CN117646044A - 多酶级联合成(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法及其应用 - Google Patents
多酶级联合成(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开多酶级联合成(1R,2R)‑4‑甲砜基苯丝氨醇的方法，以D‑丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D‑丙氨酸为底物，利用氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，通过多酶级联反应合成(1R,2R)‑4‑甲砜基苯丝氨醇。合成路线为：D‑丝氨酸首先被氨基酸氧化酶转化为β‑羟基丙酮酸，β‑羟基丙酮酸和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶的催化下生成(R)‑1‑对甲砜基苯基‑1‑羟基‑2‑氧代‑3‑丙醇(即中间产物2a)，中间产物2a和D‑丙氨酸继续在转氨酶的催化下转化为(1R,2R)‑4‑甲砜基苯丝氨醇。本方案无需添加有机溶剂且无副产物生成，转化率高达99.9％，建立了一条新的(1R,2R)‑4‑甲砜基苯丝氨醇的高效绿色酶法合成路线。
Description
技术领域
本发明属于生物催化和生物制药领域，具体涉及一种利用生物催化剂合成氟苯尼考手性中间体(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法。
背景技术
氟苯尼考，化学名称为D(+)-苏-1-对甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3-氟丙醇，结构式如下所示：
氟苯尼考是在八十年代后期成功研制的一种新的兽医专用β-氨基醇类抗生素，1990年首次在日本上市，1993年挪威批准该药治疗鲑的疖病，1995年法国、英国、奥地利、墨西哥及西班牙批准用于治疗牛呼吸系统细菌性疾病。在日本和墨西哥还批准用作猪的饲料添加剂，预防和治疗猪的细菌性疾病。氟苯尼考因其具有更好的抗菌活性、安全性和有效性，不易产生耐药性，没有再生障碍性贫血、致畸、致癌和致突变等作用，是替代氯霉素和甲砜霉素的新一代氯霉素类抗生素。
(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇是合成氟苯尼考的关键手性砌块。目前化学法合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇，是以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，经过铜盐催化、硫酸酯化、D-酒石酸手性拆分、硼氢化钾还原等多步反应，合成路线如下所示。
上述化学法合成的反应过程繁琐，反应条件剧烈；生产过程产生大量的高盐和有机废水，严重污染环境；而且在硼氢化钾还原步骤还会产生氢气，存在安全生产问题。
因此建立(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的高效绿色合成路线，具有广阔的应用前景，也是目前手性合成研究的难点。2021年，上海交通大学林双君教授课题组以对甲砜基苯甲醛与羟基丙酮酸锂为底物，利用转酮酶EcTK1_YYH和转氨酶ATA117_ACHH的催化合成(1R,2R)-1,3-二羟基-2-氨基-1-对甲砜基苯丙烷(One-Pot Asymmetric Synthesis of anAminodiol Intermediate of Florfenicol Using Engineered Transketolase andTransaminase，2021，ACS Catalysis；专利“一种利用酶级联反应合成(1R,2R)-AMPP的方法”，CN202110162637.0)。但该方法羟基丙酮酸锂价格昂贵，成本高，反应转化率低。
综上所述，针对现有技术中所存在的相关问题，现在亟需研发出一种成本低、反应条件温和、立体选择性好、安全环保、高效绿色的氟苯尼考手性中间体(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的生物合成方法。
发明内容
本发明的目的在于提供多酶级联合成氟苯尼考中间体(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，以解决现有技术中(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇合成所存在的反应过程繁琐，产生污染环境的副产物，成本高，反应转化率低等技术问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，以D-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸为底物，利用氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，通过多酶级联反应合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇；合成路线包括：D-丝氨酸首先被氨基酸氧化酶转化为β-羟基丙酮酸，β-羟基丙酮酸和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶的催化下生成中间产物2a(化学名称为：(R)-1-对甲砜基苯基-1-羟基-2-氧代-3-丙醇)，中间产物2a和D-丙氨酸继续在转氨酶的催化下转化为(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇。
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，反应体系包括：100mL反应体系中含有50mM Tris-HCl缓冲液，氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶、转氨酶的含酶湿菌体5g，120mM D-丝氨酸，20mM对甲砜基苯甲醛，120mM D-丙氨酸，2.5mM 5′-磷酸吡哆醇，2mM MgCl2，500U/mL过氧化氢酶，1mM硫胺素焦磷酸；反应条件为：所有原料混合后置于30℃下振荡反应14h。
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述氨基酸氧化酶、所述丙酮酸脱羧酶和所述转氨酶来自于采用基因工程手段共表达氨基酸氧化酶基因-丙酮酸脱羧酶基因-转氨酶基因的重组大肠杆菌全细胞，或者所述氨基酸氧化酶、所述丙酮酸脱羧酶和所述转氨酶来自于采用基因工程手段分别表达氨基酸氧化酶基因、丙酮酸脱羧酶基因、转氨酶基因的重组大肠杆菌全细胞。
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述氨基酸氧化酶包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白；所述丙酮酸脱羧酶包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白；所述转氨酶包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述氨基酸氧化酶为RtDAAO，编码所述RtDAAO的基因序列如SEQ ID NO：2所示；所述丙酮酸脱羧酶为SwPDC，编码所述SwPDC的基因序列如SEQ ID NO：4所示；所述转氨酶为CeTA，编码所述CeTA的基因序列如SEQ ID NO：6所示。
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，100mL反应体系中，含5g氨基酸氧化酶基因-丙酮酸脱羧酶基因-转氨酶基因的共表达重组大肠杆菌全细胞、50mM Tris-HCl缓冲液、120mM D-丝氨酸、20mM对甲砜基苯甲醛、120mM D-丙氨酸、2.5mM 5’-磷酸吡哆醇、2mMMgCl2、500U/mL过氧化氢酶、1mM硫胺素焦磷酸。
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，100mL反应体系中，含5g氨基酸氧化酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、5g丙酮酸脱羧酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、5g转氨酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、50mM Tris-HCl缓冲液，120mM D-丝氨酸、20mM对甲砜基苯甲醛、120mM D-丙氨酸、2.5mM 5’-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、500U/mL过氧化氢酶、1mM硫胺素焦磷酸。
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，所述合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的反应结束后，使用乙酸乙酯淬灭反应，取上清液进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:3(v/v)。
本发明至少具有以下有益效果：
本申请在本领域首次提出直接使用D-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸作为底物，采用多酶级联反应“一锅法”高效合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇。该方法包括以下步骤：以D-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸为底物，利用氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，多酶级联合成氟苯尼考手性中间体(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇，合成路线如下所示：
本发明提供一种利用多酶级联不对称合成氟苯尼考手性中间体(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法。本申请的合成方法以廉价易得的D-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸为底物，通过氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶及转氨酶多酶级联反应，在常温常压下通过“一锅法”反应便可获得氟苯尼考的关键手性砌块(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇，目标产物的转化率为99.9％。本申请的(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇合成方法无需分离中间产物，具有成本低、反应条件温和、立体选择性好、安全环保等特点，为一种高效绿色生物合成途径。
附图说明
图1为本申请实施例3中采用酶法合成中间产物2a的HPLC检测图；1为底物对甲砜基苯甲醛，2为中间产物2a标品，3为实施例3中采用酶法合成的中间产物2a样品。
图2为本申请实施例3中中间产物2a的1H-NMR图谱。
图3为本申请实施例4和实施例5中多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的HPLC检测图；1为底物对甲砜基苯甲醛，2为中间产物2a标品，3为(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇标品，4为实施例4中多酶级联合成的(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇样品，5为实施例5中多酶级联合成的(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇样品。
图4为本申请实施例4中(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的1H-NMR图谱。
图5为本申请实施例5中多酶级联合成的(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的手性分析图；1为(DL)-4-甲砜基苯丝氨醇标品，2为(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇标品，3为实施例5中多酶级联合成的(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇样品。
具体实施方式
以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到，本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。
目前以D-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸为底物，通过氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶及转氨酶多酶级联不对称催化合成光学纯(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的合成路径还无人研究过。本发明的技术人员致力于开发一种温和、高效、经济、环保安全的(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的合成路线。
本申请使用D-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸作为底物，“一锅法”高效合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇，具体包括以下步骤：以D-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸为底物，利用氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，多酶级联催化合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇，合成路线如下所示：
以下按照本申请的研究思路，依次介绍本申请的主要实验过程和主要实施方案。为表达简便和节省篇幅，以下所列的实施例仅为申请人经过反复验证成功后的代表性实验，未列出的部分实验为本技术领域的通用技术。本申请所用试剂和实验仪器均为申请人实验室的现有实验用品，具体信息在此不进行赘述。
实施例1氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶、转氨酶的基因挖掘
(1)氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase,DAAO)可催化D-丝氨酸的氧化。利用来源于Rhodotorula toruloides NP11的氨基酸氧化酶，简称RtDAAO(ACCESSION：XP_016270247)催化D-丝氨酸的氧化，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码该氨基酸氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
(2)通过基因挖掘筛选到10种不同来源的丙酮酸脱羧酶(Pyruvatedecarboxylase，PDC)，具体信息参见表1所示。
将氨基酸氧化酶RtDAAO氧化D-丝氨酸的产物，分别与上述10种不同来源的丙酮酸脱羧酶混合，采用如下的反应体系进行反应后再进行HPLC检测，目标是筛选出反应效率最高、转化率最好的PDC。
1mL的反应体系中，含50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、30mM D-丝氨酸、5mM对甲砜基苯甲醛、1mM硫胺素焦磷酸、2mM MgCl2、500U/mL过氧化氢酶、50mg氨基酸氧化酶表达细胞BL21-RtDAAO、50mg丙酮酸脱羧酶表达细胞BL21-PDC。
反应条件为：在30℃下反应4h，用乙酸乙酯猝灭反应，利用HPLC检测丙酮酸脱羧酶的转化率。
HPLC检测条件为：检测波长：224nm；色谱柱：Agilent C18 column(250×4.6mm，5μm)；流动相：KH2PO4溶液(50mM，pH8.0)/乙腈＝85/15(v/v)；流速：1mL/min，温度：30℃；上样量：10μL。
依照底物的标准曲线，计算各反应液中的底物残留量，用于转化率的计算，以评估各PDC的转化性能。各PDC的转化率如下表1所示，其中SwPDC是转化率最好的丙酮酸脱羧酶，将D-丝氨酸的氧化产物β-羟基丙酮酸转化为中间产物2a的转化率为99.88％。SwPDC的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，编码该丙酮酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
表1 10种丙酮酸脱羧酶的转化率统计
(3)通过基因挖掘筛选到10种不同来源的转氨酶(transaminase，TA)，可参见表2所示，采用如下的反应体系，反应完成后进行HPLC检测，目标是筛选出转化率最好的TA。
1mL的反应体系中，含50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、5mM中间体2a、30mM D-丙氨酸、2.5mM 5′-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、50mg转氨酶表达细胞BL21-TA。
反应条件：在25℃下反应14h后用乙酸乙酯猝灭反应，取上清液利用HPLC检测转化率。检测方法与实施例1中的(2)所列方法相同。
依照底物的标准曲线，计算各反应液中的底物残留量，用于转化率的计算，以评估各TA的转化性能。各TA的转化率如表2所示，CeTA是转化率最好的转氨酶，将中间产物2a转化为目标产物(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的转化率达86.54％。CeTA的氨基酸序列如SEQID NO：5所示，编码该转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
表2 10种转氨酶的转化率统计
实施例2氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶、转氨酶的重组表达
通过PCR扩增获得带有酶切位点的RtDAAO、SwPDC和CeTA编码基因rtdaao、swpdc和ceta，分别通过BamHI和XhoI限制性内切酶酶切后，连接到质粒pCDFDuet-1、pACYCDuet-1、pET28a上构建重组质粒pCDFDuet-rtdaao、pACYCDuet-swpdc，pET28a-ceta，并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别获得工程菌BL21-RtDAAO、BL21-SwPDC和BL21-CeTA。前述试验方法均为本领域的通用技术，在此不对实验过程和实验条件进行详细阐述。
利用重叠延伸PCR的方法，构建共表达载体pETDuet-rtdaao-swpdc-ceta。
基本方法如下：
①以pCDFDuet-rtdaao为模板，利用引物F1(SEQ ID NO：7)和R1(SEQ ID NO：8)扩增rtdaao片段；
②以pACYCDuet-swpdc为模板，利用引物F2(SEQ ID NO：9)和R2(SEQ ID NO：10)扩增swpdc片段；
③以pET28a-ceta为模板，利用引物F3(SEQ ID NO：11)和R3(SEQ ID NO：12)扩增ceta片段；
④以上述rtdaao片段、swpdc片段和ceta片段为模板，利用引物F1(SEQ ID NO：7)和R3(SEQ ID NO：12)扩增rtdaao-swpdc-ceta片段；
⑤利用BamHI和XhoI限制性内切酶对rtdaao-swpdc-ceta片段和pET28a进行双酶切，回收后，利用T4连接酶进行重组，构建共表达质粒pETDuet-rtdaao-swpdc-ceta。
⑥将DNA测序确证无误的共表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得共表达工程菌BL21-RtDAAO-SwPDC-CeTA。
工程菌的诱导表达：在平板上挑取工程菌的单克隆接种到25mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，200rpm过夜培养，获得种子液。移取5mL种子液转接到500mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，200rpm条件下培养。当重组大肠杆菌培养液的OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，在25℃条件下诱导表达12h。最后于4℃、6000rpm离心5min，收集菌体，于-80℃下冻存备用。
实施例3中间产物2a的合成
在如下的反应体系中，D-丝氨酸首先被氨基酸氧化酶RtDAAO转化为β-羟基丙酮酸，β-羟基丙酮酸和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶SwPDC的催化下生成中间产物2a，反应过程如下所示：
具体操作如下：
100mL反应体系中，含50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、120mM D-丝氨酸、20mM对甲砜基苯甲醛、1mM硫胺素焦磷酸、2mM MgCl2、500U/mL过氧化氢酶、5g氨基酸氧化酶表达细胞BL21-RtDAAO、5g丙酮酸脱羧酶表达细胞BL21-SwPDC，在30℃下反应14h后进行HPLC检测，检测方法与实施例1中的(2)所列方法相同，转化率达99.9％(参见附图1所示，反应液中底物已耗尽)。
取反应后的上清液，使用乙酸乙酯萃取，取有机相进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝10:1(v/v)。获得的产品进行1H-NMR检测，确定产物为中间体2a(参见附图2的1H-NMR检测结果所示)。
实施例4多酶级联“一锅法”合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇
在如下的反应体系中，D-丝氨酸首先被氨基酸氧化酶RtDAAO转化为β-羟基丙酮酸，β-羟基丙酮酸和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶SwPDC的催化下生成中间产物2a，中间产物2a继续在转氨酶CeTA的催化下，转化为目标产物(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇，具体操作如下：
100mL反应体系中，含50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液、5g BL21-Rt DAAO湿菌体、5g BL21-SwPDC湿菌体和5g BL21-CeTA湿菌体、120mM D-丝氨酸、20mM对甲砜基苯甲醛、120mM D-丙氨酸、2.5mM 5′-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、500U/mL过氧化氢酶、1mM硫胺素焦磷酸，在30℃下反应14h后进行HPLC检测，检测方法与实施例1中的(2)所列方法相同，转化率为99.9％(参见附图3所示，反应液中底物已耗尽)。
取反应后的上清液，使用乙酸乙酯萃取，取有机相进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:3(v/v)。获得的产品进行1H-NMR检测，确定为(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇(参见附图4的1H-NMR检测结果所示)。
实施例5多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法
本实施例5与实施例4不同之处在于：本实施例中用5gBL21-RtDAAO-SwPDC-CeTA共表达的大肠杆菌菌体代替三种单独表达的大肠杆菌菌体BL21-RtDAAO、BL21-SwPDC和BL21-CeTA。100mL反应体系中含有50mM Tris-HCl缓冲液，5g BL21-RtDAAO-SwPDC-CeTA共表达的大肠杆菌菌体、20mM对甲砜基苯甲醛、120mM D-丝氨酸、120mM D-丙氨酸、2.5mM5’-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、500U/mL过氧化氢酶、1mM硫胺素焦磷酸；反应条件为：所有原料混合后置于30℃下振荡反应14h。反应后进行HPLC检测，检测方法与实施例1中的(2)所列方法相同，转化率为99.9％(参见附图3所示)。取反应后的上清液，使用乙酸乙酯萃取，取有机相进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:3(v/v)。获得的样品利用HPLC进行光学纯度的分析。
HPLC检测条件为：检测波长：224nm；色谱柱：Crownpak CR-I(+)(150×3.0mm,5μm)；流动相：HClO4溶液(16.2g/L，pH1.0)；流速：0.15mL/min，温度：12℃；上样量：3μL。
(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇和(1S,2S)-4-甲砜基苯丝氨醇的保留时间分别为11.5mim和12.5min。对映体过量值(ee)的计算公式如下：
其中：S1R,和S1S,分别为(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇和(1S,2S)-4-甲砜基苯丝氨醇的峰面积。
经液相检测并分析，获得的(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇样品具有较高的光学纯度，ee值达99％以上(参见附图5所示)。
Claims (9)
1.多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，其特征在于，以D-丝氨酸、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸为底物，利用氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，通过多酶级联反应合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇；合成路线为：D-丝氨酸首先被氨基酸氧化酶转化为β-羟基丙酮酸，β-羟基丙酮酸和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶的催化下生成(R)-1-对甲砜基苯基-1-羟基-2-氧代-3-丙醇(即中间产物2a)，中间产物2a和D-丙氨酸继续在转氨酶的催化下转化为(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇。
2.根据权利要求1所述的多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，其特征在于，反应体系包括：100mL反应体系中含有50mM Tris-HCl缓冲液，氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶、转氨酶的含酶湿菌体5g，120mM D-丝氨酸，20mM对甲砜基苯甲醛，120mM D-丙氨酸，2.5mM 5′-磷酸吡哆醇，2mM MgCl2，500U/mL过氧化氢酶，1mM硫胺素焦磷酸；反应条件为：所有原料混合后置于30℃下反应14h。
3.根据权利要求2所述的多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，其特征在于，所述氨基酸氧化酶、所述丙酮酸脱羧酶和所述转氨酶来自于采用基因工程手段共表达氨基酸氧化酶基因-丙酮酸脱羧酶基因-转氨酶基因的重组大肠杆菌全细胞，或者所述氨基酸氧化酶、所述丙酮酸脱羧酶和所述转氨酶来自于采用基因工程手段分别表达氨基酸氧化酶基因、丙酮酸脱羧酶基因、转氨酶基因的重组大肠杆菌全细胞。
4.根据权利要求3所述的多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，其特征在于，所述氨基酸氧化酶包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白；所述丙酮酸脱羧酶包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白；所述转氨酶包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。
5.根据权利要求4所述的多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，其特征在于，所述氨基酸氧化酶为RtDAAO，编码所述RtDAAO的基因序列如SEQ ID NO：2所示；所述丙酮酸脱羧酶为SwPDC，编码所述SwPDC的基因序列如SEQ ID NO：4所示；所述转氨酶为CeTA，编码所述CeTA的基因序列如SEQ ID NO：6所示。
6.根据权利要求4所述的多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，其特征在于，所述100mL反应体系中，含5g氨基酸氧化酶基因-丙酮酸脱羧酶基因-转氨酶基因的共表达重组大肠杆菌全细胞、50mM Tris-HCl缓冲液，120mM D-丝氨酸、20mM对甲砜基苯甲醛、120mM D-丙氨酸、2.5mM 5’-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、500U/mL过氧化氢酶、1mM硫胺素焦磷酸。
7.根据权利要求4所述的多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，其特征在于，所述100mL反应体系中，含5g氨基酸氧化酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、5g丙酮酸脱羧酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、5g转氨酶基因表达重组大肠杆菌全细胞、50mM Tris-HCl缓冲液，120mM D-丝氨酸、20mM对甲砜基苯甲醛、120mM D-丙氨酸、2.5mM 5’-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、500U/mL过氧化氢酶、1mM硫胺素焦磷酸。
8.根据权利要求2-7任意一项所述的多酶级联合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的方法，其特征在于，所述合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇的反应结束后，使用乙酸乙酯淬灭反应，取上清液进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5:3(v/v)。
9.一种氟苯尼考手性中间体(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇，其特征在于：其由权利要求1至8之一所述的方法制得。
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