CN116621920B - 一种还原型谷胱甘肽的制备方法 - Google Patents
一种还原型谷胱甘肽的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116621920B CN116621920B CN202310903816.4A CN202310903816A CN116621920B CN 116621920 B CN116621920 B CN 116621920B CN 202310903816 A CN202310903816 A CN 202310903816A CN 116621920 B CN116621920 B CN 116621920B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- glutathione
- glycine
- crystal form
- sodium malate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 title claims abstract description 219
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims abstract description 103
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 56
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 32
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 19
- 150000001879 copper Chemical class 0.000 claims abstract description 15
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims abstract description 13
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 108
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 53
- WPUMTJGUQUYPIV-JIZZDEOASA-L disodium (S)-malate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](O)CC([O-])=O WPUMTJGUQUYPIV-JIZZDEOASA-L 0.000 claims description 40
- 235000019265 sodium DL-malate Nutrition 0.000 claims description 40
- 239000001394 sodium malate Substances 0.000 claims description 40
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 14
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 11
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 claims description 10
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 claims description 10
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 claims description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 claims description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 claims 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 claims 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 abstract description 40
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 9
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 5
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 5
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Natural products OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 3
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 108010081687 Glutamate-cysteine ligase Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 101150094189 gshAB gene Proteins 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 2
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036164 Glutathione synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100034294 Glutathione synthetase Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000034809 Product contamination Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 230000001195 anabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000043 antiallergic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BERDEBHAJNAUOM-UHFFFAOYSA-N copper(I) oxide Inorganic materials [Cu]O[Cu] BERDEBHAJNAUOM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRFJLUBVMFXRPN-UHFFFAOYSA-N cuprous oxide Chemical compound [O-2].[Cu+].[Cu+] KRFJLUBVMFXRPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940112669 cuprous oxide Drugs 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- -1 sulfhydryl compound Chemical class 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/10—Process efficiency
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种还原型谷胱甘肽的制备方法，属于肽的制备技术领域。对表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行培养，中后期流加葡萄糖溶液作为碳源，根据OD600值进行诱导，进行发酵，对发酵体系进行超滤，滤液用铜盐法进行分离，得到谷胱甘肽溶液；再对谷胱甘肽溶液进行浓缩、结晶得到β晶型产品；对β晶型产品重新溶解，转换晶型得到α晶型产品。本发明构建表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行生物发酵制备还原型谷胱甘肽；再通过改变碳源减少了谷胱甘肽制备过程中杂质的产生，再结合铜盐法提取、β结晶将杂质G完全去除，得到纯度更高的晶型为α晶型的谷胱甘肽产品。
Description
技术领域
本发明涉及肽的制备技术领域，具体涉及一种还原型谷胱甘肽的制备方法。
背景技术
谷胱甘肽（glutathione， GSH）是动物、植物及微生物中广泛存在的巯基化合物，在人体内的生化防御体系中起重要作用，具有抗自由基，抗衰老，抗氧化等多方面的生理功能，能够提高人体的免疫力。还原性谷胱甘肽在临床上已经得到广泛应用，例如作为解毒剂、抗氧化剂、抗过敏剂，以及作为肝脏疾病的主要治疗药物和其他多种疾病的辅助治疗药物。
从1888年发现GSH以来，GSH已经实现工业化生产，目前生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶法和发酵法，其中应用最广的是酶法和发酵法。溶剂萃取法是通过向动植物组织或酵母中添加蛋白酶、淀粉酶进行预处理，用溶剂进行抽提萃取，经浓缩，分离精制得到GSH，此方法获得的GSH回收率低、生产成本高且存在污染；化学合成法是使用GSH的三种前体氨基酸作为原料，经过一系列化学缩合生成GSH，此方法比较成熟，在20世纪50年代已经工业生产，但此方法存在反应时间长、反应步骤多、工艺复杂、易造成污染以及存在GSH的消旋体需要拆分等缺点。酶法是目前研究最广泛的GSH的合成方法之一，此法是谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸在ATP及Mg2+存在下，经γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶（GSHⅠ，γ-GCS，由gshⅠ编码）及谷胱甘肽合成酶（GSHⅡ，GS，由gshⅡ编码）的催化合成。酶法在实际应用中，如果使用原核生物或粗酶液需要添加ATP，但对于工业生产来说，直接添加ATP是不现实的。有研究报道采用ATP再生系统调高了ATP的供给，但仍然仅限研究，无法工业应用。对ATP的需求使得酶法很难应用于大规模生产。与其它方法相比，发酵法具有反应条件温和、成本低、生产速率快、反应步骤简单等优点，是目前工业上应用最广泛的一种。发酵法最突出的特点是应用葡萄糖、淀粉等些相对廉价的物质作为生产原料，利用自身的代谢系统合成GSH。在GSH的生产中，选择合适的GSH生产酶系至关重要，目前所用的酶系大多来自大肠杆菌或酵母的GSHⅠ和GSHⅡ，这类酶对氨基酸有很强的亲和力，但GSHⅠ受GSH的抑制严重，这在一定程度上限制了GSH的高产。虽然利用基因工程的手段可以提高GSHⅠ和GSHⅡ的表达量，但仍然无法消除GSH的积累对合成反馈抑制，目前公开发表的文献涉及利用发酵法生产谷胱甘肽的菌种主要为酵母菌，利用酵母菌发酵生产谷胱甘肽具有发酵周期长，产量低的缺陷。
随着新技术，新工艺的运用，谷胱甘肽产品生产中出现了新的杂质，杂质研究是药品研发的重要内容。欧洲药典将谷胱甘肽产品中4种主要杂质分别命名为A、B、C、D，之后的研究人员将新工艺技术研究中发现的新的产品杂质依序进行命名。申请号为CN109096367A的专利公开了“一种还原型谷胱甘肽发酵过程中产生的杂质G的分离方法及其用途”，将谷胱甘肽产品生产中产生的杂质谷胱丙肽命名为杂质G。
自2005年来，陆续有报道发现一种同时具有γ-GCS及GS活性可催化合成谷胱甘肽两步反应的双功能酶GshF，这种酶主要分布于部分革兰氏阳性菌中，大多数对GSH的反馈抑制不敏感，因此有极大的潜力应用于GSH的高产。已有报道使用重组大肠杆菌表达双功能酶用于谷胱甘肽的发酵，GSH的最高产量达到15 g/L，远超其他文献报道，具有非常高的应用前景。利用发酵法进行GSH生产，葡萄糖及淀粉经过一系列生物代谢产生丙酮酸进入三羧酸循环，中间产物及产生的ATP用于GSH的合成，丙酮酸是一种重要的中间代谢产物，其在转氨酶的催化下形成丙氨酸，故丙氨酸在微生物体内具有较高的浓度水平；其次GSH双功能酶的专一性较低，因此在生物发酵过程及生物催化过程中，部分甘氨酸被丙氨酸替代生成谷胱丙肽，谷胱丙肽是利用双功能酶合成谷胱甘肽产品中的一种重要杂质，在发酵法生产的产品中具有较高的浓度水平。
目前谷胱甘肽中杂质都是制备产物后进行分离，主要有以下几种。铜盐法：早期GSH分离最常用的一种，该法有很大的实用价值，是目前进行工业化生产所采用的主要工艺；离子交换法：GSH的等电点为5.93，在pH低于5.93的溶液中，GSH会带正电荷，此时可与阳离子交换树脂相互作用，调整各种工艺条件，即可将GSH分离，但是树脂活化需要大量的酸碱，且产品纯度较低，不利于工业化推广；有机汞亲和层析：GSH中的巯基与汞有很强的亲和作用，因此用含汞树脂分离GSH可收到良好的效果，用合成汞树脂进行亲和层析分离GSH，回收率可达到82.96%，但此法会造成汞污染，不利于大规模应用；双水相法：主要是基于双水相分配技术来分离GSH，梅乐和等采用双水相分配结合温度诱导实现了GSH的分离，总萃取率在80%以上，此方法由于设备昂贵等原因，目前还处于试验阶段。
而工业生产中主要采用铜盐法进行谷胱甘肽的分离，其原理是利用亚铜离子对谷胱甘肽巯基的专一亲和性进行分离纯化，但谷胱丙肽也具有巯基，铜盐法去除谷胱丙肽杂质的分离效果不佳。目前市场谷胱甘肽产品晶型为α晶型，一般是在水-溶媒结晶体系，低温条件下结晶得到的，谷胱丙肽与谷胱甘肽结晶性质及其接近，结晶产品中谷胱丙肽的残留量较高，需要多次结晶或多种技术手段结合才能够达到质量要求。生物法生产谷胱甘肽，谷胱丙肽杂质的有效控制成为了影响谷胱甘肽产品质量的瓶颈。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种还原型谷胱甘肽的制备方法。本发明构建表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行生物发酵制备还原型谷胱甘肽；再通过改变碳源减少了谷胱甘肽制备过程中杂质的产生，再结合铜盐法提取、β结晶将杂质G完全去除，得到纯度更高的晶型为α晶型的谷胱甘肽产品。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种还原型谷胱甘肽的制备方法，所述制备方法为：
（1）对表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行培养，中后期流加葡萄糖溶液作为碳源，OD600为20-70时进行诱导，诱导结束添加氨基酸，同时以苹果酸钠/甘氨酸溶液替换葡萄糖作为碳源，进行发酵，对发酵体系进行超滤，滤液用铜盐法进行分离，得到谷胱甘肽溶液；
（2）谷胱甘肽溶液进行浓缩、结晶得到β晶型产品；对β晶型产品重新溶解，进行晶型转化得到α晶型产品。
优选的，步骤（1）中，所述表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21是将KANA基因和gshF基因插入到质粒pUC18中构建重组表达载体pUC18-KANA-gshF，然后将重组表达载体pUC18-KANA-gshF导入大肠杆菌BL21得到的。
优选的，步骤（1）中，所述培养的温度为37℃，时间为20-26 h。
培养表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21的培养基为（每L）：Na2HPO4·12H2O 15.12g、KH2PO43.0 g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.011 g，葡萄糖9.0 g，NH4Cl 3.0 g，1% （w/v） 维生素B10.2 mL 和微量元素 0.2 mL ；微量元素溶液为（每L）：FeSO4·7H2O 80g，AlCl3·6H2O 10 g，ZnSO4·7H2O 2.0 g，CuCl2·2H2O 1.0 g，NaMoO4·2H2O 2.0 g，MnSO4·H2O 10 g，CoCl24.0 g，H3BO40.5 g，溶解于 3.0 M HCl中。
溶氧反弹后，开始流加葡萄糖溶液，发酵罐达到额定转速后（发酵4~6h左右），调节葡萄糖补料速率，使溶氧范围在3%-50%。
优选的，所述葡萄糖溶液的浓度为45%-60% ；所述葡萄糖溶液的加入量占培养基体积的25%-35%；所述诱导的时间为2-5h。
葡萄糖溶液是由450~600g葡萄糖溶于去离子水中，定容至1L，配置得到的。
优选的，步骤（1）中，所述氨基酸包括谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸；所述谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸的摩尔比为1 ：1 ：1；所述氨基酸中的谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸浓度均为25-100mM。
优选的，步骤（1）中，所述苹果酸钠/甘氨酸溶液中苹果酸钠和甘氨酸的摩尔比为4~10:1，所述苹果酸钠/甘氨酸溶液的浓度为40~50%；所述苹果酸钠/甘氨酸溶液的加入量占体系总体积的4-8%；所述苹果酸钠/甘氨酸溶液的流加速率使溶氧保持在3-15%。
苹果酸钠/甘氨酸溶液是将苹果酸钠和甘氨酸溶于去离子水中得到的，将400~500g苹果酸钠和甘氨酸溶于去离子水中，定人至1L，得到苹果酸钠/甘氨酸溶液。
优选的，所述苹果酸钠/甘氨酸溶液中苹果酸钠和甘氨酸的摩尔比为6~8:1；所述苹果酸钠/甘氨酸溶液流的加速率使溶氧保持在5-10%。
优选的，步骤（1）中，所述发酵的温度为37 ℃，发酵周期为20-26h；所述超滤所用的超滤膜为孔径10-50nm的陶瓷膜。
优选的，步骤（2）中，所述β晶型产品的结晶温度为25~45℃，时间为4~8h；所述α晶型产品的结晶温度为0-5℃，时间为4~8h。
本发明的第二方面，提供上述制备方法的应用，所述制备方法用于去除杂质G或提高还原型谷胱甘肽纯度。
本发明的有益效果：
（1）本发明通过改变碳源减少了谷胱甘肽制备过程中杂质的产生，再结合铜盐法分离以及进行β结晶，可有效去除剩余的杂质G，得到纯度更高的谷胱甘肽产品。谷胱甘肽制备过程中产生得杂质G很少，用铜盐法提取谷胱甘肽再结合β结晶，可有效去除杂质G。
（2）本发明以苹果酸钠/甘氨酸溶液替代葡萄糖等碳源，切断了葡萄糖等碳源进入三羧酸循环的关键中间产物---丙酮酸来源，大幅度降低了丙酮酸的浓度水平，进而降低了杂质G合成的前提物质丙氨酸的合成代谢水平，从而降低了产物中杂质G的含量。
（3）本发明的方法简单，成本低，适于工业生产，可有效减少杂质G谷胱丙肽的产生，有利于得到纯度更高的谷胱甘肽结晶。
附图说明
图1是载体pUC18-KANA-gshF的结构示意图；
图2是实施例1制备的β晶型产品和α晶型产品的X-粉末衍射谱图；
图3是实施例2制备的光谷甘肽α晶型产品的高效液相色谱图；
图4是对比例5制备的光谷甘肽α晶型产品的高效液相色谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分介绍的，目前市场谷胱甘肽产品晶型为α晶型，一般是在水-溶媒结晶体系，低温条件下结晶得到的，谷胱丙肽与谷胱甘肽结晶性质及其接近，结晶产品中谷胱丙肽的残留量较高，需要多次结晶和多种分离技术手段结合才能够达到质量要求。
基于此，本发明的目的是提供一种还原型谷胱甘肽的制备方法。本发明首先构建了表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21（pUC18-KANA-gshF），如图1所示，将KANA基因插入到pUC18-gshF（参见Cheng Wang等，Heterologous gshF gene expression in variousvector systems inEscherichiacoli for enhanced glutathione production，Journalof Biotechnology 214 (2015) 63–68）中构建重组表达载体，然后将重组表达载体导入大肠杆菌BL21得到的。对该菌种进行培养、诱导，在发酵阶段以苹果酸钠/甘氨酸溶液替代葡萄糖作为碳源，切断了葡萄糖等碳源进入三羧酸循环的关键中间产物---丙酮酸来源，大幅度降低了丙酮酸的浓度水平，进而降低了杂质G合成的前提物质丙氨酸的合成代谢水平。苹果酸为三羧酸循环的中间产物，在三羧酸循环中与草酸乙酰相互转化，草酸乙酰与乙酰辅酶A合成柠檬酸，因此苹果酸能够降低乙酰辅酶A的积累水平，进而加快丙酮酸的分解代谢。过量的甘氨酸能够增加谷氨酰胺半胱氨酸与甘氨酸合成谷胱甘肽的几率，竞争性抑制了丙氨酸与谷氨酰胺半胱氨酸合成谷胱丙肽的代谢水平。发酵时，控制溶氧保持5-10%范围，既兼顾了GSH的生物合成收率，又使杂质G的生物合成保持较低水平。谷胱甘肽溶液再通过铜盐法提取和进行β结晶，能够有效去除杂质G，得到纯度更高的谷胱甘肽α晶型产品。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
说明：本发明中表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21（pUC18-KANA-gshF）是根据文献Heterologous gshF gene expression in various vector systemsinEscherichiacoli for enhanced glutathione production中公开的pUC18-gshF（即在pUC18质粒中插入gshF基因）中插入耐卡那霉素基因（KANA），构建重组表达载体，然后将重组表达载体导入大肠杆菌BL21，得到表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21。
向pUC18-gshF中插入耐卡那霉素基因（KANA）、构建重组表达载体、重组表达载体导入大肠杆菌BL21的步骤均为现有技术，具体制备过程不再赘述。
本发明中所使用的载体是委托南京天霖生物科技有限公司制备的。
实施例1~3和对比例1~4中高效液相色谱检测溶液中杂质G的浓度时，实施例1~3和对比例1~4中结晶的用量及溶剂的用量各组均相同。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1
（1）将表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21（pUC18-KANA-gshF）进行培养（接种量为2vt%），培养温度为37 ℃，通气比为1:1.2（发酵液体积与每分钟通入发酵罐内标准状况下的空气体积之比），溶氧反弹后，流加50%葡萄糖溶液作为碳源。当培养液的OD600值达到45时进行诱导3.5h。诱导结束，添加谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸，使三种氨基酸的浓度皆为50mM，同时以 40%苹果酸钠/甘氨酸溶液替换葡萄糖溶液作为碳源，苹果酸钠:甘氨酸的摩尔比为7:1；添加氨基酸后，调整苹果酸钠/甘氨酸溶液流加速率使溶氧保持在5-10%范围；发酵3.5h，发酵结束后，发酵液超滤，滤液用铜盐法进行提取得到谷胱甘肽溶液。
（2）谷胱甘肽溶液进行浓缩至谷胱甘肽含量至190mg/ml，滴加0.75倍体积的无水乙醇，35℃结晶6h，结晶过滤干燥，即得到β晶型产品；β晶型产品重新溶解为25mg/ml的溶液；用高效液相色谱检测溶液中杂质G的浓度为0.12mg/ml，浓缩至谷胱甘肽含量至220mg/ml，滴加0.75倍体积的无水乙醇，3℃结晶6h，结晶过滤干燥，即得到α晶型产品，其纯度为99.4 %。
实施例2
（1）将表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21（pUC18-KANA-gshF）进行培养（接种量为5 vt %），培养温度为37 ℃，通气比1:1.2，溶氧反弹后，流加55%葡萄糖溶液作为碳源。当培养液的OD600值达到20时进行诱导2-5h。诱导结束，添加谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸，使三种氨基酸的浓度分别为70mM，同时以45%浓度苹果酸钠/甘氨酸溶液替换葡萄糖溶液作为碳源，苹果酸钠:甘氨酸的摩尔比为8:1；添加氨基酸后，调整苹果酸钠/甘氨酸溶液流加速率使溶氧保持在8-10%左右；发酵2h，发酵结束后，发酵液超滤，滤液用铜盐法进行提取得到谷胱甘肽溶液。
（2）谷胱甘肽溶液进行浓缩至含量至200mg/ml，滴加1倍体积的95%乙醇溶液，30℃结晶8h，结晶过滤干燥，即得到β晶型产品；β晶型产品重新溶解为25mg/ml的溶液，用高效液相色谱检测溶液中杂质G的浓度为0.15mg/ml。然后浓缩至谷胱甘肽含量至210mg/ml，滴加0.5倍体积的无水乙醇，0℃结晶4h，结晶过滤干燥，即得到α晶型产品，其纯度为99.2 %。
实施例3
（1）将表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21（pUC18-KANA-gshF）进行培养（接种量为3 vt %），培养温度为37℃，通气比1:1.2，溶氧反弹后，流加45%葡萄糖溶液作为碳源，调节补料速率使溶氧保持在20-50%范围内。当培养液的OD600值达到70时进行诱导2h。诱导结束，添加 谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸，使其浓度分别为60mM，同时以42%浓度的苹果酸钠/甘氨酸溶液替换葡萄糖溶液作为碳源，苹果酸钠:甘氨酸的摩尔比为6:1；添加氨基酸后，调整苹果酸钠/甘氨酸溶液流加速率使溶氧保持在4-6%；发酵5h，发酵结束后，发酵液超滤，滤液用铜盐法进行提取得到谷胱甘肽溶液。
（2）谷胱甘肽溶液进行浓缩至含量280mg/ml，滴加0.5倍体积的无水乙醇，40℃结晶4h，结晶过滤干燥，即得到β晶型产品；β晶型产品重新溶解为25mg/ml的溶液；用高效液相色谱检测溶液中杂质G的浓度为0.08mg/ml 。浓缩至谷胱甘肽含量160mg/ml，滴加1倍体积的无水的乙醇溶液，5℃结晶8h，结晶过滤干燥，即得到α晶型产品，其纯度为99.3 %。
对比例1
与实施例1的区别在于：以等量葡萄糖溶液替换苹果酸钠/甘氨酸溶液。
β晶型产品重新溶解为25mg/ml的溶液；用高效液相色谱检测溶液中杂质G的浓度为0.63mg/ml。α晶型产品纯度为98.5%。
对比例2
与实施例1的区别在于：以苹果酸钠替换苹果酸钠/甘氨酸溶液，苹果酸钠的用量与苹果酸钠/甘氨酸溶液中苹果酸钠的用量相同。
β晶型产品重新溶解为25mg/ml的溶液；用高效液相色谱检测溶液中杂质G的浓度为0.41mg/ml。α晶型产品纯度为98.9%。
对比例3
与实施例1的区别在于：以甘氨酸换苹果酸钠/甘氨酸溶液，甘氨酸的用量与苹果酸钠/甘氨酸溶液中甘氨酸的用量相同。
β晶型产品重新溶解为25mg/ml的溶液；用高效液相色谱检测溶液中杂质G的浓度为0.46mg/ml。α晶型产品纯度为 98.7%。
对比例4
与实施例1的区别在于：不进行β结晶，直接结晶得到α晶型产品，纯度为98.6 %。α结晶重新溶解为25mg/ml的溶液，用高效液相色谱检测溶液中杂质G的浓度为0.30mg/ml。
对比例5
按对比例2方法发酵谷胱甘肽，发酵液用20%硫酸酸化至PH1-3，超滤，滤液加入等当量的氧化亚铜，搅拌3h；过滤，去离子水洗涤滤饼，得谷胱甘肽亚铜；
参照专利公布号：CN 106146609 A¸专利名称“一种利用膜分离技术从谷胱甘肽亚铜盐中分离提纯谷胱甘肽的方法”中提供的技术，将谷胱甘肽亚铜用去离子水悬浮成2000mg/L的悬浮液，通入硫化氢进行置换3h，置换结束过滤，得谷胱甘肽滤液；用硫酸调节PH3.1-3.3，用1um孔径的有机膜进行微滤；分别用孔径500分子量和300分子量的有机膜进行纳滤，纳滤液真空浓缩至谷胱甘肽含量260mg/ml，滴加1BV体积的无水乙醇0-5℃结晶6h；过滤，0.5BV的50%乙醇淋洗，干燥得谷胱甘肽产品，其纯度为94.7%。
对实施例2和对比例5制备的光谷甘肽α晶型产品的高效液相色谱图进行对比，如图3和4所示，可以看出，实施例2制备的光谷甘肽α晶型产品中不含杂质G，纯度远高于对比例5采用现有方法制备的光谷甘肽α晶型产品。与对比例1~4相比，实施例2制备得到的α晶型产品中，杂质G的含量最低，说明本发明以苹果酸钠/甘氨酸溶液替换葡萄糖溶液作为碳源可降低杂质G的产生，以铜盐法结合β结晶等多重方式可有效分离产生的杂质G。此外，采用β结晶可以有效去除杂质G，还能去除其他杂质，进一步提高光谷甘肽产品纯度。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种还原型谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
（1）对表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21进行培养，中后期流加葡萄糖溶液作为碳源，OD600为20-70时进行诱导，诱导结束添加氨基酸，同时以苹果酸钠/甘氨酸溶液替换葡萄糖作为碳源，进行发酵，对发酵体系进行超滤，滤液用铜盐法进行分离，得到谷胱甘肽溶液；所述表达双功能酶基因的大肠杆菌BL21是将KANA基因和gshF基因插入到质粒pUC18中构建重组表达载体pUC18-KANA-gshF，然后将重组表达载体pUC18-KANA-gshF导入大肠杆菌BL21得到的，所述KANA基因为耐卡那霉素基因；所述培养的温度为37℃，时间为20-26 h；所述葡萄糖溶液的浓度为45%-60% ；所述葡萄糖溶液的加入量占培养基体积的25%-35%；所述诱导的时间为2-5h；所述氨基酸为谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸；所述谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸的摩尔比为1 ：1 ：1；所述氨基酸中的谷氨酸钠、半胱氨酸、甘氨酸浓度均为25-100mM；所述苹果酸钠/甘氨酸溶液中苹果酸钠和甘氨酸的摩尔比为4~10:1，所述苹果酸钠/甘氨酸溶液的浓度为40~50%；所述苹果酸钠/甘氨酸溶液的加入量占体系总体积的4-8%；所述苹果酸钠/甘氨酸溶液的流加速率使溶氧保持在3-15%；
（2）谷胱甘肽溶液进行浓缩、结晶得到β晶型产品；对β晶型产品重新溶解，进行晶型转化得到α晶型产品；所述β晶型产品的结晶温度为25~45℃，时间为4~8h；所述α晶型产品的结晶温度为0-5℃，时间为4~8h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述苹果酸钠/甘氨酸溶液中苹果酸钠和甘氨酸的摩尔比为6~8:1；所述苹果酸钠/甘氨酸溶液流的加速率使溶氧保持在5-10%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述发酵的温度为37 ℃，发酵周期为20-26h；所述超滤所用的超滤膜为孔径10-50nm的陶瓷膜。
4.权利要求1~3任一项所述的制备方法在提高还原型谷胱甘肽纯度中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310903816.4A CN116621920B (zh) | 2023-07-24 | 2023-07-24 | 一种还原型谷胱甘肽的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310903816.4A CN116621920B (zh) | 2023-07-24 | 2023-07-24 | 一种还原型谷胱甘肽的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116621920A CN116621920A (zh) | 2023-08-22 |
| CN116621920B true CN116621920B (zh) | 2023-09-29 |
Family
ID=87636890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310903816.4A Active CN116621920B (zh) | 2023-07-24 | 2023-07-24 | 一种还原型谷胱甘肽的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116621920B (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016114618A1 (ko) * | 2015-01-16 | 2016-07-21 | 서강대학교산학협력단 | 광합성 세포막 소낭을 이용한 글루타치온의 지속적 생산 방법 |
| CN109096367A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-28 | 上海青平药业有限公司 | 一种还原型谷胱甘肽发酵过程中产生的杂质g的分离纯化方法及其用途 |
| CN109134594A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 一种酶法制备谷胱甘肽的方法 |
| CN112646768A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-13 | 上海青平药业有限公司 | 一种重组谷氨酸棒杆菌及谷胱甘肽的制备方法 |
-
2023
- 2023-07-24 CN CN202310903816.4A patent/CN116621920B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016114618A1 (ko) * | 2015-01-16 | 2016-07-21 | 서강대학교산학협력단 | 광합성 세포막 소낭을 이용한 글루타치온의 지속적 생산 방법 |
| CN109134594A (zh) * | 2017-06-15 | 2019-01-04 | 深圳市古特新生生物科技有限公司 | 一种酶法制备谷胱甘肽的方法 |
| CN109096367A (zh) * | 2018-08-22 | 2018-12-28 | 上海青平药业有限公司 | 一种还原型谷胱甘肽发酵过程中产生的杂质g的分离纯化方法及其用途 |
| CN112646768A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-13 | 上海青平药业有限公司 | 一种重组谷氨酸棒杆菌及谷胱甘肽的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Heterologous gshF gene expression in various vector systems in Escherichia coli for enhanced glutathione production";Cheng Wang 等;《Journal of Biotechnology》;第214卷;第63-68页 * |
| "新型谷胱甘肽合成酶重组菌的发酵工艺优化";赵翔 等;《中国新技术新产品》(第4期);第1-3页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116621920A (zh) | 2023-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107058416B (zh) | 一种精制谷氨酸的发酵工艺 | |
| FI81607B (fi) | Framstaellning av butanol medelst foerbaettrat jaesningsfoerfarande. | |
| EP1916308A1 (en) | Use of vitamins in fermentation processes for the production of amino acids | |
| Hwang et al. | The fermentation process for L-phenylalanine production using an auxotrophic regulatory mutant of Escherichia coli | |
| CN111748480A (zh) | 一种维斯假丝酵母及其应用 | |
| CN117126898B (zh) | 一种通过生物技术制备缬氨酸的工艺 | |
| CN108715827B (zh) | 酪氨酸酚裂解酶的胞外表达及其应用 | |
| CN116621920B (zh) | 一种还原型谷胱甘肽的制备方法 | |
| US5518905A (en) | Method for producing L-3,4-dihydroxyphenylalanine by precipitation of anhydrous crystals | |
| KR100240696B1 (ko) | 아릴알카노산의 분리 | |
| CN112251476B (zh) | 一种l-苯丙氨酸的生产方法 | |
| CN110541013B (zh) | 一种发酵生产l-亮氨酸的方法 | |
| KR910002850B1 (ko) | L-라이신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 제조방법 | |
| JP3116102B2 (ja) | Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法 | |
| CN114621892A (zh) | 高产聚唾液酸的大肠杆菌及其应用 | |
| CN104313071B (zh) | 高纯L‑α‑氨基酸的生物合成方法 | |
| CN102925530A (zh) | 一种l-蛋氨酸的制备方法 | |
| JP4577513B2 (ja) | ２−アルキルシステインアミド又はその塩、並びに、それらの製造方法及び用途 | |
| CN111635917A (zh) | 一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法 | |
| CA1301690C (en) | PROCESS FOR THE FERMENTATIVE PREPARATION OF L-AMINO ACIDS FROM .alpha.-KETO CARBOXYLIC ACIDS | |
| CN105821013B (zh) | 羰基还原酶及其在制备手性n-保护-羟基氮杂环中的应用 | |
| NO167024B (no) | Fremgangsmaate for rensing av karnitin. | |
| CN113862315B (zh) | 适用于大肠杆菌发酵生产l-苯丙氨酸的组方及其应用 | |
| CN108486173A (zh) | 一种α-酮戊二酸的制备方法 | |
| CN115074293A (zh) | 一种甘油葡糖苷提纯工艺 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240207 Address after: 274007 No. 1777, Kunming Road, Heze City, Shandong Province Patentee after: Shandong Ruiying Pharmaceutical Group Co.,Ltd. Country or region after: China Patentee after: SHANGHAI QINGPING PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 1777 Kunming Road, Mudan District, Heze City, Shandong Province Patentee before: Shandong Ruiying Pharmaceutical Group Co.,Ltd. Country or region before: China |
|
| TR01 | Transfer of patent right |