸
分解を接触してリボヌクレオシドジホスヘートを生成さ
せ得るのみならず、リボヌクレオシドジホスヘートから
のポリリボヌクレオチドの生成にも触媒作用を及ぼしう
る。
分解を接触してリボヌクレオシドジホスヘートを生成さ
せ得るのみならず、リボヌクレオシドジホスヘートから
のポリリボヌクレオチドの生成にも触媒作用を及ぼしう
る。
ポ17 NMPは天然に存在する一重鎖リボ核酸(ss
RNA)またはホモポリマーもしくはコポリマー 5s
RNA例えばポリイノシン酸(ポリI)、ポリシチジル
酸(ポリC)もしくはポリシチジル/ウリジル酸(ポリ
C,U)であることができる。ポリIおよびポリCまた
はポリC,Uはアニーリングして、例えば米国特許第4
,1i64i号および目−ロツノ臂特許出願会告第11
3,162および214921号に開示されるよ5に、
インターフェロンの誘導およびウィルス感染ならびに癌
の治療に有用な二本鎖リボ核酸(a8RNA)を形成す
ることができる。
RNA)またはホモポリマーもしくはコポリマー 5s
RNA例えばポリイノシン酸(ポリI)、ポリシチジル
酸(ポリC)もしくはポリシチジル/ウリジル酸(ポリ
C,U)であることができる。ポリIおよびポリCまた
はポリC,Uはアニーリングして、例えば米国特許第4
,1i64i号および目−ロツノ臂特許出願会告第11
3,162および214921号に開示されるよ5に、
インターフェロンの誘導およびウィルス感染ならびに癌
の治療に有用な二本鎖リボ核酸(a8RNA)を形成す
ることができる。
この合成反応および加りん酸分解反応は遊離の酵素とし
ての溶液中のPNPアーゼな用いて通常実施される。し
かしながらBoysr、 Fditor、τheIkz
ymea、 3d版、茸巻、第8部(1982) 、
546頁に記載されるように、PNPアーゼは種々の不
溶性物質例工ば、ニトロセルロースフィルター セルロ
ースヒース、シルケット加工セルロース、セファロース
(Elepharose”) 4 Bポリサッカライr
、ヒPラジPアガロース、ジアゾ化p−7ミノベンゼン
スルホニルエチル(ABSg)ア7!/ロース、AB8
gセファデックスG−200およびAB8gセルロース
に固定化されてきた。Boysr氏は固定化されたPN
Pアーゼは溶性酵素に比較して有利であると述べている
。すなわち、加りん酸分解にとってよりも重合に好適な
一条件下である種の支持体を用いて重合の収率が改善さ
れること、酵素からの反応生成物の分離が単純化される
こと、および酵素が何回も再循環されうろことである。
ての溶液中のPNPアーゼな用いて通常実施される。し
かしながらBoysr、 Fditor、τheIkz
ymea、 3d版、茸巻、第8部(1982) 、
546頁に記載されるように、PNPアーゼは種々の不
溶性物質例工ば、ニトロセルロースフィルター セルロ
ースヒース、シルケット加工セルロース、セファロース
(Elepharose”) 4 Bポリサッカライr
、ヒPラジPアガロース、ジアゾ化p−7ミノベンゼン
スルホニルエチル(ABSg)ア7!/ロース、AB8
gセファデックスG−200およびAB8gセルロース
に固定化されてきた。Boysr氏は固定化されたPN
Pアーゼは溶性酵素に比較して有利であると述べている
。すなわち、加りん酸分解にとってよりも重合に好適な
一条件下である種の支持体を用いて重合の収率が改善さ
れること、酵素からの反応生成物の分離が単純化される
こと、および酵素が何回も再循環されうろことである。
Thang氏他のBiochemical and B
iophysical ResearchCommun
ications、 51 + 1−8 (1968)
¥Cはニトロセルロースフィルターに固定化されたP
NPアーゼが開示されている。Ho ffman他のB
iochemical andBiophysical
Re5earch Communications、
41 、165 。
iophysical ResearchCommun
ications、 51 + 1−8 (1968)
¥Cはニトロセルロースフィルターに固定化されたP
NPアーゼが開示されている。Ho ffman他のB
iochemical andBiophysical
Re5earch Communications、
41 、165 。
710−714(1970)にはホモボリヌクレオチr
の製造への、CNBr活性化されたセルロースに結合さ
れたPNPアーゼの使用が開示され【いる。
の製造への、CNBr活性化されたセルロースに結合さ
れたPNPアーゼの使用が開示され【いる。
8Inith他のFEBB Letterts、 50
、42 、246−248(1973)には−重鎖ポ
リリボヌクレオチドの製造への、シルケット加工された
セルロースまたはセファロースまたはアミノアルキルシ
ランガラスビーズに結合されたPNPアーゼの使用が開
示されている。5oreq他のJournal of
Biologi−cal Chemistry、 25
2 、6885−6888 (j 977 )にはポリ
ヌクレオチドの加りん酸分解のための、 CNBr活性
化されたセファロースに固定化されたPNPアーゼが開
示されている。Bachner他のBiochemi−
cal and Biophysical Re5ea
rch Communlcations、 65 。
、42 、246−248(1973)には−重鎖ポ
リリボヌクレオチドの製造への、シルケット加工された
セルロースまたはセファロースまたはアミノアルキルシ
ランガラスビーズに結合されたPNPアーゼの使用が開
示されている。5oreq他のJournal of
Biologi−cal Chemistry、 25
2 、6885−6888 (j 977 )にはポリ
ヌクレオチドの加りん酸分解のための、 CNBr活性
化されたセファロースに固定化されたPNPアーゼが開
示されている。Bachner他のBiochemi−
cal and Biophysical Re5ea
rch Communlcations、 65 。
12 、476−483(1975’)には、ポリヌク
レオチrがアガロースに固定化されたPNPアーゼを用
いて合成されたと述べられている。Yamauchi他
のJournal of Fermentation
Technology+ 64 、 A 6 。
レオチrがアガロースに固定化されたPNPアーゼを用
いて合成されたと述べられている。Yamauchi他
のJournal of Fermentation
Technology+ 64 、 A 6 。
517−522(1986)およびYamauchi他
のJournalof Fermentation T
6ChnOIOgY+ 64 、 JK5 、455−
457(1985) VCは種々の共有結合法によりア
ミノプロピル多孔質ガラスに固定化されたPNPアーゼ
が開示されており、そしてグルタルアルデヒP結合によ
り得られた生成物がポリ!およびポリCのようなポリヌ
クレオチドの実際上の製造に適すると記載されている。
のJournalof Fermentation T
6ChnOIOgY+ 64 、 JK5 、455−
457(1985) VCは種々の共有結合法によりア
ミノプロピル多孔質ガラスに固定化されたPNPアーゼ
が開示されており、そしてグルタルアルデヒP結合によ
り得られた生成物がポリ!およびポリCのようなポリヌ
クレオチドの実際上の製造に適すると記載されている。
Yamauchiはまた従来のCNBr活性化されたセ
ルロースおよびシリカゲルへのPNPアーゼの固定化法
についても言及し【いるが、これらの方法は完全には満
足できるものではなかったと述べている。Brentn
all他のTetrahedron Lstters、
425 、2595−25945(1982)釦は、
セルロースに固定化されたPNPアーゼを用いる8−ク
ウロアデノシンジホスヘートの重合が開示されている。
ルロースおよびシリカゲルへのPNPアーゼの固定化法
についても言及し【いるが、これらの方法は完全には満
足できるものではなかったと述べている。Brentn
all他のTetrahedron Lstters、
425 、2595−25945(1982)釦は、
セルロースに固定化されたPNPアーゼを用いる8−ク
ウロアデノシンジホスヘートの重合が開示されている。
Vang他のBiochsmical andBiop
hysical Re5earch Communic
ations、 90 、A 2 。
hysical Re5earch Communic
ations、 90 、A 2 。
606−614 (1979) VCはCNBr活性化
されたセファロースへのPNPアーゼの固定化が開示さ
れており、そして結合された酵素がNDPの重合におい
【その活性の70%を保持し【いると述べている。Cl
1ahiOn他のBiotechnology an+
I Bioenginee−ring、 >CDI 、
493−423(1982) 、 Ca5hion他
のNucleic Ac1ds Re5earch、
Symposium 8eries A 7 。
されたセファロースへのPNPアーゼの固定化が開示さ
れており、そして結合された酵素がNDPの重合におい
【その活性の70%を保持し【いると述べている。Cl
1ahiOn他のBiotechnology an+
I Bioenginee−ring、 >CDI 、
493−423(1982) 、 Ca5hion他
のNucleic Ac1ds Re5earch、
Symposium 8eries A 7 。
175pH89(1980)%およびcaahion他
の米国特許第4,579,845ICはトリチル化アガ
ロースまたはセファロースビーズへの非共有結合による
PNPアーゼおよび他の酵素の固定化Kが記載されてい
る。Ansberga他の0.8.8.R,特許出願公
告第8111L717号にはポリヌクレオチド合成のた
めのガンマアルオニつムヒPロキサイPK固定化された
PNPアーゼが開示されている。xratasyuk他
のlzv、 8ib、 Otd Akad、 888R
,8er、 Biol。
の米国特許第4,579,845ICはトリチル化アガ
ロースまたはセファロースビーズへの非共有結合による
PNPアーゼおよび他の酵素の固定化Kが記載されてい
る。Ansberga他の0.8.8.R,特許出願公
告第8111L717号にはポリヌクレオチド合成のた
めのガンマアルオニつムヒPロキサイPK固定化された
PNPアーゼが開示されている。xratasyuk他
のlzv、 8ib、 Otd Akad、 888R
,8er、 Biol。
Nauk、 2.93−99(197B)ICはポリヌ
クレオチドの合成および加りん酸分解のための、マクロ
細孔性マトリックスに固定化されたPNPアーゼが開示
されている。Kumarev他の阻oorg Khim
、 、 g。
クレオチドの合成および加りん酸分解のための、マクロ
細孔性マトリックスに固定化されたPNPアーゼが開示
されている。Kumarev他の阻oorg Khim
、 、 g。
700−707(1976) VCは、グロピオンアル
テヒP含有シロクロム(ailochrome)支持体
へのPNPアーゼの固定が開示されている。Broom
、 A、D、は未刊行の個人的な通信において誘導体化
セファロース、ポリアクリルアミPおよびアガロースを
含む多数の種々の支持体に固定化されたPNPアーゼな
用いるポリヌクレオチド合成実験について述べている。
テヒP含有シロクロム(ailochrome)支持体
へのPNPアーゼの固定が開示されている。Broom
、 A、D、は未刊行の個人的な通信において誘導体化
セファロース、ポリアクリルアミPおよびアガロースを
含む多数の種々の支持体に固定化されたPNPアーゼな
用いるポリヌクレオチド合成実験について述べている。
最良の結果を生じる市販の支持体はアガロースのスクシ
ンイミr誘導体であるAffi−Gel” 1 o (
阻o−Ra(1)であるが、PNPアーゼを共有よりむ
しろ疎水的に結合しているセファロース4Bのベンジル
霞導体でさら1cjL好な結果が得られた。
ンイミr誘導体であるAffi−Gel” 1 o (
阻o−Ra(1)であるが、PNPアーゼを共有よりむ
しろ疎水的に結合しているセファロース4Bのベンジル
霞導体でさら1cjL好な結果が得られた。
エポキシ活性化された粒子、すなわち活性なタンツク結
合基としてオキシラン基を含有するポリマーの粒子が種
々の酵素の固定化に使用されてきたが%PNPアーぜの
固定化には使用されていなかった。Kraamer他の
米国特許第4ρ70.548.4.190,713.4
.21309.4,247,645および4.5116
94号にはこの種の粒子および酵素の結合へのその使用
が記載されている。このKraemer他の粒子は 囚 グリシリル基を有するエチレン系不飽和モノマー (B) 少なくとも2個のラジカル重合性二重結合を
有するコそツマpHおよび (C) ラジカル重合性水溶性コモノマーのコポリマ
ーから成り【いる。R2;hm PharmaGm b
H社はRupargi t’cなる商標の下VCKro
netの特許に教示された種類の一群のポリマー粒子を
販売している。RHhm Pharma社の商品説明書
にはその粒子がメタクリルアミP、 N、N’−メチレ
ン−ビスーメタクリルアミPグリシジルメタクリレート
および/またはアリルグリシジルエーテルの共重合によ
り製造されたオキシランアクリル系ビーズとして記載さ
れており、そして酵素は高収率(遊離の酵素活性の60
〜90%)でその粒子に固定化されうると記載されてい
る。
合基としてオキシラン基を含有するポリマーの粒子が種
々の酵素の固定化に使用されてきたが%PNPアーぜの
固定化には使用されていなかった。Kraamer他の
米国特許第4ρ70.548.4.190,713.4
.21309.4,247,645および4.5116
94号にはこの種の粒子および酵素の結合へのその使用
が記載されている。このKraemer他の粒子は 囚 グリシリル基を有するエチレン系不飽和モノマー (B) 少なくとも2個のラジカル重合性二重結合を
有するコそツマpHおよび (C) ラジカル重合性水溶性コモノマーのコポリマ
ーから成り【いる。R2;hm PharmaGm b
H社はRupargi t’cなる商標の下VCKro
netの特許に教示された種類の一群のポリマー粒子を
販売している。RHhm Pharma社の商品説明書
にはその粒子がメタクリルアミP、 N、N’−メチレ
ン−ビスーメタクリルアミPグリシジルメタクリレート
および/またはアリルグリシジルエーテルの共重合によ
り製造されたオキシランアクリル系ビーズとして記載さ
れており、そして酵素は高収率(遊離の酵素活性の60
〜90%)でその粒子に固定化されうると記載されてい
る。
RWhm Pharma社は、標準的な条件下ではタン
Aりの固定化はpH7〜8で実施することを推奨してい
るがしかしペプシンのようなある種のタン・ぐり質を結
合させるには酸性条件を推奨しておりそして任意の所定
の酵素を結合する最適の−は広い範囲(PHO〜12)
から選択されうろことを示し【いる。Eupergit
@Cは粒径および多孔の 度の異なる4種類で入手しうる。Eupergit C
1C30N、およびC250Lはそれぞれ平均直径的1
50.30および250μ溝を有するマクロ細孔性ビー
ズであり、モして細孔(溝および穴)の直径はそれぞれ
約0.03、Q、04およびα15#である。 Eup
ergi乞001 Zは平均直径約1都の非多孔質マイ
クロビーズである。
Aりの固定化はpH7〜8で実施することを推奨してい
るがしかしペプシンのようなある種のタン・ぐり質を結
合させるには酸性条件を推奨しておりそして任意の所定
の酵素を結合する最適の−は広い範囲(PHO〜12)
から選択されうろことを示し【いる。Eupergit
@Cは粒径および多孔の 度の異なる4種類で入手しうる。Eupergit C
1C30N、およびC250Lはそれぞれ平均直径的1
50.30および250μ溝を有するマクロ細孔性ビー
ズであり、モして細孔(溝および穴)の直径はそれぞれ
約0.03、Q、04およびα15#である。 Eup
ergi乞001 Zは平均直径約1都の非多孔質マイ
クロビーズである。
その他の会社も酵素の固定化用のエポキシ活性化された
ポリマー粒子を提供している。Phar−macia
Laboratories社はエポキシ活性化されたセ
ファロース6Bを提供している。Rledel−deH
ahn 社はビニルアセテートとジビニルベンゼン尿素
とから調製し、その表面のアセテート基をオキシラン基
で加水分解することにより修飾したVA−エポキシBI
O8YNTH■ビーズを提供している。このVA−エポ
キシビーズは直径約50〜200綿でありそして直径的
103#lの細孔を含有する。
ポリマー粒子を提供している。Phar−macia
Laboratories社はエポキシ活性化されたセ
ファロース6Bを提供している。Rledel−deH
ahn 社はビニルアセテートとジビニルベンゼン尿素
とから調製し、その表面のアセテート基をオキシラン基
で加水分解することにより修飾したVA−エポキシBI
O8YNTH■ビーズを提供している。このVA−エポ
キシビーズは直径約50〜200綿でありそして直径的
103#lの細孔を含有する。
Ma t thewsの米国特許第3,844,892
および1952.557には、1.2−エポキシ基お
よび末端不飽和を含有するモノマーをオレフィンモノマ
ー例えばアクリロニトリル、メタクリレートリル、メチ
ルアクリレートまたはメチルメタクリレートと反応させ
ることにより調製されるエポキシ含有コポリマーへの酵
素の固定化が開示されている。第1番目のモノマーはビ
スフェノールAのジグリシ・クルエーテルのようなジェ
ポキシPをアクリル酸またはメタクリル酸のような二官
能性オレフィンと反応させることにより作られる。
および1952.557には、1.2−エポキシ基お
よび末端不飽和を含有するモノマーをオレフィンモノマ
ー例えばアクリロニトリル、メタクリレートリル、メチ
ルアクリレートまたはメチルメタクリレートと反応させ
ることにより調製されるエポキシ含有コポリマーへの酵
素の固定化が開示されている。第1番目のモノマーはビ
スフェノールAのジグリシ・クルエーテルのようなジェ
ポキシPをアクリル酸またはメタクリル酸のような二官
能性オレフィンと反応させることにより作られる。
Bigvoodの米国特許第4,582,860および
4.612,288には、オキシラン担持モノビニルモ
ノマー、例えばグリシジルアクリレートもしくはメタク
リレートまたはアリルグリシジルエーテルをトリメチロ
ールグロノントリメタクリレートのようなトリビニルモ
ノマーと共重合させることにより作られるエポキシ活性
化されたポリマービーズへの酵素の固定化が開示されて
いる。
4.612,288には、オキシラン担持モノビニルモ
ノマー、例えばグリシジルアクリレートもしくはメタク
リレートまたはアリルグリシジルエーテルをトリメチロ
ールグロノントリメタクリレートのようなトリビニルモ
ノマーと共重合させることにより作られるエポキシ活性
化されたポリマービーズへの酵素の固定化が開示されて
いる。
PNPアーゼの固定化によりポリリボヌクレオチドの合
成にとって遊離酵素の使用に比較して幾つかの利点が得
られるが、ある種の支持体への固定化は固定化に際して
の酵素活性の損失および重合条件下での支持体からの酵
素の浸出を含め幾つかの間頂点を生じうる。例えば、8
chna−pp他のBiochemical and
Biophysical ResearchCommu
nications、 70 、41 (1976)に
は、CNBr活性化セファ四−スからの酵素の浸出問題
について言及されており、そしてこの問題を軽減するた
めに代りにアミン、ヒPう・クンまたはヒPうJ)P担
持支持体が示唆されている。
成にとって遊離酵素の使用に比較して幾つかの利点が得
られるが、ある種の支持体への固定化は固定化に際して
の酵素活性の損失および重合条件下での支持体からの酵
素の浸出を含め幾つかの間頂点を生じうる。例えば、8
chna−pp他のBiochemical and
Biophysical ResearchCommu
nications、 70 、41 (1976)に
は、CNBr活性化セファ四−スからの酵素の浸出問題
について言及されており、そしてこの問題を軽減するた
めに代りにアミン、ヒPう・クンまたはヒPうJ)P担
持支持体が示唆されている。
固形の、水不溶性のエポキシ活性化されたポリマー支持
体粒子に固定化されたPNPアーゼが0.3〜0.8
U/fの比活性を示し、標準的なボIJ IJボヌクレ
オチP合成条件(p)19,37℃)の下で10回以上
連続して反復使用して約5%一般的には1%より低い割
合でしか支持体から浸出されず、そしてポリリボヌクレ
オチド合成に10回使用後でもそのもとの活性の少くと
も90%を保持していることが見出された。比活性とは
支持体1グラム(湿潤重量)当りのPNPアーゼ活性の
単位として定義される。活性の単位(U)は下記アッセ
イ条件下に1分で1μモルの無機ホスヘートを生成する
活性と定義される。この低い浸出割合は予想外であった
、何故ならPNPアーゼは3個のポリペブチrサブユニ
ットからなるトリマーであるからである。3個のサブユ
ニットすべてがエポキシ活性化された支持体粒子忙共有
結合され【いるかと5かはわからない。
体粒子に固定化されたPNPアーゼが0.3〜0.8
U/fの比活性を示し、標準的なボIJ IJボヌクレ
オチP合成条件(p)19,37℃)の下で10回以上
連続して反復使用して約5%一般的には1%より低い割
合でしか支持体から浸出されず、そしてポリリボヌクレ
オチド合成に10回使用後でもそのもとの活性の少くと
も90%を保持していることが見出された。比活性とは
支持体1グラム(湿潤重量)当りのPNPアーゼ活性の
単位として定義される。活性の単位(U)は下記アッセ
イ条件下に1分で1μモルの無機ホスヘートを生成する
活性と定義される。この低い浸出割合は予想外であった
、何故ならPNPアーゼは3個のポリペブチrサブユニ
ットからなるトリマーであるからである。3個のサブユ
ニットすべてがエポキシ活性化された支持体粒子忙共有
結合され【いるかと5かはわからない。
また、固定化反応の収率は反応混合物の−の如何に強く
左右されることも見出された。PNPアーゼの固定化、
ならびに多くの他の酵素の固定化は通常的8〜10の塩
基性−で実施される。
左右されることも見出された。PNPアーゼの固定化、
ならびに多くの他の酵素の固定化は通常的8〜10の塩
基性−で実施される。
このことはポリリボヌクレオチド合成が行われる範囲と
一致する。以前、固定化はPNPアーゼコンホーメーシ
ョンの変化を回避するために合成とほぼ同じ−で実施さ
れねばならないと教示されていた。エポキシ活性化され
た支持体への固定化は一約4〜9の範囲内のどこででも
実施できるが、収率は一約4〜6における方がかなり曳
好であることが見出された。
一致する。以前、固定化はPNPアーゼコンホーメーシ
ョンの変化を回避するために合成とほぼ同じ−で実施さ
れねばならないと教示されていた。エポキシ活性化され
た支持体への固定化は一約4〜9の範囲内のどこででも
実施できるが、収率は一約4〜6における方がかなり曳
好であることが見出された。
また、ヌクレオシ?)ホスフェートを固定化PIPアー
ゼ触媒を用いてポリリボヌクレオチドと反応させること
により得られるポリリボヌクレオチドの鎖長(分子量)
は支持体粒子の細孔寸法、ならびに反応時間によること
も見出された。細孔寸法が大きくなると、反応の早期(
例えば初めの約30%)期間中はポリリボヌクレオチr
の分子量が低くなる。従って、所望の分子量範囲を有す
るポリリボヌクレオチドは適正な細孔寸法を有する支持
体を使用しそして適正な時間反応させることにより得ら
れうる。
ゼ触媒を用いてポリリボヌクレオチドと反応させること
により得られるポリリボヌクレオチドの鎖長(分子量)
は支持体粒子の細孔寸法、ならびに反応時間によること
も見出された。細孔寸法が大きくなると、反応の早期(
例えば初めの約30%)期間中はポリリボヌクレオチr
の分子量が低くなる。従って、所望の分子量範囲を有す
るポリリボヌクレオチドは適正な細孔寸法を有する支持
体を使用しそして適正な時間反応させることにより得ら
れうる。
第1図はPNPアーゼ固定化反応における−の作用を示
すプロットである。
すプロットである。
第2図はポリリボヌクレオチド生成物の分子量に及ぼす
支持体細孔寸法および反応時間の影響を示すプロットで
ある。
支持体細孔寸法および反応時間の影響を示すプロットで
ある。
エポキシ活性化された支持体粒子(ビーズ)は、タンツ
ク質の反応性の求核性官能基例えばアミン、スルフヒP
リル、アルコール、a!、 7ミド、または芳香族炭素
基に接近しうるエポキシド(オキシラン)基を含有する
かまたは含有するよ5に処理された天然または合成のポ
リマーもしくはコポリマーであることができる。エポキ
シ基はポリマーの合成姥使用されるモノマーまたはコモ
ノマーの一部分であることができるし、または合成後に
ポリマーとエポキシ含有化合物との反応により共有的に
付加させることができる。かかるポリマーは次のように
表ゎさ(式中mは0または約1〜5の整数であり、そし
′″CxはOまたは日であるかまたはN%P、8もしく
はCを含有する基である)。天然に存在するポリマーの
適当な例をあげれば、エポキシ活性化されたポリサッカ
ライr例えばアガロースおよびセファロースである。使
用できる合成ポリマーにはエポキシ活性化されたポリア
クリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミr
、ポリメタクリルアミr、ポリビニルアセテートおよび
ポリビニルアルコールが包含される。特に適当な米国特
許第4,070,348.4,190,713、4.2
08,309.4,247,643および4,511,
694゜Ma t thevrsの米国特許第5,84
4,892および3.932,557およびB1gwo
od氏の米国特許第4.582,860および4,61
2,288を参照されたい。
ク質の反応性の求核性官能基例えばアミン、スルフヒP
リル、アルコール、a!、 7ミド、または芳香族炭素
基に接近しうるエポキシド(オキシラン)基を含有する
かまたは含有するよ5に処理された天然または合成のポ
リマーもしくはコポリマーであることができる。エポキ
シ基はポリマーの合成姥使用されるモノマーまたはコモ
ノマーの一部分であることができるし、または合成後に
ポリマーとエポキシ含有化合物との反応により共有的に
付加させることができる。かかるポリマーは次のように
表ゎさ(式中mは0または約1〜5の整数であり、そし
′″CxはOまたは日であるかまたはN%P、8もしく
はCを含有する基である)。天然に存在するポリマーの
適当な例をあげれば、エポキシ活性化されたポリサッカ
ライr例えばアガロースおよびセファロースである。使
用できる合成ポリマーにはエポキシ活性化されたポリア
クリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミr
、ポリメタクリルアミr、ポリビニルアセテートおよび
ポリビニルアルコールが包含される。特に適当な米国特
許第4,070,348.4,190,713、4.2
08,309.4,247,643および4,511,
694゜Ma t thevrsの米国特許第5,84
4,892および3.932,557およびB1gwo
od氏の米国特許第4.582,860および4,61
2,288を参照されたい。
商業的に入手しうる適当な物質には、VApH11io
xyBiosynth@(Crescent Chem
ical Company )、Kupergi乞”C
(Roehm Pharma )およびエポキシ活性化
されたセファロース(8epharoae’ )(Ph
armacia Laboratories )が包含
される0支持体の平均粒径は決定的に重要なわけではな
いが、一般に約1〜1000μmの範囲内であろう。粒
子は実質的に非多孔質であるかまたは平均直径的α01
〜11srLの細孔(溝および穴)を含有することがで
きる。約200〜1000ヌクレオチPの鎖長さを有す
るポリリボヌクレオチrの製造には平均直径的α02〜
0.5μmの細孔を含有する平均直径約10〜500μ
情の粒子が好ましい。
xyBiosynth@(Crescent Chem
ical Company )、Kupergi乞”C
(Roehm Pharma )およびエポキシ活性化
されたセファロース(8epharoae’ )(Ph
armacia Laboratories )が包含
される0支持体の平均粒径は決定的に重要なわけではな
いが、一般に約1〜1000μmの範囲内であろう。粒
子は実質的に非多孔質であるかまたは平均直径的α01
〜11srLの細孔(溝および穴)を含有することがで
きる。約200〜1000ヌクレオチPの鎖長さを有す
るポリリボヌクレオチrの製造には平均直径的α02〜
0.5μmの細孔を含有する平均直径約10〜500μ
情の粒子が好ましい。
これは薬理活性が比較的高くかつ毒性が低いdsRNA
を生成させるのに好ましい5aRNA鎖長の範囲である
。現在量も好ましいのは平均ビーズ寸法約100〜30
0μ常を有しておりかつ約0.02〜0.2μmの平均
細孔寸法を有する支持体である。
を生成させるのに好ましい5aRNA鎖長の範囲である
。現在量も好ましいのは平均ビーズ寸法約100〜30
0μ常を有しておりかつ約0.02〜0.2μmの平均
細孔寸法を有する支持体である。
エポキシ活性化されたビーズへのPNPアーゼの固定化
は単にビーズをPNPアーゼの水性緩衝溶液と混合し、
酸の添加により所望の−に調整し、そしてその混合物を
数時間(例えば10〜40時間)好ましくは穏やかにか
きまぜながら放置するととくより達成される。前記した
とおり、固定化はpipH4〜9で実施できるが最適な
比活性および収率を得るにはpH4〜6が好ましい。
は単にビーズをPNPアーゼの水性緩衝溶液と混合し、
酸の添加により所望の−に調整し、そしてその混合物を
数時間(例えば10〜40時間)好ましくは穏やかにか
きまぜながら放置するととくより達成される。前記した
とおり、固定化はpipH4〜9で実施できるが最適な
比活性および収率を得るにはpH4〜6が好ましい。
所望の場合はビーズをPNPアーゼと混合する前に緩衝
液に浸すことKより膨潤させることもできる。数種の緩
衝液を−4〜6での固定化反応の実施に関して試験した
。4−モルホリンエタンスルホン酸(MES )緩衝液
を使用すると、酢酸塩および燐酸塩緩衝液を用いる場合
より収率が良いことが見出された。
液に浸すことKより膨潤させることもできる。数種の緩
衝液を−4〜6での固定化反応の実施に関して試験した
。4−モルホリンエタンスルホン酸(MES )緩衝液
を使用すると、酢酸塩および燐酸塩緩衝液を用いる場合
より収率が良いことが見出された。
下記実施例では、以下の一般的方法が用いられた。
酵素アッセイ
PNPアーゼの溶性形態および固定化形態の両種の酵素
活性は、トリス緩衝液(0,1M、 pH9,0)、ア
デノシンジホスフェート(ADP% 20 mM )
、MgcL2(s mM )を含有する溶液中で酵素(
約25U/ゴ)を37℃で15分間インキエベートする
ことにより測定した。反応で生成された無機ホスフェー
トはB*naini他のAnal、 Bioah*m、
152.254−258(1983)記載の方法によ
り測定する。脂アーゼ活性の1単位(U)はアッセイ条
件下に1分間で1μモルの無機ホスフェートを生ずる活
性と定義される。
活性は、トリス緩衝液(0,1M、 pH9,0)、ア
デノシンジホスフェート(ADP% 20 mM )
、MgcL2(s mM )を含有する溶液中で酵素(
約25U/ゴ)を37℃で15分間インキエベートする
ことにより測定した。反応で生成された無機ホスフェー
トはB*naini他のAnal、 Bioah*m、
152.254−258(1983)記載の方法によ
り測定する。脂アーゼ活性の1単位(U)はアッセイ条
件下に1分間で1μモルの無機ホスフェートを生ずる活
性と定義される。
HPLC分析
HPLC分析はUVダイオードプレイ検出器およびDu
Pont GF −250サイズ排除カラムを備えたH
ewlett−Paokard 1090 M HPL
Cで行われた。溶離剤は流速2−7分のNa2HPO4
(α2M、pH7,0)である。これらの条件下にポリ
ヌクレオチドおよびヌクレオチドジホスヘートが分離さ
れる。
Pont GF −250サイズ排除カラムを備えたH
ewlett−Paokard 1090 M HPL
Cで行われた。溶離剤は流速2−7分のNa2HPO4
(α2M、pH7,0)である。これらの条件下にポリ
ヌクレオチドおよびヌクレオチドジホスヘートが分離さ
れる。
実施例 1
オキシランアクリル系ビーズに固定されたPNPアーゼ
1]:up@rgit@C250Lオキシランアクリル
系ビーズをME!3緩衝液(50pHα1M% pHs
、 9 )中で15分間膨潤させた。上澄液をデカンテ
ーションして除去しそしてビーズをMg8緩衝液(3×
75−)で洗った。PNPアーゼの緩衝液(46,5m
。
系ビーズをME!3緩衝液(50pHα1M% pHs
、 9 )中で15分間膨潤させた。上澄液をデカンテ
ーションして除去しそしてビーズをMg8緩衝液(3×
75−)で洗った。PNPアーゼの緩衝液(46,5m
。
3.2U/mj、) リスHC1(10mMXpH8,
2) 、gDTA(1my ) 、2−メルカプトエタ
ノール(1mM)。
2) 、gDTA(1my ) 、2−メルカプトエタ
ノール(1mM)。
グリセリン(50*v/v))を加えた。(グリセリン
は凍結防止に市販のPNPアーゼ溶液中に冠含されてい
る。HD’I’Aおよび2−メルカプトエタノールは防
腐剤として包含されるン反応混合物のpHをIN HC
lを用いて5.9に調整しそしてこの懸濁液をゆっくり
と30分間タンブルさせた。
は凍結防止に市販のPNPアーゼ溶液中に冠含されてい
る。HD’I’Aおよび2−メルカプトエタノールは防
腐剤として包含されるン反応混合物のpHをIN HC
lを用いて5.9に調整しそしてこの懸濁液をゆっくり
と30分間タンブルさせた。
ビーズを沈降させ、上澄液をデカンテーションして除去
した。ビーズをMIli8緩衡液(3M5mg、α1M
−%I)H5,5)およびトリスヒドロキシメチルアミ
ツメタン(トリ、*)II衝漬液4M5ml、(LIM
%pH8,0)で洗った。このビーズ(湿潤重量235
g)はPNPアーゼ活性?10を有することが判った(
収率62−)。4℃で1か月貯蔵した場合、この固定化
されたPNPアーゼはそのもとの活性の95−以上を保
持していた。その上、この固定化されたPNPアーゼは
高められた温度に露出させた場合(37℃、13時間)
でももとの活性の9596以上を保持していた。同じ条
件下で溶性酵素はそのもとの活性の約70慢しか保持し
ていない。
した。ビーズをMIli8緩衡液(3M5mg、α1M
−%I)H5,5)およびトリスヒドロキシメチルアミ
ツメタン(トリ、*)II衝漬液4M5ml、(LIM
%pH8,0)で洗った。このビーズ(湿潤重量235
g)はPNPアーゼ活性?10を有することが判った(
収率62−)。4℃で1か月貯蔵した場合、この固定化
されたPNPアーゼはそのもとの活性の95−以上を保
持していた。その上、この固定化されたPNPアーゼは
高められた温度に露出させた場合(37℃、13時間)
でももとの活性の9596以上を保持していた。同じ条
件下で溶性酵素はそのもとの活性の約70慢しか保持し
ていない。
実施例 2
エポキシ活性化セファロースビーズに固定化されたPN
Pアーゼ エポキシ活性化されたセファロースビーズ(Pharm
afia Laboratories s [119)
を水中で15分間膨潤させ、次K Mg8緩衝液(28
1d%αI Ms pH5,5)で洗った。上澄液をデ
カンテーションで除去しそしてPNPアーゼの緩衝溶液
(α25pH5.4U/ld、トリスHcz (10m
M、 pHs、2 )、RDTA (1mM )、2−
メルカプトエタノール(1mM)、グリセリン(5Q*
V/v))を加えた。このS濁液を穏やかに24時間ゆ
り動かした。このビーズをMg8緩衝液(3X5dsα
I M% p)! 5.5 )およびトリス緩衝液(3
M5m、[11Ms pHB−0)で洗った。
Pアーゼ エポキシ活性化されたセファロースビーズ(Pharm
afia Laboratories s [119)
を水中で15分間膨潤させ、次K Mg8緩衝液(28
1d%αI Ms pH5,5)で洗った。上澄液をデ
カンテーションで除去しそしてPNPアーゼの緩衝溶液
(α25pH5.4U/ld、トリスHcz (10m
M、 pHs、2 )、RDTA (1mM )、2−
メルカプトエタノール(1mM)、グリセリン(5Q*
V/v))を加えた。このS濁液を穏やかに24時間ゆ
り動かした。このビーズをMg8緩衝液(3X5dsα
I M% p)! 5.5 )およびトリス緩衝液(3
M5m、[11Ms pHB−0)で洗った。
このビーズ(湿潤重量 0.89 )はα24υのPN
Pアーゼ活性を有することが判った(収率3(IIlb
)。
Pアーゼ活性を有することが判った(収率3(IIlb
)。
実施例 3
エポキシ活性化されたポリビニルアルコールビーズに固
定化されたPNPアーゼ エポキシ活性化されたポリビニルアルコールビーズ(M
A−:r、ポキシBiosynth”、 R1睡del
−cleHaen 、α11り)をMgI259衝液(
1pHαIM、pH5,9)中で15分間膨潤させた。
定化されたPNPアーゼ エポキシ活性化されたポリビニルアルコールビーズ(M
A−:r、ポキシBiosynth”、 R1睡del
−cleHaen 、α11り)をMgI259衝液(
1pHαIM、pH5,9)中で15分間膨潤させた。
上澄液をデカンテーションで除去しそしてPNPアーゼ
の緩衝溶液(α57 Ml、t2 U / d s
)リスHC2(10mM、pH8,2)、ED’l’A
(1mM )、2−メルカプトエタノール(1!nM
)、グリセリン(50IIIv/’v))を加えた。こ
の懸濁液を槍やかに24時間ゆり動かした。この゛ビー
ズを沈降させそして上澄液をデカンテーションして除去
した。ビーズをMg8緩衝液(3,Xfd、αI MS
pH5,5)およびトリス緩衝液(1pH0,1M%1
)H8,O)およびトリス緩衝液(1m、tOMspH
9Q)で洗った。このビーズCmf4N’lk0.56
9)はQ、24UのPNPアーゼ活性を有することが判
った(収率53−)。
の緩衝溶液(α57 Ml、t2 U / d s
)リスHC2(10mM、pH8,2)、ED’l’A
(1mM )、2−メルカプトエタノール(1!nM
)、グリセリン(50IIIv/’v))を加えた。こ
の懸濁液を槍やかに24時間ゆり動かした。この゛ビー
ズを沈降させそして上澄液をデカンテーションして除去
した。ビーズをMg8緩衝液(3,Xfd、αI MS
pH5,5)およびトリス緩衝液(1pH0,1M%1
)H8,O)およびトリス緩衝液(1m、tOMspH
9Q)で洗った。このビーズCmf4N’lk0.56
9)はQ、24UのPNPアーゼ活性を有することが判
った(収率53−)。
実施例 4
オキシランアクリル系ビーズに固定化されたPNPアー
ゼのタンパク質浸出 Eup@rgit■C25OLオキシランアクリル系ビ
ーズに固定化されたPNPアーゼ(総湿潤重量2.16
9、タンパク質517q含有)を、Mgcz2(5mM
)およびNJL2HPO4(2oIRt)を含有するト
リスa漬液(Z5pH0.1M、pH9,0)Ic加え
り。コノ811!l液を室温で穏やかにゆり動かした。
ゼのタンパク質浸出 Eup@rgit■C25OLオキシランアクリル系ビ
ーズに固定化されたPNPアーゼ(総湿潤重量2.16
9、タンパク質517q含有)を、Mgcz2(5mM
)およびNJL2HPO4(2oIRt)を含有するト
リスa漬液(Z5pH0.1M、pH9,0)Ic加え
り。コノ811!l液を室温で穏やかにゆり動かした。
一部分(0,1m)を周期的VC採取しそしてBCA
(ビシンコニニン酸)アラ七イ法(Sm1th、 An
al、 Bio−oh*m、150176−85(19
85))によりタンパク質についてアッセイした。
(ビシンコニニン酸)アラ七イ法(Sm1th、 An
al、 Bio−oh*m、150176−85(19
85))によりタンパク質についてアッセイした。
0 55.4 α80
1 56.5 α812
58、<S α834
698 α9724
73.9 10148
76.2 t0372 7
8.5 1.04144 7
9、9 105158 80
.1 105バツクグラウンドタンパク
質に対してI7/4整すると、反応条件下に7日後で固
定化された総タンパク質のα3ts未満しが支持体から
浸出していなかった。
1 56.5 α812
58、<S α834
698 α9724
73.9 10148
76.2 t0372 7
8.5 1.04144 7
9、9 105158 80
.1 105バツクグラウンドタンパク
質に対してI7/4整すると、反応条件下に7日後で固
定化された総タンパク質のα3ts未満しが支持体から
浸出していなかった。
実施例 5
固定化PNPアーゼを用いるポリヌクレオチドのマルチ
製造 イノシンジホスフェート(I D Ps 20 mM
)およびMgCl2 (5mM )を含有するトリス緩
衝液(4opHαI MSpH90)中におけるgup
@rgit■C250Lオキシランアクリル系ビーズに
固定化されたPNPアーゼ(i、 917 S総湿潤重
量3.75り)の懸濁液を2兜で42時時間中かにゆり
動かした。この固定化されたPNPアーゼをp過しそし
てトリス緩衝液で洗った(3X13.3m、α1M5p
H9,0)。合一したp液を0.2μ情フイルターに通
し、そしてAmi o o nPMpH0限外濾過lj
#(10000分子Iカシトオフ膜)を備えたNuol
・opor・攪拌細胞ダイアフィルトレージ日ン(di
afiltration )装澹に入れた。この溶液を
滞留′吻容量が2m未満となるまで60 psi(4,
218に9/m’ )の窒素ガス圧で濾過した。滞留物
をEDTA溶液(80pH(+、IMSpr+75)、
酢酸カリウム溶液(80m、 0.1M、 pH7,5
)および水(80tnt)を用い逐次的に希釈および次
に容鉗2−未満となるまで1縮した。滞留物を水(20
yt/)中に溶解させた。HPLC分析によれば、ポリ
イノシン酸が滞留物中に定量的に保持されており(縮収
率50−55%)、一方ヌクレオシドジホスフェートお
よびその他の低分子適化合物はP液中に含有されている
ことが示された。このポリヌクレオチドの水溶液は凍結
乾燥、沈殿または後続の反応に硝する。回収された固定
化#素はそのもとの活性の90Ls以上を保持しており
そしてポリヌクレオチドの製造にさらに15回使用でき
た。
製造 イノシンジホスフェート(I D Ps 20 mM
)およびMgCl2 (5mM )を含有するトリス緩
衝液(4opHαI MSpH90)中におけるgup
@rgit■C250Lオキシランアクリル系ビーズに
固定化されたPNPアーゼ(i、 917 S総湿潤重
量3.75り)の懸濁液を2兜で42時時間中かにゆり
動かした。この固定化されたPNPアーゼをp過しそし
てトリス緩衝液で洗った(3X13.3m、α1M5p
H9,0)。合一したp液を0.2μ情フイルターに通
し、そしてAmi o o nPMpH0限外濾過lj
#(10000分子Iカシトオフ膜)を備えたNuol
・opor・攪拌細胞ダイアフィルトレージ日ン(di
afiltration )装澹に入れた。この溶液を
滞留′吻容量が2m未満となるまで60 psi(4,
218に9/m’ )の窒素ガス圧で濾過した。滞留物
をEDTA溶液(80pH(+、IMSpr+75)、
酢酸カリウム溶液(80m、 0.1M、 pH7,5
)および水(80tnt)を用い逐次的に希釈および次
に容鉗2−未満となるまで1縮した。滞留物を水(20
yt/)中に溶解させた。HPLC分析によれば、ポリ
イノシン酸が滞留物中に定量的に保持されており(縮収
率50−55%)、一方ヌクレオシドジホスフェートお
よびその他の低分子適化合物はP液中に含有されている
ことが示された。このポリヌクレオチドの水溶液は凍結
乾燥、沈殿または後続の反応に硝する。回収された固定
化#素はそのもとの活性の90Ls以上を保持しており
そしてポリヌクレオチドの製造にさらに15回使用でき
た。
IDPに代え°c適当なりボヌクレオシドジボスフエー
トを用いることにより、この実施例記載の方法に従って
他のホモポリマーおよびコポリマーポリリボヌクレオチ
ドが製造されつる。例えば、ポリ(1!12Uはシチジ
ンジホスフェートおよびウリジンジホスフェートを12
81のモル比で代用することにより製造できる。
トを用いることにより、この実施例記載の方法に従って
他のホモポリマーおよびコポリマーポリリボヌクレオチ
ドが製造されつる。例えば、ポリ(1!12Uはシチジ
ンジホスフェートおよびウリジンジホスフェートを12
81のモル比で代用することにより製造できる。
ポリ■はEup@rgit@CまたはEup@rgit
■C25OL (平均細孔寸法それぞれ3oおよび16
0nm)のいずれかに固定化されたPNPアーゼを用い
、前記のようKして合成された。生成したポリIの分子
量はサイズ排除HPLCにより測定された。
■C25OL (平均細孔寸法それぞれ3oおよび16
0nm)のいずれかに固定化されたPNPアーゼを用い
、前記のようKして合成された。生成したポリIの分子
量はサイズ排除HPLCにより測定された。
第2図に示されるよう)Ic 、gup@rgit@
(!により触媒された反応では3〇−未満の反応でgu
p@r−git@C250LK支持された酵素の場合よ
りも分子量の高いポリマーを生成する。3〇−以上の反
応では、gup@rgit@C250Lはguperg
it■Cより平均分子量の高いポリマーを生成する。
(!により触媒された反応では3〇−未満の反応でgu
p@r−git@C250LK支持された酵素の場合よ
りも分子量の高いポリマーを生成する。3〇−以上の反
応では、gup@rgit@C250Lはguperg
it■Cより平均分子量の高いポリマーを生成する。
本発明の態様を要約して示せば以下のとおりである。
1)固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有機ポ
リマー粒子に共有結合により固定されたポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼ。
リマー粒子に共有結合により固定されたポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼ。
2)ポリマーがエポキシ活性化されたポリサッカライド
、ポリ(メタ)アクリレート、ポリ(メタ)アクリルア
ミド、ポリビニルアセテート、またはポリビニルアルコ
ールであることからなる前記1項記載の組成物。
、ポリ(メタ)アクリレート、ポリ(メタ)アクリルア
ミド、ポリビニルアセテート、またはポリビニルアルコ
ールであることからなる前記1項記載の組成物。
3)ポリマーがオキシ、ランアクリル系ホモポリマーま
たはコポリマーであり、そして粒子が平均直径的1〜1
000.pmを有しておりかつ平均直径的0.01〜1
Pの細孔を含有することからなる前記2項記載の組成物
。
たはコポリマーであり、そして粒子が平均直径的1〜1
000.pmを有しておりかつ平均直径的0.01〜1
Pの細孔を含有することからなる前記2項記載の組成物
。
4)粒子が平均直径的10〜500μmを有しておりか
つ平均直径的o、02〜α5μ偽の細孔を含有すること
からなる前記3項記載の組成物05) ポリマーが1 囚 グリシジル基を有するエチレン系不飽和上ツマー寓 (ト)少なくとも2個のラジカル重合性二重結合を有す
るコモノマー、および (C) ラジカル重合性水溶性コモノマー、のコポリ
マーであることからなる前記4項記載の組成物。
つ平均直径的o、02〜α5μ偽の細孔を含有すること
からなる前記3項記載の組成物05) ポリマーが1 囚 グリシジル基を有するエチレン系不飽和上ツマー寓 (ト)少なくとも2個のラジカル重合性二重結合を有す
るコモノマー、および (C) ラジカル重合性水溶性コモノマー、のコポリ
マーであることからなる前記4項記載の組成物。
6)ポリマーが、
囚 グリシリルメタクリレ−Fおよび/またはアリルグ
リシジルエーテル、 CB) NeN’−メチレン−ビスーメタクリルア之
ド、および (C) メタクリルアさド、 のコポリマーであることからなる前記5項記載の組成物
。
リシジルエーテル、 CB) NeN’−メチレン−ビスーメタクリルア之
ド、および (C) メタクリルアさド、 のコポリマーであることからなる前記5項記載の組成物
。
7)粒子が直径約100〜300Pを有しておりかつ直
径約0.02〜0.211mの細孔を含有することから
なる前記6項記載の組成物。
径約0.02〜0.211mの細孔を含有することから
なる前記6項記載の組成物。
8)ポリマーがエポキシ活性化されたポリビニルアルコ
ールであることからなる前記3項記載の組成物。
ールであることからなる前記3項記載の組成物。
9)ポリヌクレオチドホスホリラーゼを水溶液中pH4
〜6で、固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有
機ポリマー粒子と反応させることからなるポリヌクレオ
チドホスホリラーゼの固定化法。
〜6で、固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有
機ポリマー粒子と反応させることからなるポリヌクレオ
チドホスホリラーゼの固定化法。
10) 反応カ4−モルホリンエタンスルホン酸°緩
衝液中で行われることからなる前記9項記載の方法。
衝液中で行われることからなる前記9項記載の方法。
11) ポリマーがオキシランアクリル系またはエポ
キシ活性化されたポリビニルアルコールであり1そして
粒子が平均直径約100〜300μ鵠を有しておりかつ
平均直径的0.02〜0.2μ傷の細孔を含有すること
からなる前記10項記載の方法。
キシ活性化されたポリビニルアルコールであり1そして
粒子が平均直径約100〜300μ鵠を有しておりかつ
平均直径的0.02〜0.2μ傷の細孔を含有すること
からなる前記10項記載の方法。
12)固定化されたポリヌクレオチドホスホリラ−−I
I/の存在下にヌクレオシドジホスフェートからポリリ
ボヌクレオチドを合成するにあたり、固形の、水不溶性
の、エポキシ活性化された有機ポリマー粒子に共有結合
により固定化されたポリリボヌクレオチドホスホリラ−
ゼを使用することからなる方法。
I/の存在下にヌクレオシドジホスフェートからポリリ
ボヌクレオチドを合成するにあたり、固形の、水不溶性
の、エポキシ活性化された有機ポリマー粒子に共有結合
により固定化されたポリリボヌクレオチドホスホリラ−
ゼを使用することからなる方法。
13)ポリマーがエポキシ活性化されたポリサッカライ
ド、ポリ(メタ)アクリレート、ポリ(メタ)アクリル
ア建ド、ポリビニルアセテート、またはポリビニルアル
コールで、%ルことからなる前記12項記載の方法。
ド、ポリ(メタ)アクリレート、ポリ(メタ)アクリル
ア建ド、ポリビニルアセテート、またはポリビニルアル
コールで、%ルことからなる前記12項記載の方法。
14)ポリマーがオキシランアクリル系ホモポリマーま
たはコポリマーであり、そして粒子が平均直径的1〜1
000/Jfiを有しておりかつ平均直径的α01〜1
μmの細孔を含有することからなる前記13項記載の方
法。
たはコポリマーであり、そして粒子が平均直径的1〜1
000/Jfiを有しておりかつ平均直径的α01〜1
μmの細孔を含有することからなる前記13項記載の方
法。
15)粒子が平均直径約10〜500μ揖を有しており
かつ平均直径的0.02〜0.5μmの細孔を含有する
ことからなる前記14項記載の方法。
かつ平均直径的0.02〜0.5μmの細孔を含有する
ことからなる前記14項記載の方法。
16)ポリマーが、
囚) グリシリル基を有するエチレン系不飽和モノマー
1 (1m少なくとも2個のラジカル重合性二重結合を有す
るコモノマー、および (C) ラジカル重合性水溶性コモノマー、のコポリ
マーであることからなる前記15項記載の方法。
1 (1m少なくとも2個のラジカル重合性二重結合を有す
るコモノマー、および (C) ラジカル重合性水溶性コモノマー、のコポリ
マーであることからなる前記15項記載の方法。
17)ポリマーが、
(4) グリシジルメタクリレートおよび/またはアリ
ルグリシジルエーテル、 CB) NUN’−メチレン−ビス−メタクリルアさ
ド、および (Q メタクリルアミド のコポリマーであることからなる前記16項記載の方法
。
ルグリシジルエーテル、 CB) NUN’−メチレン−ビス−メタクリルアさ
ド、および (Q メタクリルアミド のコポリマーであることからなる前記16項記載の方法
。
18)粒子が直径的100〜300μmを有しておりか
つ直径約α02〜12μ偽の細孔を含有することからな
る前記17項記載の方法。
つ直径約α02〜12μ偽の細孔を含有することからな
る前記17項記載の方法。
19)固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼの
存在下にポリヌクレオチドの加りん酸分解によりリボヌ
クレオチドジホスフェートを製造するにあたり、固形の
、水不溶性の、エポキシ活性化された有機ポリマー粒子
に共有結合により固定化されたポリヌクレオチドホスホ
リラーゼを使用することからなる方法。
存在下にポリヌクレオチドの加りん酸分解によりリボヌ
クレオチドジホスフェートを製造するにあたり、固形の
、水不溶性の、エポキシ活性化された有機ポリマー粒子
に共有結合により固定化されたポリヌクレオチドホスホ
リラーゼを使用することからなる方法。
第1図はPNPアーゼ固定化反応におけるpHの作用を
示すプロットである。 第2図はポリリボヌクレオチド生成物の分子量に及ぼす
支持体細孔寸法および反応時間の影響を示すプロットで
ある。 特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
eアンド・コンノセニー 図面の浄0(内荏に変更なし) 一〇−vl:、渇f1 一−−◆−−−収率χ FIG、 1 外2名 手 続 補 正 書(方式) 年lO月スO日
示すプロットである。 第2図はポリリボヌクレオチド生成物の分子量に及ぼす
支持体細孔寸法および反応時間の影響を示すプロットで
ある。 特許出願人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
eアンド・コンノセニー 図面の浄0(内荏に変更なし) 一〇−vl:、渇f1 一−−◆−−−収率χ FIG、 1 外2名 手 続 補 正 書(方式) 年lO月スO日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1)固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有機ポ
リマー粒子に共有結合により固定化されたポリヌクレオ
チドホスホリラーゼ。 2)ポリヌクレオチドホスホリラーゼを水溶液中pH4
〜6で、固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有
機ポリマー粒子と反応させることからなるポリヌクレオ
チドホスホリラーゼの固定化法。 3)固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼの存
在下にヌクレオシドジホスヘートからポリリボヌクレオ
チドを合成するにあたり、固形の、水不溶性の、エポキ
シ活性化された有機ポリマー粒子に共有結合により固定
化されたポリリボヌクレオチドホスホリラーゼを使用す
ることからなる方法。 4)固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼの存
在下にポリヌクレオチドの加りん酸分解によりリボヌク
レオチドジホスヘートを製造するにあたり、固形の、水
不溶性の、エポキシ活性化された有機ポリマー粒子に共
有結合により固定化されたポリヌクレオチドホスホリラ
ーゼを使用することからなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US20819488A | 1988-06-16 | 1988-06-16 | |
US208,194 | 1988-06-16 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02109979A true JPH02109979A (ja) | 1990-04-23 |
Family
ID=22773602
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1152454A Pending JPH02109979A (ja) | 1988-06-16 | 1989-06-16 | エポキシ活性化ビーズに固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼ |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0346865A3 (ja) |
JP (1) | JPH02109979A (ja) |
KR (1) | KR910005628B1 (ja) |
AU (1) | AU3653789A (ja) |
DK (1) | DK296089A (ja) |
FI (1) | FI892939A (ja) |
HU (1) | HUT50865A (ja) |
IL (1) | IL90600A0 (ja) |
NO (1) | NO892497L (ja) |
PT (1) | PT90886A (ja) |
ZA (1) | ZA894605B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09503301A (ja) * | 1993-10-02 | 1997-03-31 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | アフィニティークロマトグラフィーのためのヌクレオチド含有吸着材 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991000346A1 (en) * | 1989-07-03 | 1991-01-10 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotide phosphorylase immobilized on tris(hydroxymethyl)methylacrylamide polymer beads |
EP0562373A3 (en) * | 1992-03-23 | 1994-05-25 | Siemens Ag | Immobilisation of biochemical substances |
DE19653730C2 (de) * | 1996-12-11 | 1999-06-24 | Schering Ag | Immobilisierte Proteine aus Rohextrakt und deren Verwendung zur Umsetzung von Estern |
US5905024A (en) * | 1996-12-17 | 1999-05-18 | University Of Chicago | Method for performing site-specific affinity fractionation for use in DNA sequencing |
EP1138762A1 (en) * | 1998-12-10 | 2001-10-04 | Takara Shuzo Co, Ltd. | Method for immobilizing oligonucleotide on a carrier |
SI1439220T1 (sl) * | 2003-01-16 | 2007-12-31 | Adorkem Technology Spa | Imobilizirani biokatalizatorji, uporabnimi za izdelavo naravnih nukleozidov in modificiranih analogov z encimatskimi reakcijami transglikolizacije |
MX2023001476A (es) * | 2020-08-05 | 2023-03-16 | Oncovir Inc | Produccion escalable de polirribonucleotidos de tama?o controlado. |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4210723A (en) * | 1976-07-23 | 1980-07-01 | The Dow Chemical Company | Method of coupling a protein to an epoxylated latex |
US4208309A (en) * | 1977-05-20 | 1980-06-17 | Rohm Gmbh | Pearl polymer containing hollow pearls |
DE3136940A1 (de) * | 1981-09-17 | 1983-03-31 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von 5'-ribonucleotiden" |
US4582860A (en) * | 1983-12-15 | 1986-04-15 | Rohm And Haas Company | Oxirane resins for enzyme immobilization |
-
1989
- 1989-06-13 IL IL90600A patent/IL90600A0/xx unknown
- 1989-06-14 EP EP19890110788 patent/EP0346865A3/en not_active Withdrawn
- 1989-06-15 FI FI892939A patent/FI892939A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-06-15 NO NO89892497A patent/NO892497L/no unknown
- 1989-06-15 DK DK296089A patent/DK296089A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-06-16 HU HU893131A patent/HUT50865A/hu unknown
- 1989-06-16 PT PT90886A patent/PT90886A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-06-16 KR KR1019890008296A patent/KR910005628B1/ko active IP Right Grant
- 1989-06-16 JP JP1152454A patent/JPH02109979A/ja active Pending
- 1989-06-16 ZA ZA894605A patent/ZA894605B/xx unknown
- 1989-06-16 AU AU36537/89A patent/AU3653789A/en not_active Abandoned
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09503301A (ja) * | 1993-10-02 | 1997-03-31 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング | アフィニティークロマトグラフィーのためのヌクレオチド含有吸着材 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0346865A3 (en) | 1990-09-12 |
FI892939A (fi) | 1989-12-17 |
PT90886A (pt) | 1989-12-29 |
DK296089A (da) | 1989-12-17 |
IL90600A0 (en) | 1990-01-18 |
DK296089D0 (da) | 1989-06-15 |
KR910001042A (ko) | 1991-01-30 |
HUT50865A (en) | 1990-03-28 |
KR910005628B1 (ko) | 1991-08-01 |
EP0346865A2 (en) | 1989-12-20 |
NO892497D0 (no) | 1989-06-15 |
NO892497L (no) | 1989-12-18 |
ZA894605B (en) | 1991-02-27 |
FI892939A0 (fi) | 1989-06-15 |
AU3653789A (en) | 1989-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108384767B (zh) | 转氨酶突变体及其应用 | |
Leonhardt et al. | Enzyme-mimicking polymers exhibiting specific substrate binding and catalytic functions | |
Wagner et al. | Preparation of sepharose-bound poly (rI: rC) | |
Nilsson et al. | The use of bead polymerization of acrylic monomers for immobilization of enzymes | |
EP3733689B1 (en) | Transaminase mutant and application thereof | |
EP0565978B1 (de) | Aktivierte Trägermaterialien, ihre Herstellung und Verwendung | |
FI92074C (fi) | Menetelmä entsyymien immobilisoimiseksi kiinnittämällä ne rakeiseen piimaahan | |
CA3196800A1 (en) | Reagents for massively parallel nucleic acid sequencing | |
US3959079A (en) | Insolubilization of proteins by chemical activation of a polymerized support and crosslinking of the protein to the support | |
SE450493B (sv) | Forfarande for framstellning av sampolymerer av polysackarider som berare av enzymatisk aktivitet | |
WO2019071474A1 (zh) | 修饰的核苷或核苷酸 | |
JPH02109979A (ja) | エポキシ活性化ビーズに固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼ | |
DK1577324T3 (en) | Three-branched sugar chain asparagine derivatives, sugar chain asparagines, sugar chains and processes for their preparation | |
Reddy et al. | Immobilized nucleases | |
Orth et al. | Carrier‐Bound Biologically Active Substances and Their Applications | |
Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
US4931476A (en) | Crosslinked polymers and a process for their preparation | |
CN117070514B (zh) | 非天然rna的制备方法及产品 | |
US4767620A (en) | Crosslinked polymers with carbonate ester groups, and a process for their preparation | |
EP2316932B1 (en) | Enzyme-functionalized supports | |
Trelles et al. | Immobilization techniques applied to the development of biocatalysts for the synthesis of nucleoside analogue derivatives | |
WO1991000346A1 (en) | Polynucleotide phosphorylase immobilized on tris(hydroxymethyl)methylacrylamide polymer beads | |
Chang et al. | Immobilization of leuconostoe mesenteroides dextransucrase to porous phenoxyacetyl cellulose beads | |
EP0691887B1 (de) | Immobilisierte enzyme | |
WO2001046471A1 (en) | Expression of proteins from amplified, immobilized nucleic acids |