JPH02109979A - エポキシ活性化ビーズに固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼ
（以下ＰＮＰアーゼと略記）Ｋ関する。

ポリヌクレオチドホスホリラーゼはマグネシウムイオン
の存在下にリボヌクレオチＰジホスヘート（ＮＤＰ）か
らの−重鎖ポリリボヌクレオチｒ（ポリリボヌクレオシ
ｒモノホスヘート、ポリＮＭＰまたは鹿Ｐｎとも呼ばれ
る）の合成に触媒作用を及ぼす細菌性酵素である。

ＮＤＰ　＋　（ｌＪＭＰ）ｎ−＜　　＜−−＞　　（Ｎ
Ｍｐ）ｎ＋Ｐｉ（式中、ｎは整数でありモしてＰｌはホ
スヘートイオンを表す）、各ＮＤＰはあらかじめ形成さ
れたポリリボヌクレオチｆ　（ＮＭＰ）。ｐＨの遊離の
３′−とＰロキシル末端に連続的に付加される。しばし
ば、（ＮＭＰ）ｎ−、のプライマー鎖が反応の開始時に
用いられる。反応の平衡はホスヘートイオン濃度を高め
ることＫより、ポリリボヌクレオチドが分解する方向に
シフトさせることができる。

即ち、ＰＮＰアーゼはポリリボヌクレオチドの加りん酸
分解を接触してリボヌクレオシドジホスヘートを生成さ
せ得るのみならず、リボヌクレオシドジホスヘートから
のポリリボヌクレオチドの生成にも触媒作用を及ぼしう
る。

ポ１７　ＮＭＰは天然に存在する一重鎖リボ核酸（ｓｓ
ＲＮＡ）またはホモポリマーもしくはコポリマー　５ｓ
ＲＮＡ例えばポリイノシン酸（ポリＩ）、ポリシチジル
酸（ポリＣ）もしくはポリシチジル／ウリジル酸（ポリ
Ｃ，Ｕ）であることができる。ポリＩおよびポリＣまた
はポリＣ，Ｕはアニーリングして、例えば米国特許第４
，１ｉ６４ｉ号および目−ロツノ臂特許出願会告第１１
３，１６２および２１４９２１号に開示されるよ５に、
インターフェロンの誘導およびウィルス感染ならびに癌
の治療に有用な二本鎖リボ核酸（ａ８ＲＮＡ）を形成す
ることができる。

この合成反応および加りん酸分解反応は遊離の酵素とし
ての溶液中のＰＮＰアーゼな用いて通常実施される。し
かしながらＢｏｙｓｒ、　Ｆｄｉｔｏｒ、τｈｅＩｋｚ
ｙｍｅａ、　３ｄ版、茸巻、第８部（１９８２）　、　
５４６頁に記載されるように、ＰＮＰアーゼは種々の不
溶性物質例工ば、ニトロセルロースフィルター　セルロ
ースヒース、シルケット加工セルロース、セファロース
（Ｅｌｅｐｈａｒｏｓｅ”）　４　Ｂポリサッカライｒ
、ヒＰラジＰアガロース、ジアゾ化ｐ−７ミノベンゼン
スルホニルエチル（ＡＢＳｇ）ア７！／ロース、ＡＢ８
ｇセファデックスＧ−２００およびＡＢ８ｇセルロース
に固定化されてきた。Ｂｏｙｓｒ氏は固定化されたＰＮ
Ｐアーゼは溶性酵素に比較して有利であると述べている
。すなわち、加りん酸分解にとってよりも重合に好適な
一条件下である種の支持体を用いて重合の収率が改善さ
れること、酵素からの反応生成物の分離が単純化される
こと、および酵素が何回も再循環されうろことである。

Ｔｈａｎｇ氏他のＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、　５１　＋　１−８　（１９６８）
　￥Ｃはニトロセルロースフィルターに固定化されたＰ
ＮＰアーゼが開示されている。Ｈｏ　ｆｆｍａｎ他のＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、
　４１　、１６５　。

７１０−７１４（１９７０）にはホモボリヌクレオチｒ
の製造への、ＣＮＢｒ活性化されたセルロースに結合さ
れたＰＮＰアーゼの使用が開示され【いる。

８Ｉｎｉｔｈ他のＦＥＢＢ　Ｌｅｔｔｅｒｔｓ、　５０
　、４２　、２４６−２４８（１９７３）には−重鎖ポ
リリボヌクレオチドの製造への、シルケット加工された
セルロースまたはセファロースまたはアミノアルキルシ
ランガラスビーズに結合されたＰＮＰアーゼの使用が開
示されている。５ｏｒｅｑ他のＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｉｏｌｏｇｉ−ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５
２　、６８８５−６８８８　（ｊ　９７７　）にはポリ
ヌクレオチドの加りん酸分解のための、　ＣＮＢｒ活性
化されたセファロースに固定化されたＰＮＰアーゼが開
示されている。Ｂａｃｈｎｅｒ他のＢｉｏｃｈｅｍｉ−
ｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｌｃａｔｉｏｎｓ、　６５　。

１２　、４７６−４８３（１９７５’）には、ポリヌク
レオチｒがアガロースに固定化されたＰＮＰアーゼを用
いて合成されたと述べられている。Ｙａｍａｕｃｈｉ他
のＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋　６４　、　Ａ　６　。

５１７−５２２（１９８６）およびＹａｍａｕｃｈｉ他
のＪｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｔ
６ＣｈｎＯＩＯｇＹ＋　６４　、　ＪＫ５　、４５５−
４５７（１９８５）　ＶＣは種々の共有結合法によりア
ミノプロピル多孔質ガラスに固定化されたＰＮＰアーゼ
が開示されており、そしてグルタルアルデヒＰ結合によ
り得られた生成物がポリ！およびポリＣのようなポリヌ
クレオチドの実際上の製造に適すると記載されている。

Ｙａｍａｕｃｈｉはまた従来のＣＮＢｒ活性化されたセ
ルロースおよびシリカゲルへのＰＮＰアーゼの固定化法
についても言及し【いるが、これらの方法は完全には満
足できるものではなかったと述べている。Ｂｒｅｎｔｎ
ａｌｌ他のＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｓｔｔｅｒｓ、
　４２５　、２５９５−２５９４５（１９８２）釦は、
セルロースに固定化されたＰＮＰアーゼを用いる８−ク
ウロアデノシンジホスヘートの重合が開示されている。

Ｖａｎｇ他のＢｉｏｃｈｓｍｉｃａｌ　ａｎｄＢｉｏｐ
ｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃ
ａｔｉｏｎｓ、　９０　、Ａ　２　。

６０６−６１４　（１９７９）　ＶＣはＣＮＢｒ活性化
されたセファロースへのＰＮＰアーゼの固定化が開示さ
れており、そして結合された酵素がＮＤＰの重合におい
【その活性の７０％を保持し【いると述べている。Ｃｌ
１ａｈｉＯｎ他のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎ＋
Ｉ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅ−ｒｉｎｇ、　＞ＣＤＩ　、
　４９３−４２３（１９８２）　、　Ｃａ５ｈｉｏｎ他
のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　８ｅｒｉｅｓ　Ａ　７　。

１７５ｐＨ８９（１９８０）％およびｃａａｈｉｏｎ他
の米国特許第４，５７９，８４５ＩＣはトリチル化アガ
ロースまたはセファロースビーズへの非共有結合による
ＰＮＰアーゼおよび他の酵素の固定化Ｋが記載されてい
る。Ａｎｓｂｅｒｇａ他の０．８．８．Ｒ，特許出願公
告第８１１１Ｌ７１７号にはポリヌクレオチド合成のた
めのガンマアルオニつムヒＰロキサイＰＫ固定化された
ＰＮＰアーゼが開示されている。ｘｒａｔａｓｙｕｋ他
のｌｚｖ、　８ｉｂ、　Ｏｔｄ　Ａｋａｄ、　８８８Ｒ
，８ｅｒ、　Ｂｉｏｌ。

Ｎａｕｋ、　２．９３−９９（１９７Ｂ）ＩＣはポリヌ
クレオチドの合成および加りん酸分解のための、マクロ
細孔性マトリックスに固定化されたＰＮＰアーゼが開示
されている。Ｋｕｍａｒｅｖ他の阻ｏｏｒｇ　Ｋｈｉｍ
、　、　ｇ。

７００−７０７（１９７６）　ＶＣは、グロピオンアル
テヒＰ含有シロクロム（ａｉｌｏｃｈｒｏｍｅ）支持体
へのＰＮＰアーゼの固定が開示されている。Ｂｒｏｏｍ
、　Ａ、Ｄ、は未刊行の個人的な通信において誘導体化
セファロース、ポリアクリルアミＰおよびアガロースを
含む多数の種々の支持体に固定化されたＰＮＰアーゼな
用いるポリヌクレオチド合成実験について述べている。

最良の結果を生じる市販の支持体はアガロースのスクシ
ンイミｒ誘導体であるＡｆｆｉ−Ｇｅｌ”　１　ｏ　（
阻ｏ−Ｒａ（１）であるが、ＰＮＰアーゼを共有よりむ
しろ疎水的に結合しているセファロース４Ｂのベンジル
霞導体でさら１ｃｊＬ好な結果が得られた。

エポキシ活性化された粒子、すなわち活性なタンツク結
合基としてオキシラン基を含有するポリマーの粒子が種
々の酵素の固定化に使用されてきたが％ＰＮＰアーぜの
固定化には使用されていなかった。Ｋｒａａｍｅｒ他の
米国特許第４ρ７０．５４８．４．１９０，７１３．４
．２１３０９．４，２４７，６４５および４．５１１６
９４号にはこの種の粒子および酵素の結合へのその使用
が記載されている。このＫｒａｅｍｅｒ他の粒子は 囚　グリシリル基を有するエチレン系不飽和モノマー （Ｂ）　　少なくとも２個のラジカル重合性二重結合を
有するコそツマｐＨおよび （Ｃ）　　ラジカル重合性水溶性コモノマーのコポリマ
ーから成り【いる。Ｒ２；ｈｍ　ＰｈａｒｍａＧｍ　ｂ
Ｈ社はＲｕｐａｒｇｉ　ｔ’ｃなる商標の下ＶＣＫｒｏ
ｎｅｔの特許に教示された種類の一群のポリマー粒子を
販売している。ＲＨｈｍ　Ｐｈａｒｍａ社の商品説明書
にはその粒子がメタクリルアミＰ、　Ｎ、Ｎ’−メチレ
ン−ビスーメタクリルアミＰグリシジルメタクリレート
および／またはアリルグリシジルエーテルの共重合によ
り製造されたオキシランアクリル系ビーズとして記載さ
れており、そして酵素は高収率（遊離の酵素活性の６０
〜９０％）でその粒子に固定化されうると記載されてい
る。

ＲＷｈｍ　Ｐｈａｒｍａ社は、標準的な条件下ではタン
Ａりの固定化はｐＨ７〜８で実施することを推奨してい
るがしかしペプシンのようなある種のタン・ぐり質を結
合させるには酸性条件を推奨しておりそして任意の所定
の酵素を結合する最適の−は広い範囲（ＰＨＯ〜１２）
から選択されうろことを示し【いる。Ｅｕｐｅｒｇｉｔ
＠Ｃは粒径および多孔の 度の異なる４種類で入手しうる。Ｅｕｐｅｒｇｉｔ　Ｃ
１Ｃ３０Ｎ、およびＣ２５０Ｌはそれぞれ平均直径的１
５０．３０および２５０μ溝を有するマクロ細孔性ビー
ズであり、モして細孔（溝および穴）の直径はそれぞれ
約０．０３、Ｑ、０４およびα１５＃である。　Ｅｕｐ
ｅｒｇｉ乞００１　Ｚは平均直径約１都の非多孔質マイ
クロビーズである。

その他の会社も酵素の固定化用のエポキシ活性化された
ポリマー粒子を提供している。Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社はエポキシ活性化されたセ
ファロース６Ｂを提供している。Ｒｌｅｄｅｌ−ｄｅＨ
ａｈｎ　社はビニルアセテートとジビニルベンゼン尿素
とから調製し、その表面のアセテート基をオキシラン基
で加水分解することにより修飾したＶＡ−エポキシＢＩ
Ｏ８ＹＮＴＨ■ビーズを提供している。このＶＡ−エポ
キシビーズは直径約５０〜２００綿でありそして直径的
１０３＃ｌの細孔を含有する。

Ｍａ　ｔ　ｔｈｅｗｓの米国特許第３，８４４，８９２
　および１９５２．５５７には、１．２−エポキシ基お
よび末端不飽和を含有するモノマーをオレフィンモノマ
ー例えばアクリロニトリル、メタクリレートリル、メチ
ルアクリレートまたはメチルメタクリレートと反応させ
ることにより調製されるエポキシ含有コポリマーへの酵
素の固定化が開示されている。第１番目のモノマーはビ
スフェノールＡのジグリシ・クルエーテルのようなジェ
ポキシＰをアクリル酸またはメタクリル酸のような二官
能性オレフィンと反応させることにより作られる。

Ｂｉｇｖｏｏｄの米国特許第４，５８２，８６０および
４．６１２，２８８には、オキシラン担持モノビニルモ
ノマー、例えばグリシジルアクリレートもしくはメタク
リレートまたはアリルグリシジルエーテルをトリメチロ
ールグロノントリメタクリレートのようなトリビニルモ
ノマーと共重合させることにより作られるエポキシ活性
化されたポリマービーズへの酵素の固定化が開示されて
いる。

ＰＮＰアーゼの固定化によりポリリボヌクレオチドの合
成にとって遊離酵素の使用に比較して幾つかの利点が得
られるが、ある種の支持体への固定化は固定化に際して
の酵素活性の損失および重合条件下での支持体からの酵
素の浸出を含め幾つかの間頂点を生じうる。例えば、８
ｃｈｎａ−ｐｐ他のＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕ
ｎｉｃａｔｉｏｎｓ、　７０　、４１　（１９７６）に
は、ＣＮＢｒ活性化セファ四−スからの酵素の浸出問題
について言及されており、そしてこの問題を軽減するた
めに代りにアミン、ヒＰう・クンまたはヒＰうＪ）Ｐ担
持支持体が示唆されている。

固形の、水不溶性のエポキシ活性化されたポリマー支持
体粒子に固定化されたＰＮＰアーゼが０．３〜０．８　
Ｕ／ｆの比活性を示し、標準的なボＩＪ　ＩＪボヌクレ
オチＰ合成条件（ｐ）１９，３７℃）の下で１０回以上
連続して反復使用して約５％一般的には１％より低い割
合でしか支持体から浸出されず、そしてポリリボヌクレ
オチド合成に１０回使用後でもそのもとの活性の少くと
も９０％を保持していることが見出された。比活性とは
支持体１グラム（湿潤重量）当りのＰＮＰアーゼ活性の
単位として定義される。活性の単位（Ｕ）は下記アッセ
イ条件下に１分で１μモルの無機ホスヘートを生成する
活性と定義される。この低い浸出割合は予想外であった
、何故ならＰＮＰアーゼは３個のポリペブチｒサブユニ
ットからなるトリマーであるからである。３個のサブユ
ニットすべてがエポキシ活性化された支持体粒子忙共有
結合され【いるかと５かはわからない。

また、固定化反応の収率は反応混合物の−の如何に強く
左右されることも見出された。ＰＮＰアーゼの固定化、
ならびに多くの他の酵素の固定化は通常的８〜１０の塩
基性−で実施される。

このことはポリリボヌクレオチド合成が行われる範囲と
一致する。以前、固定化はＰＮＰアーゼコンホーメーシ
ョンの変化を回避するために合成とほぼ同じ−で実施さ
れねばならないと教示されていた。エポキシ活性化され
た支持体への固定化は一約４〜９の範囲内のどこででも
実施できるが、収率は一約４〜６における方がかなり曳
好であることが見出された。

また、ヌクレオシ？）ホスフェートを固定化ＰＩＰアー
ゼ触媒を用いてポリリボヌクレオチドと反応させること
により得られるポリリボヌクレオチドの鎖長（分子量）
は支持体粒子の細孔寸法、ならびに反応時間によること
も見出された。細孔寸法が大きくなると、反応の早期（
例えば初めの約３０％）期間中はポリリボヌクレオチｒ
の分子量が低くなる。従って、所望の分子量範囲を有す
るポリリボヌクレオチドは適正な細孔寸法を有する支持
体を使用しそして適正な時間反応させることにより得ら
れうる。

第１図はＰＮＰアーゼ固定化反応における−の作用を示
すプロットである。

第２図はポリリボヌクレオチド生成物の分子量に及ぼす
支持体細孔寸法および反応時間の影響を示すプロットで
ある。

エポキシ活性化された支持体粒子（ビーズ）は、タンツ
ク質の反応性の求核性官能基例えばアミン、スルフヒＰ
リル、アルコール、ａ！、　７ミド、または芳香族炭素
基に接近しうるエポキシド（オキシラン）基を含有する
かまたは含有するよ５に処理された天然または合成のポ
リマーもしくはコポリマーであることができる。エポキ
シ基はポリマーの合成姥使用されるモノマーまたはコモ
ノマーの一部分であることができるし、または合成後に
ポリマーとエポキシ含有化合物との反応により共有的に
付加させることができる。かかるポリマーは次のように
表ゎさ（式中ｍは０または約１〜５の整数であり、そし
′″ＣｘはＯまたは日であるかまたはＮ％Ｐ、８もしく
はＣを含有する基である）。天然に存在するポリマーの
適当な例をあげれば、エポキシ活性化されたポリサッカ
ライｒ例えばアガロースおよびセファロースである。使
用できる合成ポリマーにはエポキシ活性化されたポリア
クリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミｒ
、ポリメタクリルアミｒ、ポリビニルアセテートおよび
ポリビニルアルコールが包含される。特に適当な米国特
許第４，０７０，３４８．４，１９０，７１３、４．２
０８，３０９．４，２４７，６４３および４，５１１，
６９４゜Ｍａ　ｔ　ｔｈｅｖｒｓの米国特許第５，８４
４，８９２および３．９３２，５５７およびＢ１ｇｗｏ
ｏｄ氏の米国特許第４．５８２，８６０および４，６１
２，２８８を参照されたい。

商業的に入手しうる適当な物質には、ＶＡｐＨ１１ｉｏ
ｘｙＢｉｏｓｙｎｔｈ＠（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　）、Ｋｕｐｅｒｇｉ乞”Ｃ
（Ｒｏｅｈｍ　Ｐｈａｒｍａ　）およびエポキシ活性化
されたセファロース（８ｅｐｈａｒｏａｅ’　）（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）が包含
される０支持体の平均粒径は決定的に重要なわけではな
いが、一般に約１〜１０００μｍの範囲内であろう。粒
子は実質的に非多孔質であるかまたは平均直径的α０１
〜１１ｓｒＬの細孔（溝および穴）を含有することがで
きる。約２００〜１０００ヌクレオチＰの鎖長さを有す
るポリリボヌクレオチｒの製造には平均直径的α０２〜
０．５μｍの細孔を含有する平均直径約１０〜５００μ
情の粒子が好ましい。

これは薬理活性が比較的高くかつ毒性が低いｄｓＲＮＡ
を生成させるのに好ましい５ａＲＮＡ鎖長の範囲である
。現在量も好ましいのは平均ビーズ寸法約１００〜３０
０μ常を有しておりかつ約０．０２〜０．２μｍの平均
細孔寸法を有する支持体である。

エポキシ活性化されたビーズへのＰＮＰアーゼの固定化
は単にビーズをＰＮＰアーゼの水性緩衝溶液と混合し、
酸の添加により所望の−に調整し、そしてその混合物を
数時間（例えば１０〜４０時間）好ましくは穏やかにか
きまぜながら放置するととくより達成される。前記した
とおり、固定化はｐｉｐＨ４〜９で実施できるが最適な
比活性および収率を得るにはｐＨ４〜６が好ましい。

所望の場合はビーズをＰＮＰアーゼと混合する前に緩衝
液に浸すことＫより膨潤させることもできる。数種の緩
衝液を−４〜６での固定化反応の実施に関して試験した
。４−モルホリンエタンスルホン酸（ＭＥＳ　）緩衝液
を使用すると、酢酸塩および燐酸塩緩衝液を用いる場合
より収率が良いことが見出された。

下記実施例では、以下の一般的方法が用いられた。

酵素アッセイ ＰＮＰアーゼの溶性形態および固定化形態の両種の酵素
活性は、トリス緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ９，０）、ア
デノシンジホスフェート（ＡＤＰ％　２０　ｍＭ　）　
、ＭｇｃＬ２（ｓ　ｍＭ　）を含有する溶液中で酵素（
約２５Ｕ／ゴ）を３７℃で１５分間インキエベートする
ことにより測定した。反応で生成された無機ホスフェー
トはＢ＊ｎａｉｎｉ他のＡｎａｌ、　Ｂｉｏａｈ＊ｍ、
　１５２．２５４−２５８（１９８３）記載の方法によ
り測定する。脂アーゼ活性の１単位（Ｕ）はアッセイ条
件下に１分間で１μモルの無機ホスフェートを生ずる活
性と定義される。

ＨＰＬＣ分析 ＨＰＬＣ分析はＵＶダイオードプレイ検出器およびＤｕ
Ｐｏｎｔ　ＧＦ　−２５０サイズ排除カラムを備えたＨ
ｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｏｋａｒｄ　１０９０　Ｍ　ＨＰＬ
Ｃで行われた。溶離剤は流速２−７分のＮａ２ＨＰＯ４
（α２Ｍ、ｐＨ７，０）である。これらの条件下にポリ
ヌクレオチドおよびヌクレオチドジホスヘートが分離さ
れる。

実施例　１ オキシランアクリル系ビーズに固定されたＰＮＰアーゼ １］：ｕｐ＠ｒｇｉｔ＠Ｃ２５０Ｌオキシランアクリル
系ビーズをＭＥ！３緩衝液（５０ｐＨα１Ｍ％　ｐＨｓ
、　９　）中で１５分間膨潤させた。上澄液をデカンテ
ーションして除去しそしてビーズをＭｇ８緩衝液（３×
７５−）で洗った。ＰＮＰアーゼの緩衝液（４６，５ｍ
。

３．２Ｕ／ｍｊ、）　リスＨＣ１（１０ｍＭＸｐＨ８，
２）　、ｇＤＴＡ（１ｍｙ　）　、２−メルカプトエタ
ノール（１ｍＭ）。

グリセリン（５０＊ｖ／ｖ））を加えた。（グリセリン
は凍結防止に市販のＰＮＰアーゼ溶液中に冠含されてい
る。ＨＤ’Ｉ’Ａおよび２−メルカプトエタノールは防
腐剤として包含されるン反応混合物のｐＨをＩＮ　ＨＣ
ｌを用いて５．９に調整しそしてこの懸濁液をゆっくり
と３０分間タンブルさせた。

ビーズを沈降させ、上澄液をデカンテーションして除去
した。ビーズをＭＩｌｉ８緩衡液（３Ｍ５ｍｇ、α１Ｍ
−％Ｉ）Ｈ５，５）およびトリスヒドロキシメチルアミ
ツメタン（トリ、＊）ＩＩ衝漬液４Ｍ５ｍｌ、（ＬＩＭ
％ｐＨ８，０）で洗った。このビーズ（湿潤重量２３５
ｇ）はＰＮＰアーゼ活性？１０を有することが判った（
収率６２−）。４℃で１か月貯蔵した場合、この固定化
されたＰＮＰアーゼはそのもとの活性の９５−以上を保
持していた。その上、この固定化されたＰＮＰアーゼは
高められた温度に露出させた場合（３７℃、１３時間）
でももとの活性の９５９６以上を保持していた。同じ条
件下で溶性酵素はそのもとの活性の約７０慢しか保持し
ていない。

実施例　２ エポキシ活性化セファロースビーズに固定化されたＰＮ
Ｐアーゼ エポキシ活性化されたセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍ
ａｆｉａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｓ　［１１９）
を水中で１５分間膨潤させ、次Ｋ　Ｍｇ８緩衝液（２８
１ｄ％αＩ　Ｍｓ　ｐＨ５，５）で洗った。上澄液をデ
カンテーションで除去しそしてＰＮＰアーゼの緩衝溶液
（α２５ｐＨ５．４Ｕ／ｌｄ、トリスＨｃｚ　（１０ｍ
Ｍ、　ｐＨｓ、２　）、ＲＤＴＡ　（１ｍＭ　）、２−
メルカプトエタノール（１ｍＭ）、グリセリン（５Ｑ＊
Ｖ／ｖ））を加えた。このＳ濁液を穏やかに２４時間ゆ
り動かした。このビーズをＭｇ８緩衝液（３Ｘ５ｄｓα
Ｉ　Ｍ％　ｐ）！　５．５　）およびトリス緩衝液（３
Ｍ５ｍ、［１１Ｍｓ　ｐＨＢ−０）で洗った。

このビーズ（湿潤重量　０．８９　）はα２４υのＰＮ
Ｐアーゼ活性を有することが判った（収率３（ＩＩｌｂ
）。

実施例　３ エポキシ活性化されたポリビニルアルコールビーズに固
定化されたＰＮＰアーゼ エポキシ活性化されたポリビニルアルコールビーズ（Ｍ
Ａ−：ｒ、ポキシＢｉｏｓｙｎｔｈ”、　Ｒ１睡ｄｅｌ
−ｃｌｅＨａｅｎ　、α１１り）をＭｇＩ２５９衝液（
１ｐＨαＩＭ、ｐＨ５，９）中で１５分間膨潤させた。

上澄液をデカンテーションで除去しそしてＰＮＰアーゼ
の緩衝溶液（α５７　Ｍｌ、ｔ２　Ｕ　／　ｄ　ｓ　　
）リスＨＣ２（１０ｍＭ、ｐＨ８，２）、ＥＤ’ｌ’Ａ
　（１ｍＭ　）、２−メルカプトエタノール（１！ｎＭ
）、グリセリン（５０ＩＩＩｖ／’ｖ））を加えた。こ
の懸濁液を槍やかに２４時間ゆり動かした。この゛ビー
ズを沈降させそして上澄液をデカンテーションして除去
した。ビーズをＭｇ８緩衝液（３，Ｘｆｄ、αＩ　ＭＳ
ｐＨ５，５）およびトリス緩衝液（１ｐＨ０，１Ｍ％１
）Ｈ８，Ｏ）およびトリス緩衝液（１ｍ、ｔＯＭｓｐＨ
９Ｑ）で洗った。このビーズＣｍｆ４Ｎ’ｌｋ０．５６
９）はＱ、２４ＵのＰＮＰアーゼ活性を有することが判
った（収率５３−）。

実施例　４ オキシランアクリル系ビーズに固定化されたＰＮＰアー
ゼのタンパク質浸出 Ｅｕｐ＠ｒｇｉｔ■Ｃ２５ＯＬオキシランアクリル系ビ
ーズに固定化されたＰＮＰアーゼ（総湿潤重量２．１６
９、タンパク質５１７ｑ含有）を、Ｍｇｃｚ２（５ｍＭ
）およびＮＪＬ２ＨＰＯ４（２ｏＩＲｔ）を含有するト
リスａ漬液（Ｚ５ｐＨ０．１Ｍ、ｐＨ９，０）Ｉｃ加え
り。コノ８１１！ｌ液を室温で穏やかにゆり動かした。

一部分（０，１ｍ）を周期的ＶＣ採取しそしてＢＣＡ　
（ビシンコニニン酸）アラ七イ法（Ｓｍ１ｔｈ、　Ａｎ
ａｌ、　Ｂｉｏ−ｏｈ＊ｍ、１５０１７６−８５（１９
８５））によりタンパク質についてアッセイした。

０　　　　　　　５５．４　　　　　　　　　　α８０
１　　　　　　５６．５　　　　　　　　　α８１２　
　　　　　　５８、＜Ｓ　　　　　　　　　　α８３４
　　　　　６９８　　　　　　　　α９７２４　　　　
　　７３．９　　　　　　　　１０１４８　　　　　　
７６．２　　　　　　　　　ｔ０３７２　　　　　　７
８．５　　　　　　　　１．０４１４４　　　　　　７
９、９　　　　　　　　１０５１５８　　　　　　８０
．１　　　　　　　　１０５バツクグラウンドタンパク
質に対してＩ７／４整すると、反応条件下に７日後で固
定化された総タンパク質のα３ｔｓ未満しが支持体から
浸出していなかった。

実施例　５ 固定化ＰＮＰアーゼを用いるポリヌクレオチドのマルチ
製造 イノシンジホスフェート（Ｉ　Ｄ　Ｐｓ　２０　ｍＭ　
）およびＭｇＣｌ２　（５ｍＭ　）を含有するトリス緩
衝液（４ｏｐＨαＩ　ＭＳｐＨ９０）中におけるｇｕｐ
＠ｒｇｉｔ■Ｃ２５０Ｌオキシランアクリル系ビーズに
固定化されたＰＮＰアーゼ（ｉ、　９１７　Ｓ総湿潤重
量３．７５り）の懸濁液を２兜で４２時時間中かにゆり
動かした。この固定化されたＰＮＰアーゼをｐ過しそし
てトリス緩衝液で洗った（３Ｘ１３．３ｍ、α１Ｍ５ｐ
Ｈ９，０）。合一したｐ液を０．２μ情フイルターに通
し、そしてＡｍｉ　ｏ　ｏ　ｎＰＭｐＨ０限外濾過ｌｊ
＃（１００００分子Ｉカシトオフ膜）を備えたＮｕｏｌ
・ｏｐｏｒ・攪拌細胞ダイアフィルトレージ日ン（ｄｉ
ａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　）装澹に入れた。この溶液を
滞留′吻容量が２ｍ未満となるまで６０　ｐｓｉ（４，
２１８に９／ｍ’　）の窒素ガス圧で濾過した。滞留物
をＥＤＴＡ溶液（８０ｐＨ（＋、ＩＭＳｐｒ＋７５）、
酢酸カリウム溶液（８０ｍ、　０．１Ｍ、　ｐＨ７，５
）および水（８０ｔｎｔ）を用い逐次的に希釈および次
に容鉗２−未満となるまで１縮した。滞留物を水（２０
ｙｔ／）中に溶解させた。ＨＰＬＣ分析によれば、ポリ
イノシン酸が滞留物中に定量的に保持されており（縮収
率５０−５５％）、一方ヌクレオシドジホスフェートお
よびその他の低分子適化合物はＰ液中に含有されている
ことが示された。このポリヌクレオチドの水溶液は凍結
乾燥、沈殿または後続の反応に硝する。回収された固定
化＃素はそのもとの活性の９０Ｌｓ以上を保持しており
そしてポリヌクレオチドの製造にさらに１５回使用でき
た。

ＩＤＰに代え°ｃ適当なりボヌクレオシドジボスフエー
トを用いることにより、この実施例記載の方法に従って
他のホモポリマーおよびコポリマーポリリボヌクレオチ
ドが製造されつる。例えば、ポリ（１！１２Ｕはシチジ
ンジホスフェートおよびウリジンジホスフェートを１２
８１のモル比で代用することにより製造できる。

ポリ■はＥｕｐ＠ｒｇｉｔ＠ＣまたはＥｕｐ＠ｒｇｉｔ
■Ｃ２５ＯＬ　（平均細孔寸法それぞれ３ｏおよび１６
０ｎｍ）のいずれかに固定化されたＰＮＰアーゼを用い
、前記のようＫして合成された。生成したポリＩの分子
量はサイズ排除ＨＰＬＣにより測定された。

第２図に示されるよう）Ｉｃ　、ｇｕｐ＠ｒｇｉｔ＠　
（！により触媒された反応では３〇−未満の反応でｇｕ
ｐ＠ｒ−ｇｉｔ＠Ｃ２５０ＬＫ支持された酵素の場合よ
りも分子量の高いポリマーを生成する。３〇−以上の反
応では、ｇｕｐ＠ｒｇｉｔ＠Ｃ２５０Ｌはｇｕｐｅｒｇ
ｉｔ■Ｃより平均分子量の高いポリマーを生成する。

本発明の態様を要約して示せば以下のとおりである。

１）固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有機ポ
リマー粒子に共有結合により固定されたポリヌクレオチ
ドホスホリラーゼ。

２）ポリマーがエポキシ活性化されたポリサッカライド
、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ（メタ）アクリルア
ミド、ポリビニルアセテート、またはポリビニルアルコ
ールであることからなる前記１項記載の組成物。

３）ポリマーがオキシ、ランアクリル系ホモポリマーま
たはコポリマーであり、そして粒子が平均直径的１〜１
０００．ｐｍを有しておりかつ平均直径的０．０１〜１
Ｐの細孔を含有することからなる前記２項記載の組成物
。

４）粒子が平均直径的１０〜５００μｍを有しておりか
つ平均直径的ｏ、０２〜α５μ偽の細孔を含有すること
からなる前記３項記載の組成物０５）　ポリマーが１ 囚　グリシジル基を有するエチレン系不飽和上ツマー寓 （ト）少なくとも２個のラジカル重合性二重結合を有す
るコモノマー、および （Ｃ）　　ラジカル重合性水溶性コモノマー、のコポリ
マーであることからなる前記４項記載の組成物。

６）ポリマーが、 囚　グリシリルメタクリレ−Ｆおよび／またはアリルグ
リシジルエーテル、 ＣＢ）　　ＮｅＮ’−メチレン−ビスーメタクリルア之
ド、および （Ｃ）　　メタクリルアさド、 のコポリマーであることからなる前記５項記載の組成物
。

７）粒子が直径約１００〜３００Ｐを有しておりかつ直
径約０．０２〜０．２１１ｍの細孔を含有することから
なる前記６項記載の組成物。

８）ポリマーがエポキシ活性化されたポリビニルアルコ
ールであることからなる前記３項記載の組成物。

９）ポリヌクレオチドホスホリラーゼを水溶液中ｐＨ４
〜６で、固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有
機ポリマー粒子と反応させることからなるポリヌクレオ
チドホスホリラーゼの固定化法。

１０）　　反応カ４−モルホリンエタンスルホン酸°緩
衝液中で行われることからなる前記９項記載の方法。

１１）　　ポリマーがオキシランアクリル系またはエポ
キシ活性化されたポリビニルアルコールであり１そして
粒子が平均直径約１００〜３００μ鵠を有しておりかつ
平均直径的０．０２〜０．２μ傷の細孔を含有すること
からなる前記１０項記載の方法。

１２）固定化されたポリヌクレオチドホスホリラ−−Ｉ
Ｉ／の存在下にヌクレオシドジホスフェートからポリリ
ボヌクレオチドを合成するにあたり、固形の、水不溶性
の、エポキシ活性化された有機ポリマー粒子に共有結合
により固定化されたポリリボヌクレオチドホスホリラ−
ゼを使用することからなる方法。

１３）ポリマーがエポキシ活性化されたポリサッカライ
ド、ポリ（メタ）アクリレート、ポリ（メタ）アクリル
ア建ド、ポリビニルアセテート、またはポリビニルアル
コールで、％ルことからなる前記１２項記載の方法。

１４）ポリマーがオキシランアクリル系ホモポリマーま
たはコポリマーであり、そして粒子が平均直径的１〜１
０００／Ｊｆｉを有しておりかつ平均直径的α０１〜１
μｍの細孔を含有することからなる前記１３項記載の方
法。

１５）粒子が平均直径約１０〜５００μ揖を有しており
かつ平均直径的０．０２〜０．５μｍの細孔を含有する
ことからなる前記１４項記載の方法。

１６）ポリマーが、 囚）　グリシリル基を有するエチレン系不飽和モノマー
１ （１ｍ少なくとも２個のラジカル重合性二重結合を有す
るコモノマー、および （Ｃ）　　ラジカル重合性水溶性コモノマー、のコポリ
マーであることからなる前記１５項記載の方法。

１７）ポリマーが、 （４）　グリシジルメタクリレートおよび／またはアリ
ルグリシジルエーテル、 ＣＢ）　　ＮＵＮ’−メチレン−ビス−メタクリルアさ
ド、および （Ｑ　メタクリルアミド のコポリマーであることからなる前記１６項記載の方法
。

１８）粒子が直径的１００〜３００μｍを有しておりか
つ直径約α０２〜１２μ偽の細孔を含有することからな
る前記１７項記載の方法。

１９）固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼの
存在下にポリヌクレオチドの加りん酸分解によりリボヌ
クレオチドジホスフェートを製造するにあたり、固形の
、水不溶性の、エポキシ活性化された有機ポリマー粒子
に共有結合により固定化されたポリヌクレオチドホスホ
リラーゼを使用することからなる方法。

【図面の簡単な説明】

第１図はＰＮＰアーゼ固定化反応におけるｐＨの作用を
示すプロットである。 第２図はポリリボヌクレオチド生成物の分子量に及ぼす
支持体細孔寸法および反応時間の影響を示すプロットで
ある。 特許出願人　　イー・アイ・デュポン・ド・ネモアース
ｅアンド・コンノセニー 図面の浄０（内荏に変更なし） 一〇−ｖｌ：、渇ｆ１ 一−−◆−−−収率χ ＦＩＧ、　１ 外２名 手 続 補 正 書（方式） 年ｌＯ月スＯ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有機ポ
   リマー粒子に共有結合により固定化されたポリヌクレオ
   チドホスホリラーゼ。 ２）ポリヌクレオチドホスホリラーゼを水溶液中ｐＨ４
   〜６で、固形の、水不溶性の、エポキシ活性化された有
   機ポリマー粒子と反応させることからなるポリヌクレオ
   チドホスホリラーゼの固定化法。 ３）固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼの存
   在下にヌクレオシドジホスヘートからポリリボヌクレオ
   チドを合成するにあたり、固形の、水不溶性の、エポキ
   シ活性化された有機ポリマー粒子に共有結合により固定
   化されたポリリボヌクレオチドホスホリラーゼを使用す
   ることからなる方法。 ４）固定化されたポリヌクレオチドホスホリラーゼの存
   在下にポリヌクレオチドの加りん酸分解によりリボヌク
   レオチドジホスヘートを製造するにあたり、固形の、水
   不溶性の、エポキシ活性化された有機ポリマー粒子に共
   有結合により固定化されたポリヌクレオチドホスホリラ
   ーゼを使用することからなる方法。