JP4291511B2 - フェキソフェナジンの新規の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明の主題は、フェキソフェナジンの新規の製造方法にある。
フェキソフェナジンは、有意の抗ヒスタミン活性を有し且つ副作用がない薬剤である｛季節性アレルギー性鼻炎の処置についてのフェキソフェナジン塩酸塩の効能及び安全性（Efficacy and Safety of Fexofenadine hydrochloride for treatment of seasonal allergic rhinitis）、Bernstein D.I.ら、Ann. Allergy-Asthma-Immunol.、（1997）79(5)、443〜448｝。
【０００２】
この化合物は、それ自体抗ヒスタミン薬であるテルフェナジンの主要代謝産物である｛D. Mc Tavish、KL Goa及びM. Ferill、『テルフェナジン：その薬理学的性質及び治療上の有効性の最新の評価（terfenadine: an updated review of its pharmacological properties and therapeutic efficiency）』、Drug 39、552〜574（1989）｝。
フェキソフェナジンは従来は化学的ルートで多段階で１０％よりも低い収率で調製されていた（米国特許第５５７８６１０号及び同第５５８１０１１号の各明細書）。
【０００３】
従って、本出願人は、フェキソフェナジンのための別の合成ルートを見出すことを提唱する。そして、次の非常に特異的な２つのタイプの微生物：アブシディア・コリンビフェラ（Absidia Corymbifera）属（特にAbsidia Corymbifera LCP 63-1800）又はストレプトミセス（Streptomyces）属｛特にStreptomyces platensis（ストレプトミセス・プラテンシス）NRRL 2364｝：の内の１つを用いるバイオ転化（生物学的転化）方法に選択が向けられる。
これらの微生物についてのバイオ転化の特異性は予期されなかった。篩分け（選別）の間に研究された数多くの菌株の中で、これらだけが良好な収率で且つ殆ど又は全く副生成物なしでフェキソフェナジンを得ることを可能にするものだった。
【０００４】
本発明の主題は、次式（I）：
【化５】
の化合物の製造方法であって、
アブシディア・コリンビフェラ属の微生物培地又はストレプトミセス属の微生物培地を用いて５．０〜８．０の範囲のｐＨにおいて次式（II）：
【化６】
の化合物のバイオ転化を実施して式（I）の所期の化合物を得て、
必要に応じてこの化合物を単離し、精製し且つ（又は）塩形成させることを特徴とし、
式（I）又は式（II）の化合物が２つの可能なエナンチオマーの内のいずれか一方の形にあることもでき、それらの混合物の形にあることもできる、前記製造方法にある。式中の星印（アスタリスク）は不斉炭素の位置を示す。
【０００５】
本発明の特定的な主題は、アブシディア・コリンビフェラがAbsidia Corymbifera LCP 63-1800である前記の製造方法、又はストレプトミセスがStreptomyces platensis NRRL 2364である前記の製造方法にある。
フェキソフェナジンは式（I）のエナンチオマーのラセミ混合物である。従って本発明のより特定的な主題は、式（II）の２種のエナンチオマーのラセミ混合物に相当するテルフェナジンのバイオ転化を実施して式（I）のエナンチオマーのラセミ混合物に相当するフェキソフェナジンを得る、前記の方法にある。
【０００６】
アブシディア・コリンビフェラ、特にAbsidia Corymbifera LCP 63-1800は、パリ自然歴史博物館隠花植物研究所（Cryptogamie du Meseum d'Histoire Naturelle de Paris）から入手できる。
本発明の主題である方法において用いることができるストレプトミセスの中では、次のストレプトミセスを挙げることができる：
・Streptomyces albus
・Streptomyces ambofaciens ATCC 15154
・Streptomyces antibioticus ATCC 31771
・Streptomyces aureofaciens ATCC 10762
・Streptomyces djakartensis
・Streptomyces erythraeus
・Streptomyces felleus DSM 40130
・Streptomyces fradiae W3554
・Streptomyces griseus NRRL B150
・Streptomyces JSP-2 (FH2126)
・Streptomyces lividans JT46/pCS2
・Streptomyces narbonensis FH 2102
・Streptomyces olivaceus ATCC 3335
・Streptomyces platensis ATCC 13865
・Streptomyces platensis NRRL 2364
・Streptomyces rimosus 2234
・Streptomyces venezuelae NRRL B-2446。
【０００７】
別の核がない極めて簡単な細菌の細胞は原核生物として分類することができるということは、当業者に知られている。これは線状細菌（filamentous bacteria）であるStreptomycesの場合であり、これは好気性生物であり、グラム陽性である。他方、その他の微生物、例えば糸状真菌（filamentous fungi）及び全く特定的にはAbsidia Corymbiferaのような微生物は、真核生物と称される。これらの細胞は、特に核及び多数の細胞質小器官が存在することによって原核生物から区別される。
【０００８】
本発明の主題である前記の方法は、数多くの利点を提供する。まず、本方法は、多数の合成段階を必要とし且つそれぞれの反応段階において必要な単離工程が伴う化学的ルートを回避する。工業的な利用の場合、このルートは費用がかかり且つ汚染をもたらすことが認められている。
【０００９】
本発明の主題である方法の場合、単一の操作が必要なだけであり、随意としての精製段階は本質的にはバイオ転化の際に生成することがある副生成物、即ちまだ酸に酸化していないアルコールが下記のホスフェートの形にエステル化されたものに相当するトリオールホスフェート（式（IIIｂ））を除去することを目的とするだけである。
【００１０】
本方法はまた、工業的用途にも適する。０．５ｇ／リットルの出発物質濃度で操作することによって、収率は出発物質に対して７０％を超える。
【００１１】
化学的ルートに対して微生物ルートを用いることのその他の利点としては、この技術の非汚染性局面を強調することができ、すべての操作は水性媒体中で行なわれる。
【００１２】
精製は、当業者に周知の方法に従って実施される。これは結晶化、クロマトグラフィー又はイオン交換樹脂による精製であることができる。
【００１３】
塩形成反応は、通常の条件下で実施することができる。例えばこの操作は、エタノール性苛性ソーダの存在下で実施することができる。また、炭酸又は酸性炭酸ナトリウム又はカリウムのようなナトリウム又はカリウム塩を用いることもできる。得られる塩は、アルカリ若しくはアルカリ土類金属又は随意に置換されたアンモニウムの塩であることができる。
【００１４】
酸化は、糸状真菌の培地を用いた有機分子の微生物的酸化に通常用いられている方法に従って実施される｛Holland HL、Organic synthesis with oxidative enzymes. VCH publisher, Inc, New York 1992; Lacroix I.、Biton J. and Azerad R.、Microbial biotransformation of synthetic immunomodulating agent HR325、Bioorg. Med. Chem.（1997）7、1369〜1380; Sebek OK、Fungal transformations as a useful method for the organic synthesis of organic compounds、Mycologia 75(2)、383〜394、1983; Azerad R.、Microbial models for drug metabolism、Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology、Vol. 63、page 169、1999｝。
【００１５】
かくして、最初に予備試験において分析的ルート、特に薄層クロマトグラフィー又はＨＰＬＣによって、最も好ましい発酵条件、例えば栄養培地の選択、好適な基質の溶剤、基質の濃度、培養のための最適な技術的条件（例えば温度、換気、ｐＨ及び時間）、並びに基質の添加及び基質と微生物との接触のような発酵条件を決定する。
【００１６】
第一の局面において、培養は液状栄養培地中で５〜７の初期ｐＨで２０〜３０℃、好ましくは２６〜２８℃の温度においてAbsidia Corymbifera LCP 63-1800又はストレプトミセス（Streptomyces）属（特にStreptomyces platensis NRRL 2364）の接種材料（胞子又は菌糸体）から実施される。換気は、培養容器を回転撹拌する（１５０〜２５０ｒｐｍ）ことによって、又は発酵容器中でブイヨン培地１リットル当たりに毎分約１リットルの流量で空気を導入することによって、保証される。
【００１７】
２４〜７２時間、好ましくは６０〜６５時間の時間の後に、テルフェナジンを０．１〜１ｇ／リットル、好ましくは０．４〜０．６ｇ／リットルの濃度でエタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドのような水と混和性の有機溶剤（培地１リットル当たりに５〜２０ミリリットル）、好ましくはエタノール（１０ミリリットル／リットル）中の溶液状で添加する。培養と同じ条件下でインキュベーションを続ける。随意にｐＨを５．０〜８．０の値に再調節して維持する。基質の転化の後にインキュベーション上澄み液のＨＰＬＣ分析又は有機溶剤で抽出したサンプルの薄層クロマトグラフィーを実施するのが有利である。一般的に４８〜２００時間の後に充分な量のフェキソフェナジンが生成した。
【００１８】
別の手順は、培地のバイオマスを濾過によって分離し、これを水又は緩衝液で洗浄して中性ｐＨにし、次いで好適な緩衝液（例えばｐＨ７の０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液）中に再懸濁させ、次いで基質を添加して前記のようにインキュベーションを続けることから成る。
【００１９】
本方法の生成物の単離及び精製は、周知の態様で実施される。例えば、本方法の生成物を有機溶剤（好ましくは酢酸エチル）で抽出することができ、また、疎水性カラム上に吸着させ、次いで有機溶剤によって溶離させ、有機溶剤を蒸発させ、生成物をカラムクロマトグラフィー若しくは結晶化によって分離精製することもできる。
【００２０】
従って、本発明のより一層特定的な主題は、バイオ転化条件が次の通り：
・０．５ｇ／リットル〜１０ｇ／リットル、好ましくは０．５ｇ／リットル〜５ｇ／リットルのテルフェナジン添加濃度；
・５．０〜８．０の範囲のｐＨ；
・２６℃〜２８℃の範囲の温度；
及び
・ブイヨン培地１リットル当たりに毎分ほぼ１リットルの空気流導入による換気：
である前記の方法にある。
【００２１】
本発明の１つの目標は、副生成物の生成を最小限にするためにインキュベーションの間ｐＨを最適な値に調節して随意にそれを維持することである。
【００２２】
Absidia Corymbifera又はStreptomyces platensisによるテルフェナジン（II）のフェキソフェナジン（I）への転化は、いくつかの連続的な段階を伴い、次の図式に従ってトリオール（IIIｃ）並びに２つの望まれない副生成物であるテルフェナジンホスフェート（テルフェナジン−Ｐと略記する）（IIIａ）及びトリオールホスフェート（トリオール−Ｐと略記する）（IIIｂ）が中間で生成する：
【化７】
【化８】
【００２３】
インキュベーション培地中の微生物によってもたらされるテルフェナジン（II）のトリオール（IIIｃ）への初期酸化は、僅かに酸性の乃至中性のｐＨ（６＜ｐＨ＜７）によって促進される（第２表）。テルフェナジンホスフェート（IIIａ）の生成（不可逆的らしい）は、試験したすべての条件において非常に制限されたままで、１〜２％未満である。他方、トリオールホスフェート（IIIｂ）の生成は、第３表に示したように特に中性又はアルカリ性ｐＨ（ｐＨ７．０〜８．０）においてインキュベーションを実施した場合には、培地中に蓄積する酸化生成物の内の有意の割合を占める（図１も参照されたい）。このｐＨは、インキュベーション培地が自然にそこに向かって変化していくｐＨである。しかしながら、僅かに酸性のｐＨ（最適にはｐＨ６付近）においては、インキュベーション培地中に存在する菌を起源とするホスファターゼがトリオールホスフェート（IIIｂ）の迅速な加水分解を触媒し（第４表、図１）、それより高いｐＨ（ｐＨ≧７）においてはトリオールのフェキソフェナジンへの不可逆的酸化が促進される（第５表、図１）。
【００２４】
その結果、殆どすべてのテルフェナジンをフェキソフェナジンに転化させるためには、（生成する非常に少量のテルフェナジンホスフェートを考慮しないのならば、）いくつかの可能な方策がある。
・最初にインキュベーションを初期培地中で約６．５のｐＨにおいてｐＨを制御することなく進行させて（同時にｐＨが８．０〜８．５に向かって変化する）テルフェナジンをトリオールホスフェート（IIIｂ）とフェキソフェナジンとの安定な変化しない混合物に完全に転化させ（図２）（例２及び３）、次いでｐＨを３．５〜４の範囲の値に低下させて（IIIｂ）の（IIIｃ）への転化を促進し、トリオールホスフェート（IIIｂ）が完全に消失するまでｐＨをゆっくり自然に６．０に向けて上昇させ、次いでトリオール（IIIｃ）がフェキソフェナジンに転化するまでｐＨをほぼ８．０に再調節して維持する（図３）（例４）。
・同じ態様でインキュベーションを培地中で最初に約６．５のｐＨにおいてｐＨを制御することなく進行させ（ｐＨが自然に８．０〜８．５に向かって変化する）、次いでｐＨを６．０〜６．５の範囲の値に低下させて維持する。このｐＨにおいてはホスファターゼ−ホスホリラーゼ活性のこのｐＨにおける平衡の結果としてトリオールホスフェート（IIIｂ）が非常に迅速に加水分解し、他方トリオール（IIIｃ）自体は非常に迅速に酸化して殆ど完全にフェキソフェナジンに転化する（図４）（例５）。
【００２５】
従って、本発明のより特定的な主題は、
・ほぼ６．５の初期ｐＨを自然に８．０〜８．５に変化させてトリオールホスフェート（IIIｂ）と式（I）の化合物との混合物をもたらし、
次いでこのｐＨを３．５〜４の範囲の値に低下させて式（IIIｂ）の中間体化合物の式（IIIｃ）の中間体化合物への転化を促進し、
次いで式（IIIｂ）の化合物が完全に消失するまでｐＨを自然にほぼ６．０に変化させ、
最後に式（IIIｃ）の化合物がフェキソフェナジンに転化するまでｐＨをほぼ８．０に再調節して維持する、前記方法；
・初期ｐＨがほぼ６．５であり、
このｐＨを自然に８．０〜８．５に変化させ、
次いで６．３〜６．８の範囲の値に低下させて維持する、前記方法；
・精製工程の間に請求項１記載の式（I）の化合物の抽出を酢酸エチル中で実施する、前記方法：
にある。
【００２６】
最後に、本発明の主題はまた、中間体化合物としての、式（IIIｃ）の化合物にもある。
【００２７】
以下、実施例によって本発明を例示するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００２８】
様々な培地の調製
培地Ａ：蒸留水９００ミリリットルに対して、コーンスティープリカー、１０ミリリットル；ＮａＮＯ3、２ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ；ＫＣｌ、０．５ｇ。燐酸塩緩衝液（蒸留水４０ミリリットル中にＫ2ＨＰＯ4、２ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ）及びグルコース（蒸留水６０ミリリットル中に３０ｇ）を接種の瞬間に添加。
培地Ｂ：蒸留水９００ミリリットルに対して、大豆ペプトン、５ｇ；酵母抽出物、５ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇ；ＮａＮＯ3、２ｇ；ＫＣｌ、０．５ｇ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ。燐酸塩緩衝液（蒸留水４０ミリリットル中にＫ2ＨＰＯ4、２ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ）及びグルコース（蒸留水６０ミリリットル中に３０ｇ）を接種の瞬間に添加。
培地Ｃ：蒸留水９００ミリリットルに対して、大豆ペプトン、５ｇ；酵母抽出物、５ｇ；ＮａＣｌ、５ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4、５ｇ。グルコース（２００ｇ／リットル溶液１００ミリリットル）を接種の瞬間に添加。
培地Ｄ：蒸留水９００ミリリットルに対して、コーンスティープリカー、１０ミリリットル；大豆ペプトン、５ｇ；ＮａＮＯ3、２ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ；ＫＣｌ、０．５ｇ。燐酸塩緩衝液（蒸留水４０ミリリットル中にＫ2ＨＰＯ4、２ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ）及びグルコース（蒸留水６０ミリリットル中に３０ｇ）を接種の瞬間に添加。
培地Ｅ：培地Ｃを殺菌前に濃ＨＣｌでｐＨ７に調節したもの。
【００２９】
例１：様々な微生物の研究（篩分け）
篩分け（選別）のために、培地１００ミリリットルを含有させた２５０ミリリットル三角フラスコに、固体培地上で収穫したばかりの胞子の懸濁液を接種し、回転式インキュベーター中で２７℃において２００ｒｐｍで６６時間成長（培養）を実施する。
培地中のバイオマスにエタノール中の溶液状のテルフェナジン（１０ミリリットル／リットル）を最終濃度０．２ｇ／リットルで直接添加する。
培養と同じ条件下で７日間インキュベーションを続ける。
【００３０】
（ａ）分析方法
インキュベーションの間に上澄み液の一定したサンプル（１日１ミリリットル）を取り出し、遠心分離し、精密濾過し、Nucleosil C18のカラム上でＨＰＬＣに注入する｛２５０×４ｍｍ、流量１ミリリットル／分；２２０ｎｍ、６０℃において検出；溶剤はアセトニトリル−水−トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）混合物の、ＣＨ3ＣＮ−水−ＴＦＡ（１００：９００：１）（溶剤Ａ）からＣＨ3ＣＮ−水−ＴＦＡ（９００：１００：１）（溶剤Ｂ）の勾配のものである｝。
これらの条件下において、
・テルフェナジン（II）は１４．５６分の保持時間を有し、
・テルフェナジン−Ｐ（IIIａ）は１１．８分の保持時間を有し、
・トリオール（IIIｃ）は９．６１分の保持時間を有し、
・フェキソフェナジンは９．４５分の保持時間を有し、
・トリオール−Ｐ（IIIｂ）は７．４３分の保持時間を有する。
【００３１】
（ｂ）篩分けの結果
前記の培養条件下での篩分けの実施によって、試験した菌株の中で、下記の表に示した結果が得られ、そしてAbsidia Corymbifera LCP 63-1800及びStreptomyces platensis NRRL 2364の２種の菌株が三角フラスコ中でフェキソフェナジンを良好な収率でしかし無視できない量のトリオールホスフェート及びトリオールの存在下で製造することを可能にすることがわかった。
【００３２】
第１表：様々な微生物によるテルフェナジンの代謝
（０．２ｇ／リットル、９６時間、２７℃）
【表１】
(a)：菌糸体上に吸着されたテルフェナジンはないので、培養上澄み液のみを試験した。
± ：５〜１０％（ＨＰＬＣ）
＋ ：１０〜２０％（ＨＰＬＣ）
＋＋＋：７０〜８０％（ＨＰＬＣ）
【００３３】
（ｃ）Absidia Corymbifera LCP 63-1800によって生成したフェキソフェナジンの精製及び完全な特徴付け
Absidia Corymbiferaの三角フラスコを用いて（１００ミリリットル−テルフェナジン２０ｍｇ）出発し、菌糸体を濾過し、水で洗浄した後に、上澄み液をＮａＣｌで飽和させて酢酸エチルで３回抽出する。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥させ、次いで減圧下で蒸発させて白っぽい固体状残渣２７ｍｇを得て、これをシリカゲルカラム上で溶剤としてＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ−ＮＨ4ＯＨ（８２．５：１５：２．５）を用いたクロマトグラフィーによって精製する。標準試料のフェキソフェナジンと同じ純粋な生成物１２．４ｍｇが回収された。融点１９０〜１９５℃。
【００３４】
（ｄ）Absidia Corymbifera LCP 63-1800を用いて得られたフェキソフェナジンの構造研究
【化９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ、２５０．１３ＭＨｚ）Δ、ｐｐｍ：１．４９（６Ｈ、ｓ、２ＣＨ3）、１．５５〜１．８２（８Ｈ、ｍ、Ｈ−９、Ｈ−１０及びＨ−１３）、２．７３〜２．８５（４Ｈ、ｍ、Ｈ−１２）、３．３０〜３．３２（２Ｈ、ｍ、Ｈ−１１）、４．６０（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝５．５７及び５．９７Ｈｚ、Ｈ−８）、７．１７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．１７Ｈｚ、Ｈ−５）、７．２９（６Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝７．１７及び７．９７Ｈｚ、Ｈ−１８、Ｈ−１９及びＨ−２０）、７．３９（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．３７Ｈｚ、Ｈ−６）、７．５３（４Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５７Ｈｚ、Ｈ−１７及びＨ−２１）。
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ、６２．９ＭＨｚ）Δ、ｐｐｍ：２３．７（ＣＨ2、Ｃ−１０）、２７．１（２ＣＨ2、Ｃ−１３）、３０．２（２ＣＨ3、Ｃ−３）、３９．０（ＣＨ2、Ｃ−９）、４４．９（ＣＨ、Ｃ−１４）、５０．９（第４級Ｃ、Ｃ−２）、５５．４（２ＣＨ2、Ｃ−１２）、５９．５（ＣＨ2、Ｃ−１１）、７５．９（ＣＨ、Ｃ−８）、８１．７（第４級Ｃ、Ｃ−１５）、２３．７（ＣＨ2、Ｃ−１０）、１２８．６；１２３．９；１２９．４及び１３１．０（ＣＨ、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−１７、Ｃ−１８、Ｃ−１９、Ｃ−２０及びＣ−２１）、１４５．２；１４９．２及び１５０．３（第４級Ｃ、Ｃ−４、Ｃ−７及びＣ−１６）、１８６．３（第４級Ｃ、Ｃ−１）。
ＭＳ（エレクトロスプレー、陰イオン）、ｍ／ｚ：５００（Ｍ−Ｈ+）、４５６（Ｍ−Ｈ+−ＣＯ2）、３７８（４５６−Ｃ6Ｈ6）。
【００３５】
例２：フェキソフェナジンの微生物的調製
培地Ｄ１００ミリリットルを含有させた２５０ミリリットル三角フラスコ１０個にAbsidia Corymbifera LCP 63-1800を接種する。各三角フラスコにエタノール１ミリリットル中のテルフェナジン５０ｍｇを添加する。７日後に、１０個の三角フラスコをガーゼ上で濾過し（上澄み液は８．０のｐＨを有する）、塩化ナトリウムによる飽和を２時間実施し（ｐＨ＝５〜６）、次いで酢酸エチルで３回抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させる。減圧下で蒸発させた後に、所期の未精製化合物４０９ｍｇが得られた（収率７７％、ほぼ９０％の純度の生成物）。
この生成物をシリカゲルカラム（２３０〜４００メッシュ、シリカ４０ｇ、直径３ｃｍ）上で塩化メチレン／メタノール／水酸化アンモニウム混合物（８２．５−１５−２．５）を用いて溶離させて精製する。純粋なフェキソフェナジン３１２ｍｇが回収された（６１．４％）。
【００３６】
例３：発酵容器（培地Ａ）中におけるフェキソフェナジンの調製
Absidia Corymbiferaの培養を、培地Ａ（ｐＨ６．５）中で、しかし菌糸体２×１０6個／リットルを接種された５リットルの容量のBiolafitte発酵容器中で、２７℃において、約５リットル／分の空気流量で、２７５回転／分の撹拌下（螺旋状撹拌羽根）で実施する。６６時間の培養の後に得られた直径約１ｍｍの均質ペレットの形のバイオマスを、培養発酵容器中で直接バイオ転化のために用いた。エタノール５０ミリリットル中のテルフェナジン１．２５ｇを添加し、同じ条件下で７日間インキュベーションを続ける。この段階でのｐＨは８．５であり、インキュベーション培地はフェキソフェナジン３５％及びトリオールホスフェート６５％を含有する。バイオマスを濾過によって液状培地から分離する。濾液をＮａＣｌで飽和させ、そのｐＨを希ＨＣｌで６．０に調節し、これを酢酸エチルで３回抽出する。例２に記載したような精製の後に、純粋なフェキソフェナジン３５０ｍｇ（２７％）が回収された。水相中のトリオールホスフェート（IIIｂ）は、XAD-2のカラム上での吸着及びメタノールによる溶離によって回収することができる。
【００３７】
例３ａ：発酵容器（培地Ｄ）中におけるフェキソフェナジンの調製
Absidia Corymbiferaの培養を、培地Ｄ（ｐＨ６．５）中で、Biolafitte発酵容器中で例３におけるのと同じ条件下で実施する。６６時間の培養の後に得られたバイオマスを、培養発酵容器中で直接バイオ転化のために用いた。エタノール２５ミリリットル中のテルフェナジン１ｇを添加し、同じ条件下で４日間インキュベーションを続ける。この段階でのｐＨは８．０であり、インキュベーション培地はフェキソフェナジン７０％及びトリオールホスフェート３０％を含有し、これらを例３に記載したように単離して精製する。
【００３８】
例４：ｐＨを連続的に調節しながら発酵容器中でフェキソフェナジンを調製するための方法
Absidia Corymbiferaの培養を、培地Ｄ（ｐＨ６．５）中で、例３に記載した条件下で実施する。エタノール５０ミリリットル中のテルフェナジン２．５ｇを添加し、同じ条件下で４日間インキュベーションを続ける。この段階でのｐＨは８．０であり、インキュベーション培地はフェキソフェナジン４２％、トリオール（IIIｃ）１３％及びトリオールホスフェート（IIIｂ）２５％を含有する。濃ＨＣｌでｐＨを３．５に調節し、同じ条件下でインキュベーションを続けて培地のｐＨを６まで自由に変化させる（３日間）。この段階でトリオールホスフェート（IIIｂ）は殆ど完全に消失してトリオールになる。ｐＨを８．０に再調節し、同じ条件下でさらに２日間インキュベーションを続ける。この場合、培地はフェキソフェナジン８５％及びトリオールホスフェート（IIIｂ）１３％を含有する。
【００３９】
例５：発酵容器中でフェキソフェナジンを調製するための最適化された方法
Absidia Corymbiferaの培養を、培地Ｄ（ｐＨ６．５）中で、例３に記載した条件下で実施する。エタノール５０ミリリットル中のテルフェナジン２．５ｇを添加し、同じ条件下で４日間インキュベーションを続ける。この段階でのｐＨは８．０であり、インキュベーション培地はフェキソフェナジン３５％、トリオール（IIIｃ）１１．５％及びトリオールホスフェート（IIIｂ）３４％を含有する。希ＨＣｌでｐＨを６．０〜６．５に調節して維持し、同じ条件下でインキュベーションを続ける（３日間）。この場合、培地はフェキソフェナジン８９．５％及びトリオールホスフェート９．５％を含有する。
【００４０】
例６：
培地Ｅ１００ミリリットルを含有させた２５０ミリリットル三角フラスコにStreptomyces platensis NRRL 2364を接種して例１に記載したようにして培養する。この培地及びバイオマス（ｐＨは５．０である）の半分にエタノール０．５ミリリットル中に溶解させたテルフェナジン１０ｍｇを添加し、同じ条件下で数日間インキュベーションを続ける。３日後に、観察された代謝産物はトリオール（IIIｃ）だけだった（６０％）。７日後にはトリオールの収率が６７％に達した。
【００４１】
例７：
例６の培地及びバイオマスの残りの半分にテルフェナジン（エタノール０．５ミリリットル中に１０ｍｇ）を添加し、例６におけるのと同じ条件下で３日間インキュベートし、次いで７．５Ｍ−ＮａＯＨを添加することによってｐＨ８．０にする。さらに４日間インキュベーションを続け、トリオールホスフェート（IIIｂ）１６％、フェキソフェナジン（I）３７％及びトリオール（IIIｃ）２６％が得られた。
【００４２】
例８：発酵容器中におけるフェキソフェナジンの調製
予備培養
無菌培地１００ミリリットルを含有させた５００ミリリットル三角フラスコ中で最少培地（炭素源はグルコース）中で予備培養を実施する。この三角フラスコにStreptomyces platensis NRRL 2364のグリセロール化懸濁液（−８０℃において冷凍貯蔵）４５０マイクロリットルを接種し、軌道運動振盪機（軌道寸法２．５ｃｍ）中で３４℃で２５０ｒｐｍにおいて７５時間インキュベートする。
【００４３】
発酵／バイオ転化
グルコース１２５ｇ／リットルの最少培地３００ミリリットルを含有する総容積５００ミリリットルの発酵容器中で、発酵を実施する。この発酵容器に前記の予備培養物７．５ミリリットルを接種する。培養条件は次の通りである：・温度は３４℃に調節、
・一定の撹拌（ｐＯ２の調整なし）、
・５４リットル／時間での一定の換気（３ｖｖｍ）、
・２０％ＫＯＨの添加によりｐＨを６．０に調節。
４８時間の培養の後に、エタノール３ミリリットル中に溶解させたテルフェナジン７５ｍｇを添加する。２１２時間経過するまで培養を続ける。
【００４４】
結果
この試験のために、ブイヨン培地をエタノール中で１／１０に希釈した後にテルフェナジン及びその誘導体を逆相ＨＰＬＣによって分析する。２１２時間で７１％の反応の進行が得られ（フェキソフェナジン生成）、収支は８２％と見積もられた。
【００４５】
第２表：ｐＨの関数としてのテルフェナジンの酸化の初速度（６６時間後のバイオマス、洗浄してテルフェナジン１０６１マイクロモル／リットルの存在下で０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液中に再懸濁）。ＨＰＬＣによって実施した測定は、（トリオール＋トリオールホスフェート＋フェキソフェナジン）の合計に対応する。
【表２】
【００４６】
第３表：ｐＨの関数としてのトリオールのホスホリル化の初速度（インキュベーションの２時間後）（６６時間後のバイオマス、洗浄してトリオール１８６マイクロモル／リットルの存在下で０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液中に再懸濁）。インキュベーション上澄み液中の生成したトリオールホスフェートをＨＰＬＣによって測定した（最初の２時間はフェキソフェナジンの生成は何ら観察されなかった）。
【表３】
【００４７】
第４表：ｐＨの関数としてのトリオールホスフェートの加水分解の初速度（トリオールホスフェート２７２マイクロモル／リットルを含有させた１２０時間後のインキュベーション上澄み液、濃ＨＣｌで様々なｐＨに調節して維持し、２７℃においてインキュベート）。トリオールホスフェートの消失及びトリオールの発現の両方についてＨＰＬＣによって加水分解を測定した。この初期速度は、最初の７．５時間の加水分解について実施したサンプルの平均について計算した。
【表４】
【００４８】
第５表：ｐＨの関数としての６時間のインキュベーション及び２４時間のインキュベーションの時点で測定したトリオールの酸化（６６時間後のバイオマス、洗浄してトリオール１８６マイクロモル／リットルの存在下で０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液中に再懸濁）。これらの時点の間にフェキソフェナジンが生成し、トリオールの濃度はあまり変わらなかった。２つの生成物をＨＰＬＣによって測定した。
【表５】
＊計算した％＝（生成したフェキソフェナジン／残留トリオール）×１００
【図面の簡単な説明】
【図１】 Absidia blakesleeanaによるテルフェナジンの代謝の４つの一体の反応に対するｐＨの影響をまとめたグラフである。縦座標の尺度は、各曲線について同じ程度（桁）の値になるように乗除することによって再計算した。
【図２】 ｐＨを制御せずに行なった培地Ｄ中でのテルフェナジンのバイオ転化（０．２ｇ／リットル）における各物質の経時濃度変化を示すグラフである。
【図３】 インキュベーションのｐＨを３．５（９６時間）及び８．０（１６８時間）に調節しながら１００ミリリットル三角フラスコ内で媒体Ｄ中で行なったテルフェナジンのバイオ転化（０．５ｇ／リットル）における各物質の濃度及びｐＨの経時変化を示すグラフである。
【図４】 インキュベーションのｐＨを９６時間後に６．０に変更して維持しながら三角フラスコ内で行なったAbsidia blakesleeanaによるテルフェナジンのバイオ転化（０．５ｇ／リットル、２７℃、培地Ｄ）における各物質の濃度及びｐＨの経時変化を示すグラフである。
本発明の主題は、フェキソフェナジンの新規の製造方法にある。
フェキソフェナジンは、有意の抗ヒスタミン活性を有し且つ副作用がない薬剤である｛季節性アレルギー性鼻炎の処置についてのフェキソフェナジン塩酸塩の効能及び安全性（Efficacy and Safety of Fexofenadine hydrochloride for treatment of seasonal allergic rhinitis）、Bernstein D.I.ら、Ann. Allergy-Asthma-Immunol.、（1997）79(5)、443〜448｝。
【０００２】
この化合物は、それ自体抗ヒスタミン薬であるテルフェナジンの主要代謝産物である｛D. Mc Tavish、KL Goa及びM. Ferill、『テルフェナジン：その薬理学的性質及び治療上の有効性の最新の評価（terfenadine: an updated review of its pharmacological properties and therapeutic efficiency）』、Drug 39、552〜574（1989）｝。
フェキソフェナジンは従来は化学的ルートで多段階で１０％よりも低い収率で調製されていた（米国特許第５５７８６１０号及び同第５５８１０１１号の各明細書）。
【０００３】
従って、本出願人は、フェキソフェナジンのための別の合成ルートを見出すことを提唱する。そして、次の非常に特異的な２つのタイプの微生物：アブシディア・コリンビフェラ（Absidia Corymbifera）属（特にAbsidia Corymbifera LCP 63-1800）又はストレプトミセス（Streptomyces）属｛特にStreptomyces platensis（ストレプトミセス・プラテンシス）NRRL 2364｝：の内の１つを用いるバイオ転化（生物学的転化）方法に選択が向けられる。
これらの微生物についてのバイオ転化の特異性は予期されなかった。篩分け（選別）の間に研究された数多くの菌株の中で、これらだけが良好な収率で且つ殆ど又は全く副生成物なしでフェキソフェナジンを得ることを可能にするものだった。
【０００４】
本発明の主題は、次式（I）：
【化５】
アブシディア・コリンビフェラ属の微生物培地又はストレプトミセス属の微生物培地を用いて５．０〜８．０の範囲のｐＨにおいて次式（II）：
【化６】
必要に応じてこの化合物を単離し、精製し且つ（又は）塩形成させることを特徴とし、
式（I）又は式（II）の化合物が２つの可能なエナンチオマーの内のいずれか一方の形にあることもでき、それらの混合物の形にあることもできる、前記製造方法にある。式中の星印（アスタリスク）は不斉炭素の位置を示す。
【０００５】
本発明の特定的な主題は、アブシディア・コリンビフェラがAbsidia Corymbifera LCP 63-1800である前記の製造方法、又はストレプトミセスがStreptomyces platensis NRRL 2364である前記の製造方法にある。
フェキソフェナジンは式（I）のエナンチオマーのラセミ混合物である。従って本発明のより特定的な主題は、式（II）の２種のエナンチオマーのラセミ混合物に相当するテルフェナジンのバイオ転化を実施して式（I）のエナンチオマーのラセミ混合物に相当するフェキソフェナジンを得る、前記の方法にある。
【０００６】
アブシディア・コリンビフェラ、特にAbsidia Corymbifera LCP 63-1800は、パリ自然歴史博物館隠花植物研究所（Cryptogamie du Meseum d'Histoire Naturelle de Paris）から入手できる。
本発明の主題である方法において用いることができるストレプトミセスの中では、次のストレプトミセスを挙げることができる：
・Streptomyces albus
・Streptomyces ambofaciens ATCC 15154
・Streptomyces antibioticus ATCC 31771
・Streptomyces aureofaciens ATCC 10762
・Streptomyces djakartensis
・Streptomyces erythraeus
・Streptomyces felleus DSM 40130
・Streptomyces fradiae W3554
・Streptomyces griseus NRRL B150
・Streptomyces JSP-2 (FH2126)
・Streptomyces lividans JT46/pCS2
・Streptomyces narbonensis FH 2102
・Streptomyces olivaceus ATCC 3335
・Streptomyces platensis ATCC 13865
・Streptomyces platensis NRRL 2364
・Streptomyces rimosus 2234
・Streptomyces venezuelae NRRL B-2446。
【０００７】
別の核がない極めて簡単な細菌の細胞は原核生物として分類することができるということは、当業者に知られている。これは線状細菌（filamentous bacteria）であるStreptomycesの場合であり、これは好気性生物であり、グラム陽性である。他方、その他の微生物、例えば糸状真菌（filamentous fungi）及び全く特定的にはAbsidia Corymbiferaのような微生物は、真核生物と称される。これらの細胞は、特に核及び多数の細胞質小器官が存在することによって原核生物から区別される。
【０００８】
本発明の主題である前記の方法は、数多くの利点を提供する。まず、本方法は、多数の合成段階を必要とし且つそれぞれの反応段階において必要な単離工程が伴う化学的ルートを回避する。工業的な利用の場合、このルートは費用がかかり且つ汚染をもたらすことが認められている。
【０００９】
本発明の主題である方法の場合、単一の操作が必要なだけであり、随意としての精製段階は本質的にはバイオ転化の際に生成することがある副生成物、即ちまだ酸に酸化していないアルコールが下記のホスフェートの形にエステル化されたものに相当するトリオールホスフェート（式（IIIｂ））を除去することを目的とするだけである。
【００１０】
本方法はまた、工業的用途にも適する。０．５ｇ／リットルの出発物質濃度で操作することによって、収率は出発物質に対して７０％を超える。
【００１１】
化学的ルートに対して微生物ルートを用いることのその他の利点としては、この技術の非汚染性局面を強調することができ、すべての操作は水性媒体中で行なわれる。
【００１２】
精製は、当業者に周知の方法に従って実施される。これは結晶化、クロマトグラフィー又はイオン交換樹脂による精製であることができる。
【００１３】
塩形成反応は、通常の条件下で実施することができる。例えばこの操作は、エタノール性苛性ソーダの存在下で実施することができる。また、炭酸又は酸性炭酸ナトリウム又はカリウムのようなナトリウム又はカリウム塩を用いることもできる。得られる塩は、アルカリ若しくはアルカリ土類金属又は随意に置換されたアンモニウムの塩であることができる。
【００１４】
酸化は、糸状真菌の培地を用いた有機分子の微生物的酸化に通常用いられている方法に従って実施される｛Holland HL、Organic synthesis with oxidative enzymes. VCH publisher, Inc, New York 1992; Lacroix I.、Biton J. and Azerad R.、Microbial biotransformation of synthetic immunomodulating agent HR325、Bioorg. Med. Chem.（1997）7、1369〜1380; Sebek OK、Fungal transformations as a useful method for the organic synthesis of organic compounds、Mycologia 75(2)、383〜394、1983; Azerad R.、Microbial models for drug metabolism、Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology、Vol. 63、page 169、1999｝。
【００１５】
かくして、最初に予備試験において分析的ルート、特に薄層クロマトグラフィー又はＨＰＬＣによって、最も好ましい発酵条件、例えば栄養培地の選択、好適な基質の溶剤、基質の濃度、培養のための最適な技術的条件（例えば温度、換気、ｐＨ及び時間）、並びに基質の添加及び基質と微生物との接触のような発酵条件を決定する。
【００１６】
第一の局面において、培養は液状栄養培地中で５〜７の初期ｐＨで２０〜３０℃、好ましくは２６〜２８℃の温度においてAbsidia Corymbifera LCP 63-1800又はストレプトミセス（Streptomyces）属（特にStreptomyces platensis NRRL 2364）の接種材料（胞子又は菌糸体）から実施される。換気は、培養容器を回転撹拌する（１５０〜２５０ｒｐｍ）ことによって、又は発酵容器中でブイヨン培地１リットル当たりに毎分約１リットルの流量で空気を導入することによって、保証される。
【００１７】
２４〜７２時間、好ましくは６０〜６５時間の時間の後に、テルフェナジンを０．１〜１ｇ／リットル、好ましくは０．４〜０．６ｇ／リットルの濃度でエタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドのような水と混和性の有機溶剤（培地１リットル当たりに５〜２０ミリリットル）、好ましくはエタノール（１０ミリリットル／リットル）中の溶液状で添加する。培養と同じ条件下でインキュベーションを続ける。随意にｐＨを５．０〜８．０の値に再調節して維持する。基質の転化の後にインキュベーション上澄み液のＨＰＬＣ分析又は有機溶剤で抽出したサンプルの薄層クロマトグラフィーを実施するのが有利である。一般的に４８〜２００時間の後に充分な量のフェキソフェナジンが生成した。
【００１８】
別の手順は、培地のバイオマスを濾過によって分離し、これを水又は緩衝液で洗浄して中性ｐＨにし、次いで好適な緩衝液（例えばｐＨ７の０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液）中に再懸濁させ、次いで基質を添加して前記のようにインキュベーションを続けることから成る。
【００１９】
本方法の生成物の単離及び精製は、周知の態様で実施される。例えば、本方法の生成物を有機溶剤（好ましくは酢酸エチル）で抽出することができ、また、疎水性カラム上に吸着させ、次いで有機溶剤によって溶離させ、有機溶剤を蒸発させ、生成物をカラムクロマトグラフィー若しくは結晶化によって分離精製することもできる。
【００２０】
従って、本発明のより一層特定的な主題は、バイオ転化条件が次の通り：
・０．５ｇ／リットル〜１０ｇ／リットル、好ましくは０．５ｇ／リットル〜５ｇ／リットルのテルフェナジン添加濃度；
・５．０〜８．０の範囲のｐＨ；
・２６℃〜２８℃の範囲の温度；
及び
・ブイヨン培地１リットル当たりに毎分ほぼ１リットルの空気流導入による換気：
である前記の方法にある。
【００２１】
本発明の１つの目標は、副生成物の生成を最小限にするためにインキュベーションの間ｐＨを最適な値に調節して随意にそれを維持することである。
【００２２】
Absidia Corymbifera又はStreptomyces platensisによるテルフェナジン（II）のフェキソフェナジン（I）への転化は、いくつかの連続的な段階を伴い、次の図式に従ってトリオール（IIIｃ）並びに２つの望まれない副生成物であるテルフェナジンホスフェート（テルフェナジン−Ｐと略記する）（IIIａ）及びトリオールホスフェート（トリオール−Ｐと略記する）（IIIｂ）が中間で生成する：
【化７】
インキュベーション培地中の微生物によってもたらされるテルフェナジン（II）のトリオール（IIIｃ）への初期酸化は、僅かに酸性の乃至中性のｐＨ（６＜ｐＨ＜７）によって促進される（第２表）。テルフェナジンホスフェート（IIIａ）の生成（不可逆的らしい）は、試験したすべての条件において非常に制限されたままで、１〜２％未満である。他方、トリオールホスフェート（IIIｂ）の生成は、第３表に示したように特に中性又はアルカリ性ｐＨ（ｐＨ７．０〜８．０）においてインキュベーションを実施した場合には、培地中に蓄積する酸化生成物の内の有意の割合を占める（図１も参照されたい）。このｐＨは、インキュベーション培地が自然にそこに向かって変化していくｐＨである。しかしながら、僅かに酸性のｐＨ（最適にはｐＨ６付近）においては、インキュベーション培地中に存在する菌を起源とするホスファターゼがトリオールホスフェート（IIIｂ）の迅速な加水分解を触媒し（第４表、図１）、それより高いｐＨ（ｐＨ≧７）においてはトリオールのフェキソフェナジンへの不可逆的酸化が促進される（第５表、図１）。
【００２４】
その結果、殆どすべてのテルフェナジンをフェキソフェナジンに転化させるためには、（生成する非常に少量のテルフェナジンホスフェートを考慮しないのならば、）いくつかの可能な方策がある。
・最初にインキュベーションを初期培地中で約６．５のｐＨにおいてｐＨを制御することなく進行させて（同時にｐＨが８．０〜８．５に向かって変化する）テルフェナジンをトリオールホスフェート（IIIｂ）とフェキソフェナジンとの安定な変化しない混合物に完全に転化させ（図２）（例２及び３）、次いでｐＨを３．５〜４の範囲の値に低下させて（IIIｂ）の（IIIｃ）への転化を促進し、トリオールホスフェート（IIIｂ）が完全に消失するまでｐＨをゆっくり自然に６．０に向けて上昇させ、次いでトリオール（IIIｃ）がフェキソフェナジンに転化するまでｐＨをほぼ８．０に再調節して維持する（図３）（例４）。
・同じ態様でインキュベーションを培地中で最初に約６．５のｐＨにおいてｐＨを制御することなく進行させ（ｐＨが自然に８．０〜８．５に向かって変化する）、次いでｐＨを６．０〜６．５の範囲の値に低下させて維持する。このｐＨにおいてはホスファターゼ−ホスホリラーゼ活性のこのｐＨにおける平衡の結果としてトリオールホスフェート（IIIｂ）が非常に迅速に加水分解し、他方トリオール（IIIｃ）自体は非常に迅速に酸化して殆ど完全にフェキソフェナジンに転化する（図４）（例５）。
【００２５】
従って、本発明のより特定的な主題は、
・ほぼ６．５の初期ｐＨを自然に８．０〜８．５に変化させてトリオールホスフェート（IIIｂ）と式（I）の化合物との混合物をもたらし、
次いでこのｐＨを３．５〜４の範囲の値に低下させて式（IIIｂ）の中間体化合物の式（IIIｃ）の中間体化合物への転化を促進し、
次いで式（IIIｂ）の化合物が完全に消失するまでｐＨを自然にほぼ６．０に変化させ、
最後に式（IIIｃ）の化合物がフェキソフェナジンに転化するまでｐＨをほぼ８．０に再調節して維持する、前記方法；
・初期ｐＨがほぼ６．５であり、
このｐＨを自然に８．０〜８．５に変化させ、
次いで６．３〜６．８の範囲の値に低下させて維持する、前記方法；
・精製工程の間に請求項１記載の式（I）の化合物の抽出を酢酸エチル中で実施する、前記方法：
にある。
【００２６】
最後に、本発明の主題はまた、中間体化合物としての、式（IIIｃ）の化合物にもある。
【００２７】
以下、実施例によって本発明を例示するが、これら実施例は本発明を限定するものではない。
【００２８】
様々な培地の調製
培地Ａ：蒸留水９００ミリリットルに対して、コーンスティープリカー、１０ミリリットル；ＮａＮＯ3、２ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ；ＫＣｌ、０．５ｇ。燐酸塩緩衝液（蒸留水４０ミリリットル中にＫ2ＨＰＯ4、２ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ）及びグルコース（蒸留水６０ミリリットル中に３０ｇ）を接種の瞬間に添加。
培地Ｂ：蒸留水９００ミリリットルに対して、大豆ペプトン、５ｇ；酵母抽出物、５ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇ；ＮａＮＯ3、２ｇ；ＫＣｌ、０．５ｇ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ。燐酸塩緩衝液（蒸留水４０ミリリットル中にＫ2ＨＰＯ4、２ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ）及びグルコース（蒸留水６０ミリリットル中に３０ｇ）を接種の瞬間に添加。
培地Ｃ：蒸留水９００ミリリットルに対して、大豆ペプトン、５ｇ；酵母抽出物、５ｇ；ＮａＣｌ、５ｇ；Ｋ2ＨＰＯ4、５ｇ。グルコース（２００ｇ／リットル溶液１００ミリリットル）を接種の瞬間に添加。
培地Ｄ：蒸留水９００ミリリットルに対して、コーンスティープリカー、１０ミリリットル；大豆ペプトン、５ｇ；ＮａＮＯ3、２ｇ；ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．５ｇ；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ；ＫＣｌ、０．５ｇ。燐酸塩緩衝液（蒸留水４０ミリリットル中にＫ2ＨＰＯ4、２ｇ；ＫＨ2ＰＯ4、１ｇ）及びグルコース（蒸留水６０ミリリットル中に３０ｇ）を接種の瞬間に添加。
培地Ｅ：培地Ｃを殺菌前に濃ＨＣｌでｐＨ７に調節したもの。
【００２９】
例１：様々な微生物の研究（篩分け）
篩分け（選別）のために、培地１００ミリリットルを含有させた２５０ミリリットル三角フラスコに、固体培地上で収穫したばかりの胞子の懸濁液を接種し、回転式インキュベーター中で２７℃において２００ｒｐｍで６６時間成長（培養）を実施する。
培地中のバイオマスにエタノール中の溶液状のテルフェナジン（１０ミリリットル／リットル）を最終濃度０．２ｇ／リットルで直接添加する。
培養と同じ条件下で７日間インキュベーションを続ける。
【００３０】
（ａ）分析方法
インキュベーションの間に上澄み液の一定したサンプル（１日１ミリリットル）を取り出し、遠心分離し、精密濾過し、Nucleosil C18のカラム上でＨＰＬＣに注入する｛２５０×４ｍｍ、流量１ミリリットル／分；２２０ｎｍ、６０℃において検出；溶剤はアセトニトリル−水−トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）混合物の、ＣＨ3ＣＮ−水−ＴＦＡ（１００：９００：１）（溶剤Ａ）からＣＨ3ＣＮ−水−ＴＦＡ（９００：１００：１）（溶剤Ｂ）の勾配のものである｝。
これらの条件下において、
・テルフェナジン（II）は１４．５６分の保持時間を有し、
・テルフェナジン−Ｐ（IIIａ）は１１．８分の保持時間を有し、
・トリオール（IIIｃ）は９．６１分の保持時間を有し、
・フェキソフェナジンは９．４５分の保持時間を有し、
・トリオール−Ｐ（IIIｂ）は７．４３分の保持時間を有する。
【００３１】
（ｂ）篩分けの結果
前記の培養条件下での篩分けの実施によって、試験した菌株の中で、下記の表に示した結果が得られ、そしてAbsidia Corymbifera LCP 63-1800及びStreptomyces platensis NRRL 2364の２種の菌株が三角フラスコ中でフェキソフェナジンを良好な収率でしかし無視できない量のトリオールホスフェート及びトリオールの存在下で製造することを可能にすることがわかった。
【００３２】
第１表：様々な微生物によるテルフェナジンの代謝
（０．２ｇ／リットル、９６時間、２７℃）
【表１】
± ：５〜１０％（ＨＰＬＣ）
＋ ：１０〜２０％（ＨＰＬＣ）
＋＋＋：７０〜８０％（ＨＰＬＣ）
【００３３】
（ｃ）Absidia Corymbifera LCP 63-1800によって生成したフェキソフェナジンの精製及び完全な特徴付け
Absidia Corymbiferaの三角フラスコを用いて（１００ミリリットル−テルフェナジン２０ｍｇ）出発し、菌糸体を濾過し、水で洗浄した後に、上澄み液をＮａＣｌで飽和させて酢酸エチルで３回抽出する。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥させ、次いで減圧下で蒸発させて白っぽい固体状残渣２７ｍｇを得て、これをシリカゲルカラム上で溶剤としてＣＨ2Ｃｌ2−ＭｅＯＨ−ＮＨ4ＯＨ（８２．５：１５：２．５）を用いたクロマトグラフィーによって精製する。標準試料のフェキソフェナジンと同じ純粋な生成物１２．４ｍｇが回収された。融点１９０〜１９５℃。
【００３４】
（ｄ）Absidia Corymbifera LCP 63-1800を用いて得られたフェキソフェナジンの構造研究
【化９】
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ、６２．９ＭＨｚ）Δ、ｐｐｍ：２３．７（ＣＨ2、Ｃ−１０）、２７．１（２ＣＨ2、Ｃ−１３）、３０．２（２ＣＨ3、Ｃ−３）、３９．０（ＣＨ2、Ｃ−９）、４４．９（ＣＨ、Ｃ−１４）、５０．９（第４級Ｃ、Ｃ−２）、５５．４（２ＣＨ2、Ｃ−１２）、５９．５（ＣＨ2、Ｃ−１１）、７５．９（ＣＨ、Ｃ−８）、８１．７（第４級Ｃ、Ｃ−１５）、２３．７（ＣＨ2、Ｃ−１０）、１２８．６；１２３．９；１２９．４及び１３１．０（ＣＨ、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−１７、Ｃ−１８、Ｃ−１９、Ｃ−２０及びＣ−２１）、１４５．２；１４９．２及び１５０．３（第４級Ｃ、Ｃ−４、Ｃ−７及びＣ−１６）、１８６．３（第４級Ｃ、Ｃ−１）。
ＭＳ（エレクトロスプレー、陰イオン）、ｍ／ｚ：５００（Ｍ−Ｈ+）、４５６（Ｍ−Ｈ+−ＣＯ2）、３７８（４５６−Ｃ6Ｈ6）。
【００３５】
例２：フェキソフェナジンの微生物的調製
培地Ｄ１００ミリリットルを含有させた２５０ミリリットル三角フラスコ１０個にAbsidia Corymbifera LCP 63-1800を接種する。各三角フラスコにエタノール１ミリリットル中のテルフェナジン５０ｍｇを添加する。７日後に、１０個の三角フラスコをガーゼ上で濾過し（上澄み液は８．０のｐＨを有する）、塩化ナトリウムによる飽和を２時間実施し（ｐＨ＝５〜６）、次いで酢酸エチルで３回抽出し、硫酸マグネシウムで乾燥させる。減圧下で蒸発させた後に、所期の未精製化合物４０９ｍｇが得られた（収率７７％、ほぼ９０％の純度の生成物）。
この生成物をシリカゲルカラム（２３０〜４００メッシュ、シリカ４０ｇ、直径３ｃｍ）上で塩化メチレン／メタノール／水酸化アンモニウム混合物（８２．５−１５−２．５）を用いて溶離させて精製する。純粋なフェキソフェナジン３１２ｍｇが回収された（６１．４％）。
【００３６】
例３：発酵容器（培地Ａ）中におけるフェキソフェナジンの調製
Absidia Corymbiferaの培養を、培地Ａ（ｐＨ６．５）中で、しかし菌糸体２×１０6個／リットルを接種された５リットルの容量のBiolafitte発酵容器中で、２７℃において、約５リットル／分の空気流量で、２７５回転／分の撹拌下（螺旋状撹拌羽根）で実施する。６６時間の培養の後に得られた直径約１ｍｍの均質ペレットの形のバイオマスを、培養発酵容器中で直接バイオ転化のために用いた。エタノール５０ミリリットル中のテルフェナジン１．２５ｇを添加し、同じ条件下で７日間インキュベーションを続ける。この段階でのｐＨは８．５であり、インキュベーション培地はフェキソフェナジン３５％及びトリオールホスフェート６５％を含有する。バイオマスを濾過によって液状培地から分離する。濾液をＮａＣｌで飽和させ、そのｐＨを希ＨＣｌで６．０に調節し、これを酢酸エチルで３回抽出する。例２に記載したような精製の後に、純粋なフェキソフェナジン３５０ｍｇ（２７％）が回収された。水相中のトリオールホスフェート（IIIｂ）は、XAD-2のカラム上での吸着及びメタノールによる溶離によって回収することができる。
【００３７】
例３ａ：発酵容器（培地Ｄ）中におけるフェキソフェナジンの調製
Absidia Corymbiferaの培養を、培地Ｄ（ｐＨ６．５）中で、Biolafitte発酵容器中で例３におけるのと同じ条件下で実施する。６６時間の培養の後に得られたバイオマスを、培養発酵容器中で直接バイオ転化のために用いた。エタノール２５ミリリットル中のテルフェナジン１ｇを添加し、同じ条件下で４日間インキュベーションを続ける。この段階でのｐＨは８．０であり、インキュベーション培地はフェキソフェナジン７０％及びトリオールホスフェート３０％を含有し、これらを例３に記載したように単離して精製する。
【００３８】
例４：ｐＨを連続的に調節しながら発酵容器中でフェキソフェナジンを調製するための方法
Absidia Corymbiferaの培養を、培地Ｄ（ｐＨ６．５）中で、例３に記載した条件下で実施する。エタノール５０ミリリットル中のテルフェナジン２．５ｇを添加し、同じ条件下で４日間インキュベーションを続ける。この段階でのｐＨは８．０であり、インキュベーション培地はフェキソフェナジン４２％、トリオール（IIIｃ）１３％及びトリオールホスフェート（IIIｂ）２５％を含有する。濃ＨＣｌでｐＨを３．５に調節し、同じ条件下でインキュベーションを続けて培地のｐＨを６まで自由に変化させる（３日間）。この段階でトリオールホスフェート（IIIｂ）は殆ど完全に消失してトリオールになる。ｐＨを８．０に再調節し、同じ条件下でさらに２日間インキュベーションを続ける。この場合、培地はフェキソフェナジン８５％及びトリオールホスフェート（IIIｂ）１３％を含有する。
【００３９】
例５：発酵容器中でフェキソフェナジンを調製するための最適化された方法
Absidia Corymbiferaの培養を、培地Ｄ（ｐＨ６．５）中で、例３に記載した条件下で実施する。エタノール５０ミリリットル中のテルフェナジン２．５ｇを添加し、同じ条件下で４日間インキュベーションを続ける。この段階でのｐＨは８．０であり、インキュベーション培地はフェキソフェナジン３５％、トリオール（IIIｃ）１１．５％及びトリオールホスフェート（IIIｂ）３４％を含有する。希ＨＣｌでｐＨを６．０〜６．５に調節して維持し、同じ条件下でインキュベーションを続ける（３日間）。この場合、培地はフェキソフェナジン８９．５％及びトリオールホスフェート９．５％を含有する。
【００４０】
例６：
培地Ｅ１００ミリリットルを含有させた２５０ミリリットル三角フラスコにStreptomyces platensis NRRL 2364を接種して例１に記載したようにして培養する。この培地及びバイオマス（ｐＨは５．０である）の半分にエタノール０．５ミリリットル中に溶解させたテルフェナジン１０ｍｇを添加し、同じ条件下で数日間インキュベーションを続ける。３日後に、観察された代謝産物はトリオール（IIIｃ）だけだった（６０％）。７日後にはトリオールの収率が６７％に達した。
【００４１】
例７：
例６の培地及びバイオマスの残りの半分にテルフェナジン（エタノール０．５ミリリットル中に１０ｍｇ）を添加し、例６におけるのと同じ条件下で３日間インキュベートし、次いで７．５Ｍ−ＮａＯＨを添加することによってｐＨ８．０にする。さらに４日間インキュベーションを続け、トリオールホスフェート（IIIｂ）１６％、フェキソフェナジン（I）３７％及びトリオール（IIIｃ）２６％が得られた。
【００４２】
例８：発酵容器中におけるフェキソフェナジンの調製
予備培養
無菌培地１００ミリリットルを含有させた５００ミリリットル三角フラスコ中で最少培地（炭素源はグルコース）中で予備培養を実施する。この三角フラスコにStreptomyces platensis NRRL 2364のグリセロール化懸濁液（−８０℃において冷凍貯蔵）４５０マイクロリットルを接種し、軌道運動振盪機（軌道寸法２．５ｃｍ）中で３４℃で２５０ｒｐｍにおいて７５時間インキュベートする。
【００４３】
発酵／バイオ転化
グルコース１２５ｇ／リットルの最少培地３００ミリリットルを含有する総容積５００ミリリットルの発酵容器中で、発酵を実施する。この発酵容器に前記の予備培養物７．５ミリリットルを接種する。培養条件は次の通りである：・温度は３４℃に調節、
・一定の撹拌（ｐＯ２の調整なし）、
・５４リットル／時間での一定の換気（３ｖｖｍ）、
・２０％ＫＯＨの添加によりｐＨを６．０に調節。
４８時間の培養の後に、エタノール３ミリリットル中に溶解させたテルフェナジン７５ｍｇを添加する。２１２時間経過するまで培養を続ける。
【００４４】
結果
この試験のために、ブイヨン培地をエタノール中で１／１０に希釈した後にテルフェナジン及びその誘導体を逆相ＨＰＬＣによって分析する。２１２時間で７１％の反応の進行が得られ（フェキソフェナジン生成）、収支は８２％と見積もられた。
【００４５】
第２表：ｐＨの関数としてのテルフェナジンの酸化の初速度（６６時間後のバイオマス、洗浄してテルフェナジン１０６１マイクロモル／リットルの存在下で０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液中に再懸濁）。ＨＰＬＣによって実施した測定は、（トリオール＋トリオールホスフェート＋フェキソフェナジン）の合計に対応する。
【表２】
第３表：ｐＨの関数としてのトリオールのホスホリル化の初速度（インキュベーションの２時間後）（６６時間後のバイオマス、洗浄してトリオール１８６マイクロモル／リットルの存在下で０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液中に再懸濁）。インキュベーション上澄み液中の生成したトリオールホスフェートをＨＰＬＣによって測定した（最初の２時間はフェキソフェナジンの生成は何ら観察されなかった）。
【表３】
第４表：ｐＨの関数としてのトリオールホスフェートの加水分解の初速度（トリオールホスフェート２７２マイクロモル／リットルを含有させた１２０時間後のインキュベーション上澄み液、濃ＨＣｌで様々なｐＨに調節して維持し、２７℃においてインキュベート）。トリオールホスフェートの消失及びトリオールの発現の両方についてＨＰＬＣによって加水分解を測定した。この初期速度は、最初の７．５時間の加水分解について実施したサンプルの平均について計算した。
【表４】
第５表：ｐＨの関数としての６時間のインキュベーション及び２４時間のインキュベーションの時点で測定したトリオールの酸化（６６時間後のバイオマス、洗浄してトリオール１８６マイクロモル／リットルの存在下で０．０５Ｍ燐酸塩緩衝液中に再懸濁）。これらの時点の間にフェキソフェナジンが生成し、トリオールの濃度はあまり変わらなかった。２つの生成物をＨＰＬＣによって測定した。
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Absidia blakesleeanaによるテルフェナジンの代謝の４つの一体の反応に対するｐＨの影響をまとめたグラフである。縦座標の尺度は、各曲線について同じ程度（桁）の値になるように乗除することによって再計算した。
【図２】 ｐＨを制御せずに行なった培地Ｄ中でのテルフェナジンのバイオ転化（０．２ｇ／リットル）における各物質の経時濃度変化を示すグラフである。
【図３】 インキュベーションのｐＨを３．５（９６時間）及び８．０（１６８時間）に調節しながら１００ミリリットル三角フラスコ内で媒体Ｄ中で行なったテルフェナジンのバイオ転化（０．５ｇ／リットル）における各物質の濃度及びｐＨの経時変化を示すグラフである。
【図４】 インキュベーションのｐＨを９６時間後に６．０に変更して維持しながら三角フラスコ内で行なったAbsidia blakesleeanaによるテルフェナジンのバイオ転化（０．５ｇ／リットル、２７℃、培地Ｄ）における各物質の濃度及びｐＨの経時変化を示すグラフである。
Claims (8)
- 次式（I）：
アブシディア・コリンビフェラ（Absidia Corymbifera）属の微生物培地又はストレプトミセス（Streptomyces）属の微生物培地を用いて５．０〜８．０の範囲のｐＨにおいて次式（II）：
必要に応じてこの化合物を単離し、精製し且つ（又は）塩形成させることを特徴とし、
式（I）又は式（II）の化合物が２つの可能なエナンチオマーの内のいずれか一方の形にあることもでき、それらの混合物の形にあることもできる、前記製造方法。 - アブシディア・コリンビフェラがAbsidia Corymbifera LCP 63-1800である、請求項１記載の方法。
- ストレプトミセスがStreptomyces platensis（ストレプトミセス・プラテンシス） NRRL 2364である、請求項１記載の方法。
- 式（II）のエナンチオマーのラセミ混合物に相当するテルフェナジンのバイオ転化を実施して式（I）のエナンチオマーのラセミ混合物に相当するフェキソフェナジンを得る、請求項１、２又は３記載の方法。
- バイオ転化条件が
・０．５〜１０ｇ／リットルのテルフェナジン添加濃度、
・５．０〜８．０の範囲のｐＨ、
・２６℃〜２８℃の範囲の温度、
・ブイヨン培地１リットル当たりに毎分１リットルの空気流導入による換気
である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 - 初期ｐＨが６．５であり、
このｐＨを自然に８．０〜８．５の範囲に変化させて次式（IIIｂ）：
次いでこのｐＨを３．５〜４の範囲の値に低下させて式（IIIｂ）の中間体化合物の次式（IIIｃ）：
次いで式（IIIｂ）の化合物が完全に消失するまでｐＨを自然に６．０に変化させ、
最後に式（IIIｃ）の化合物がフェキソフェナジンに転化するまでｐＨを８．０に再調節して維持する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 初期ｐＨが６．５であり、
このｐＨを自然に８．０〜８．５に変化させ、
次いで６．３〜６．８の範囲の値に低下させて維持する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。 - 精製工程の間に請求項１記載の式（I）の化合物の抽出を酢酸エチル中で実施する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
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