CN116064701A - 一种β-烟酰胺单核苷酸的生产工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β‑烟酰胺单核苷酸的生产工艺。该工艺以腺苷与六偏磷酸钠在AK腺苷激酶的作用下磷酸化，并同时在酸性离子交换树脂的催化下脱去腺嘌呤，得到5‑磷酸核糖；得到的5‑磷酸核糖与烟酰胺在烟酰胺焦磷酸转移酶的作用下缩合生成烟酰胺单核苷酸。本发明采用两步酶法工艺，原料成本低廉易获取，全程水相反应，不需要经过不稳定的中间体，直接制得烟酰胺单核苷酸，收率高，后处理简单，是一条安全、环保、经济的绿色生产工艺路线。

Description

一种β-烟酰胺单核苷酸的生产工艺

技术领域：

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的生产工艺。

背景技术：

烟酰胺单核苷酸也叫β-烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide Mononucleotide，β-NMN)，结构如化合物Ⅰ所示。

β-烟酰胺单核苷酸在人体细胞能量生成中扮演重要角色，参与细胞内NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，细胞能量转化的重要辅酶)的合成，是NAD⁺的关键前体之一。DavidScinclair研究团队在文献Science,2017,355,1312-1317中报道，NAD⁺在小鼠体内的增加，能够使得大龄小鼠的组织和肌肉衰老迹象被延缓，这项研究工作使得人类向实现长寿梦想迈进了一大步。NAD⁺分子量过大，口服吸收利用率低。但随着对NAD⁺前体小分子物质β-烟酰胺单核苷酸的研究发现服用β-烟酰胺单核苷酸可以有效提升体内NAD⁺的浓度并显著改善人体新陈代谢，使得β-烟酰胺单核苷酸成为了“不老神药”。这也促使全球医药、食品、化妆品界科研人员不断的对β-烟酰胺单核苷酸进行研究与开发。

关于β-烟酰胺单核苷酸的制备方法的报道很多，主要有化学合成和酶法制备。

常见的化学生产工艺如Scheme 1和Scheme 2所示：

该化学生产工艺使用到危险物料三氯氧磷和大量有机溶剂，且存在中间体不稳定、后处理繁琐、收率低、污染严重等问题。

常见的化学-酶法生产工艺如Scheme 2所示：

化学-酶法生产工艺同样存在中间体不稳定、后处理繁琐的问题，并且三氟甲磺酸三甲基硅酯价格较高，不利于降低工艺成本。

另外，常见的全酶法主要包括以下几种，专利CN108026130B中公开的以烟酰胺、ATP和核糖为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶的催化作用下发生反应，制得烟酰胺单核苷酸；专利CN112877386A中公开以D-核糖、烟酰胺、ATP为底物，在核糖激酶、磷酸核糖变位酶及烟酰胺核糖激酶的偶联催化作用下，合成得到烟酰胺单核苷酸；专利CN112980906B中公开以腺苷、烟酰胺为原料经过PNP酶、NRK酶合成NMN等。该方法法存在原料价格成本高，转化底物浓度低等问题。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简单易于产业化的烟酰胺单核苷酸的生产方法。

本发明提供一种β-烟酰胺单核苷酸的生产方法，反应路线：

进一步，所述生产β-烟酰胺单核苷酸的步骤如下：腺苷与六偏磷酸钠在AK腺苷激酶的作用下磷酸化，并同时在酸性离子交换树脂的催化下脱去腺嘌呤，得到5-磷酸核糖；得到的5-磷酸核糖与烟酰胺在烟酰胺焦磷酸转移酶的作用下缩合生成烟酰胺单核苷酸。

进一步，反应中所述的酸性离子交换树脂为50W-X8型树脂。

更进一步，先将腺苷、六偏磷酸钠和离子交换树脂50W-X8搅拌升温后，调节pH在5.8～6.0之间。然后投入AK腺苷激酶，继续控制pH在5.8～6.0之间，30～35℃保温反应至结束。

更进一步，反应结束后，将上述反应液过滤，滤饼为离子交换树脂50W-X8，可回收活化后进行下一批生产套用，滤液可直接进入下一步。

进一步，将烟酰胺、六水合氯化镁、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠搅拌升温至30℃，调节pH在6.0～7.0之间。然后投入烟酰胺焦磷酸转移酶，同时泵入上一步的反应滤液，搅拌混合均匀后，控制pH在6.5～7.0之间，反应7～10小时。

进一步，将得到的反应液经离心，除去反应体系中的固渣及游离酶，再经过超滤膜过滤，得到粗品溶液，过大孔树脂柱，用水洗脱，收集纯度高于90％的洗脱溶液，浓缩成饱和溶液，调节pH为5.0备用。

进一步，在15～20℃条件下，向无水乙醇中滴加备用的pH为5.0的烟酰胺单核苷酸饱和溶液，有大量固体析出，搅拌，抽滤，真空干燥，得到白色固体NMN。

本发明的有益效果在于：本发明采用两步酶法反应，原料便宜易得，全程水相反应，不需要使用有机溶剂，不需要经过不稳定的中间体，直接制备烟酰胺单核苷酸，收率高，后处理简单，且成本低，解决了现有生产工艺中存在的路线长、“三废”多及成本高的问题，同时避免了危险物料和有机溶剂的使用，是一条安全、环保、经济的绿色生产路线。

附图说明

无

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1 5-磷酸核糖的制备

在1500L反应釜加入去离子水1000kg，投腺苷60Kg、六偏磷酸钠50Kg和离子交换树脂50W-X8 30Kg，开启搅拌，搅拌升温至30℃，滴加10％的氢氧化钠溶液调节pH在5.8～6.0之间。投入AK腺苷激酶2Kg，待混合均匀后，滴加10％的碳酸氢钠溶液控制pH在5.8～6.0之间，30～35℃保温反应10小时，取样进行TLC监控合格。

反应液过滤，滤饼为离子交换树脂50W-X8，回收待活化后进行下一批生产套用，滤液(A)直接进入下一步工序。

实施例2β-烟酰胺单核苷酸的制备

在3000L反应釜加入去离子水1000kg，投烟酰胺25.6Kg、六水合氯化镁5Kg、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)8.70Kg和磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)6.80Kg，开启搅拌，搅拌升温至30℃，滴加10％的氢氧化钠溶液调节pH在6.0～7.0之间。投入烟酰胺焦磷酸转移酶3.5Kg，同时泵入实施例1中的反应滤液(A)，搅拌混合均匀后，开始滴加10％的碳酸氢钠溶液控制pH在6.5～7.0之间，取样进行HPLC监控合格。

反应液经离心机离心，除去反应体系中的固渣及游离酶，再经过超滤膜过滤，得到粗品溶液。

粗品溶液过大孔树脂柱，用水洗脱，HPLC跟踪检测，收集纯度高于90％的洗脱溶液，浓缩成饱和溶液(B)，用10％的氢氧化钠水溶液调节pH为5.0备用。

2000L反应釜加入无水乙醇1000kg，搅拌降温至15～20℃，开始滴加烟酰胺单核苷酸饱和溶液(B)，有大量固体析出，搅拌5小时后，抽滤，30度下真空干燥20小时，得到58Kg白色固体产物。

Claims (7)

1.一种β-烟酰胺单核苷酸的生产工艺，其特征在于，所述生产工艺的反应式路线如下：

腺苷与六偏磷酸钠在AK腺苷激酶的作用下磷酸化，并同时在酸性离子交换树脂的催化下脱去腺嘌呤，得到5-磷酸核糖；得到的5-磷酸核糖与烟酰胺在烟酰胺焦磷酸转移酶的作用下缩合生成β-烟酰胺单核苷酸。

2.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述酸性离子交换树脂为50W-X8型树脂。

3.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述第一步磷酸化反应需要控制pH在5.8～6.0之间。

4.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述第一步磷酸化反应需在反应结束后，将反应液过滤，保留滤液。

5.如权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述第二步缩合反应将烟酰胺、六水合氯化镁、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠搅拌升温至30℃，调节pH在6.0～7.0之间。然后投入烟酰胺焦磷酸转移酶，同时泵入上一步的反应滤液，搅拌混合均匀后，控制pH在6.5～7.0之间，反应7～10小时。

6.如权利要求5所述的生产工艺，其特征在于，将第二步缩合反应得到的反应液离心，除去反应体系中的固渣及游离酶，再经超滤膜过滤，得到的粗品溶液，过大孔树脂柱，用水洗脱，收集纯度高于90％的洗脱溶液，浓缩成饱和溶液，调节pH为5.0备用。

7.如权利要求6所述的生产工艺，其特征在于，在15～20℃条件下，向无水乙醇中滴加备用的pH为5.0的浓缩饱和溶液，有大量固体析出，搅拌，抽滤，真空干燥，得到β-烟酰胺单核苷酸。