SU689200A1 - Способ получени водонерастворимых биологически активных соединений - Google Patents

Description

ции с последующей сшивкой глутаровым альдегидом. К полученным аминированным носител м ковалентно присоедин ют полиакриловую кислоту (ПАК), использу  водорастворимый карбодимид 2 . Однако псшучение водонераствориких биологически активных соединений этим способом имеет р д недостатков. После иммобилизации веществ на таких носител х остаютс  остаточные амино группы, обуславливаю дие неспецифическую адсорбцию кислых белков и нуклеиновых кислот. Это  вление крайне нежелательное, особенно при иммобилизации соединений дл  биоспецифической хроматографии. Получение иммобилизованных препаратов этим способом , как правило, многостадийно. Функциональное разнообразие получаемых носителей также ограничено.

Целью предлагаемого способа  вл етс  улучшение качества целевых продуктов и упрощение способа их получени . Указанна  цель достигаетс  за счет того, что кремнеземную основу при 55-б5с подвергают действию ионизирующего излучени  с мощностью дозы 40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давле- НИИ 35-400 мм Нд с последующей, в случае необходимости, активацией привитых полимеров дл  образовани  реакционноспособных групп и взаимо SiO j-CH CH-CHjCH- ...(Щ -СН-СН-СН,СН

СООН CONHfCH l NH-©

- действем полученных носителей с растворами биологически активных соединений обычно при Q-20 C в течение 2-20 ч.

Согласно изобретению способ полуt чени  водонёрастворимых биологически активных соединений с улучшенным качеством целевых продуктов заключаетс  в том, что кремнеземную основу модифицируют гидрофильными

органическими полимерами. Модификаци  достигаетс  за счет того, что

носитель подвергают при SS-eS C обычно в течение 2-10 ч действию ионизирукнцего излучени  с мощностью дозы 40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35400 мм Нд. Полученный модифицированный носитель, в случае необходимости дополнительно активируют известными приемами, обычно путем обработки бифункциональными реагентами, в качестве которых используют или диамины, или диальдегиды, или дихлорангидриды , и полученный носитель подвергают взаимодействию с растворами биологически активных соединений . В качестве биологически активных соединений обычно используют ферменты, лиганды, нуклеотиды.

Получаемые водонерастворимые биологически активные вещества содержат звень  следующей структуры:

I СООН CO-(L

SiOJ-CH,CH-CH,CH . гу ,г,

СНгО-(Г где L - иммобилизованное соединение липид, фермент, нуклеЬтид и т.д. Улучшение качества иммобилизованных биологически активных соединений достигаетс , во-первых, за счет увеличени  емкости. Концентраци  функционсшьных групп дл  иммобилизации достигает 4 ммолей на грамм, носител  что в 8 раз превосходит концентрацию функциЬнальных групп на обычных кремнеземных носител х. Повышение емкости не так существенно при иммобилизации белков, но очень важно 1при иммобилизации низкомолекул рных лигандов (нуклеитидов, аминокислот и др.) дл  аффинной хроматографии. Улучшение качества иммобилизованных биологически активных соединений достигаетс  также отсутствием в полу ченных препаратах неспецифически сор бированных белков и нуклеиновых ки.слот . Неспецифическа  сорбци  сывороSfO ,)-CH,CH-CH,CH II

(L.

Claims (2)

1. онОС точного альбумина при рН 7,4 на таких носител х в 5 раз меньше, чем дл  исходного макропористого кремнезема и в 10-20 раз меньше, чем у кремнеземных носителей, получаемых через аминопропилпроизводное или через ПЭИ. Низка  неспецифическа  сорбци  на получаемых сорбентах объ сн етс  понижением свободной энергии поверхности в следствие сглаживани  внутренней .поверхности привитыми органическими полимерами. Положительный эффект описываемого способа состоит в том, что: 1. Способ дает высокий выход иммобилизованного продукта (особенно дл  ннзкомолекул рных лигандов), так как концентраци  активных групп на носителе достигает 2-4 ммолей на грамм. Например, при иммобилизации уриднн 5-монофосфата фосфодиэфирным методом количество иммобилизованного нуклеотида достигает 20 мг на мл сорбента, тогда как на органических носител х типа сефароэы эта величина почти на пор док ниже. 2.Использование дл  иммобилизаци кремнеземных носителей с привитой по акриловой кислотой снижает неспецифи ческую сорбцию кислых белков и нукле иновых кислот. Неспецифическа  сорбци  бычьего сывороточного альбумина в 0,1 м фосфатном буфере рН 7,4 на т ких носител х в 5 раз меньше, чем у исходного макропористого кремнезема и в 10-20 раз меньше, чем у кремнеземных носител х, получемых через аминопропилпроизводное. Неспецифическа  сорбци  денатурированных-фрах ментов ДНК (длиной 500 пар нуклеотидов ) при рН 6,0 на таких носител х в 10-15 раз меньше, чем на кремнеземных носител х непокрытых полимерами и не превышает 2-3 оптических единиц при Л 260 нм. 3. Данный способ дает возможность И Лмобилизовать биологически активные соединени  на органонеорганичес ких носител х, содержащих практичес ки любые отнотипные (в зависимости от вз того мономера) группы. Например , при полимеризации акриловой кислоты получают карбоксильные груп пы, при полимеризации винилацетата после омылени  получают вторичные спиртовые группы) при полимеризации зтиленгликоль метакрилата получают первичные спиртовые группы и т.д. Нижеследующие примеры служат иллюстрацией описываемого способа. Пример 1. Макропористый жремнезем - силохром (30 г) поме11аю в стекл нную ампулу и откачивают до остаточного давлени  10 мм Нд при многократном замораживании и размораживании. Носитель в ампуле облучают Со° в течение 2-х ч при мощности дозы 40-50 рад/с в при сутствии паров акриловой кислоты. Процесс провод т при 60-65-с и при давлении паров акриловой кислоты 35-40 мм Нд. Полученный носитель отмывают кип щим метанолом до посто нного веса. Получают производное 1 с содержанием углерода до 15% и с концентрацией карбоксильных гру до 3 молей на грамм носител . К производному 1 в 500 мл сухого хлор форма добавл ют 9 мл хлористого тио нила, 0,5 мл диметилформамида и кип т т реакционную массу 2 ч при перемешивании . Продукт промывают на фил ре сухим хлороформом, суспензируют в 500 мл сухого хлороформа, добавл ют 300 мл этилендиамина, 18 мл тр этиламина и кип т т 3 ч при перемешивании . Полученный носитель тщательно промывают на фильтре хлорофо мом, ацетоном, водой, ацетоном. Отб рают 2 г полученного сорбента и сус пендируют в 10 мл хлористого метиле на, содержащего 50 мг модифицированного фосфатидилхолина (при С,; наход тс  карбоксильнна  группа, активированна  N-оксисукцинимидом). Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре 20 ч. По окончании реакции сорбент промывают хлороформом , метанолом и высушивают. Количество св занного лиганда составл ет -V 17 мг на 1 г носител . Полученный биспецифический сорбент опробован дл  выделени  липидперенос щегос  белка (ЛПБ). Сорбент оказалс  весьма эффективным. На нем была достигнута степень селективности , равна  3,0 (отношение количества адсорбированного ЛПБ в процентах к общему количеству адсорбированного белка в процентах) и высока  степень очистки, равна  20 (отношение удельной активности ЛПБ после десорбции с носител  и удельной активности ЛПБ в исходной белковой фракции). Попытка выделить ЛПБ на том же -лиганде, но присоединенном к аминопропилсилоxpONiy , была неудачной. В этом случае степень селективности составл ла 1,8, а степень очистки только 1,3. П р и м е р 2. Носитель 1 (см.пр.1) суспендируют в 5 мл воды, добавл ют 200 мг 1-циклогексил-З-( 2-морфолиноэтилкарбодиимида мето-р-толуолсульфоната )(водорастворимого карбодиимида), поддерживают рН 4,5-6,0 и прибавл ют 100 мг панкреатической рибонуклеазы. Реакционную смесь перемешивают на качалке при 0-5°С в течение 4 ч. Водонерастворимый продукт отмывают на фильтре 1 MNaCl и водой до отсутстви  .детектируемых количеств белка в промывках . Водонерастворимый продукт содержит 40 мг белка на грамм носител . Иммобилизованный препарат использован дл  .обработки белковых дрожжевых экстрактов с целью расщеплени  содержащихс  там нуклеиновых кислот до коротких олигонуклеотидов. Один грамм иммобилизованного препарата эффективно гидролизуют нуклеиновые кислоты (до содержани  кислоторастворимой доли 80-90%), содержащиес  в 50 г дрожжевой биомассы. В течение 10 циклов работы активность иммобилизованного фермента снижаетс  на 20-25%. Пример 3. Производное 1 (4 г), полученное на основе пористого стекла (см,пр.1), суспендируют в 100 МП абсолютного метанола, насыщенного НС1, и кип т т 2 ч. Промывают метанолом (500 мл), суспендируют в 100 МП абсолютного ТГФ, содержащего 1 г LiAlH и кип т т при перемешивании 8 ч. Полученный носитель промывают ТГФ (200 мл) эфиром (200 мп) и высушивают на фильтре ацетоном. Полученный носитель (2 г ) суспендируют в 10 мл воды при рН 5,5-6,0, добавл ют 800 мг водорастворимого карбодиимида и 200 мг уридин 5-монофосфата. Перемешивают 4 ч и отмывают на фильтре l.MNaCl и водой до отсутстви  поглоще ни  при v 260 им. Водонерастворимый продукт содержит до 50 мг нуклеотида на грамм носител  20 мг/мл носител  и стабилен при комнатной температуре в высушенном состо нии. Пример 4. Силикагель (30 г) помещают в стекл нную ампулу и откачивают до остаточного давлени  мм Нд при многократном замораживании и размораживании. Носитель в ампуле облучают на установке ТРЦ-ЗА рентгеновскими лучами в течение 10 ч с мощностью дозы 90-100 рад/с в присутствии паров винилацетата при 55бО и при давлении паров 350-400 ммНд К полученному носителю (10 г) в 50 мл сухого метанола добавл ют раствор ме тилата натри , приготовленный растворением 0,6 г металлического натри  в 9,4 мл сухого метанола, и кип т т при перемешивании.1 ч. Затем промывают на фильтре метанолом, высушиваю 200 мл абсолютного хл суспендируют в содержащего 15 г п-нитробен роформа зоилхлорида и 5 мл триэтиламина, и кип т т 2 ч при перемешивании. Промы вают на фильтре хлороформом, ацетоном , водой, ацетоном. Подученный носитель суспендируют в 100 мл воды, содержащей 10 мл пиридина, добавл ют 10 г N325/2.0 и кип т т 1 час. Промывают на фильтре водой и суспендируют пол учтенный носитель (2 г) в 50 мл 2,5 н HCI. Реакционную массу охлаждают до , добавл ют 840 мг NanOj и перемешивают при +5С на холоде в течение 30 мин. Промывают на фильтре водой, 0,1 М фосфатным буфером рН 8,0 и суспендируют в 5 мл тог же буфера, содержащего фермент экзонуклеазу А5 (1 мг/мл). Инкубируют 2 ч при 0-5°С, затем промывают на фильтре 1 М NaCl и водой до отсутстви  белка в Промывках. Иммобилизованный препарат обладает активностью до 1000 ед.акт. на 1 г препарата (2 мг белка на 1 грамм препарата). Одного грамма- иммобилизованного пре-. парата достаточно дл  превращени  0,5 г РНК за 18 ч в гидролизат, содержащий 60-70% нуклеозид 5-монофосфатов . В течение 10 циклов работы активность иммобилизованного фермента снижаетс  на 25-30%. Формула изобретени  1.Способ получени  водонерастворимых биологически активных соединений , включающий модификацию кремнеземной основы путем покрыти  гидрофильными органическими полимерами, последующую , в случае необходимости, активацию модифицированного носител  и обработку полученного носител  растворами биологически активных соединений, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  процесса и улучшени  качества.целевого продукта , кремнеземную основу модифицируют при 55- 65с действием ионизирующего излучени  с мощностью дозы 40-100 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35400 мм Нд. 2.Способ по П.1, отличающийс  тем, что в качестве биологически активных соединений используют ферменты, липиды, нуклеотиды. 3.Способ по П.1, отличающийс  тем, что активацию моди,фицированного носител  осуществл ют бифункциональными реагентами. 4.Способ по П.1, отличающийс  тем, что в качестве дифункционального реагентов используют или диамины, или диальдегиды, или дихлорангидриды. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Авторское свидетельство СССР №455741, кл. В 01 J 11/00, 1975.
2. 2.G . Р .- Roye г , G .М . Green , B.K.Sinha Rigid Support materials for the immobilization of enzymes, J. Macromol. Sei., Chem, A 10, 1-2, 289-307, 1976 (прототип).