CN107760666B - 一种可调控酶比例的可逆双酶共固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可调控酶比例的可逆双酶共固定化方法,该方法通过DNA介导固定化技术,将多种酶共固定在巴胺及其衍生物修饰的多功能化磁性纳米粒子表面,此法合成条件温和,并可通过调节磁性纳米粒子表面的官能团数量来控制多酶反应体系中不同酶的固载量。通过此法建立的固定化多酶体系具有活性高,稳定性好等优势。
Description
技术领域
本发明属于固定化酶制备技术领域,具体涉及一种可调控酶比例的可逆双酶共固定化方法,尤其是在多巴胺及多巴胺衍生物修饰的多功能化磁性纳米粒子表面通过DNA互补介导固定化多酶的方法。
背景技术
酶是一种生物体内产生的,具有生物催化功能的高分子物质,可以有效地控制生物体体内或体外的特定化学反应。近年来,酶因其具有催化效率高,种类繁多,反应条件温和,选择性高和绿色环保等优点,替代了许多传统的化学催化剂,在研究和生产中被广泛的应用。
但是,由于游离酶在反应过程中存在缺乏长期稳定性,反应后回收成本高和很难重复使用等问题,限制了其在一些领域内的发展。固定化酶技术则有效的解决了上述游离酶存在的问题。固定化酶与游离酶相比,具有以下优点:(1)分离手段简单,可以快速将酶从反应体系中分离出来;(2)实现酶的有效回收和重复使用,降低研究和生产成本;(3)通常能够提高酶在一些极端(例如高温)或者特殊的反应条件下的稳定性;(4)使酶反应过程可控。
随着固定化酶技术的发展,多酶固定化体系也逐渐成为相关研究学者关注的研究热点之一。与传统的单一固定化酶和生物催化剂相比,多酶固定化具有以下的优点:
(1)能够充分发挥不同酶的特点,并将其催化特性结合起来;
(2)在反应中,第二步酶催化移走了前一步酶催化产生的底物,使逆反应速度大大下降,降低了底物对酶的抑制作用,使反应更彻底;
(3)实现了酶催化反应的连续生产。
磁性纳米粒子具有比表面积大、生物相容性好以及磁响应性高等优点,因此其作为固定化酶的载体吸引了大量的研究。对裸露的Fe3O4磁珠表面进行功能化修饰,不仅可以大幅度提高其稳定性和抗氧化性,还可以为磁珠表面提供丰富的官能团,从而提高固定化酶的性能。将多功能化的磁性纳米粒子作为固定化多酶的载体,我们可以通过调整其表面官能团的数量来控制多酶反应体系中不同酶的固载量,从而进一步提高固定化多酶体系的性能和可控性。
传统的固定化酶方式基本都是基于通过共价或者非共价的方式将酶直接固定到修饰后的磁性纳米粒子表面,这种固定化方式通常是不可逆的,而且会影响固定化酶体系的性能和稳定性。在多酶固定化体系中,当相应的酶具有相同或者相似的结构时,通过传统方法将酶直接固定到多功能化磁性纳米粒子表面依然很难做到对不同的酶进行精确的比例控制。因此,需要进一步探索可用于将酶固定到多功能化磁性纳米粒子表面,且活性高、稳定性好以及动态可逆固定化的固定化多酶过程。
发明内容
为了克服现有技术的不足,本发明的目的是提供一种可调控酶比例的可逆双酶共固定化方法,该方法通过DNA介导固定化技术,将多种酶共固定在巴胺及其衍生物修饰的多功能化磁性纳米粒子表面,此法合成条件温和,并可通过调节磁性纳米粒子表面的官能团数量来控制多酶反应体系中不同酶的固载量。通过此法建立的固定化多酶体系具有活性高,稳定性好等优势。
为了达到上述目的,本发明按照以下技术方案实现:一种可调控酶比例的可逆双酶共固定化方法,首先合成马来酰亚胺基-多巴胺衍生物,将其与多巴胺通过超声法键合到磁性四氧化三铁纳米粒子表面,制备氨基-马来酰亚胺基修饰的双功能化磁性纳米粒子,然后通过缩合和迈克尔加成反应将5’ 羧基修饰的单链DNA(P1)和5’ 巯基修饰的单链DNA(P2)键合到双功能化磁性纳米粒子表面,制备单链DNA双功能化的磁性纳米粒子;制备5’巯基修饰的单链DNA标记的酶(C1-GOx和C2-HRP),通过DNA互补介导固定化技术实现GOx和HRP的共固定化。
在本发明的优选的实施方案中,所述的方法包括以下步骤:
(1)将多巴胺和多巴胺的马来酰亚胺基衍生物在超声条件下与磁性四氧化三铁纳米粒子反应1h,制备多巴胺衍生物修饰的氨基-马来酰亚胺基双官能团磁性纳米粒子;
(2)将将两条不同序列的5’ 巯基修饰的单链DNA(C1和C2)与三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)在35-40℃条件下反应2-3 h,切断DNA储存过程中形成的二硫键,然后将反应后的单链DNA经过交联剂分别交联到不同酶上,然后在25-30℃条件下反应12-30 h,合成巯基单链DNA标记的酶;
(3)将5’ 羧基修饰的单链DNA(P1)和5’ 巯基修饰的单链DNA(P2)与氨基-马来酰亚胺基多功能化的磁性四氧化三铁纳米粒子在25-30℃下反应5-7 h,制备单链DNA标记的双功能化磁性纳米粒子,然后用BSA对其进行封闭;
(4)将(2)中合成的巯基单链DNA标记的酶与(3)中合成的单链DNA标记的多功能化磁性纳米粒子在35-40℃反应3-4 h,经过DNA互补介导固定化技术将酶固定到双功能化磁性纳米粒子表面。
进一步,步骤(1)中所述的马来酰亚胺基多巴胺衍生物的结构式为:
进一步,步骤(1)中所述的磁性四氧化三铁纳米粒子的合成方法为水热法,粒径约为12-18 nm。
进一步,步骤(2)中所述的交联剂为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐(suflo-smcc),用量为1 mg。
进一步,步骤(2)、(3)中所述的5’ 羧基修饰的单链DNA(P1)和5’ 巯基修饰的单链DNA(C1),5’ 巯基修饰的单链DNA(P2)和5’ 巯基修饰的单链DNA(C2)为碱基互补配对且碱基数为24。
进一步,步骤(2)中所述的酶的用量为2-4 mg,TCEP浓度为30-40 mM,DNA用量为0.5 OD。
进一步,步骤(3)中所示的氨基-马来酰亚胺基双功能化磁性纳米粒子的用量为25mg,DNA用量为0.5 OD。
本发明首先通过DNA杂交将酶共固定到多巴胺及其衍生物修饰的多功能化磁性纳米粒子表面;随后将固定化多酶体系用于酶比例调控、酶学性质、稳定性以及可逆性的考察,并与游离酶和传统固定化多酶进行比较。与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1) 酶的固定化反应条件温和,有利于保持酶的活性。
(2) 以多巴胺及其马来酰亚胺衍生物修饰的氨基-马来酰亚胺基双功能化磁性纳米粒子作为固定化多酶体系的载体,可以通过调节磁性纳米粒子表面的官能团数量来控制多酶反应体系中不同酶的固载量。
(3) 短链DNA具有较强的机械刚性以及高稳定性,用DNA互补介导固定化酶可以将酶高度平行的固定到载体表面,这使得酶在固定化过程中可以避免直接接触磁性纳米粒子表面而对酶的二级、三级结构产生影响。因此此法可以充分保持酶的生物活性,并提高固定化酶的稳定性,有利于扩展固定化多酶体系在其他领域的广泛应用。
(4) DNA独特的碱基互补配对原则可以提高固定化酶过程的特异性和稳定性,从而使多酶固定化过程变得更加可控。
(5) 通过DNA杂交的可逆性,可以实现固定化酶过程的动态可逆。同时,通过本发明的方法制备的固定化酶还可以对目标酶进行更换,节约制备成本。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细说明,但并不构成对本发明的限制。
实施例1:酶比例可调控的多酶固定化体系的建立
(1)将25 mg粒径为12-18 nm的磁性纳米粒子(MP)在5 mL 无水甲醇中超声分散,加入5.3 mM 多巴胺(DA)和多巴胺马来酰亚胺基衍生物(MA),混合物在室温下超声反应1h;反应结束后,产物(DM@MP)用去离子水洗3次,浸泡在去离子水中,在4℃下保存以备后续使用。
(2)0.5 OD 5’ 羧基修饰的单链DNA(P1)溶于25 mM MES (pH 6.0)缓冲溶液中,随后加入500 μL 20 mg mL-1的NHS和40 mg mL-1的EDC溶液,混合液置于摇床反应,29℃,20min;反应完后,将上述反应液加入5 mL DM@MP(5 mg mL-1)分散液中,置于摇床反应,29℃,6h;反应完后,用10 mM PBS(0.1 M NaCl,pH 7.4)洗3次,加入 0.5 OD 5’ 巯基修饰的单链DNA(P2),置于摇床反应,29℃,6 h。反应结束后,产物(P1-P2@DM@MP)为单链DNA标记的双功能化磁性纳米粒子,用10 mM PBS(0.1 M NaCl,pH 7.4)洗2次,加入5 mL 0.5% BSA溶液,摇床反应30 min,29℃。反应结束后,用10 mM PBS(0.1 M NaCl,pH 7.4)洗3次备用。
(3)将200 μL SH-DNA(C1,0.5 OD)与60 μL TCEP(30 mM)在50 mL离心管中混合,置于摇床反应,37℃,2 h;反应结束后,混合物用3K超滤离心管过滤6次,22 min/次,8000xp,除去未参加反应的DNA。C2的处理方法与C1相似。
(4)将2 mg 葡萄糖氧化酶(GOx)溶于200 μL 10 mM PBS(pH 7.4,0.1 M NaCl)中,混合均匀;将 1 mg sulfo-SMCC超声溶解于200 μL 10 mM PBS(pH 7.4,0.1 M NaCl)中,将其与上述GOx溶液混合,置于摇床中,37℃,2 h。反应结束后,混合液用10K超滤离心管过滤6次,10 min/次,8000 xp,除去未反应的sulfo-SMCC,然后与(3)中的产物在摇床中进行反应,29 ℃,24 h,合成巯基单链DNA标记的葡萄糖氧化酶(GOx-C1)共轭物。反应结束后,产物用10K超滤离心管过滤6次,10 min/次,8000 xp,除去未反应的C1。HRP-C2的合成方法与GOx-C1一致。
(5)向(2)中的P1-P2@DM@MP里加入(4)中的C1-GOx和C2-HRP复合物,混合溶液在37℃下,摇床中反应3 h,反应后用10 mM PBS(pH 7.4,0.1 M NaCl)洗3次,制备的产物命名为GOx-HRP@DM@MP,4℃保存备用。
对比实施例1:制备GOx-HRP@APTES@MP。
制备GOx-HRP@APTES@MP:将25 mg 分别经过正硅酸乙酯(TEOS)及3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)功能化修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子用20 mM PBS(pH 8.0)超声洗3遍,加入4.5 mL 20 mM PBS(pH 8.0)及0.5 mL戊二醛(50 wt %),置于摇床反应,29℃,3 h;反应完后,用20 mM PBS(pH 8.0)洗3次,加入2 mg GOx和HRP,置于摇床反应,37℃,3 h。
实施例2:调控多酶固定化体系中酶的比例。
(1)不同酶比例的固定化多酶体系的制备:具体步骤同实施例1。调节DA和MA,P1和P2,C1-GOx和C2-HRP的摩尔比例,制备GOx:HRP摩尔比例分别为1:4, 3:4, 5:4, 8:4, 10:4, 13:4的GOx-HRP@DM@MP。
(2)配制5 mMβ-Glucose底物溶液,0.5 mg实施例1中合成的GOx-HRP@DM@MP,加入1mLβ-Glucose溶液(含有1 mM TMB),在37℃下,摇床反应5 min。反应结束后,利用磁场将GOx-HRP@DM@MP分离出来,向上清液中加入20 μL 2 M的硫酸溶液,用紫外分光光度计检测其在450 nm处的吸光度,根据吸光度比较酶的相对活性。
经考察,本发明制备的GOx-HRP多酶固定化体系在GOx:HRP=8:4时达到最大酶解效率。与其他的多酶固定化体系相比,本发明制备的多酶固定化体系可以精确的对不同酶进行比例控制。
实施例3:多酶固定化体系的酶学性质
(1)固定化多酶体系的制备:同实施例1。
(2)配制一系列浓度的β-Glucose底物溶液,0.5 mg实施例1中合成的GOx-HRP@DM@MP,加入1 mLβ-Glucose溶液(含有1 mM TMB),在37℃下,摇床反应5 min。上清液中加入20μL 2 M的硫酸溶液,检测其在450 nm处的吸光度。游离的GOx-HRP和GOx-HRP@APTES@MP采用相同的方法测定酶学性质,并与GOx-HRP@DM@MP进行比较。
分析结果表明,GOx-HRP@DM@MP的米氏常数为1.41 mM,游离的GOx-HRP的米氏常数为2.63 mM,GOx-HRP@APTES@MP的米氏常数为1.92mM。与其他GOx-HRP多酶固定化体系以及游离的GOx-HRP相比,本发明制备的GOx-HRP多酶固定化体系的米氏常数值更小,说明本发明制备的多酶固定化体系具有更好的性能。
实施例4:固定化多酶体系的稳定性
(1)固定化多酶体系的制备:同实施例1。
(2)热稳定性考察:实施例1中合成的GOx-HRP@DM@MP在60℃下进行孵育,分别在0min,20 min,40 min,60 min,80 min,100 min,120 min后取出并冷却至室温,随后加入1mLβ-Glucose溶液(5 mM β-Glucose,含有1 mM TMB),在37℃下,摇床反应5 min。上清液中加入20 μL 2 M的硫酸溶液,检测其在450 nm处的吸光度。游离的GOx-HRP和GOx-HRP@APTES@MP采用相同的方法热考察稳定性,并与GOx-HRP@DM@MP进行比较。
稳定性考察:实施例1中合成的GOx-HRP@DM@MP(4℃下保存)分别在0, 1, 2,3,4,5,6,7,10,15,20,25,30天后取出,随后加入1 mLβ-Glucose溶液(5 mM β-Glucose,含有1mM TMB),在37℃下,摇床反应5 min。上清液中加入20 μL 2 M的硫酸溶液,检测其在450 nm处的吸光度。游离的GOx-HRP和GOx-HRP@APTES@MP采用相同的方法热考察稳定性,并与GOx-HRP@DM@MP进行比较。
经考察,本发明制备的GOx-HRP多酶固定化体系拥有良好的热稳定性和长期稳定性。GOx-HRP@DM@MP在60℃孵育40min后仍可保持原酶活性的89.7 %;120 min后仍可保持原酶活性的56.6%。在4℃下保存30天后,GOx-HRP@DM@MP仍保有原酶活性的81.2%。与其他GOx-HRP多酶固定化体系相比,本发明制备的多酶固定化体系的稳定性有很大优势。
实施例5:多酶固定化体系的可逆性
(1)固定化酶体系的制备:同实施例1。
(2)0.5mg实施例1中合成的固定化多酶体系,加入1 mLβ-Glucose溶液(5 mM β-Glucose,含有1 mM TMB),在37℃下,摇床反应5 min。上清液中加入20 μL 2 M的硫酸溶液,检测其在450 nm处的吸光度。
(3)将(2)中的固定化多酶体系充分洗涤,加入1 mL 0.05 M NaOH,摇床反应,37℃,3 min,进行DNA双链解旋。反应结束后,去除上清液并充分洗涤,产物中加入1 mLβ-Glucose溶液(5 mM β-Glucose,含有1 mM TMB),摇床反应5 min,37℃。上清液中加入20 μL2 M的硫酸溶液,检测其在450 nm处的吸光度。分析结果表明,只有3%左右的酶活性,说明DNA双螺旋已经打开,固定化多酶体系中几乎不含DNA-酶复合物。
(4)将(3)中反应后的固定化多酶体系用10 mM PBS(pH 7.4,0.1 M NaCl)充分洗涤,加入实例1(4)中的C1-GOx和C2-HRP复合物,混合溶液在37℃,摇床反应3 h。反应结束后,充分洗涤并去除上清液,固定化多酶体系加入1 mLβ-Glucose溶液(5 mM β-Glucose,含有1 mM TMB),摇床反应5 min,37℃。上清液中加入20 μL 2 M的硫酸溶液,检测其在450 nm处的吸光度。分析结果表明,大约保持85%酶活性,说明新的C1-GOx和C2-HRP复合物已经固定在(3)中的反应产物上,因此完成体系第二次固定化酶。
(5)重复(3)。分析结果表明,大约保持2%酶活性,说明DNA双螺旋第二次打开,固定化多酶体系中几乎不含DNA-酶复合物。充分证明了制备的固定化多酶体系有很好的可逆性及通过DNA互补介导固定化多酶的重现性。
尽管通过参照本发明的优选实施例,已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (8)
1.一种可调控酶比例的可逆双酶共固定化方法,其特征在于,首先合成马来酰亚胺基-多巴胺衍生物,将其与多巴胺通过超声法键合到磁性四氧化三铁纳米粒子表面,制备氨基-马来酰亚胺基修饰的双功能化磁性纳米粒子,然后通过缩合和迈克尔加成反应将5’ 羧基修饰的单链DNA P1和5’ 巯基修饰的单链DNA P2键合到双功能化磁性纳米粒子表面,制备单链DNA双功能化的磁性纳米粒子;制备5’ 巯基修饰的单链DNA标记的酶C1-GOx和C2-HRP,由于P1与C1以及P2与C2为完全互补序列,因此采用DNA互补介导固定化技术实现GOx和HRP的共固定化。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将多巴胺和多巴胺的马来酰亚胺基衍生物在超声条件下与磁性四氧化三铁纳米粒子反应1h,制备多巴胺衍生物修饰的氨基-马来酰亚胺基双官能团磁性纳米粒子;
(2)将两条不同序列的5’ 巯基修饰的单链DNA C1和C2与三(2-羧乙基)膦盐酸盐TCEP在35-40℃条件下反应2-3 h,切断DNA间形成的二硫键,然后将反应后的单链DNA经过交联剂分别制备C1-GOx和C2-HRP,然后在25-30℃条件下反应12-30 h,合成巯基单链DNA标记的酶;
(3)将5’ 羧基修饰的单链DNA P1和5’ 巯基修饰的单链DNA P2与氨基-马来酰亚胺基双功能化的磁性四氧化三铁纳米粒子在25-30℃下反应5-7 h,制备单链DNA标记的双功能化磁性纳米粒子,然后用BSA对其进行封闭;
(4)将(2)中合成的巯基单链DNA标记的酶与(3)中合成的单链DNA标记的双功能化磁性纳米粒子在35-40℃反应3-4 h,经过DNA互补介导固定化技术将酶固定到双功能化磁性纳米粒子表面。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述的磁性四氧化三铁纳米粒子的合成方法为水热法,粒径为12-18 nm。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的交联剂为4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-硫代-N-琥珀酰亚胺酯钠盐suflo-smcc,用量为1 mg。
6.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(2)、(3)中所述的5’ 羧基修饰的单链DNA P1和5’ 巯基修饰的单链DNA C1,5’ 巯基修饰的单链DNA P2和5’ 巯基修饰的单链DNAC2为碱基互补配对且碱基数为24。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述的酶的用量为2-4 mg,TCEP浓度为30-40 mM,DNA用量为0.5 OD。
8.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所示的氨基-马来酰亚胺基双功能化磁性纳米粒子的用量为25 mg,DNA用量为0.5 OD。
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CN107760666A (zh) | 2018-03-06 |
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