NO892497L - Polynukleotid-fosforylase immobilisert paa epoxyaktiverte perler. - Google Patents
Polynukleotid-fosforylase immobilisert paa epoxyaktiverte perler.Info
- Publication number
- NO892497L NO892497L NO89892497A NO892497A NO892497L NO 892497 L NO892497 L NO 892497L NO 89892497 A NO89892497 A NO 89892497A NO 892497 A NO892497 A NO 892497A NO 892497 L NO892497 L NO 892497L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- epoxy
- immobilized
- particles
- approximately
- pnpase
- Prior art date
Links
- 101001066878 Homo sapiens Polyribonucleotide nucleotidyltransferase 1, mitochondrial Proteins 0.000 title claims description 60
- 102000002681 Polyribonucleotide nucleotidyltransferase Human genes 0.000 title claims description 60
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 title claims description 31
- 239000011049 pearl Substances 0.000 title 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 22
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 20
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 14
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- -1 nucleoside diphosphates Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 9
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 claims description 9
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 9
- RFJIPESEZTVQHZ-UHFFFAOYSA-N oxirane;prop-2-enoic acid Chemical group C1CO1.OC(=O)C=C RFJIPESEZTVQHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 6
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000003055 glycidyl group Chemical group C(C1CO1)* 0.000 claims description 3
- 229920000193 polymethacrylate Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 claims description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 claims 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 claims 2
- 102000009097 Phosphorylases Human genes 0.000 claims 1
- 108010073135 Phosphorylases Proteins 0.000 claims 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 24
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 10
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 8
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 7
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical group BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical group C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 4
- JPXZQMKKFWMMGK-KQYNXXCUSA-N IDP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 JPXZQMKKFWMMGK-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 3
- STMDPCBYJCIZOD-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-dinitroanilino)-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O STMDPCBYJCIZOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N bicinchoninic acid Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C=3C=C(C4=CC=CC=C4N=3)C(=O)O)=CC(C(O)=O)=C21 AFYNADDZULBEJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N bisphenol A Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N (2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-(6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolane-2-carboxylic acid Chemical compound [C@]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)(N1C=NC=2C(O)=NC=NC12)C(=O)O AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- TURITJIWSQEMDB-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-[(2-methylprop-2-enoylamino)methyl]prop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NCNC(=O)C(C)=C TURITJIWSQEMDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N CDP Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 ZWIADYZPOWUWEW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241001082241 Lythrum hyssopifolia Species 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N Methylacrylonitrile Chemical compound CC(=C)C#N GYCMBHHDWRMZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YCZVNBQAIZENBU-UHFFFAOYSA-N NC(=O)N.C(=C)C=CC=C Chemical compound NC(=O)N.C(=C)C=CC=C YCZVNBQAIZENBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKKRPWIIYQTPQF-UHFFFAOYSA-N Trimethylolpropane trimethacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC(CC)(COC(=O)C(C)=C)COC(=O)C(C)=C OKKRPWIIYQTPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N Uridinemonophosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOGRQMPFHUHIGU-UHFFFAOYSA-N Uridylic acid Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 FOGRQMPFHUHIGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- WWPJIPNLITVJIL-UUOKFMHZSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(6-amino-8-chloropurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphono hydrogen phosphate Chemical compound ClC1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O WWPJIPNLITVJIL-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N diglycidyl ether Chemical compound C1OC1COCC1CO1 GYZLOYUZLJXAJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229940028843 inosinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004245 inosinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- RPQRDASANLAFCM-UHFFFAOYSA-N oxiran-2-ylmethyl prop-2-enoate Chemical compound C=CC(=O)OCC1CO1 RPQRDASANLAFCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940085991 phosphate ion Drugs 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N uridine 5'-monophosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DJJCXFVJDGTHFX-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/084—Polymers containing vinyl alcohol units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/087—Acrylic polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår immobilisert polynukleotid-fosforylase (PNPase).
Polynukleotid-fosforylase er et bakterielt enzym som katalyserer syntesen av enkel-trådet polyribonukleotid (også benevnt polyribonukleosid-monofosfat, poly NMP eller NMP n)
fra ribonukleotid-difosfater (NDP) under tilstedeværelse av magnesiumioner:
hvor n er et helt tall og P^ angir fosfation. Hvert
NDP tilsettes sekvensielt til den frie 3<1->hydroxylterminal
av tidligere dannet polyribonukleotid (NMP)n_^. Ofte anvendes en start-tråd av (NMP)n_^ved begynnelsen av reaksjonen. Reaksjonslikevekten kan endres i retningen av nedbryt-ning av polyribonukleotid ved å øke konsentrasjonen av fosfationer. Således kan PNPase anvendes for å katalysere fosforolysen av polyribonukleotider for å danne ribonukleosid-difosfater såvel som å katalysere dannelsen av polyribonukleotider fra ribonukleosid-difosfater.
Poly-NMP kan være en naturlig forekommende enkel-trådet ribonukleinsyre (ssRNA) eller en homopolymer eller kopolymer ssRNA som polyinosinsyre (poly I), polycytidylsyre (poly C)
eller polycytidyl/uridylsyre (poly C, U). Poly I og poly C
eller poly C, U kan herdes til dannelse av dobbel-trådet ribonnukleinsyre (dsRNA) anvendelig for induksjon av interferon og i behandlingen av virusinfeksjoner og kreft,
som fremlagt f.eks. i US Patent 4 130 641 og European Published Applications 113 162 og 213 921.
Syntesereaksjonene og fosforolysereaksjonene utføres vanligvis med PNPasen i oppløsning som fritt enzym. Som beskrevet i Boyer, Editor, The Enzymes, 3dje utgave, volum XV, del 8, (1982), side 546, er PNPase imidlertid
immobilisert på forskjellige uoppløselige materialer som nitrocellulosefiltere, celluloseperler, mercerisert cellulose, Sepharose (r) 4B polysakkarid, hydrazid agarose, diazotisert p-aminobenzensulfonylethyl (ABSE) agarose, ABSE Sephadex
G-200 og ABSE cellulose. Boyer angir at den immobiliserte PNPase har fortrinn fremfor det oppløselige enzym; med noe understøttelse forbedres polymerisering under pH-betingelser som begunstiger polymerisering fremfor fosforolyse, adskillelse av reaksjonsprodukter fra enzym er forenklet, og enzymet kan resirkuleres flere ganger.
Thang et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 31, s. 1-8 (1968) fremlegger PNPase immobilisert på et nitrocellulosefilter. Hoffmann et al., Biochemical and Biophysical Research Communications,
Vol. 41, nr. 3, s. 710-714 (1970) fremlegger anvendelse av PNPase bundet til CNBr-aktivert cellulose for fremstilling
av homopolynukleotider. Smith et al., FEBS Letters, Vol. 30, nr. 2, s, 246-248 (1973) fremlegger anvendelse av PNPase
(r)
bundet til mercerisert cellulose eller Sepharose^ eller aminoalkylsilan-glassperler for fremstilling av enkel-trådete polyribonukleotider. Soreq et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 252, s. 6885-6888 (1977), fremlegger PNPase immobilisert på CNBr-aktivert Sepharose^ for fosforolyse av polynukleotider. Bachner et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 63, nr. 2, s. 476-483 (1975) nevner at polynukleotider ble syntetisert med PNPase immobilisert på agarose. Yamauchi et al., Journal of Fermentation Technology, Vol. 64, nr. 6, s. 517-522 (1986)
and Yamauchi et al., Journal of Fermentation Technology,
Vol. 64, nr. 5, s. 455-457 (1985) fremlegger PNPase immobilisert på aminopropyl-porøst glass ved hjelp av forskjellige kovalentbinding-fremgangsmåter, og angir at det erholdte produkt ved hjelp av glutaraldehyd-binding
er egnet for praktisk fremstilling av polynukleotider som poly-I poly-C. Yamauchi refererer også til tidligere fremgangsmåter for immobilisering av PNPase på CNBr-aktivert cellulose og på silikagel, men angir at disse fremgangsmåter ikke helt var tilfredsstillende. Brentall et al., Tetrahedron Letters, nr. 25, s. 2595-2596 (1986) fremlegger polymerisering av 8-kloroadenosin-difosfat ved anvendelse av PNPase immobilisert
på cellulose. Vang et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 90, nr. 2, s. 606-614 fremlegger
(r)
immobilisering av PNPase på CNBr-aktivert Sepharose^ og angir at det bundne enzym bibeholder 70 % av dets aktivitet ved polymerisering av NDP. Cashion et al., Biotechnology and Bioengineering, Vol. XXIV, s. 493-423 (1982), Cashion et al., Nucleic Acids Research, Symposium Series nr. 7, s. 173-189
(1980), og Cashion et al. US Patent 4 379 843 beskriver immobiliseringen av PNPase og andre enzymer på tritylert agarose eller Sepharose(^R)-perler ved hjelp av ikke-kovalent binding. Ansberga et al., USSR publiserte patentsøknad 810 717 fremlegger PNPase immobilisert i gamma-aluminium-hydroxyd for syntese av polynukleotider. Kratasyuk et al.,
Izv. Sib. Otd. Akad. SSSR. Ser. Biol. Nauk. Vol. 2,
s. 93-99 (1978) fremlegger PNPase immobilisert på en makro-porøs matrix for syntese og fosforolyse av polynukleotider. Kumarev et al., Bioorg. Khim., Vol. 2, s. 700-707 (1976) fremlegger immobilisering av PNPase på et propionaldehyd-inneholdende silokrom-støttemateriale. Broom, A.D., i en upublisert personlig meddelelse, beskriver polynukleotid-syntese-eksperimenter ved anvendelse av PNPase immobilisert på et antall forskjellige støttematerialer, innbefattet derivatisert cellulose, polyakrylamid og agarose; det kommersielt tilgjengelige støttemateriale som ga de beste
(r) resultater var Affi-Gel 10 (Bio-Rad), et succinimid-derivat av agarose, men enda bedre resultater ble erholdt med et (e) benzylderivat av Sepharose 4B, som bandt PNPase hydrofobisk istedet for kovalent.
Epoxy-aktiverte partikler, dvs. partikler av
polymerer som inneholder etylenoxyd-grupper som aktive protein-bindende grupper, har vært anvendt til immobilisering av forskjellige enzymer, men har ikke vært anvendt til immobilisering av PNPase. Kraemer et al. US patenter 4 070 348, 4 190 713, 4 208 309, 4 247 643 og 4 511 694 fremlegger partikler av denne type og deres anvendelse til å binde enzymer. Partiklene ifølge Kreamer et al. er sammensatt av kopolymerer av (A) en etylenisk umettet monomer med en glycidyl-gruppe, (B) en comonomer med minst to radikale polymeriserbare dobbeltbindinger, og (C) en radikal-polymeriserbar vannoppløslig comonomer. Rohm Pharma
GmbH markedsfører en familie av polymere partikler av typen fremlagt i patentene ifølge Kramer under varemerket Eupergit<®>C. Faglitteraturen fra Rohm Pharma beskriver partiklene som etylenoxyd-akrylperler fremstillt ved kopolymerisering av metakrylamid, N,N<1->metylen-bis-metakrylamid, glycidyl-metakrylat og/eller allyl-glycidyleter, og angir at enzymene kan immobiliseres på partiklene med høye utbytter (60-90 %) av aktiviteten av de frie enzymer). Rohm Pharma anbefaler at proteinimmobilisering under standard betingelser utføres ved pH 7-8, men anbefaler sure betingelser for binding av noen proteiner som pepsin, og indikerer at den optimale pH for binding av et hvert gitt enzym kan utvelges av et bredt område (pH 0-12). EupergitV-'C
er tilgjengelig i 4 variasjoner som adskiller seg i partikkel-(R>
størrelse og porøsitet. Eupergit^C, C 30 N, og C 250 L
er makroporøse perler med gjennomsmnittlig diametere på henholdsvis tilnærmet 150,30 og 250|>m, og porer (kanaler og hulrom) henholdsvis tilnærmet 0,03, 0,04 og 0,15 mi
(R)
diameter. Eupergit^ C 1 Z er ikke-porøse mikroperler med tilnærmet 1 jAm gjennomsnittlig diameter.
Andre selskaper tilbyr også epoxy-aktiverte partikler for immobilisering av enzymer. Pharmacia Laboratories tilbyr
epoxy-aktivert Sepharose^ 6B. Riedel-de Haén tilbyr VA-epoksy BIOSYNTH<®>vinylacetat-perler og divinyletylen-urea med en overflate modifisert ved hydrolyse av acetatgruppene med etylenoxydgrupper. VA-epoksyperlene har en diameter på tilnærmet 50-200 Jim og inneholder porer med tilnærmet diameter på 0,03/am.
Matthews US Patent 3 884 892 og 3 932 557 fremlegger immobilisering av enzymer på epoxy-inneholdende copolymerer fremstillt ved reaksjon av en monomer inneholdende en 1,2-epoxygruppe og terminalumettethet med en alken-monomer som acrylonitril, methakrylonitril, metylakrylat eller metyl-methacrylat. Den første monomer fremstilles ved å omsette et diepoksyd, som en diglycidyleter av bisfenol A, med et di-funksjonelt alken som akrylsyre eller methakrylsyre.
Bigwood US Patent 4 582 860 og 4 612 288 fremlegger immobilisering av enzymer på epoxy-aktiverte polymerperler fremstilt ved copolymerisering av en etylenoxyd-bærende monovinylmonomer, som glycidylacrylat eller methacrylat eller allylglycidyleter, med en trivinylmonomer som trimetylol-propantrimethacrylat.
Selv om immobilisering av PNPase tilveiebringer flere fordeler fremfor anvendelsen av fritt enzym for syntese av polyribonukleotider, kan immobilisering på visse støtte-materialer gi flere problemer, innbefattet tap av enzym-aktivitet ved immobilisering og lekking av enzym fra støtte-materialet under polymeriseringsbetingelsene. F.eks. refererer Schnapp et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 70, nr. 1 (1976) til problemet med lekking av
(r)
enzym fra CNBr-aktivert Sepharose^, og foreslår istedet anvendelse av støttemateriale som inneholder amin, hydrazin eller hydrazid for å dempe problemet.
Det er funnet at PNPase immobilisert på støttepartikler av en fast, vannuoppløselig epoxy-aktivert polymer utviser spesifikk aktivitet i området av 0,3-0,8 U/g, at PNPasen ut-vaskes fra støttematerialet i en mengde mindre enn tilnærmet 5 %, generellt mindre enn 1 %, ved kontinuerlig anvendelse i løpet av 10 resirkuleringer under standard polyribonukleotidsyntese-betingelser (pH 9, 37 °C), og at PNPasen bibeholder minst 90 % av dens opprinnelige aktivitet etter anvendelse 10 ganger for polyribonukleotidsyntese. Spesifikk aktivitet defineres som enheter av PNPase-aktivitet pr. gram støtte-materiale (våt vekt). En aktivitetsenhet (U) defineres som den aktivitet som vil danne 1^imol uorganisk fosfat i løpet av 1 minutt under analysebetingelsene beskrevet i det etter-følgende. Den lave utvaskningshastighet var uventet, fordi PNPase er en trimer som er sammensatt av tre polypeptid-underenheter. Det er ukjent hvorvidt alle tre underenheter er kovalent bundet til de epoxy-aktiverte støttepartikler.
Det er også funnet at utbyttet av immobiliserings-reaksjonen er sterkt avhengig av pH i reaksjonsblandingen. PNPase-immobilisering, såvel som immobilisering av mange andre enzymer, utføres vanligvis ved basisk pH i området av tilnærmet 8 til 10. Dette tilsvarer området hvor polyribonukleotid-syntese utføres. Det var tidligere antatt at immobilisering burde utføres ved tilnærmet den samme pH som syntesen for å unngå forandringer i PNPase-konformasjon. Det er funnet at, selvom immobiliseringen på epoxy-aktivert støttemateriale kan utføres hvor som helst i pH-området 4 til 9, er utbyttet vesentlig bedre i pH-området 4 til 6.
Det er også funnet at kjedelengden (molekylvekt) av polyribonukleotider erholdt ved immobilisert PNPase-katalysert reaksjon av nukleosid-difosfater med polyribonukleotider er avhengig av porestørrelsen av støttepartiklene såvel som av reaksjonstiden. Større porestørrelser resulterer i polyribonukleotider med lavere molekylvekt i løpet av det tidlige stadium (f.eks. tilnærmet de første 30 %) av reaksjon. Således kan et polyribonukleotid med ønsket molekylvektområde erholdes ved anvendelse av et støttemateriale med passende porestør-relse og passende reaksjonstid.
BESKRIVELSE AV FIGURENE
Figur 1 viser effekten av pH i PNPase-immobiliserings-reaksjonen. Figur 2 viser effekten av støttematerialets pore-størrelse og reaksjonstid på molekylvekt av polyribonukleotid-produktet.
De epoxy-aktiverte støttepartikler (perler) kan være enhver naturlig forekommende eller syntetisk polymer eller copolymer som inneholder eller er behandlet for å inneholde en epoxy (etylenoxyd)-gruppe som er tilgjengelig for en reaktiv nukleofil funksjonell gruppe av et protein, f.eks. et amin, sulfhydryl, alkohol, syre, amid, eller aromatisk karbon-gruppe. Epoxygruppen kan være en del av monomeren eller comonomeren anvendt i syntese av polymeren, eller den kan være kovalent bundet etter syntesen ved reaksjon av polymeren med en epoxy-inneholdende forbindelse. Slike polymerer kan representeres som følger:
hvor m er null eller et helt tall fra 1 til 5 og X er O eller S eller en gruppe inneholdende N, P, S eller C. Eksempler på egnede naturlig forekommende polymerer innbefatter epoxy-aktiverte polysakkarider som agarose og Sepharose (B). Syntetiske polymerer som kan anvendes innbefatter epoxy-aktiverte polyacrylater, polymethacrylater, polyacryl-amider, polymethac.rylamider, polyvinylacetater og polivinyl-alkoholer. Spesielt egnede patenter er 4 070 348, 4 190 713, 4 208 309, 4 247 643 og 4 511 694, Matthews US patenter
3 844 892 og 3 932 557 og Bigwoods US patenter 4 582 860 og
4 612 288 fra hvilke de kjente teknikker er inkorporerte heri. Egnede kommersiellt tilgjengelige materialer innbefatter VA-Epoxy Biosyntn(^ R) tilgjengelig fra Crescent Chemical Company,
(r) CS) Eupergir^ C fra Roehm Pharma, og epoxy-aktivert Sepharose^
fra Pharmacia Laboratories.
Gjennomsnittlig partikkelstørrelse av støttematerialet er ikke kritisk, men vil vanligvis være i området fra tilnærmet 1 til 1000fim. Partiklene kan være vesentlig ikke-porøse eller kan inneholde porer (kanaler og hulrom) med gjennomsnittlig diameter i området av tilnærmet 0,01 til 1 ^Urn. Partiklene med gjennomsnittlig størrelsesområde fra tilnærmet 10 til 500 |um inneholdende por.er med gjennomsnittlig diamter i området fra tilnærmet 0,02 til 0,5 |um, er foretrukket for fremstilling av polyribonukleotider med kjedelengder i området fra tilnærmet 200 til 1000 nukleotider. Dette er det foretrukne ssRNA-kjedelengde-område for fremstilling av dsRNA med høyere farmakologisk aktivitet og lavere toksisitet. Mest foretrukket for tiden er støttematerialer med gjennomsnittlig perlestørrelse i området fra tilnærmet 100 til 300 } a m og gjennomsnittlig porestørrelse i området fra tilnærmet 0,02
til 0,2 nm.
Immobilisering av PNPasen på de epoxy-aktiverte perler oppnås ganske enkelt ved å blande perlene med en vandig bufret oppløsning av PNPase, justering til den ønskede pH ved til-setning av syre, og hensettelse av blandingen i noen få timer (f.eks. 10-40), fortrinnsvis under forsiktig omrysting. Som angitt ovenfor kan immobiliseringen utføres ved pH i området 4 til 9, men pH i området 4-6 er foretrukket for å er-holde optimal spesifikk aktivitet og,utbytte. Hvis ønskelig kan perlene svelles ved bløtlegging i buffer før blanding med PNPase. Flere buffere ble testet for utførelse av immobili-seringsreaksjonen. I pH området 4-6, ble det funnet at anvendelse av 4-morfolinetansulfonsyre (MES)-buffer førte til bedre utbytter enn de erholdte med acetatbuffer og fos-fatbuffer.
I eksemplene nedenfor ble de følgende generelle fremgangsmåter anvendt.
Enzymanalyser
Den enzymatiske aktivitet av både den oppløselige og den immobiliserte form av PNPase ble målt ved å inkubere enzymet (ca. 25 U/mL) i en oppløsning inneholdende trisbuffer (0,1M, pH 9,0), adenosindifosfat (ADP, 20 mM), MgCl2(5mM)
ved 37 °C i 15 minutter. Det uorganiske fosfat dannet i reaksjonen måles ved hjelp av fremgangsmåten ifølge Bencini et al., Anal. Biochem. Vol. 132, s. 254-258 (1983). En aktivitetsenhet (U) av PNPase defineres som den aktivitet som vil danne et mikromol uorganisk fosfat i løpet av 1 minutt under analyse-bet ingelsene.
HPLC-analyse
HPLC-analyser ble utført på en Hewlett-Packard 1090 M HPCL utstyrt med en avsøkende UV-diodedetektor og en DuPont GF-250 størrelsesekskluderende kolonne. Elueringsmidlet er Na^HPO^ (0,2M, pH 7,0) ved gjennomstrømningshastighet på 2 mL/min. Polynukleotidene og nukleosid-difosfåtene adskilles under disse betingelser.
EKSEMPLER
Eksempel 1: PNPase immobilisert på etylenoxyd-acrylsyreperler
Æ)
Eupergit C 250 L etylenoxyd-acrylsyreperler ble svellet i MES-buffer (50mL, 0,1M, pH 5,9) i 15 minutter. Supernatanten ble dekantert og perlene ble vasket med MES-buffer (3 x 75 ml). En bufret oppløsning av PNPase (46,5 mL, 3,2 U/mL, tris:HCL
(10 mM, pH 8,2), EDTA (ImM), 2-mercaptoethanol (ImM), glycerol (50 % v/v)) ble tilsatt. (Glycerol er inkludert i kommersielt tilgjengelig PNPase-oppløsning for å forhindre frysing; EDTA og 2-mercaptoethanol er inkludert som konserveringsmidler).
PH av reaksjonsblandingen ble justert til 5,9 IN HC1 og suspensjonen ble sakte omveltet i 30 timer.
Perlene ble tillatt å falle til ro og supernatanten ble dekantert. Perlene ble vasket med MES-buffer (3 x 5 mL, 0,1 M,
pH 5,5) og trishydroxymethylaminometan (tris)-buffer (4 x 5 mL, 0,1 M, pH 8,0). Perlene ( 235 g våt vekt) ble funnet å inneholde 93,5 U av PNPase-aktivitet (62 % utbytte). Når lagret i en måned ved 4 °C, bibeholdt den immobiliserte PNPase mer enn 95 % av dens originale aktivitet. Videre bibeholdt den immobiliserte PNPase mer enn 95 % av dens originale aktivitet etter utsettelse for forhøyet temperatur (37 °C i 13 timer). Under de samme betingelser bibeholder det oppløselige enzym kun tilnærmet 70 % av dens originale akt ivitet.
Eksempel 2: PNPase immobilisert på epoxy-aktiverte
Sepharose^ perler
Epoxy-aktiverte Sepharose<*->'perler (Pharmacia Laboratories, 0,1 g) ble svellet i vann i 15 minutter og deretter vasket med MES-buffer (2 x lmL, 0,1 M, pH 5,5). Supernatanten ble dekantert og en bufret oppløsning av PNPase (0,25 mL, 3,4 U/mL, trisrHCl (10 mM, pH 8,2), EDTA (ImM), 2-mercaptoethanol (ImM), glycerol (50 % v/v)) ble tilsatt. Suspensjonen ble forsiktig omrystet i 24 timer. Perlene ble vasket med MES-buffer (3 x 5 mL, 0,1 M, pH 5,5) og trisbuffer (3 x 5 mL, 0,1 M, pH 8,0). Perlene (0,8 g våt vekt) ble funnet å inneholde 0,24 U av PNPase-aktivitet (30 % utbytte). ;Eksempel 3: PNPase immobilisert på epoxy-aktiverte ;Polyvinylalkohol-perler;Epoxy-aktiverte polyvinylalkohol-perler (VA-epoxy Biosynth<®>, Riedel-de Haén, 0,11 g) ble svellet i MES-buffer ;(1 mL, 0,1 M, pH 5,9) i 15 minutter. Supernatanten ble dekantert og en bufret oppløsning av PNPase (0,37 mL, 1,2 U/mL, tris:HCl (10 mM, pH 8,2), EDTA (ImM), 2-mercaptoethanol (ImM), glycerol (50 % v/v) ble tilsatt. Suspensjonen ble omrystet forsiktig i 24 timer. Perlene ble tillatt å falle til ro og supernatanten ble dekantert. Perlene ble vasket med MES-buffer (3 x lmL, 0,1 M, pH 5,5) og tristbuffer (lmL, ;0,1 M, pH 8,0) og trisbuffer (lmL, 1,0 M, pH 9,0). Perlene (0,36 g våt vekt) ble funnet å inneholde 0,24 U av PNPase- ;aktivitet (53 % utbytte).;Eksempel 4: Proteinutvasking av PNPase immobilisert på etylenoxyd-akrylsyreperler ;(r) ;PNPase immobilisert på Eupergit^ C 250 L-etylenoxyd-akrylsyreperler (2,16 g brutto våt vekt, inneholdende 51,7 mg protein) ble tilsatt til trisbuffer (7,5 mL, 0,1M, pH 9,0) inneholdende MgC^ (5 mM) og Na^HPO^(20mL). Suspensjonen ble omristet forsiktig ved romtemperatur. Alikvoter (0,1 mL) ble periodisk fjernet og analysert for protein ved anvendelse av BCA (bicinchoninsyre)-analysefremgangsmåten (Smith, Anal. Biochem. Vol. 150, s. 76-85 (1985)). ;
Når justert for bakgrunnsprotein, ble mindre enn 0,3 % av det totale immobiliserte protein utvasket fra støttematerialet etter 7 dager under reaksjonsbetingelser. ;Eksempel 5: Multippel fremstilling av polynukleotider ;med immobilisert PNPase;(å C ;En suspensjon av PNPase immobilisert på Eupergir* C
250 L-etylentoxyd-akrylsyreperler (1,9 U, 3,75 g brutto våt vekt) i trisbuffer (40 mL, 0,1M, pH 9,0) inneholdende inosin-difosfat (IDP, 20 mM) og MgCl2 (5mM) ble forsiktig omristet ved 25 °C i 42 timer. Den immobiliserte PNPase ble filtrert fra og vasket med trisbuffer (3 x 13,3 mL, 0,1 M,
pH 9,0). De kombinerte filtrater ble passert gjennom et 0,2 jiim filter og plassert i et Nukleoporeomristet-celle-filtrerings-apparat utstyrt med et Amicon PM-10 ultrafilter (utelukkelses-
membran molekylvekt 10000). Oppløsningen ble filtrert ved anvendelse av et nitrogengasstrykk på 60 psi inntil volumet av retentatet var mindre enn 2 mL. Retentatet ble fortynnet og deretter konsentrert sekvensielt til et volum mindre enn 2 mL med EDTA-oppløsning (80 mL, 0,1 M, pH 7,5) kaliumacetat-oppløsning (80 mL, 0,1 M, pH 7,5) og vann (80 mL). Retentatet ble oppløst i vann (20 mL). Analyse ved HPLC viste at poly-inosinsyren var kvantitativt tilbakeholdt i retentatet (50-55 % totalt utbytte) mens nukleosid-dif osf atet og andre forbindelser med lav molekylvekt var inneholdt i filtratet. Den vandige oppløsning av polynukleotid er egnet for lyofilisering, presipitering eller etterfølgende reaksjon. Det erholdte immobiliserte enzym bibeholdt mer enn 90 % av dets originale aktivitet og kunne anvendes ved ytter-ligere 15 fremstillinger av polynukleotid.
Andre homopolymere og kopolymere polyribonukleotider kan fremstilles ved fremgangsmåten ifølge dette eksempel ved å erstatte IDP med det egnede ribonukleosid-difosfat. F.eks. kan poly C-^U fremstilles ved å substituere cyt idin-dif osf at og uridin-difosfat i det molare forhold 12:1.
Poly I ble syntetisert som beskrevet ovenfor ved an-(r)
vendelse av PNPase immobilisert enten på Eupergit^ C eller Eupergit® C 250 L (gjennomsnittlige porestørrelser på 30 nm henholdsvis 160 nm). Molekylvekten av det fremstillte poly I ble målt ved størrelsesekskluderende HPLC. Som kan sees i
(r)
fig. 2, danner reaksjonen katalysert av Eupergit^C polymer av høyere molekylvekt ved omdannelser mindre enn 30 % enn Eupergit^ C 250 L-understøttet enzym. Ved omdannelser høyere enn 30 % danner Eupergir-^ C 250 L polymer av høyere gjennomsnittlig molekylvekt enn Eupergit<®>C.
Claims (9)
1. Polynukleotid-fosforylase immobilisert ved kovalent binding til partikler av en fast vannuoppløselig, epoxy-aktivert organisk polymer slik som et epoxyaktivert polysakkarid, poly(meth)acrylat, poly(meth)acrylamid, polyvinylacetat eller polyvinylalkohol.
2. Materiale ifølge krav 1
karakterisert ved at polymeren er en etylen-oksyd-acrylsyre-homopolymer eller copolymer og hvori partiklene har en gjennomsnittlig diameter på tilnærmet 1 til 1000 pm og inneholder porer med gjennomsnittlig diameter i området tilnærmet 0,01 til 1 (Om.
3. Materiale ifølge krav 2
karakterisert ved at polymeren er en copolymer av (A) en ethylenisk umettet monomer med en glycidylgruppe,
(B) en comonomer med minst 2 radikale polymeriserbare dobbeltbindinger, og (C) en radikal-polymeriserbar vannoppløselig comonomer.
4 . Fremgangsmåte for immobilisering av polynukleotid-fosforylase karakterisert ved at denne omsettes i vandig oppløsning i pH i området 4-6 med partikler av en fast vannuoppløselig, epoxy-aktivert organisk polymer.
5 . Fremgangsmåte ifølge krav 4 karakterisert ved at reaksjonen utføres i 4-m orfolinethansulfonsyre-buffer, at polymeren er en ethylen-oxyd-acrylalkohol eller en epoxy-aktivert polyvinylalkohol og partiklene har en gjennomsnittlig diameter i området av tilnærmet 100-300 f^ m°9 porer med en gjennomsnittlig diameter i området av tilnærmet 0,02 til 0,2.
6 . Forbedring av fremgangsmåten ved syntetisering av polyribonukleotider fra nukleosid-difosfater under tilstedeværelse av immobilisert polynukleotid-fosforylase, karakterisert ved anvendelse av polyribonukleotid-fosforylase immobilisert ved kovalent binding til partikler av en fast vannuoppløselig, epoxy-aktivert organisk polymer, slik som et epoxyaktivert polysakkarid, poly(meth)acrylat, poly(meth)acrylamid, polyvinylacetat, eller polyvinylalkohol.
7. Forbedring ifølge krav 6
karakterisrt ved at polymeren er en etylenoxyd-acryl-homopolymer eller copolymer og partiklene har en gjennomsnittlig diameter på tilnærmet 1 til 1000fJ m og inneholder porer med gjennomsnittlig diameter i området tilnærmet 0,01 til l/H m.
8. Forbedring ifølge krav 7
karakterisert ved at polymeren er en copolymer av (A) en ethylenisk umettet monomer med en glycidylgruppe,
(B) en comonomer med minst to radikale polymeriserbare dobbeltbindinger, og (C) en radikal-polymeriserbar vannoppløslig comonomer.
9. Forbedring av fremgangsmåten for fremstilling av ribonukleotid-difosfat ved fosforolyse av polynukleotider under tilstedeværelse av immobilisert polynukleotid-fosforylase ,
karakterisert ved anvendelse av polynukleotid-fosforylase immobilisert ved kovalent binding til partikler av en fast vann-uoppløselig, epoxy-aktivert organisk polymer.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US20819488A | 1988-06-16 | 1988-06-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO892497D0 NO892497D0 (no) | 1989-06-15 |
| NO892497L true NO892497L (no) | 1989-12-18 |
Family
ID=22773602
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO89892497A NO892497L (no) | 1988-06-16 | 1989-06-15 | Polynukleotid-fosforylase immobilisert paa epoxyaktiverte perler. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0346865A3 (no) |
| JP (1) | JPH02109979A (no) |
| KR (1) | KR910005628B1 (no) |
| AU (1) | AU3653789A (no) |
| DK (1) | DK296089A (no) |
| FI (1) | FI892939A (no) |
| HU (1) | HUT50865A (no) |
| IL (1) | IL90600A0 (no) |
| NO (1) | NO892497L (no) |
| PT (1) | PT90886A (no) |
| ZA (1) | ZA894605B (no) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU5943690A (en) * | 1989-07-03 | 1991-01-17 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Polynucleotide phosphorylase immobilized on tris(hydroxymethyl)methylacrylamide polymer beads |
| EP0562373A3 (en) * | 1992-03-23 | 1994-05-25 | Siemens Ag | Immobilisation of biochemical substances |
| DE4333674A1 (de) * | 1993-10-02 | 1995-04-06 | Merck Patent Gmbh | Nukleotidhaltiges Sorbens für die Affinitätschromatographie |
| DE19653730C2 (de) * | 1996-12-11 | 1999-06-24 | Schering Ag | Immobilisierte Proteine aus Rohextrakt und deren Verwendung zur Umsetzung von Estern |
| US5905024A (en) * | 1996-12-17 | 1999-05-18 | University Of Chicago | Method for performing site-specific affinity fractionation for use in DNA sequencing |
| WO2000034457A1 (fr) * | 1998-12-10 | 2000-06-15 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Procede relatif a l'immobilisation d'un oligonucleotide sur un support |
| PT1439220E (pt) * | 2003-01-16 | 2007-11-28 | Adorkem Technology Spa | Biocatalisadores imobilizados utilizáveis para o fabrico de nucleósidos naturais e análogos modificados por reacções de transglicosilação enzimática |
| WO2022031314A2 (en) * | 2020-08-05 | 2022-02-10 | Oncovir, Inc. | Scalable production of polyribonucleotides of controlled size |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4210723A (en) * | 1976-07-23 | 1980-07-01 | The Dow Chemical Company | Method of coupling a protein to an epoxylated latex |
| US4208309A (en) * | 1977-05-20 | 1980-06-17 | Rohm Gmbh | Pearl polymer containing hollow pearls |
| DE3136940A1 (de) * | 1981-09-17 | 1983-03-31 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | "verfahren zur herstellung von 5'-ribonucleotiden" |
| US4582860A (en) * | 1983-12-15 | 1986-04-15 | Rohm And Haas Company | Oxirane resins for enzyme immobilization |
-
1989
- 1989-06-13 IL IL90600A patent/IL90600A0/xx unknown
- 1989-06-14 EP EP19890110788 patent/EP0346865A3/en not_active Withdrawn
- 1989-06-15 DK DK296089A patent/DK296089A/da not_active Application Discontinuation
- 1989-06-15 NO NO89892497A patent/NO892497L/no unknown
- 1989-06-15 FI FI892939A patent/FI892939A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-06-16 JP JP1152454A patent/JPH02109979A/ja active Pending
- 1989-06-16 AU AU36537/89A patent/AU3653789A/en not_active Abandoned
- 1989-06-16 KR KR1019890008296A patent/KR910005628B1/ko active IP Right Grant
- 1989-06-16 ZA ZA894605A patent/ZA894605B/xx unknown
- 1989-06-16 PT PT90886A patent/PT90886A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-06-16 HU HU893131A patent/HUT50865A/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0346865A3 (en) | 1990-09-12 |
| DK296089A (da) | 1989-12-17 |
| IL90600A0 (en) | 1990-01-18 |
| FI892939A (fi) | 1989-12-17 |
| JPH02109979A (ja) | 1990-04-23 |
| EP0346865A2 (en) | 1989-12-20 |
| AU3653789A (en) | 1989-12-21 |
| KR910001042A (ko) | 1991-01-30 |
| DK296089D0 (da) | 1989-06-15 |
| KR910005628B1 (ko) | 1991-08-01 |
| PT90886A (pt) | 1989-12-29 |
| ZA894605B (en) | 1991-02-27 |
| FI892939A0 (fi) | 1989-06-15 |
| HUT50865A (en) | 1990-03-28 |
| NO892497D0 (no) | 1989-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108384767B (zh) | 转氨酶突变体及其应用 | |
| Nilsson et al. | The use of bead polymerization of acrylic monomers for immobilization of enzymes | |
| US6291216B1 (en) | Affinity supports containing ligands bound to oxirane groups | |
| EP3733689B1 (en) | Transaminase mutant and application thereof | |
| GB1568328A (en) | Immobilized enzymes on pullulan carriers and preparation thereof | |
| EP0054800B1 (en) | Process for the production of immobilized microorganisms | |
| US4978619A (en) | Enzyme immobilization by entrapment in a polymer gel matrix | |
| Marek et al. | Invertase immobilization via its carbohydrate moiety | |
| SE450493B (sv) | Forfarande for framstellning av sampolymerer av polysackarider som berare av enzymatisk aktivitet | |
| EP0034609B1 (en) | Immobilized enzyme(s) and microorganism(s) and their production | |
| NO892497L (no) | Polynukleotid-fosforylase immobilisert paa epoxyaktiverte perler. | |
| Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
| US4931476A (en) | Crosslinked polymers and a process for their preparation | |
| Bryjak et al. | Effect of polymer matrix on penicillin acylase immobilization on copolymers of butyl acrylate and ethylene glycol dimethacrylate | |
| Toogood et al. | Immobilisation of the thermostable L-aminoacylase from Thermococcus litoralis to generate a reusable industrial biocatalyst | |
| US4767620A (en) | Crosslinked polymers with carbonate ester groups, and a process for their preparation | |
| EP2316932B1 (en) | Enzyme-functionalized supports | |
| Chibata et al. | Immobilized cells: Historical background | |
| Trelles et al. | Immobilization techniques applied to the development of biocatalysts for the synthesis of nucleoside analogue derivatives | |
| US5266471A (en) | Solid carriers modified with 2,4,6-trichloro-s triazine to immobilize biomolecules | |
| WO1991000346A1 (en) | Polynucleotide phosphorylase immobilized on tris(hydroxymethyl)methylacrylamide polymer beads | |
| Fonseca et al. | An integrated downstream processing strategy for the recovery and partial purification of penicillin acylase from crude media | |
| EP0195304A2 (en) | Stabilization of intracellular enzymes | |
| KR101252928B1 (ko) | ｐＨ 민감성 고분자 담체에 고정된 고정화 효소 및 상기 고정화 효소를 이용한 선형 알파－１，４－글루칸의 제조방법 | |
| Arroyo-Begovich | Chitinase from Neurospora crassa |