CN109627244A - 酶法制备l-5-甲基四氢叶酸钙 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶法合成的技术领域，涉及一种酶法制备L‑5‑甲基四氢叶酸钙的方法，所述方法包括如下步骤：(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L‑四氢叶酸；(3)L‑四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L‑5‑甲基四氢叶酸；(4)L‑5‑甲基四氢叶酸成盐得到L‑5‑甲基四氢叶酸钙。本发明提供了一条行之有效的使用酶法制备L‑5‑甲基四氢叶酸钙的方法，这种制备方法不用拆分，反应温和，收率高，产品纯度高，环境友好，具有很好的产业化前景。

Description

酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙
技术领域
本发明属于酶法合成的技术领域，涉及一种酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙的方法。
背景技术
L-5-甲基四氢叶酸钙，又称(6S)-5-甲基四氢叶酸钙。(6S)-5-甲基四氢叶酸是组织和血叶酸的主要形式，它在人体中不需要经过繁琐的酶促步骤，可以直接参与人体内多种重要的生化反应(如嘌呤和胸腺嘧啶的合成等)。L-5-甲基四氢叶酸可用做药和食品添加剂，用作维生素制剂，预防神经管缺陷，治疗抑郁症，治疗巨幼红细胞贫血等，研究表明，L-5-甲基四氢叶酸是叶酸类药物中唯一可以渗透过血脑屏障的药物，具有防治阿尔茨海默病(老年痴呆症)的作用，因此它具有其他叶酸类药物无法比拟的优越性，具有巨大的市场前景。由于L-5-甲基四氢叶酸非常不稳定，极易氧化，因此合成高纯度、高稳定性的四氢叶酸具有成本昂贵、收率低等缺点，而四氢叶酸盐具有优异的稳定性，大量实验证明，在特定的碱溶液中可以分离纯化出高纯度、高稳定性的四氢叶酸盐，特别是其钙盐L-5-甲基四氢叶酸钙。
现有技术中的L-5-甲基四氢叶酸钙合成方法，均是使用化学合成，化学合成的5-甲基四氢叶酸主要是通过叶酸经氢化和甲基化获得，通常在5,6位双键加氢时，在6位形成光学活性碳原子，以(6R)-或(6S)-5-甲基四氢叶酸的形式存在。(6S)-5-甲基四氢叶酸现有的工艺路线是以叶酸为原料,经还原、甲基化、拆分等步骤合成而得。化学合成L-5-甲基四氢叶酸钙的方法都存在拆分难，收率低，污染大，产业化困难等诸多问题，因此寻找一条化学合成之外的方法就成为非常有现实意义的探索。
以酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙相关的现有技术中，文献《Methods inEnzymology》,1971,18(6):728-731ANew Preparation ofTetrahydrofolicAcid中介绍了二氢叶酸还原酶催化叶酸生成二氢叶酸，再用NADPH、粪链球菌的透析提取物、胶联葡萄糖-G25得到消旋的四氢叶酸，但使用此法并不能得到L-四氢叶酸。
发明内容
本发明提供了一条行之有效的使用酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙的方法。
具体而言，本发明的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，包括如下步骤：
(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；
(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L-四氢叶酸；
(3)L-四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L-5-甲基四氢叶酸；
(4)L-5-甲基四氢叶酸成盐得到L-5-甲基四氢叶酸钙。
上述步骤(1)中锌粉还原叶酸的反应是在碱性环境下进行的，所述锌粉与叶酸的质量比为1:2-1:4，反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃。所述碱性环境使用NaOH溶液滴加到叶酸水溶液中而成，反应完毕后使用磷酸再次调节pH值7.0-7.5，过滤后得到二氢叶酸溶液。
上述二氢叶酸还原酶为二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶为葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体。
上述步骤(2)的反应中加入葡萄糖，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(以下简称NADP)，乙二胺四乙酸EDTA二钠(以下简称EDTA二钠)。NADP作为辅酶，EDTA二钠作为吸附剂及稳定剂。
上述二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体与叶酸的质量比为2:1:10-3:2:10，优选为2:1:10。
上述葡萄糖、NADP和EDTA的加入量分别为叶酸质量的45％-50％、0.2％-0.5％、10％-20％。
上述步骤(2)的反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃，优选为35℃反应3小时。
上述步骤(2)反应结束后使用盐酸调节pH值至3.3-3.5，过滤后得到L-四氢叶酸湿粉。
上述步骤(3)在碱性环境下滴加甲醛，之后在0-10℃下滴加硼氢化物，升温至35-75℃保温反应，反应时间为0.5-2小时。上述碱性环境为L-四氢叶酸湿粉加入水后，NaOH调节pH值至7.5-10。上述滴加的硼氢化物为加入少量NaOH的硼氢化物溶液。反应后冷却至0-10℃，调节pH值至6.0-8.0，0-10℃保温搅拌1-10小时，过滤得到L-5-甲基四氢叶酸溶液。
上述甲醛的加入量为叶酸的当量比为1:1-1.3:1，所述硼氢化物为硼氢化钾或硼氢化钠，其加入量与叶酸的当量比为3:1-4:1。
步骤(4)的成盐反应使用现有技术中的方法，通过向L-5-甲基四氢叶酸溶液中滴加氯化钙溶液成盐。
上述反应的方程式如下。
本发明提供了一种不同于传统化学合成L-5-甲基四氢叶酸的方法，通过酶法制备(6S)-5-甲基四氢叶酸钙，这种制备方法不用拆分，反应温和，收率高，产品纯度高，环境友好，具有很好的产业化前景。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或者改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明实施例中所用的各种原料和试剂如无特别说明均为市售购买。
本发明实施例中的检测方法采用USP40中规定的Calcium L-5-Methyltetrahydrofolate检测方法和标准。
本发明所使用的HPLC检测仪器是Agilent Technologies 1260infinity。柱子型号为HYPERSIL-ODS 250x4mm，5μm。
实施例1：二氢叶酸还原酶湿菌体的制备。
取高表达二氢叶酸还原酶的大肠杆菌基因工程菌，接种至LB平板进行预培养(LB培养基：每升5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，20g琼脂粉)，再接种至TB摇瓶中继续培养(TB培养基：每升24g酵母提取物，12g蛋白胨，2g磷酸二氢钾，16g三水磷酸氢二钾，5g甘油)，培养完成后离心收集菌体，倒掉上清液，菌体沉淀收集到自封袋中，-20℃冰箱冷冻备用。
实施例2：葡萄糖脱氢酶湿菌体的制备。
取高表达葡萄糖脱氢酶的大肠杆菌基因工程菌，接种至LB平板进行预培养(LB培养基：每升5g酵母提取物，10g蛋白胨，10g氯化钠，20g琼脂粉)，再接种至TB摇瓶中继续培养(TB培养基：每升24g酵母提取物，12g蛋白胨，2g磷酸二氢钾，16g三水磷酸氢二钾，5g甘油)，培养完成后离心收集菌体，倒掉上清液，菌体沉淀收集到自封袋中，-20℃冰箱冷冻备用。
实施例3
(1)在2000ml反应瓶中加入100g叶酸、1000ml水，搅拌下滴加预先配制的NaOH溶液(60gNaOH+165ml水)。滴加完毕后加50g锌粉，10℃反应1小时，加磷酸调反应液pH至7.0，过滤，得二氢叶酸溶液；
(2)滤液加入10g葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体和20g二氢叶酸还原酶湿菌体，45g葡萄糖，0.2gNADP，10g EDTA二钠，10℃反应1小时，反应结束后过滤，用盐酸调pH至3.3，过滤，得L-四氢叶酸湿粉。
(3)在5000ml反应瓶中加入上述L-四氢叶酸湿粉，加600ml水，用NaOH调pH至7.5，滴加6.3ml甲醛(1.0eq，以叶酸计)。降低温度至10℃，滴加硼氢化钠溶液(25.7g(3eq，以叶酸计)加100ml水+0.35gNaOH)，滴加完毕后，缓慢升温至35℃。保温反应0.5小时，冷却至5℃以下，用盐酸调pH至8.0，保温10℃搅拌10小时，过滤，得L-5-甲基四氢叶酸溶液。
(4)L-5-甲基四氢叶酸溶液中加入氯化钙溶液(37.5g+60ml水),控制pH至7，滴加结束过滤。滤液保温10℃结晶24小时，过滤得L-5-甲基四氢叶酸钙粗品。粗品加650ml水进行回流，10℃结晶24小时，过滤，滤饼用50ml乙醇打浆，真空干燥，得45.2g L-5-甲基四氢叶酸钙成品，其纯度为99.1％，收率40.1％。其核磁共振氢谱和碳谱数据为：1H NMR(600MHz,D2O)δ7.41-7.48(m,4H),6.52-6.57(m,4H),4.02-4.09(m,2H),3.18-3.24(m,2H),2.87-3.02(m,2H),2.81(m,2H),2.73-2.80(m,2H),2.63-2.72(m,2H),2.25(s,6H),2.01-2.15(m,4H),1.85-1.91(m,2H),1.72-1.80(m,2H)；13C NMR(150MHz,D2O)δ182.5,180.3,171.3,169.4,159.1,153.2,152.3,129.5,122.1,112.2,112.5,102.5,55.9,54.6,43.1,42.6,36.1,33.9,28.5。
实施例4
(1)在2000ml反应瓶中加入100g叶酸、1000ml水，搅拌下滴加预先配制的NaOH溶液(60gNaOH+165ml水)。滴加完毕后加25g锌粉，50℃反应2小时，加磷酸调反应液pH 7.5，过滤，得二氢叶酸溶液；
(2)滤液加入20g葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体和30g二氢叶酸还原酶湿菌体，50g葡萄糖，0.5gNADP，20g EDTA二钠，50℃反应2小时，反应结束后过滤，用盐酸调pH至3.5，过滤，得L-四氢叶酸湿粉。
(3)在5000ml反应瓶中加入上述L-四氢叶酸湿粉，加600ml水，用NaOH调pH至7.5，滴加8.2ml甲醛(1.3eq，以叶酸计)。降低温度至10℃，滴加硼氢化钠溶液(34.3g(4eq，以叶酸计)加100ml水+0.35gNaOH)，滴加完毕后，缓慢升温至35℃。保温反应0.5小时，冷却至5℃以下，用盐酸调pH至7.0，保温10℃搅拌10小时，过滤，得L-5-甲基四氢叶酸溶液。
(4)L-5-甲基四氢叶酸溶液中加入氯化钙溶液(37.5g+60ml水),控制pH＝7，滴加结束过滤。滤液保温10℃结晶24小时，过滤得L-5-甲基四氢叶酸钙粗品。粗品加650ml水进行回流，10℃结晶24小时，过滤，滤饼用50ml乙醇打浆，真空干燥，得40.2g L-5-甲基四氢叶酸钙成品，其纯度为98.9％，收率35.7％。
实施例5
(1)在2000ml反应瓶中加入100g叶酸、1000ml水，搅拌下滴加预先配制的NaOH溶液(60gNaOH+165ml水)。滴加完毕后加25g锌粉，35℃反应3小时，加磷酸调反应液pH至7.3，过滤，得二氢叶酸溶液；
(2)滤液加入10g葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体和20g二氢叶酸还原酶湿菌体，50g葡萄糖，0.2g NADP，15g EDTA二钠，35℃反应3小时，反应结束后过滤，用盐酸调pH至3.5，过滤，得L-四氢叶酸湿粉。
(3)在5000ml反应瓶中加入上述L-四氢叶酸湿粉，加600ml水，用NaOH调pH至7.5，滴加6.3ml甲醛(1.0eq，以叶酸计)。降低温度至10℃，滴加硼氢化钠溶液(34.3g(4eq，以叶酸计)加100ml水+0.35gNaOH)，滴加完毕后，缓慢升温至35℃。保温反应0.5小时，冷却至5℃以下，用盐酸调pH7.0，保温10℃搅拌10小时，过滤，得L-5-甲基四氢叶酸溶液。
(4)L-5-甲基四氢叶酸溶液中加入氯化钙溶液(37.5g+60ml水),控制pH＝7，滴加结束过滤。滤液保温10℃结晶24小时，过滤得L-5-甲基四氢叶酸钙粗品。粗品加650ml水进行回流，10℃结晶24小时，过滤，滤饼用50ml乙醇打浆，真空干燥，得39.0g L-5-甲基四氢叶酸钙成品，其纯度为98.9％，收率34.6％。
实施例6
(1)在2000ml反应瓶中加入100g叶酸、1000ml水，搅拌下滴加预先配制的NaOH溶液(60gNaOH+165ml水)。滴加完毕后加25g锌粉，35℃反应3小时，加磷酸调反应液pH7.5，过滤，得二氢叶酸溶液；
(2)滤液加入10g葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体和20g二氢叶酸还原酶湿菌体，50g葡萄糖，0.5gNADP，20g EDTA二钠，35℃反应3小时，反应结束后过滤，用盐酸调pH至3.5，过滤，得L-四氢叶酸湿粉。
(3)在5000ml反应瓶中加入上述L-四氢叶酸湿粉，加600ml水，用NaOH调pH至7.5，滴加8.2ml甲醛(1.3eq，以叶酸计)。降低温度至10℃，滴加硼氢化钾溶液(36.7g(3eq，以叶酸计)加100ml水+0.35gNaOH)，滴加完毕后，缓慢升温至35℃。保温反应0.5小时，冷却至5℃以下，用盐酸调pH至8.0，保温10℃搅拌10小时，过滤，得L-5-甲基四氢叶酸溶液。
(4)L-5-甲基四氢叶酸溶液中加入氯化钙溶液(37.5g+60ml水),控制pH＝7，滴加结束过滤。滤液保温10℃结晶24小时，过滤得L-5-甲基四氢叶酸钙粗品。粗品加650ml水进行回流，10℃结晶24小时，过滤，滤饼用50ml乙醇打浆，真空干燥，得43.0g L-5-甲基四氢叶酸钙成品，其纯度为98.6％，收率38.2％。
实施例7
(1)在2000ml反应瓶中加入100g叶酸、1000ml水，搅拌下滴加预先配制的NaOH溶液(60gNaOH+165ml水)。滴加完毕后加50g锌粉，50℃反应2小时，加磷酸调反应液pH7.3，过滤，得二氢叶酸溶液；
(2)滤液加入10g葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体和20g二氢叶酸还原酶湿菌体，45g葡萄糖，0.2gNADP，10g EDTA二钠，50℃反应2小时，反应结束后过滤，用盐酸调pH至3.4，过滤，得L-四氢叶酸湿粉。
(3)在5000ml反应瓶中加入上述L-四氢叶酸湿粉，加600ml水，用NaOH调pH至7.5，滴加6.3ml甲醛(1.0eq，以叶酸计)。降低温度至10℃，滴加硼氢化钾溶液(48.9g(4eq，以叶酸计)加100ml水+0.35gNaOH)，滴加完毕后，缓慢升温至35℃。保温反应0.5小时，冷却至5℃以下，用盐酸调pH7.0，保温10℃搅拌10小时，过滤，得L-5-甲基四氢叶酸溶液。
(4)L-5-甲基四氢叶酸溶液中加入氯化钙溶液(37.5g+60ml水),控制pH＝7，滴加结束过滤。滤液保温10℃结晶24小时，过滤得L-5-甲基四氢叶酸钙粗品。粗品加650ml水进行回流，10℃结晶24小时，过滤，滤饼用50ml乙醇打浆，真空干燥，得34.1g L-5-甲基四氢叶酸钙成品，其纯度为98.5％，收率30.5％。

Claims (10)

1.酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，包括如下步骤：
(1)以叶酸为原料，使用锌粉将叶酸还原为二氢叶酸；
(2)二氢叶酸中加入二氢叶酸还原酶、葡萄糖脱氢酶，反应得到L-四氢叶酸；
(3)L-四氢叶酸中加入甲醛和硼氢化物反应得到L-5-甲基四氢叶酸；
(4)L-5-甲基四氢叶酸成盐得到L-5-甲基四氢叶酸钙。
2.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述步骤(1)中锌粉还原叶酸的反应是在碱性环境下进行的，所述锌粉与叶酸的质量比为1：2-1：4，反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃。
3.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶为二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶为葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体。
4.根据权利要求3所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述步骤(2)的反应中加入葡萄糖、NADP和EDTA。
5.根据权利要求3所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述二氢叶酸还原酶湿菌体、葡萄糖脱氢酶发酵湿菌体与叶酸的质量比为2：1：10-3：2：10，优选为2：1：10。
6.根据权利要求4所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述葡萄糖、NADP和EDTA的加入量分别为叶酸质量的45％-50％、0.2％-0.5％、10％-20％。
7.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，步骤(2)的反应时间为1-3小时，反应温度为10-50℃，优选为35℃反应3小时。
8.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，步骤(2)反应结束后使用盐酸调节pH值至3.3-3.5。
9.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，步骤(3)在碱性环境下滴加甲醛，之后在0-10℃下滴加硼氢化物，升温至35-75℃保温反应，反应时间为0.5-2小时。
10.根据权利要求1所述的酶法制备L-5-甲基四氢叶酸钙，其特征在于，所述甲醛的加入量为叶酸的当量比为1：1-1.3：1，所述硼氢化物为硼氢化钾或硼氢化钠，其加入量与叶酸的当量比为3：1-4：1。
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