CN104109701A - 一种三磷酸腺苷的制备方法 - Google Patents
一种三磷酸腺苷的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种三磷酸腺苷的制备方法。本发明主要是以二磷酸腺苷为原料，在葡萄糖、磷酸根离子、铵离子、镁离子等物质的条件下，利用啤酒酵母泥将二磷酸腺苷经生物发酵转化为三磷酸腺苷；再经活性炭、大孔吸附树脂、阴离子交换树脂等分离、纯化方法，得到三磷酸腺苷二钠盐。其生产工艺合适于工业化大生产，操作简便、安全，转化率高，在生物发酵过程中，降低有机溶剂的使用，减少了对环境的污染，低环保；另外本发明为三磷酸腺苷的生产提供了新途径。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域，特别是一种三磷酸腺苷的制备方法。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)是由一个腺嘌呤,一个核糖和一个三磷酸单位组成的核苷酸, 它是生物体内重要的高能磷酸化合物。ATP水解为二磷酸腺苷(ADP)和正磷酸(Pi)或ATP水解为一磷酸腺苷(AMP)和焦磷酸(PPi)时,有大量的自由能释放出来。现ATP已被证实它在生命细胞的新陈代谢以及各种生化反应的能量提供中扮演着极其重要的角色，是生命活动及生化反应所必需的高能化合物。
ATP是生物体内重要的代谢物质,作为代谢的中间体、辅酶和能量供应者,参与生物体内的很多生化反应。在临床应用上,ATP已作为一个治疗试剂,对进行性肌肉萎缩、中风后遗症、心肌梗塞、心肌炎、冠状动脉硬化、肝炎等病症具有良好的治疗和辅助治疗作用。通常,体弱病人身体合成ATP能力减弱,用它作补充能量,以增强机体抵抗力。近年来国外学者结合ATP和AD(腺苷)、cAMP的构效关系,及其受体的生理作用,认为ATP在防治肿瘤,调节神经等方面具有明显作用。因此,ATP的生物体外合成研究和临床应用实验,无论在生理医学还是工业应用上都具有重要意义。
1929年Lohman从糖分解代谢旺盛的肌肉首次发现并提取ATP。在40年代末至50年代,主要从兔子肌肉中提取获得ATP,随后以AMP为原料的化学合成法开始出现。60年代, 我国用菠菜光合磷酸化法制备ATP，还有用磨碎的或经丙酮干燥的面包酵母以AMP或腺苷为前提生物合成ATP,70年代后这一方法又有所改进,如利用酵母自溶后的酶液或将酵母用表面活性剂处理再用于合成ATP,从而大幅度提高反应效率。这种利用酵母细胞为酶源进行酶合成ATP的方法,一直沿用至今。80年代前后,用固定化酵母细胞生产ATP的方法开始见诸报道。进入90年代后,研究报道有利用白地酶细胞的自溶作用生产ATP,亦利用半导体代替叶绿体催化生成ATP的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种三磷酸腺苷的制备方法。
本发明的技术解决方案是：
一种三磷酸腺苷的制备方法，其方法如下：加入纯化水于反应釜中，加热，将葡萄糖、磷酸根离子、铵离子、镁离子等加入反应釜中使其溶解，用氢氧化钠溶液调pH值至5.5-8.5；向反应釜中加入啤酒酵母泥，缓慢升温，当温度达到30-45℃时，加入二磷酸腺苷，此时开始取样测定三磷酸腺苷的转化率，当转化率达到95%（高效液相面积归一化法）以上时，反应结束；反应结束立即用1-6M的盐酸调节反应液pH至2.0-5.0，终止反应；并开始进行压滤，当反应液压滤结束后，再用纯化水冲洗滤饼，将压滤液和水洗液混匀。
所述方法中磷酸根离子用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾磷酸氢二钠或磷酸二氢钠，铵离子用氯化铵或磷酸铵，镁离子用氯化镁或硫酸镁。各反应物的用量按重量份计为：
二磷酸腺苷 1-2份 磷酸铵（或氯化铵） 0.01-0.1份
葡萄糖 1-2份 硫酸镁（或氯化镁） 0.1-1份
磷酸氢二钾（或磷酸二氢钾或磷酸氢二钠或磷酸二氢钠） 0.5-2.5份
酵母泥 10-20份。
将上述含有三磷酸腺苷的发酵混合液上活性炭床柱进行除盐，以纯化水或pH=2的稀酸水溶液为冲洗液，以0.2-0.8BV/h的流速去除残留在活性炭床柱的混合液，以20-80%，pH7-10的乙醇水溶液为洗脱液（用氨水调pH值），以0.2-0.8BV/h的流速进行等度洗脱，收集含有三磷酸腺苷的洗脱峰；将上述含有三磷酸腺苷的洗脱峰经减压浓缩得浓缩液，上大孔吸附树脂床柱进行脱色，以纯化水或pH=2的稀酸水溶液为冲洗液，以0.2-0.8BV/h的流速去除残留在大孔吸附树脂床柱的混合液，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液；将上述含有三磷酸腺苷的冲洗液上阴离子交换树脂床柱进行分离、纯化，以纯化水或pH=2的稀酸水溶液为冲洗液，以0.5-1.5BV/h的流速去除残留在阴离子交换树脂床柱的混合液，洗脱液先以含氯化钠或氯化钾的0.02-0.08mol/L，pH1-6的稀酸溶液，以0.5-1.5BV/h的流速进行洗脱：再以含氯化钠或氯化钾的0.5-1.5mol/L，pH1-6的稀酸溶液Ⅱ进行洗脱，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液。
将洗脱液 收集液进行纳滤，当纳滤浓缩的体积为纳滤前的1/4时，停止纳滤。将纳滤浓缩液放入醇沉罐中进行醇沉，醇沉浓度为85%，沉淀即为三磷酸腺苷固体。
所述稀酸溶液、稀酸溶液Ⅰ、稀酸溶液Ⅱ各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③甲酸溶液、④乙酸溶液。
本发明主要是以二磷酸腺苷为原料，利用啤酒酵母泥将二磷酸腺苷经生物发酵转化为三磷酸腺苷。其生产工艺合适于工业化大生产，操作简便、安全，转化率高，在生物发酵过程中，降低了有机溶剂的使用，减少了对环境的污染，低环保；另外本发明为三磷酸腺苷的生产提供了新途径。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1：
加入纯化水于反应釜中，加热至40℃，将葡萄糖15g、磷酸氢二钾15g、磷酸氢二钠19g、磷酸铵0.75g、氯化镁8.5g等加入反应釜中使其溶解，用氢氧化钠溶液调pH值至7.0；向反应釜中加入啤酒酵母泥300g，缓慢升温，当温度达到35℃时，加入二磷酸腺苷20g，此时开始计时取样，应用高效液相色谱法测定反应液中三磷酸腺苷的转化率，当转化率达到95%（高效液相面积归一化法）以上时，反应结束；反应结束立即用4M的盐酸调节反应液pH至2.0，终止反应；并加入助滤剂开始进行压滤，当反应液压滤结束后，再用纯化水冲洗滤饼，将压滤液和水洗液混匀。
腺苷的发酵混合液上活性炭床柱进行除盐，以pH=2的盐酸水溶液为冲洗液，以0.5BV/h的流速去除残留在活性炭床柱的混合液，以40%，pH7的乙醇水溶液为洗脱液（用氨水调pH值），以0.5BV/h的流速进行等度洗脱，收集含有三磷酸腺苷的洗脱峰；将上述含有三磷酸腺苷的洗脱峰经减压浓缩得浓缩液，上大孔吸附树脂床柱进行脱色，以纯化水为冲洗液，以0.4BV/h的流速去除残留在大孔吸附树脂床柱的混合液，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液；将上述含有三磷酸腺苷的冲洗液上阴离子交换树脂床柱进行分离、纯化，以pH=2的甲酸水溶液为冲洗液，以0.6BV/h的流速去除残留在阴离子交换树脂床柱的混合液，洗脱液先以含0.04 mol/L氯化钾、pH4甲酸溶液，以0.6BV/h的流速进行洗脱：再以含0.85mol/L氯化钾pH2甲酸溶液进行洗脱，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液。
将含有三磷酸腺苷的收集液进行纳滤，当纳滤浓缩的体积为纳滤前的1/4时，停止纳滤。将纳滤浓缩液放入醇沉罐中进行醇沉，醇沉浓度为85%，沉淀即为三磷酸腺苷。
实施例2：
加入纯化水于反应釜中，加热至38℃，将葡萄糖19g、磷酸二氢钠18.5g、磷酸二氢钾20.5g、氯化铵0.65g、硫酸镁7.5g等加入反应釜中使其溶解，用氢氧化钠溶液调pH值至8.0；向反应釜中加入啤酒酵母泥220g，缓慢升温，当温度达到37℃时，加入二磷酸腺苷15g，此时开始计时取样，应用高效液相色谱法测定反应液中三磷酸腺苷的转化率，当转化率达到95%（高效液相面积归一化法）以上时，反应结束；反应结束立即用6M的盐酸调节反应液pH至3.0，终止反应；并加入助滤剂开始进行压滤，当反应液压滤结束后，再用纯化水冲洗滤饼，将压滤液和水洗液混匀。
将上述含有三磷酸腺苷的发酵混合液上活性炭床柱进行除盐，以纯化水为冲洗液，以0.6BV/h的流速去除残留在活性炭床柱的混合液，以60%，pH8的乙醇水溶液为洗脱液（用氨水调pH值），以0.6BV/h的流速进行等度洗脱，收集含有三磷酸腺苷的洗脱峰；将上述含有三磷酸腺苷的洗脱峰经减压浓缩得浓缩液，上大孔吸附树脂床柱进行脱色，以纯化水为冲洗液，以0.5BV/h的流速去除残留在大孔吸附树脂床柱的混合液，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液；将上述含有三磷酸腺苷的冲洗液上阴离子交换树脂床柱进行分离、纯化，以pH=2的乙酸水溶液为冲洗液，以1.0BV/h的流速去除残留在阴离子交换树脂床柱的混合液，洗脱液先以含0.08 mol/L氯化钠、pH4乙酸溶液，以0.6BV/h的流速进行洗脱：再以含0.85mol/L氯化钠pH2乙酸溶液进行洗脱，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液。
将含有三磷酸腺苷的收集液进行纳滤，当纳滤浓缩的体积为纳滤前的1/4时，停止纳滤。将纳滤浓缩液放入醇沉罐中进行醇沉，醇沉浓度为85%，沉淀即为三磷酸腺苷。
实施例3：
加入纯化水于反应釜中，加热至32℃，将葡萄糖30g、磷酸氢二钠18g、磷酸氢二钾21g、氯化铵1.2g、氯化镁6.5g等加入反应釜中使其溶解，用氢氧化钠溶液调pH值至6.0；向反应釜中加入啤酒酵母泥400g，缓慢升温，当温度达到37℃时，加入二磷酸腺苷25g，此时开始计时取样，应用高效液相色谱法测定反应液中三磷酸腺苷的转化率，当转化率达到95%（高效液相面积归一化法）以上时，反应结束；反应结束立即用1M的盐酸调节反应液pH至5.0，终止反应；并加入助滤剂开始进行压滤，当反应液压滤结束后，再用纯化水冲洗滤饼，将压滤液和水洗液混匀。
将上述含有三磷酸腺苷的发酵混合液上活性炭床柱进行除盐，以纯化水为冲洗液，以0.8BV/h的流速去除残留在活性炭床柱的混合液，以70%，pH10的乙醇水溶液为洗脱液（用氨水调pH值），以0.8BV/h的流速进行等度洗脱，收集含有三磷酸腺苷的洗脱峰；将上述含有三磷酸腺苷的洗脱峰经减压浓缩得浓缩液，上大孔吸附树脂床柱进行脱色，以pH=2的盐酸溶液为冲洗液，以0.8BV/h的流速去除残留在大孔吸附树脂床柱的混合液，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液；将上述含有三磷酸腺苷的冲洗液上阴离子交换树脂床柱进行分离、纯化，以pH=2的乙酸水溶液为冲洗液，以1.2 BV/h的流速去除残留在阴离子交换树脂床柱的混合液，洗脱液先以含0.07 mol/L氯化钠、pH5乙酸溶液，以1.2BV/h的流速进行洗脱：再以含0.95mol/L氯化钠pH1.5乙酸溶液进行洗脱，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液。
将含有三磷酸腺苷的收集液进行纳滤，当纳滤浓缩的体积为纳滤前的1/4时，停止纳滤。将纳滤浓缩液放入醇沉罐中进行醇沉，醇沉浓度为85%，沉淀即为三磷酸腺苷。
Claims (9)
1.一种三磷酸腺苷的制备方法，其特征是以二磷酸腺苷为原料，在葡萄糖、磷酸根离子、铵离子、镁离子等物质的条件下，利用啤酒酵母泥将二磷酸腺苷经生物发酵转化为三磷酸腺苷。
2.根据权利要求1所述，其特征是反应的pH值为5.5~8.5。
3.根据权利要求1所述，其特征是反应温度为30~45℃。
4.根据权利要求1所述，其特征是所述的磷酸根离子用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾磷酸氢二钠或磷酸二氢钠。
5.根据权利要求1所述，其特征是所述的铵离子用氯化铵或磷酸铵。
6.根据权利要求1所述，其特征是所述的镁离子用氯化镁或硫酸镁。
7.根据权利要求1所述，其特征是各反应物的用量按重量份计为：
二磷酸腺苷 1~2份 磷酸铵（或氯化铵） 0.01~0.1份
葡萄糖 1~2份 硫酸镁（或氯化镁） 0.1~1份
磷酸氢二钾（或磷酸二氢钾或磷酸氢二钠或磷酸二氢钠） 0.5~2.5份
酵母泥 10~20份。
8.将上述含有三磷酸腺苷的发酵混合液经活性炭、大孔吸附树脂、阴离子交换树脂等分离、纯化方法，得到三磷酸腺苷二钠盐。
9.根据权利要求8所述，其特征是：
（1）将上述含有三磷酸腺苷的发酵混合液上活性炭床柱进行除盐，冲洗液以0.2~0.8BV/h的流速去除残留在活性炭床柱的混合液，所述冲洗液为下列之一：①纯化水、②pH=2的盐酸水溶液、③pH=2的甲酸水溶液、④pH=2的乙酸水溶液；洗脱液以0.2~0.8BV/h的流速进行等度洗脱，收集含有三磷酸腺苷的洗脱峰，所述洗脱液为20~80%，pH7~10的乙醇水溶液（用氨水调pH值）；
（2）将上述含有三磷酸腺苷的洗脱峰经减压浓缩得浓缩液，上大孔吸附树脂床柱进行脱色，冲洗液以0.2~0.8BV/h的流速去除残留在大孔吸附树脂床柱的混合液，收集含有三磷酸腺苷的上样流出液和冲洗液，所述冲洗液为下列之一：①纯化水、②pH=2的盐酸水溶液、③pH=2的甲酸水溶液、④pH=2的乙酸水溶液；
（3）将上述含有三磷酸腺苷的上样流出液和冲洗液上阴离子交换树脂床柱进行分离、纯化，冲洗液以0.5~1.5BV/h的流速去除残留在阴离子交换树脂床柱的混合液，所述冲洗液为下列之一：①纯化水、②pH=2的盐酸水溶液、③pH=2的甲酸水溶液、④pH=2的乙酸水溶液；洗脱液以0.5~1.5BV/h的流速进行洗脱：先用含氯化钠或氯化钾的0.02~0.08mol/L，pH1~6的稀酸溶液Ⅰ进行洗脱，再用含氯化钠或氯化钾的0.5~1.5mol/L，pH1~6的稀酸溶液Ⅱ进行洗脱，收集含有三磷酸腺苷的冲洗液，所述的稀酸溶液Ⅰ、稀酸溶液Ⅱ各自独立为下列之一：①盐酸溶液、②硫酸溶液、③甲酸溶液、④乙酸溶液。
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