HUT50865A - Process for production of immobilizated on epoxiactivated bed polinucleotid phosphorilase - Google Patents

Process for production of immobilizated on epoxiactivated bed polinucleotid phosphorilase Download PDF

Info

Publication number
HUT50865A
HUT50865A HU893131A HU313189A HUT50865A HU T50865 A HUT50865 A HU T50865A HU 893131 A HU893131 A HU 893131A HU 313189 A HU313189 A HU 313189A HU T50865 A HUT50865 A HU T50865A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
polymer
epoxy
particles
microns
activated
Prior art date
Application number
HU893131A
Other languages
English (en)
Inventor
John J Moran
Original Assignee
Du Pont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
Publication of HUT50865A publication Critical patent/HUT50865A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/084—Polymers containing vinyl alcohol units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/087—Acrylic polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány tárgya immobilizáit polinukleotid-foszforiláz (PNP-áz).
A polinukleotid-foszforiláz egy bakteriális enzim, amely katalizálja az egyszálu poliribonukleotid (más néven poliribonukleozid-monofoszfát, poliNMP vagy 67273-1739/SL • ··· ····
- 2 NMPn) ribonukleotid-difoszfátokból (NDP) történő szintézisét magnéziumionok jelenlétében:
NDP + (ΝΜΡ)η_χ --------> (NMP)n + Pi ahol n értéke egész szám és
P^ a foszfátiont jelölik. Minden egyes NDP az előzőleg kialakított poliribonukleotid (NMP)n_| szabad 3'-hidroxil terminuszához kapcsolódik. A reakció beindításához gyakran egy primer (NMP)n_i szálat alkalmaznak. A reakció egyensúlya a foszfátion koncentráció növelésével eltolható a poliribonukleotidlánc letörése irányába. így a PNP-áz felhasználható a poliribonukleotidok foszforoizisének katalizálására, amelynek során ribonukleozid-difoszfátok keletkeznek, valamint a poliribonukleotidoknak ribonukleozid-difoszfátból történő előállításának katalizálására.
Az alkalmazott poliNMP lehet egy természetes, egyszálu ribonukleinsav (ssRNS), vagy egy ssRNS homopolimer vagy kopolimer, igy poliinozinsav (poli I), policitidilsav (poli C) vagy policitidil/uridilsav (poli C,U).
A poli I és poli C vagy poli C,U olyan kettősszámu ribonukleinsavvá (dsRNS) kapcsolható össze, amely alkalmas az interferon bevezetésére és vírusos fertőzések vagy rák kezelésére (4 130 641. számú USA-beli szabadalmi leírás és 113 162. és 213 921. számú európai közrebocsátási irat).
A szintézist és a foszforolizis reakciót a PNP-ázzal általában oldatban hajtják végre szabad enzim formájában.
• « ·
Emellett azonban a PNP-áz különböző oldhatatlan anyagokon, igy nitrocellulóz szűrőn, cellulóz gyöngyökön, mercerezett cellulózon, Sepharose 4B poliszaccharidon, hidrazid agarózon, diazotált p-amino-benzol-szulfoniletil (ABSE) agarózon, ABSE Sephadex G-200-οη és ABSE cellulózon immobilizálható (Boyer: The Enzymes, 3. kiadás, 15. kötet,
8. fejezet, 546. oldal /1982/). Az immobilizált PNP-áz előnye az oldható enzimmel szemben, hogy a foszforolizissel szemben a polimerizálást előnyben részesítő pH körülmények között javul a polimerizálás kitermelése, egyszerűbb a reakcióterméknek az enzimtől történő elválasztása, és az enzim többször felhasználható. Thang és munkatársai (Biochemical and Biophysical Research Communications, 31. kötet, 1-8. oldal /1968/) nitrocellulóz szűrőn immobilizált PNP-ázt ismertetnek. Hoffmann és munkatársai (Biochemical and Biophysical Research Communications, 41. kötet, 3. szám, 710-714. oldal /1970/) CNBr-rel aktivált cellulózhoz kötött PNP-ázt ismertet, amely homopolinukleotidok előállításához alkalmazható. Smith és munkatársai (FEBS Letters, 30. kötet, 2. szám, 246-248 /1973/) mercerezett cellulózhoz vagy szepharózhoz vagy aminoalkilszilán üveggyöngyökhöz kötött PNP-ázt ismertet, amely egyszálu poliribonukleotidok előállításához alkalmazható. Soreq és munkatársai (Journal of Biological Chemistry, 252. kötet, 6885-6888 /1977/) CNBr-rel aktivált szepharózhoz kötött PNP-ázt ismertetnek, amely polinukleotidok foszforoliziséhez alkalmazhatók. Bachner és munkatársai (Biochemical and Biophysical Research Communications, 63. kötet, 2. szám, • · · · • · · · · · · ···
- 4 476-483 /1975/) polinukleotidok szintézisét ismertetik agarózon immobilizált PNP-ázzal. Yamauchi és munkatársai (Journal of Fermentation Technology, 64. kötet, 6. szám, 517-522 /1986/ és 64. kötet, 5. szám, 455-457 /1985/) különböző kovalens kötési módszerekkel porózus aminopropil-üvegen immobilizált PNP-ázt ismertetnek, ahol a glutáraldehid kötés segítségével kapott termék polinukleotidok, igy poli I és poli C gyakorlati előállításához alkalmazható. Először Yamauchi utal arra, hogy a PNP-áz CNBr-rel aktivált cellulózon és szilikagélen is immobilizálható, de ez a módszer nem teljesen kielégítő. Brentnall és munkatársai (Tetrahedron Letters,
25. szám, 2595-2596 /1982/) 8-klór-adenozin-difoszfát polimerizálását ismertetik cellulózon immobilizált PNP-áz segítségével. Vang és munkatársai (Biochemical and Biophysical Research Communications, 90. kötet,
2. szám, 606-614 /1979/) CNB-r-rel aktivált szepharózon immobilizált PNP-ázt ismertetnek, és megállapítják, hogy a kötőt enzim aktivitásának 70 %-át megőrzi NDP polimerizálása során. Cashion és munkatársai (Biotechnology and Bioengineering, XXIV. kötet, 493-423 /1982/;
Nucleic Acids Research, Symposium Series, 7. szám, 173-189 /1980/ és 4 379 843. számú USA-beli szabadalmi leírás) PNP-áz és más enzimek tritilezett agarózon vagy szepharóz gyöngyökön nem kovalens kötésekkel történő immobilizálását ismerteti. Ansberga és munkatársai (810 717. számú szovjet szabadalmi leírás) gamma-aluminium-hidroxidon immobilizált PNP-ázt ismertetnek, amely ···· · ···· ···· ···« • · · · · · • ί · · · · · • · · · · · ·· ··· · ··* · ·
- 5 polinukleozidok szintéziséhez felhasználható. Kratasyuk és munkatársai (Izv. Sib. Otd. Akad. SSSR, Ser. Bioi. Nauk. 2. kötet, 93-99 oldal /1978/) makropórusos mátrixon immobilizált PNP-ázt ismertetnek, amely polinukleotidok szintéziséhez és foszforoliziséhez felhasználható. Kumaree és munkatársai (Bioorg. Khim. 2. kötet, 700-707 /1976/) propionaldehidet tartalmazó szilokróm hordozón immobilizált PNP-ázt ismertetnek. A.D. Broom egy publikálatlan előadás keretén belül polinukleotid szintézisét ismerteti különböző hordozókon, igy cellulóz-származékon,poliakrilamidon és agarózon immobilizált PNP-áz segítségével, ahol a legjobb eredményeket az Affi-Gel 10 (Bio-Rad) és az agaróz szukcinimid-származéka hordozóként történő felhasználása esetén kapták. Mégjobb eredmények érhetők el, ha hordozóként a Sepharoz 4B benzil-származékát alkalmazták, amely a PNP-ázt kovalens kötések helyett inkább hidrofób kötésekkel rögzíti.
Az epoxi-aktivált szemcséket, vagyis aktív fehérjemegkötő csoportként oxirán csoportokat tartalmazó polimer szemcséket különböző enzimek immobilizálására alkalmazzák, amelyen belül azonban nem említik a PNP-áz immobilizálását (4 070 348., 4 190 713., 4 208 309., 4 247 643., 4 511 694. számú USA-beli szabadalmi leírás). Polimerként (A) kettős kötést és glicidilcsoportot tartalmazó monomer, (B) legalább két, gyökösen polimerizálható kettős kötést tartalmazó komonomer és (C) gyökösen polimerizálható és vízben oldódó komonomer ···· · ·«·· ···· ···· • · · · · · • · · · · · · * · · · · · • · ··· · ··· ·♦ polimerjét alkalmazzák. Ilyen polimer szemcséket forgalmaz Eupergit C kereskedelmi név alatt a Röhm Pharma GmbH.
A szemcséket a gyári leírás oxirán akrilgyöngyöknek nevezi, amelyek metakrilamid, Ν,N'-metilén-bisz-metakrilamid, glicidil-metakrilát és/vagy allil-glicidil-éter kopolimerizálásával állíthatók elő és amely az enzimeket nagy kitermeléssel (a szabad enzim aktivitásának 60-90 %-a) immobilizálja. A gyári ismertető kitér továbbá arra, hogy a fehérjék immobilizálása standard körülmények között pH = 7-8 tartományban végezhető el, de néhány fehérje, igy a pepszin megkötéséhez savas körülmények szükségesek, és utal arra, hogy egy adott enzim megkötésének optimális pH-ja 0 és 12 között változhat. Az Eupergit C négy változatban létezik, amelyek a szemcseméretben és a porozitásban különböznek. Az Eupergit C, C 30 N és C 250 L makropórusos gyöngy, amelynek átlagos átmérője mintegy 150, 30 és 250 mikrométer. A pórusok (csatornák és lyukak) átmérője mintegy 0,03, 0,04 és 0,15 mikrométer. Az Eupergit C 1 Z mintegy 1 mikrométer átlagos átmérőjű nem-porózus mikrogyöngy.
Ismertek egyéb, enzimek immobilizálására alkalmas epoxi-aktivált polimerek is. A Pharmacia Laboratories gyártmánya az epoxi-aktivált Sepharose 6B, a Riedel-de Haen gyártmánya a vinil-acetát és divinil-etilén-karbamid alapú és felületén az acetátcsoportok oxiráncsoporttal történő hidrolízisével módosított VA-epoxi bioszint gyöngy, amelynek átmérője mintegy 50-200 mikrométer, a pD^sok mérete mintegy 0,03 mikrométer.
• <
- 7 A 3 844 892. és 3 932 557. számú USA-beli szabadalmi leírások enzimek epoxi-tartalmu kopolimeren történő immobilizálását ismertetik, ahol a kopolimer előállításához az 1,2-epoxi-csoportokat tartalmazó és terminálisán telítetlen monomert olefin-monomerrel, igy akril-nitrillel, metakril-nitrillel, metil-akriláttal vagy metil-metakriláttal reagáltatnak. Az első monomer előállításához diepoxidot, igy biszfenol A diglicidil-éterét difunkcionális olefinnel, igy akrilsavval vagy metakrilsavval reagáltatjak.
A 4 582 860. és 4 612 288. számú USA-beli szabadalmi leírások enzimek epoxi-aktivált polimergyöngön történő immobilizálását ismertetik, ahol a polimergyöngyök előállításához oxirán-tartalmu monovinil monomert, igy glicidil-akrilátot vagy metakrilátot vagy allil-glicidil-étert trivinil-monomerrel, igy trimetilol-propán-trimetakriláttal kopolimerizálnak.
Bár az immobilizált PNP-áz poliribonukleozidok szintézise során egy sor előnnyel rendelkezik a szabad enzimmel összehasonlítva, egyes hordozókon történő immobilizálás problémákat vethet fel, igy az enzimaktivitás csökkenése vagy a polimerizálás során az enzimnek a hordozóról történő leszakadása. így például az enzimeknek CNBr-rel aktivált szepharózról történő leszakadásának problémájával foglalkoznak Schnapp és munkatársai (Biochemical and Biophysical Research Communications, 70. kötet, 1 (1976)) és a probléma megoldásához amin helyett hidrazint vagy hidrazidot tartalmazó hordozóanyagokat javasolnak.
···· ··«· · · • · « · · · ο • · · · · · ·· ··« · ··· ·♦
- 8 Azt találtuk, hogy szilárd, vízben oldhatatlan és epoxi-aktivált polimer hordozó részecskéken immobilizált PNP-áz megtartja fajlagos aktivitását a 0,3-0,8 U/g tartományon belül, a poliribonukleotid szintézis standard körülményei között (pH = 9, 37 °C) 10 recirkuláltatás után a leszakadás aránya legfeljebb 5 %, általában legfeljebb 1 % és a tízszeres felhasználás után eredeti aktivitásának legalább 90 %-át megőrzi. A fajlagos aktivitás az 1 g hordozóanyagra (nedves tömeg) számított PNP-áz aktivitás. Egy egységnek (U) felel meg az az aktivitás, amely a később leirt vizsgálati körülmények között 1 perc alatt 1 mikromól szervetlen foszfátot termel. Különösen meglepő az alacsony leszakadási arány, mivel a PNP-áz három polipeptid alegységből álló trimer vegyület. Nem ismeretes viszont, hogy vajon mind a három alegység kovalens kötéssel kapcsolódik-e az epoxi-aktivált hordozó szemcséihez.
Felismertük továbbá, hogy az immobilizálási reakció kitermelése erősen függ a reakcióelegy pH-jától. A PNP-áz és sok más enzim immobilizálását általában mintegy
8-10 közötti lúgos pH-π végzik. Ez megfelel annak a tartománynak, amelyen belül a poliribonukleotid szintézist is végzik. Korábban feltételezték, hogy a PNP-áz konformációjának elkerülése érdekében az immobilizálást megközelítőleg ugyanazon a pH-η kell végezni, mint a szintézist. Azt találtuk, hogy az immobilizálás az epoxi-aktivált hordozón bármely pH = 4-9 közötti pH-η megvalósítható, a kitermelés lényegesen jobb, ha mintegy pH = 4-6 tartományon belül dolgozunk.
Azt találtuk továbbá, hogy a nukleozid-difoszfátok poliribonukleotidokkal végzett immobilizált PNP-áz-zal katalizált reakciójával kapott poliribonukleotidok lánchossza (móltömege) a hordozó szemcsék pórusméretétől és a reakcióidőtől függ. Nagyobb pórusméret esetén a reakció első szakaszában (mintegy első 30 %-ában) alacsonyabb móltömegü poliribonukleotidokat kapunk. így adott móltömegü poliribonukleotid előállításához megfelelő pórusméretü hordozóanyagra és megfelelő reakcióidőre van szükség.
Az 1. ábrán lévő grafikon a pH hatását mutatja be a PNP-áz immobilizálási reakcióban.
A 2. ábrán lévő grafikon a hordozóanyag pórusméretének és a reakcióidőnek a poliribonukleotid termék móltömegére gyakorolt hatását mutatja be.
Epoxi-aktivált hordozó szemcseként (gyöngyként) bármely természetes vagy szintetikus polimer vagy kopolimer felhasználható, amely önmagában vagy megfelelő kezelés hatására epoxidcsoportot (oxiráncsoportot) tartalmaz, amely a fehérje reaktív nukleofil funkcionális csoportjai, például amin, szulfhidril, alkohol, sav, amid vagy aromás csoportjai számára jól hozzáférhető. Az epoxicsoport a polimer szintéziséhez alkalmazott monomer vagy komonomer részét képezi vagy epoxid tartalmú vegyülettel reagálva kovalens kötéssel a kész polimerhez kapcsolható.
A fenti polimer az alábbi képlettel ábrázolható:
polimer-X-(CH2)m-CH--CH2
A képletben m értéke 0 vagy 1-5 közötti egész szám,
X jelentése oxigénatom, kénatom vagy nitrogénatomot, foszforatomot, kénatomot vagy szénatomot tartalmazó csoport.
A találmány értelmében alkalmazható természetes polimerekre példaként említhető az epoxi-aktivált poliszaccharid, igy agaróz vagy szepharóz.
Szintetikus polimerként alkalmazhatók az epoxi-aktivált poliakrilátok, polimetakrilátok , poliakrilamidok, polimetakrilamidok, polivinilacetátok és polivinilalkoholok. Ezen belül előnyösen alkalmazhatók a 4 070 348., a
190 713., 4 208 309., 4 247 643. és 4 511 694.,
844 892. és 3 932 557., 4 582 860. és 4 612 288. számú USA-beli szabadalmi leírásokban ismertetett polimerek. A kereskedelmi forgalomban lévő termékek közül említhető a VA-Epoxy Biosynth (Crescent Chemical Company), Eupergit C (Roehm Pharma) és epoxi-aktivált szepharóz (Pharmacia Laboratories).
A hordozó átlagos szemcsemérete nem játszik szerepet, értéke általában mintegy 1-1000 mikrométer. A szemcsék általában nem porózusak vagy átlagosan mintegy 0,01-1 mikrométer átmérőjű pórusokat (csatornákat és lyukakat) tartalmaznak. A mintegy 10-500 mikrométer átlagos és mintegy 0,02-0,5 mikrométer átlagos átmérőjű pórusokat tartalmazó részecskék előnyösen alkalmazhatók a mintegy ··· · »«·· ··· · ···· • · · · · · * · · · · · · • · · · · · ·· ·«« · ··· ·»
- 11 200-1000 nukleotidot tartalmazó poliribonukleotidok előállításához. Az ssRNS esetében ez a lánchossz a legelőnyösebb magas farmakológiai hatással és alacsony toxicitással rendelkező dsRNS-ek előállításához. A legelőnyösebbek a mintegy 100-300 mikrométer szemcseméretü és mintegy 0,02-0,2 mikrométer átmérőjű pórusokat tartalmazó hordozók.
A PNP-áz-nak az epoxi-aktivált gyöngyökön történő immobilizálásához a gyöngyöket PNP-áz vizes puffer oldatával keverjük, savval a kívánt pH értékre állítjuk és a keveréket néhány órán (10-40 órán) keresztül, előnyösen lassú kevertetés közben pihentetjük. Mint említettük, az immobilizálás pH = 4-9 tartományban végrehajtható, de optimális fajlagos aktivitás és kitermelés érdekében előnyösen pH = 4-6 tartományban dolgozunk. Kívánt esetben a gyöngyök a PNP-áz-zal történő összekeverés előtt pufferben duzzaszthatók. Az immobilizálási reakcióhoz a pH = 4-6 tartományba eső pufferek közül többet megvizsgáltunk.
Azt találtuk, hogy az acetát és foszfát pufferekkel összehasonlítva jobb kitermelés érhető el a 4-morfolin-etán-szulfonsav (MES) pufferrel.
A találmány tárgyát közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be, amelyek során a következő általános vizsgálati módszereket alkalmazzuk.
Enzimvizsgálat
Az oldott és az immobilizált PNP-áz enzimatikus aktivitását úgy határozzuk meg, hogy az enzimet (mintegy 25 U/ml) 37 °C hőmérsékleten 15 percen keresztül 0,1 mól/1 trisz-puffért (pH = 9,0), 20 mmól/1 adenozin-difoszfátot (ADP) és 5 mmól/1 magnézium-dikloridot tartalmazó oldatban • · • ·· · ···· ··«· ···· • ♦ · • · · · · • · · • ··· ·♦
- 12 inkubáljuk. A reakció során keletkező szervetlen foszfátot Bencini és munkatársai (Anal. Biochem. 132. kötet, 254-258 /1983/) módszerével mérjük. Egy egység PNP-áz aktivitásnak felel meg az az aktivitás, amely a vizsgálat körülményei között 1 perc alatt 1 mikromól szervetlen foszfátot termel.
HPLC analízis
A HPLC analízist Hewlett-Packard 1090 M HPLC berendezésen UV detektorral és DuPont GF-250 oszloppal végezzük. Az eluens 0,2 mól/1 NazHPO^ (pH = 7,0) a térfogatáram 2 ml/perc. A polinukleotidokat és a nukleozid-difoszfátokat a fenti körülmények között választjuk el.
1. példa
Oxirán akril gyöngyön immobilizált PNP-áz
Eupergit C 250 L oxirán akril gyöngyöket 15 percen keresztül 50 ml (0,1 mól/liter) MES pufferben (pH = 5,9) duzzasztunk. A felüluszót leöntjük és a gyöngyöket háromszor 75 ml MES pufferral mossuk. Ezután 46,5 ml
3,2 U/ml koncentrációjú PNP-áz oldatot adunk hozzá; oldószer 10 mmól/1 HC1 (pH = 8,2), 1 mmól/1 EDTA, 1 mmól/1 2-merkapto-etanol és 50 térfogat% glicerol.
(A glicerol a kereskedelmi forgalomban lévő PNP-áz oldatban található a fagyás elkerülése érdekében, az EDTA és a 2-merkapto-etanol konzerválószerként szolgál.) A reakcióelegyet In sósavval pH = 5,9 értékre állítjuk és a szuszpenziót 30 órán keresztül lassan forgatjuk. Ezután a gyöngyöket hagyjuk leülepedni és a felüluszót leöntjük. A gyöngyöket háromszor 5 ml 0,1 mól/liter • · · • ··«· ·«·· ···· ·· · · · • · · · · · • · · · ·· · « · β· ··
- 13 MES pufferrel (pH = 5,5) és négyszer 5 ml 0,1 mól/liter trisz-hidroxi-metil-amino-metán (trisz) pufferrel (pH = 8,0) mossuk. A gyöngyök (nedves tömeg 235 g)
93,5 egység (kitermelés 62 %) PNP-áz aktivitást mutatnak. Egy órán keresztül 4 °C hőmérsékleten tárolva az immobilizált PNP-áz több mint 95 %-ban megtartja eredeti aktivitását. Magasabb hőmérsékleten tárolva (37 °C, 13 óra) eredeti aktivitását több mint 95 %-ban megtartja. Ugyanilyen körülmények között az oldott enzim eredeti aktivitásának csupán mintegy 70 %-át mutatja.
2. példa
Epoxi-aktivált szepharőz gyöngyökön immobilizált
PNP-áz
0,1 g epoxi-aktivált szepharőz gyöngyöket (Pharmacia Laboratories) 15 percen keresztül vízben duzzasztunk, majd kétszer 1 ml 0,1 mól/liter MES pufferrel (pH = 5,5) mossuk. A feluluszót leöntjük és a gyöngyöket 0,25 ml
3,4 U/ml koncentrációjú PNP-áz oldattal elegyítjük, oldószer 10 mmól/liter trisz-HCl (pH = 8,2), 1 mmól/liter EDTA, 1 mmól/liter 2-merkapto-etanol és 50 térfogat% glicerol. A szuszpenziót 24 órán keresztül óvatosan rázzuk. A gyöngyöket háromszor 5 ml 0,1 mól/liter MES pufferrel (pH = 5,5) és háromszor 5 ml 0,1 mól/liter trisz pufferrel (pH = 8,0) mossuk. A gyöngyök (nedves tömeg 0,8 g) 0,24 egység (kitermelés 30 %) PNP-áz ···« *«·* ···· · · · * • · · • «·· « • · · · · · • · · · * »·» »·
- 14 aktivitást mutatnak.
3. példa
Epoxi-aktivált polivinilalkohol gyöngyön immobilizált PNP-áz
0,11 g epoxi-aktivált polivinilalkohol gyöngyöt (VA-Epoxy Biosynth, Riedel-de Haen) 1 ml 0,1 mól/liter MES pufferben (pH = 5,9) 15 percen keresztül duzzasztunk. A .felüluszot leöntjük és a maradékot 0,37 ml 1,2 U/ml koncentrációjú pufferolt PNP-áz oldattal elegyítjük, ahol az oldószer 10 mmól/liter trisz-HCl (pH = 8,2), 1 mmól/liter EDTA, 1 mmól/liter 2-merkapto-etanolt és 50 térfogat% glicerol. A szuszpenziót 24 órán keresztül óvatosan rázzuk. A gyöngyöket hagyjuk leülepedni és a felüluszot leöntjük. A gyöngyöket háromszor 1 ml 0,1 mól/liter MES pufferrel (pH = 5,5), 1 ml 0,1 mól/liter trisz-pufferrel (pH = 8,0) és 1 ml 1,0 mól/liter trisz-pufferrel (pH = 9,0) mossuk. A kapott gyöngyök (nedves tömeg 0,36 g) 0,24 egység (kitermelés 53 %) PNP-áz aktivitást hordoznak.
4, példa
Fehérjekimosás oxirán akril gyöngyökön immobilizált PNP-áz esetében
2,16 g nedves tömegű és 51,7 mg fehérjét tartalmazó Eupergit C 250 L oxirán akril gyöngyön immobilizált PNP-ázt 7,5 ml 0,1 mól/liter trisz-pufferben (pH = 9,0), amely 5 mmól/liter magnézium-kloridot és 20 ml dinátrium- ···· · ·*· *··· · ♦ · « 4 · * ·* • 44 ·*·· • · · · · · •4 ·*· * ··»··
-hidrogén-foszfátot tartalmaz, felveszünk és a szuszpenziót szobahőmérsékleten óvatosan rázzuk. Időnként
0,1 ml-es részletet kiveszünk és a fehérjetartalmat bikinchoninsavas (BCA) módszerrel vizsgáljuk (Smith:
Anal. Biochem. 150. kötet, 76-85 /1985/).
Idő/h/____Fehérjekoncentráció /zug/ml/ Göngyölt fehérjeveszt.
/%/
0 55,4 0,80
1 56,5 0,81
' 2 58,6 0,83
4 69,8 0,97
24 73,9 1,01
48 76,2 1,03
72 78,3 1,04
144 79,9 1,05
168 80,1 1,05
A fehérjeháttér figyelembevételével a fenti körülmények között 7 nap alatt az immobilizált fehérjének kevesebb, mint 0,3 %-a mosódik ki.
5. példa
Polinukleotidok immobilizált PNP-ázzal történő előállítása
3,75 g nedves tömegű és 1,9 egység enzimaktivitást mutató Eupergit C 250 L oxirán aktilgyöngön immobilizált PNP-áz 40 ml 0,1 mól/liter trisz-pufferben (pH = 9,0) felvett szuszpenziót, ahol az oldószer 20 mmól/liter inozin-difoszfátot (IDP) és 5 mmól/liter magnézium-kloridot
- 16 tartalmaz, 42 órán keresztül 25 °C hőmérsékleten óvatosan rázunk. Az immobilizált PNP-ázt szűrjük és háromszor 13,3 ml 0,1 mól/liter trisz-pufferrel (pH = 9,0) mossuk.
Az egyesített szürleteket 0,2 mikrométeres szűrőn áthajtjuk és Amicon PM-10 ultraszüróvel (10 000 móltömegre beállított membrán) felszerelt Nucleopore sejtszürő berendezésbe töltjük. Az oldatot 41 x 10^ Pa nitrogénnyomás alatt 2 ml visszamaradó térfogatig szűrjük. Ezt háromszor hígítjuk és 2 ml alatti térfogatra koncentráljuk. A hígításhoz először 80 ml 0,1 mól/liter EDTA oldatot (pH = 7,5), másodszor 80 ml 0,1 mól/liter kálium-acetát oldatot (pH = 7,5), harmadszor 80 ml vizet alkalmazunk. A maradékot 20 ml vízben oldjuk. HPLC analízis szerint a poliinozinsav kvantitative a maradékban maradt (összkitermelés 50-55 %), mig a nukleozid-difoszfát és más kis móltömegü vegyületek a szürletbe kerültek. A polinukleotid vizes oldata liofilizálható, kicsapható vagy tovább reagáltatható. A feltárt immobilizált enzim több mint 90 %-ban megőrizte eredeti aktivitását és polinukleotid előállítására további tizenöt esetben felhasználható.
Az IDP helyett a megfelelő ribonukleotid-difoszfátot alkalmazva más homopolimer és kopolimer poliribonukleotidok is előállithatók a fenti módon. így például poli szintetizálható citidin-fifoszfát és uridin-difoszfát 12:1 mólarányu keverékének alkalmazásával.
A leirt módon poli I-t szintetizálunk Eupergit C-n vagy Eupergit C 250 L-en immobilizált PNP-áz segítségével ···· · ···· ···· *··<!
• «· · · ·
V · » ··* · • · · · · · «· ·*· « ··· ··
- 17 (a hordozó átlagos pórusmérete 30 nanométer vagy 160 nanométer). Az előállított poli I móltömegét kizárásos HPLC vizsgálattal mérjük. Mint a 2. ábráról látható, 30 % alatti konverzió esetén a nagyobb móltömegü polimer Eupergit C alkalmazásával, mig 30 % feletti konverzióknál a nagyobb móltömeg Eupergit C 250 L alkalmazásával állít ható elő.

Claims (19)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Kovalens kötésekkel immobilizált polinukleotid foszforiláz készítmény, azzal jellemezve , hogy hordozóanyagként szilárd, vízben oldhatatlan, epoxi-aktivált szerves polimer részecskéket tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve , hogy polimerként epoxi-aktivált poliszaccharidot, poli(met)akrilátot, poli(met)akrilamidot, polivinilacetátot, vagy polivinilalkoholt tartalmaz.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve , hogy polimerként mintegy 1-1000 mikrométer átlagos szemcseméretü és mintegy 0,01-1 mikrométer átlagos pórusátmérőjü oxirán akril homopolimert vagy kopolimert tartalmaz.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve , hogy mintegy 10-500 mikrométer átlagos szemcseméretü és mintegy 0,02-0,5 mikrométer átlagos pórusátmérőjü részecskéket tartalmaz.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve , hogy polimerként (A) glicidilcsoportot és kettős kötést tartalmazó monomer, (B) legalább két gyökösen polimerizálható kettős kötést tartalmazó komonomer és (C) gyökösen polimerizálható vízben oldódó komonomer kopolimerjét tartalmazza.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve , hogy polimerként ···· ··*· ···« ··*· • · * «· ··· · • * ··· ·*
    - 19 (A) glicidil-metakrilát és/vagy allil-glicidil-éter, (Β) N,N'-metilén-bisz-metakrilamid és (C) metakrilamid kopolimerjét tartalmazza.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy mintegy 100-300 mikrométer szemcseméretű és mintegy 0,02-0,2 mikrométer pórusátmérőjü részecskéket tartalmaz.
  8. 8. A 3. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy polimerként epoxi-aktivált polivinilalkoholt tartalmaz.
  9. 9. Eljárás polinukleotid foszforiláz immobilizálására, azzal jellemezve , hogy a polinukleotid foszforiláz pH = 4-6 éprtékü vizes oldatát szilárd, vízben oldhatatlan epoxi-aktivált szerves polimer részecskéivel reagáltatjuk.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 4-morfolin-etán-szulfonsav pufferben végezzük.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy polimerként oxirán akril vagy epoxi-aktivált polivinilalkoholt alkalmazunk, amelyek átlagos szemcsemérete mintegy 100-300 mikrométer, pórusátmérője mintegy 0,02-0,2 mikrométer.
  12. 12. Eljárás poliribonukleotidok nukleozid difoszfátokból történő előállítására immobilizált polinukleotid foszforiláz jelenlétében, azzal jellemezve , hogy szilárd, vízben oldhatatlan epoxi-aktivált szerves polimer ···· · ·»ο· ··*· ···· • ·· · · · • · · ··· · « · · * · · ·· ··· 9 ··· ··
    - 20 részecskéken kovalens kötéssel immobilizált poliribonukleotid foszforilázt alkalmazunk.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polimerként epoxi-aktivált poliszaccharidot, poli(met)akriIátót, poli(met ) akrilamidot, polivinilacetátot vagy polivinilalkoholt alkalmazunk.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy polimerként oxirán akril homopolimert vagy kopolimert alkalmazunk, ahol a részecskék átlagos szemcsemérete mintegy 1-1000 mikrométer, pórusátmérője 0,01-1 mikrométer.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy mintegy 10-500 mikrométer átlagos szemcseméretü és mintegy 0,02-0,5 pórusátmérőjü részecskéket alkalmazunk.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy polimerként (A) glicidilesöpörtót és kettős kötést tartalmazó monomer, (B) legalább két, gyökösen polimerizálható kettős kötést tartalmazó komonomer és (C) gyökösen polimerizálható vízben oldódó komonomer kopolimerjét alkalmazzuk.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy polimerként (A) glicidil-metakrilát és/vagy allil-glicidil-éter, (B) N,N'-metilén-bisz-metakrilamid és (C) metakrilamid kopolimerjét alkalmazzuk.
    ···· ···· ···· ···· • ·· · · · • · · ·Μ t • · · · · · ·· *·· · ··· ··
  18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy mintegy 100-300 mikrométer átlagos szemcseméretü és mintegy 0,02-0,2 mikrométer pórusátmérőjü részecskéket alkalmazunk.
  19. 19. Eljárás ribonukleotid-difoszfátok előállítására polinukleotidok immobilizált polinukleotid-foszforiláz jelenlétében végzett foszforolizisével, azzal jellemezve , hogy szilárd, vízben oldhatatlan epoxi-aktivált s’zerves polimer részecskéken kovalens kötéssel immobilizált polinukleotid-foszforilázt alkalmazunk.
HU893131A 1988-06-16 1989-06-16 Process for production of immobilizated on epoxiactivated bed polinucleotid phosphorilase HUT50865A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US20819488A 1988-06-16 1988-06-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT50865A true HUT50865A (en) 1990-03-28

Family

ID=22773602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU893131A HUT50865A (en) 1988-06-16 1989-06-16 Process for production of immobilizated on epoxiactivated bed polinucleotid phosphorilase

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0346865A3 (hu)
JP (1) JPH02109979A (hu)
KR (1) KR910005628B1 (hu)
AU (1) AU3653789A (hu)
DK (1) DK296089A (hu)
FI (1) FI892939A (hu)
HU (1) HUT50865A (hu)
IL (1) IL90600A0 (hu)
NO (1) NO892497L (hu)
PT (1) PT90886A (hu)
ZA (1) ZA894605B (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5943690A (en) * 1989-07-03 1991-01-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Polynucleotide phosphorylase immobilized on tris(hydroxymethyl)methylacrylamide polymer beads
EP0562373A3 (en) * 1992-03-23 1994-05-25 Siemens Ag Immobilisation of biochemical substances
DE4333674A1 (de) * 1993-10-02 1995-04-06 Merck Patent Gmbh Nukleotidhaltiges Sorbens für die Affinitätschromatographie
DE19653730C2 (de) * 1996-12-11 1999-06-24 Schering Ag Immobilisierte Proteine aus Rohextrakt und deren Verwendung zur Umsetzung von Estern
US5905024A (en) * 1996-12-17 1999-05-18 University Of Chicago Method for performing site-specific affinity fractionation for use in DNA sequencing
CN1334872A (zh) * 1998-12-10 2002-02-06 宝酒造株式会社 将寡核苷酸固定在载体上的方法
ATE371021T1 (de) * 2003-01-16 2007-09-15 Adorkem Technology Spa Immobilisierte biokatalysatoren für die herstellung von natürlichen nukleosiden und modifizierten analogen durch enzymatische transglykosylierungsreaktionen
BR112023001947A2 (pt) * 2020-08-05 2023-04-11 Oncovir Inc Produção escalonável de polirribonucleotídeos de tamanho controlado

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4210723A (en) * 1976-07-23 1980-07-01 The Dow Chemical Company Method of coupling a protein to an epoxylated latex
US4208309A (en) * 1977-05-20 1980-06-17 Rohm Gmbh Pearl polymer containing hollow pearls
DE3136940A1 (de) * 1981-09-17 1983-03-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt "verfahren zur herstellung von 5'-ribonucleotiden"
US4582860A (en) * 1983-12-15 1986-04-15 Rohm And Haas Company Oxirane resins for enzyme immobilization

Also Published As

Publication number Publication date
ZA894605B (en) 1991-02-27
NO892497L (no) 1989-12-18
FI892939A (fi) 1989-12-17
NO892497D0 (no) 1989-06-15
EP0346865A2 (en) 1989-12-20
KR910001042A (ko) 1991-01-30
FI892939A0 (fi) 1989-06-15
JPH02109979A (ja) 1990-04-23
IL90600A0 (en) 1990-01-18
EP0346865A3 (en) 1990-09-12
DK296089A (da) 1989-12-17
PT90886A (pt) 1989-12-29
AU3653789A (en) 1989-12-21
KR910005628B1 (ko) 1991-08-01
DK296089D0 (da) 1989-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108384767B (zh) 转氨酶突变体及其应用
US4247642A (en) Enzyme immobilization with pullulan gel
Nilsson et al. [3] Tresyl chloride-activated supports for enzyme immobilization
EP0565978B1 (de) Aktivierte Trägermaterialien, ihre Herstellung und Verwendung
JP7105307B2 (ja) トランスアミナーゼ突然変異体及びその応用
CA2197479A1 (en) Compositions for enzyme catalyzed template-independent creation of phosphodiester bonds using protected nucleotides
JP4003093B2 (ja) 糖類の製造方法
Benčina et al. Enzyme immobilization on epoxy‐and 1, 1′‐carbonyldiimidazole‐activated methacrylate‐based monoliths
Marek et al. Invertase immobilization via its carbohydrate moiety
US7273934B2 (en) Three-branched sugar-chain asparagine derivatives, the sugar-chain asparagines, the sugar chains, and processes for producing these
HUT50865A (en) Process for production of immobilizated on epoxiactivated bed polinucleotid phosphorilase
US3850749A (en) Preparation of oligoribonucleotides
Reddy et al. Immobilized nucleases
US4931476A (en) Crosslinked polymers and a process for their preparation
Bryjak et al. Effect of polymer matrix on penicillin acylase immobilization on copolymers of butyl acrylate and ethylene glycol dimethacrylate
JP2024513372A (ja) ポリスチレン系樹脂のアミノ化方法、及びアミノ化樹脂による酵素固定化方法
US4767620A (en) Crosslinked polymers with carbonate ester groups, and a process for their preparation
EP2316932B1 (en) Enzyme-functionalized supports
Trelles et al. Immobilization techniques applied to the development of biocatalysts for the synthesis of nucleoside analogue derivatives
WO1991000346A1 (en) Polynucleotide phosphorylase immobilized on tris(hydroxymethyl)methylacrylamide polymer beads
CN117535281B (zh) 一种氨基微球有序固定多酶的方法、其产物和应用
GB1597436A (en) Enzyme-immobilization carriers and preparation thereof
CA2002010A1 (en) Immobilized enzyme and a method for application thereof
SU689200A1 (ru) Способ получени водонерастворимых биологически активных соединений
JP2012050386A (ja) ２種類以上の多孔質充填剤を充填するカラム