JPH0417635B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素を疎水性の多孔性担体に高い吸
着率で吸着固定化する方法に関するものであり、
さらに詳しくは、酵素を、無機塩及び水溶性高分
子物質の両成分の存在下において、疎水性の多孔
性担体に高い吸着率で吸着固定化する方法に関す
るものである。 〔従来の技術〕 酵素は、生体細胞が産生する一種の有機触媒で
あり、機能すなわち触媒としての根本的性質は、
一般の科学触媒と全く同じといえる。 しかしながら、酵素は、タンパク質を主要構成
成分とする生物触媒としての特性から、実際に触
媒として使用する場合の取扱い方式は、化学触媒
の場合と大きな差異があり、通常、酵素は、水溶
性の形態でいわゆる回分方式により使用されるた
め、一般の科学触媒のように反復利用することが
できないこと、また、一反応ごとに多量の酵素が
消費されること等、酵素には、工場上の利用性の
面での種々のマイナス要因が存在する。 そこで、酵素を一般の科学触媒と同様に取扱う
ことを可能にする方法として、酵素をその活性を
保持させたまま不溶化したいわゆる不溶化酵素の
形態で基質と反応させようとするアイデイアが提
案され、酵素の基礎研究、工業的利用の両面にお
いて、多くの利点を与える革新的技術として、確
立されるに至つた。 酵素の不溶化の方式としては、酵素タンパク分
子そのものに疎水性の官能基を導入する方法、酵
素を水不溶性の担体と結合させる方法等が基本的
なものであり、このうち、後者については、吸着
力のある担体に酵素を直接吸着させ、物理吸着に
より酵素を担体に結合させた不溶化酵素すなわち
吸着固定化酵素等が種々開発されている。例え
ば、活性炭、酸性白土等を吸着剤として使用し、
これらに、糖化型アミラーゼを吸着させて調製し
た水に不溶なコンプレツクスを用いてデンプンの
加水分解を行つた事例等が報告されている。（「工
業化学雑誌」72巻、２号（1969）第489−492項）。 〔発明が解決しようとする課題〕 ところで、このような吸着担体に酵素を吸着さ
せて調製した吸着固定化酵素を、工業上利用可能
な実用化技術として完成させるためには、実際問
題として、越えるべきいくつかの障壁が存在す
る。その代表的なものとして、吸着担体に対する
酵素の吸着率の問題があげられる。従来、吸着固
定化酵素について、高い吸着率を達成する好適な
吸着担体の開発、吸着率を向上化させるための吸
着条件の検討等、多角的な検討が重ねられてきた
結果、特に、疎水性担体に関しては、例えば、無
機塩を添加して酵素を吸着固定化する方法等が開
発されているが、本発明者らが検討したところで
は、従来の方法は、必ずしも、疎水性担体に対す
る酵素の吸着率が、満足すべき値ではなく、これ
を工場上利用可能なものとするには、これらに吸
着率を一段を向上させる新しい技術を開発するこ
とが不可欠の前提条件となることが判明した。 すなわち、酵素によつては高濃度の無機塩を添
加しないと疎水性担体に吸着されないこと及び高
濃度の無機塩を添加してもなお未吸着酵素が残る
こと等の問題点があることがわかつた。吸着率が
低いことは一定量の酵素を吸着させるのに、かさ
比重の大きな多孔性担体の必要量が増すことを意
味するものであり、装置の大型化等の問題点が生
じる。 〔課題を解決するための手段〕 そこで、本発明者らは、吸着固定化酵素をめぐ
るこのような技術的背景を踏まえ、疎水性担体に
対する酵素の吸着率を一段と向上させる革新的な
技術を開発することを目標として鋭意検討を積み
重ねた結果、高濃度の無機塩の水溶性高分子物質
の両成分の存在下で、酵素を疎水性の多孔性担体
に吸着固定化することにより、吸着率を一段と向
上化し得ることを見い出して本発明を完成するに
至つた。 すなわち、本発明は、以下の通りである。 (1) 無機塩及び水溶性高分子物質の両成分の存在
下で、酵素を疎水性の多孔性担体に吸着固定化
することを特徴とする酵素の固定化方法。 (2) 無機塩が、硫酸アンモニウムである上記(1)記
載の固定化方法。 (3) 水溶性高分子物質が、ポリエチレングリコー
ルである上記(1)記載の固定化方法。 (4) 疎水性の多孔性担体が、活性炭である上記(1)
記載の固定化方法。 なお、前記したように、無機塩を添加して酵素
を疎水性担体に吸着固定化する方法は公知である
が、無機塩の水溶性高分子物質の両成分を添加す
ると酵素の疎水性担体への吸着率が一段と向上す
ることは、本発明らが初めて見い出した知見であ
り、このような事実についての報告はこれまでに
全く存在しない。 このように、本発明は、酵素を疎水性の多孔性
担体に高い吸着率で吸着固定化する方法を提供す
ることを目的とするものであり、その構成は、無
機塩及び水溶性高分子物質の両成分の存在下で、
酵素を疎水性の多孔性担体に吸着固定化すること
を特徴とするものである。 無機塩としては、硫酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、硝酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩
化リチウム等の一般的な無機塩が使用されるが、
好適には硫酸アンモニウムが使用される。 これらの無機塩の添加量は、水相の反応液に対
して、飽和度25〜95％が好ましいが、飽和度40〜
80％が特に好ましい。 水溶性高分子物質としては、ポリエチレングリ
コール、ポリプロピレングリコール等のポリアル
キレンオキシド類、デキストラン等の多糖類、及
びポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール等
の合成ポリマー等が使用されるが、特に好ましく
はポリエチレングリコール等のポリアルキレンオ
キシド類が使用される。これらの水溶性高分子物
質分子量としては、1000〜500000が好ましいが、
特に好ましくは2000〜10000であり、その添加量
は重量％で2.0〜60％、好ましくは2.5〜20％であ
る。 疎水性の多孔性担体としては、疎水性基を有す
るポリアクリルアミドゲル、多糖類ゲル、発泡ポ
リスチレンゲル、発泡フエノール樹脂ビーズ及び
活性炭等であるが、特に好ましくは活性炭が使用
される。その添加量は、特に制限はないが好まし
くは10％付近である。 ここで使用する酵素は、特に限定は無く従来公
知の各種のものを単独で又は２種以上混合して使
用することができる。その代表例としては、カタ
ラーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酸化酵素
類、グリシンアミノトランスフエラーゼ等の転移
酵素類、アスパラギナーゼ、リパーゼ、プロテア
ーゼ等の加水分解酵素、グルコースイソメラーゼ
等の異性化酵素類、アスパラギンシンセターゼ等
のリガーゼ類及びアルコール脱水素酵素等の酸化
還元酵素類が例示される。これらのうち好ましい
のは、加水分解酵素や酸化還元酵素であり、特に
リパーゼ（Porcine Pancreas 由来），3α−ヒド
ロキシステロイド脱水素酵素が好適なものとして
あげられる。 〔発明の効果〕 本発明は、無機塩と水溶性高分子物質の両成分
の存在下で、酵素を疎水性の多孔性担体に吸着固
定化することにより、吸着率を著しく向上化する
効果を有する。それによつて、かさ比重の大きな
多孔性担体の使用が可能になること、さらに、多
孔性担体の使用量の減少化が可能になること、装
置の小型化が可能となること等、工業上の利用性
の面でのメリツトは、きわめて顕著なものであ
る。 以下に、本発明の実施例及び比較例を記載し
て、さらに本発明を詳細に説明する。 〔実施例〕 実施例 １〜３ 所定量の酵素を、0.1Mりん酸緩衝液（PH7.0）
（13μ）に溶解させ、50ｍMNDH水溶液（4.0μ
）、飽和度90％硫酸アンモニウム水溶液（PH
7.0）（37μ）及びポリエチレングリコール
（Mw6000）（4.1mg）を加え、攪拌した。反応混
合物にイソオクタン（0.2ml）及び活性炭（12mg）
（粒状シラサギ，武田薬品工場(株)製）を加え、一
時間攪拌した。遠心分離により有機層を分離後、
水相から4μずつサンプリングして水層に残存
している未吸着酵素をローリー法により定量し
た。結果を表１に示す。 但し、酵素としてリパーゼを用いた場合には、
NADHは無添加である。 〔比較例〕 比較例 １〜４ 所定量の酵素を、0.1Mりん酸緩衝液（PH7.0）
（13μ）に溶解させ、50ｍMNADH水溶液
（4.0μ）、飽和度90％硫酸アンモニウム水溶液
（PH7.0）（37μ）を加え、攪拌した。反応混合物
にイソオクタン（0.2ml）及び活性炭（12ml）（粒
状シラサギ，武田薬品工場(株)製）を加え、一時間
攪拌した。遠心分離により有機層を分離後、水相
から4μずつサンプリングして水層に残存して
いる未吸着酵素をローリー法により定量した。結
果を表１に示す。 但し、酵素としてリパーゼを用いた場合には、
NADHは無添加である。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 無機塩及び水溶性高分子物質の両成分の存在
   下で、酵素を疎水性の多孔性担体に吸着固定化す
   ることを特徴とする酵素の固定化方法。 ２ 無機塩が、硫酸アンモニウムである請求項１
   記載の固定化方法。 ３ 水溶性高分子物質が、ポリエチレングリコー
   ルである請求項１記載の固定化方法。 ４ 疎水性の多孔性担体が、活性炭である請求項
   １記載の固定化方法。