CN117185971A - 一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，以β‑氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛和D‑丙氨酸为底物，在丙酮酸脱羧酶和转氨酶的级联催化下，“一锅法”合成氟苯尼考胺，再经酰胺化反应合成氟苯尼考。合成路线包括：β‑氟丙酮酸钠盐和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶的催化下生成(1R)‑3‑氟‑1‑羟基‑1‑对甲砜基苯基‑2‑丙酮；(1R)‑3‑氟‑1‑羟基‑1‑对甲砜基苯基‑2‑丙酮和D‑丙氨酸继续被反应体系中的转氨酶转化为氟苯尼考胺，最后氟苯尼考胺经一步化学的酰胺化反应合成氟苯尼考。本发明与传统的氟苯尼考化学合成法相比，步骤更少，且中间涉及构型的步骤均由高立体选择性的酶催化替代，省却拆分步骤，反应过程更加绿色环保，原子经济性更高，适宜推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物催化和制药工程领域，具体涉及一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法。
背景技术
氟苯尼考，化学名称为D(+)-苏-1-对甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3-氟丙醇，结构式如下所示：
氟苯尼考是一种β-氨基醇类抗生素，具有抗菌力强，抗菌谱广，毒副作用小，无残留，不易产生耐药性等特点，是替代氯霉素和甲砜霉素的新一代抗生素，主要用于治疗敏感细菌引起的畜禽和水产动物的细菌性疾病和支原体感染。传统的氟苯尼考化学合成工艺是以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，经过铜盐催化、硫酸酯化、D-酒石酸手性拆分、硼氢化钾还原、环化、氟化、酰胺化等多步反应，合成路线如下所示：
该化学合成路线步骤繁琐，反应条件剧烈，其中涉及的铜盐催化剂在排放前需要严格的回收处理。D-酒石酸拆分剂的回收步骤多且会产生大量的废水，传统的氟苯尼考化学合成法生产成本高、污染大。因此开发低成本的氟苯尼考绿色合成路线，是目前氟苯尼考产业的研究热点。
目前对氟苯尼考合成路线的改进主要集中在个别步骤的替代。例如专利CN110577948B利用L-苏氨酸醛缩酶将500mM的对甲砜基苯甲醛和1M的甘氨酸转化为(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸，在30℃下反应6h，转化率可达75％，de值达60％。专利CN 110951799 B利用L-苏氨酸转醛酶、乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的多酶级联反应，“一锅法”合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸。专利CN 114875084 A以β-羟基丙酮酸锂和对甲砜基苯甲醛为原料，先后经转酮酶和转氨酶的催化作用合成(1R,2R)-4-甲砜基苯丝氨醇，直接跨过铜盐催化、硫酸酯化、D-酒石酸手性拆分和硼氢化钾还原等步骤，明显缩短了氟苯尼考的合成路线。然而该路线的原材料β-羟基丙酮酸锂价格昂贵、合成成本高，反应转化率低。
综上所述，针对现有技术中所存在的相关问题，现在亟需研发出一种成本低、反应条件温和、立体选择性好、安全环保、高效绿色的氟苯尼考合成新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，以解决现有氟苯尼考合成技术中所存在的反应过程繁琐，环境污染大，成本高，反应转化率低等问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，包括：
1)β-氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛与D-丙氨酸通过丙酮酸脱羧酶和转氨酶的级联催化生成氟苯尼考胺；
2)以氟苯尼考胺为原料合成氟苯尼考。
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤2)中所述氟苯尼考胺在二氯乙酸甲酯的作用下经酰胺化反应合成氟苯尼考。
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中所述丙酮酸脱羧酶和转氨酶来自于采用基因工程手段共表达丙酮酸脱羧酶和转氨酶的重组大肠杆菌全细胞，或者为各自表达丙酮酸脱羧酶和转氨酶的重组大肠杆菌全细胞。
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中所述丙酮酸脱羧酶包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。
作为一种较优的实施方式，优选的，所述丙酮酸脱羧酶为SwPDC，编码所述SwPDC的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中所述转氨酶包含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。
作为一种较优的实施方式，优选的，所述转氨酶为CeTA，编码所述CeTA的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，氟苯尼考的合成包含3个关键步骤：①以D-丝氨酸为原料，利用氨基酸氧化酶为催化剂，辅以化学氟化反应合成β-氟丙酮酸钠盐；②以β-氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸为原料，以丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，经多酶级联反应合成氟苯尼考胺；③最后氟苯尼考胺经一步化学的酰胺化反应合成氟苯尼考。合成路线如下所示：
作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中所述β-氟丙酮酸钠盐是以D-丝氨酸为原料，利用氨基酸氧化酶为催化剂，辅以化学氟化反应合成。其中，化学氟化反应是利用三氟乙酸和氢氧化钠进行化学氟化反应，合成β-氟丙酮酸钠盐。
作为一种可能的实施方式，进一步，所述氨基酸氧化酶来自于采用基因工程手段过表达氨基酸氧化酶基因的重组大肠杆菌全细胞；
所述氨基酸氧化酶包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。
作为一种较优的实施方式，优选的，所述氨基酸氧化酶为RtDAAO，编码所述RtDAAO的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
发明的有益效果在于：
本发明通过β-氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛和D-丙氨酸作为底物，“一锅法”合成氟苯尼考胺，氟苯尼考胺再经一步化学酰胺化反应，合成氟苯尼考，明显缩短了氟苯尼考的合成路线，且反应过程中能够保证高立体选择性，免去拆分步骤，提高原子经济性，具有成本低、反应条件温和、立体选择性好、安全环保等特点，为一种氟苯尼考高效绿色合成新路线。
附图说明
图1为实施例1中β-氟丙酮酸钠盐产品的1H-NMR结果。
图2为实施例4中氟苯尼考胺产品的HPLC和1H-NMR检测结果。
图3为实施例6中氟苯尼考产品的HPLC和1H-NMR检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下按照本申请的研究思路，依次介绍本申请的主要实验过程和主要实施方案。为表达简便和节省篇幅，以下所列的实施例仅为申请人经过反复验证成功后的代表性实验，未列出的部分实验为本技术领域的通用技术。本申请所用试剂和实验仪器均为申请人实验室的现有实验用品，具体信息在此不进行赘述。
实施例1β-氟丙酮酸钠盐的合成
氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase,DAAO)可催化D-丝氨酸的氧化。利用来源于Rhodotorula toruloides NP11的氨基酸氧化酶，简称RtDAAO(ACCESSION：XP_016270247)催化D-丝氨酸的氧化，反应后生成产物β-羟基丙酮酸；β-羟基丙酮酸在三氟乙酸与氢氧化钠共同存在的情况下会生成β-氟丙酮酸钠盐，反应过程如下所示：
氨基酸氧化酶RtDAAO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该氨基酸氧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
具体操作如下：
100mL反应体系中，含50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，100mM D-丝氨酸、500U/mL过氧化氢酶、5g氨基酸氧化酶表达细胞BL21-RtDAAO，在30℃下反应14h后取出，加入1M三氟乙酸淬灭反应，充分搅拌后加入氢氧化钠溶液调节pH至7，离心去除杂质。
取反应后的上清液，使用甲醇进行共沸。获得的产品进行1H-NMR检测，确定产物为β-氟丙酮酸钠盐(参见附图1的1H-NMR检测结果所示)。
实施例2级联催化合成氟苯尼考胺关键酶的挖掘
(1)通过基因挖掘筛选到10种不同来源的丙酮酸脱羧酶(Pyruvatedecarboxylase，PDC)，具体信息参见表1所示。
将β-氟丙酮酸钠盐分别与上述10种不同来源的丙酮酸脱羧酶混合，采用如下的反应体系进行反应后再进行HPLC检测，目标是筛选出反应效率最高、转化率最好的PDC。
1mL的反应体系中，含50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液、7.5mMβ-氟丙酮酸钠盐、5mM对甲砜基苯甲醛、1mM硫胺素焦磷酸、2mM MgCl2、50mg丙酮酸脱羧酶表达静息细胞BL21-PDC。
反应条件为：在30℃下反应12h，用乙酸乙酯猝灭反应，利用HPLC检测丙酮酸脱羧酶的转化率。依照底物的标准曲线，计算各反应液中的底物残留量，用于转化率的计算，以评估各PDC的转化性能。各PDC的转化率如表1所示，其中，SwPDC是转化率最高的丙酮酸脱羧酶，将β-氟丙酮酸钠盐转化为(1R)-3-氟-1-羟基-1-对甲砜基苯基-2-丙酮的转化率为99.52％。SwPDC的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码该丙酮酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
表110种丙酮酸脱羧酶的转化率统计
(2)通过基因挖掘筛选到10种不同来源的转氨酶(Transaminase，TA)，可参见表2所示，采用如下的反应体系，反应完成后进行HPLC检测，目标是筛选出转化率最好的TA。
1mL的反应体系中，含50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液、7.5mMβ-氟丙酮酸钠盐、5mM对甲砜基苯甲醛、100mM D-丙氨酸、2.5mM 5′-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、1mM硫胺素焦磷酸、50mg丙酮酸脱羧酶表达静息细胞BL21-SwPDC、50mg转氨酶TA表达静息细胞BL21-TA。
反应条件：在25℃下反应14h后用乙酸乙酯猝灭反应，取上清液利用HPLC检测转化率。依照底物对甲砜基苯甲醛和目标产物氟苯尼考胺的标准曲线，计算各反应液中的底物、中间产物和目标产物的含量，用于转化率的计算，以评估各TA的转化性能。各TA的转化率如表2所示，其中，CeTA是转化率最高的转氨酶，目标产物氟苯尼考氨的转化率可达99.21％。CeTA的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码该转氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
表210种转氨酶的转化率统计
实施例3氨基酸氧化酶、丙酮酸脱羧酶、转氨酶的重组表达
通过PCR扩增获得带有酶切位点的RtDAAO、SwPDC和CeTA编码基因rtdaao、swpdc和ceta，分别通过BamHI和XhoI限制性内切酶酶切后，连接到质粒pET28a上构建重组质粒pET28a-rtdaao、pET28a-swpdc，pET28a-ceta，并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，分别获得工程菌BL21-RtDAAO、BL21-SwPDC和BL21-CeTA。前述试验方法均为本领域的通用技术，在此不对实验过程和实验条件进行详细阐述。
利用重叠延伸PCR的方法，构建共表达载体pET28a-swpdc-ceta。基本方法如下：
①以pET28a-swpdc为模板，利用引物F1(SEQ ID NO.7)和R1(SEQ ID NO.8)扩增swpdc片段；
②以pET28a-ceta为模板，利用引物F2(SEQ ID NO.9)和R2(SEQ ID NO.10)扩增ceta片段；
③以上述swpdc片段和ceta片段为模板，利用引物F1(SEQ ID NO.7)和R2(SEQ IDNO.10)扩增swpdc-ceta片段；
④利用BamHI和XhoI限制性内切酶对swpdc-ceta片段和pET28a进行双酶切，回收后，利用T4连接酶进行重组，构建共表达质粒pET28a-swpdc-ceta。
⑤将DNA测序确证无误的共表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，获得共表达工程菌BL21-SwPDC-CeTA。
工程菌的诱导表达：在平板上挑取工程菌的单克隆接种到25mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，200rpm过夜培养，获得种子液。移取5mL种子液转接到500mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，200rpm条件下培养。当重组大肠杆菌培养液的OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，在25℃条件下诱导表达12h。最后于4℃、6000rpm离心5min，收集菌体，于-80℃下冻存备用。
实施例4多酶级联合成氟苯尼考胺
在如下的反应体系中，β-氟丙酮酸钠盐和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶SwPDC的催化下生成(1R)-3-氟-1-羟基-1-对甲砜基苯基-2-丙酮，(1R)-3-氟-1-羟基-1-对甲砜基苯基-2-丙酮继续和D-丙氨酸一起在转氨酶CeTA的催化下，转化为目标产物氟苯尼考胺，具体操作如下：
100mL反应体系中，含50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，5g BL21-SwPDC湿菌体和5gBL21-CeTA湿菌体、120mMβ-氟丙酮酸钠盐、50mM对甲砜基苯甲醛、120mM D-丙氨酸、2.5mM5′-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、1mM硫胺素焦磷酸，在30℃下反应16h后进行HPLC检测，de值>99％，ee值>99％，转化率>99％(参见附图2所示)。
取反应后的上清液，使用乙酸乙酯萃取，取有机相进行硅胶柱层析分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝5:1(v/v)。获得的产品进行1H-NMR检测，确定为氟苯尼考胺(参见附图2的1H-NMR检测结果所示)。
实施例5多酶级联反应“一锅法”合成氟苯尼考胺
本实施例与实施例4不同之处在于：
本实施例中用5g BL21-SwPDC-CeTA共表达的大肠杆菌菌体代替两种单独表达的大肠杆菌菌体BL21-SwPDC和BL21-CeTA。100mL反应体系中含有50mM Tris-HCl缓冲液，5gBL21-SwPDC-CeTA共表达的大肠杆菌菌体、50mM对甲砜基苯甲醛、120mMβ-氟丙酮酸钠盐、120mM D-丙氨酸、2.5mM 5′-磷酸吡哆醇、2mM MgCl2、1mM硫胺素焦磷酸；反应条件为：所有原料混合后置于30℃下反应16h。反应后进行HPLC检测，de值>99％，ee值>99％，转化率>99％。
实施例6氟苯尼考胺酰胺化生成氟苯尼考
在100mL三颈瓶中，加入实施例4或5所得的氟苯尼考胺2.0g，甲醇20mL和二氯乙酸甲酯1.2mL。加热至70-80℃搅拌反应1h，加入活性炭0.1g，保温脱色30min，趁热过滤。向滤液中缓慢滴加蒸馏水，至溶液出现浑浊时停止滴加，冷至室温，放置30min，抽滤，滤饼用20mL蒸馏水洗涤，抽干，105℃干燥，得1.9g氟苯尼考纯品，纯度>99％(参见附图3所示)。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，包括：
1)β-氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛与D-丙氨酸通过丙酮酸脱羧酶和转氨酶的级联催化生成氟苯尼考胺；
2)以氟苯尼考胺为原料合成氟苯尼考。
2.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤2)中所述氟苯尼考胺在二氯乙酸甲酯的作用下经酰胺化反应合成氟苯尼考。
3.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤1)中所述丙酮酸脱羧酶和转氨酶来自于采用基因工程手段共表达丙酮酸脱羧酶和转氨酶的重组大肠杆菌全细胞，或者为各自表达丙酮酸脱羧酶和转氨酶的重组大肠杆菌全细胞。
4.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤1)中所述丙酮酸脱羧酶包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。
5.根据权利要求1或4所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶为SwPDC，编码所述SwPDC的基因序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤1)中所述转氨酶包含SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。
7.根据权利要求1或6所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，所述转氨酶为CeTA，编码所述CeTA的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
8.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤1)中所述β-氟丙酮酸钠盐是以D-丝氨酸为原料，利用氨基酸氧化酶为催化剂，辅以化学氟化反应合成。
9.根据权利要求8所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，所述氨基酸氧化酶来自于采用基因工程手段过表达氨基酸氧化酶基因的重组大肠杆菌全细胞；
所述氨基酸氧化酶包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或者与所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。
10.根据权利要求8或9所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，所述氨基酸氧化酶为RtDAAO，编码所述RtDAAO的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
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