EP1062358B1 - Nouveau procede de preparation de la fexofenadine - Google Patents

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EP1062358B1
EP1062358B1 EP99909036A EP99909036A EP1062358B1 EP 1062358 B1 EP1062358 B1 EP 1062358B1 EP 99909036 A EP99909036 A EP 99909036A EP 99909036 A EP99909036 A EP 99909036A EP 1062358 B1 EP1062358 B1 EP 1062358B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
formula
streptomyces
compound
fexofenadine
triol
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
EP99909036A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
EP1062358A1 (fr
Inventor
Robert Azerad
Jacques Biton
Isabelle Lacroix
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D211/00—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings
    • C07D211/04—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D211/68—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
    • C07D211/70—Heterocyclic compounds containing hydrogenated pyridine rings, not condensed with other rings with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/553—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07F9/576—Six-membered rings
    • C07F9/59—Hydrogenated pyridine rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring

Definitions

  • the subject of the present invention is a new process for preparation of Fexofenadine.
  • Fexofenadine is a drug that has significant antihistamine activity and that has no side effects. (Efficacy and safety of Fexofenadine hydrochloride for treatment of seasonal allergic rhinitis, Bernstein DI et al, Ann. Allergy-Asthma-Immunol. (1997) 79 (5) 443-448.
  • Terfenadine itself antihistamine agent (D. Mc Tavish, KL Goa and M. Ferill, "terfenadine: an updated review of its pharmacological properties and therapeutic efficiency, Drug 39, 552-574 (1989)).
  • Fexofenadine is currently being prepared chemical, in many stages with lower yield at 10% (US Patents 5,578,610 and 5,581,011).
  • Application EP-A-864 653 describes a microbiological transformation process from Terfenadine to Fexofenadine using either Cunninghamella or Absidia as a strain .
  • the subject of the invention is a process for the preparation of the compounds of formula (I): characterized in that a bioconversion of the compound or compounds of formula (II) is carried out: with either a culture of a microorganism of the genus Absidia corymbifera, or a culture of a microorganism of the genus Streptomyces, at a pH between 5.0 and 8.0, in order to obtain the compound or compounds of formula (I) expected, which if necessary are isolated, purified and / or salified, the compounds of formulas (I) or (II) possibly being in the two possible enantiomeric forms, isolated or in mixtures.
  • the asterisk indicates the position of the asymmetric carbon.
  • the invention particularly relates to a preparation process as described above in which the Absidia c orymbifera is Absidia corymbifera LCP 63-1800 or in which the Streptomyces is Streptomyces platensis NRRL 2364.
  • Fexofenadine is a racemic mixture of enantiomers of formula (I).
  • the process therefore has more particularly for object the method as described above in which we carry out a bioconversion of Terfenadine, corresponding to a racemic mixture of the two enantiomers of formula (II), in order to obtain Fexofenadine, corresponding to a racemic mixture of the enantiomers of formula (I).
  • Absidia corymbifera and in particular Absidia corymbifera LCP 63-1800 are available at the Cryptogamy Laboratory of the Museum of Natural History in Paris.
  • the possible purification step is basically only to eliminate a secondary product which can be formed during bioconversion, namely the triolphosphate which corresponds to alcohol not yet oxidized to acid, esterified in the form of a phosphate (formula (IIIb)) described below.
  • the purification is carried out according to the known methods of the skilled person. It can be a purification by crystallization, by chromatography or by exchange resin ion.
  • Salification reactions can be carried out under usual conditions. We operate for example in presence of ethanolic soda. You can also use a sodium salt such as carbonate or acid carbonate of sodium or potassium.
  • the salts obtained can be alkali or alkaline earth or ammonium salts possibly substituted.
  • the oxidation is carried out according to the commonly used methods for microbiological oxidation organic molecules using cultures of filamentous fungi (Holland HL, Organic synthesis with oxidative enzymes. VCH publisher, Inc, New York 1992; Lacroix I, Biton J and Azerad R, Microbial biotransformation of a synthetic immunomodulating agent HR325, Bioorg. Med. Chem. (1997) 7, 1369-1380; Sebek OK, Fungal transformations as a useful method for the organic synthesis of organic compounds, Mycologia 75 (2) 383-394, 1983 Azerad, R. Microbial models for drug metabolism, Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology, Vol. 63, page 169, 1999.
  • the fermentation conditions more favorable, such as the choice of environment nutrient, appropriate substrate solvent, concentration substrate, technical conditions such as temperature, ventilation, pH, and optimum periods for culture, addition of substrate and contact of substrate with the microorganism.
  • the culture is carried out from an inoculum (spores or mycelium) of Absidia corymbifera LCP 63-1800 or from a bacterium of the genus Streptomyces, in particular Streptomyces platensis NRRL 2364, in a liquid nutritive medium with an initial pH of 5 to 7 and at a temperature of 20 to 30 ° C, preferably from 26 to 28 ° C.
  • Aeration is ensured by rotary agitation of the culture vessels (150 to 250 rpm) or, in a fermenter, by introduction of air at a flow rate of approximately 1 l / min and per liter of culture broth.
  • terfenadine is added to a concentration from 0.1 to 1 g / liter, preferably 0.4 to 0.6 g / liter, in solution in an organic solvent miscible with water, such as ethanol, acetone, tetrahydrofuran, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide (5 to 20 ml / liter of culture), preferably ethanol (10 ml / liter).
  • an organic solvent miscible with water such as ethanol, acetone, tetrahydrofuran, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide
  • PH is eventually readjusted and kept at a value of 5.0 to 8.0.
  • the transformation of the substrate is advantageously monitored by HPLC analysis of the incubation supernatant or chromatography as a thin layer of samples extracted by a organic solvent. In general after 48 to 200 hours, it has formed sufficient amounts of exofenadine.
  • Another procedure is to separate the biomass from the culture medium by filtration, wash with water or buffered solution of neutral pH, then put it back suspension in a suitable buffer, for example a buffer 0.05 M phosphate at pH 7, then add the substrate and continue the incubation as described above.
  • a suitable buffer for example a buffer 0.05 M phosphate at pH 7, then add the substrate and continue the incubation as described above.
  • Isolation and purification of process products are carried out in a manner known per se.
  • a solvent organic preferably ethyl acetate
  • a hydrophobic column followed by elution with a organic solvent, evaporate the organic solvent, separate and purify the products by column chromatography or by crystallization.
  • One of the objectives of the invention is to adjust the pH to during the incubation and possibly keep it at a optimized value, in order to minimize the formation of secondary products.
  • Terfenadine (II) into Fexofenadine (I) by A. corymbifera or S. platensis involves several successive stages, with the intermediate formation of triol (IIIc) and that of two unwanted secondary products, Terfenadine phosphate (IIIa) and the triolphosphate (IIIb) according to the diagram below:
  • the invention also relates to intermediate compound, the compound of formula (IIIc), such as defined above.
  • 250 ml erlens containing 100 ml of culture medium are inoculated with a suspension of freshly harvested spores on solid medium and growth is carried out in a rotary incubator at 27 ° C and 200 RPM for 66 hours.
  • Terfenadine is added in solution in ethanol (10 ml / liter) at a final concentration of 0.2 g / l directly to biomass in its culture medium.
  • terfenadine (II) has a retention time of 14.56 min., terfenadine-P (IIIa), a retention time of 11.8 min., triol (IIIc), a retention time of 9.61 min., fexofenadine, a retention time of 9.45 min. and triol-P (IIIb), a retention time of 7.43 min.
  • the culture of Absidia corymbifera is carried out in medium A (pH 6.5), but in a Biolafitte fermenter, in a volume of 5 liters inoculated with 2.10 6 spores / liter, at 27 ° C, with an air flow of 5 liters / min approximately and agitation (helical turbine) of 275 revolutions / min.
  • the biomass obtained after 66 hours of culture and which is in the form of homogeneous pellets of about 1 mm in diameter was used for bioconversion directly in the culture fermenter. 1.25 g of Terfenadine in 50 ml of ethanol are added and the incubation is continued under the same conditions for 7 days.
  • the pH is 8.5 and the incubation medium contains 35% fexofenadine and 65% triolphosphate.
  • the biomass is separated from the liquid medium by filtration.
  • the filtrate is saturated with NaCl, its pH is adjusted to 6.0 with dilute HCl and it is extracted 3 times with ethyl acetate.
  • 350 mg (27%) of pure fexofenadine are recovered.
  • the triolphosphate (IIIb) can be recovered in the aqueous phase by adsorption on a column of XAD-2 and elution with methanol.
  • the culture of Absidia corymbifera is carried out in medium D (pH 6.5), in a Biolafitte fermenter, under the same conditions as in Example 3.
  • the biomass obtained after 66 hours of culture is used for bioconversion directly in the culture fermenter.
  • 1 g of Terfenadine in 25 ml of ethanol are added and the incubation is continued under the same conditions for 4 days.
  • the pH is 8.0 and the incubation medium contains 70% fexofenadine and 30% triolphosphate which are isolated and purified as described in Example 3.
  • the culture of Absidia corymbifera is carried out in medium D (pH 6.5), under the conditions described in Example 3.
  • 2.5 g of Terfenadine in 50 ml of ethanol are added and the incubation is continued in the same conditions for 4 days.
  • the pH is 8.0 and the incubation medium contains 42% fexofenadine, 13% triol (IIIc) and 25% triolphosphate (IIIb).
  • the pH is adjusted to 3.5 with concentrated HCl and the incubation is continued under the same conditions, allowing the pH of the medium to evolve freely up to 6 (3 days).
  • the triol phosphate (IIIb) has almost completely disappeared in favor of the triol.
  • the pH is readjusted to 8.0 and the incubation is continued under the same conditions for a further 2 days.
  • the medium then contains 85% fexofenadine and 13% triol phosphate (IIIb).
  • the culture of Absidia corymbifera is carried out in medium D (pH 6.5), under the conditions described in Example 3.
  • 2.5 g of Terfenadine in 50 ml of ethanol are added and the incubation is continued in the same conditions for 4 days.
  • the pH is 8.0 and the incubation medium contains 35% fexofenadine, 11.5% triol (IIIc) and 34% triolphosphate (IIIb).
  • the pH is adjusted and maintained at 6.0-6.5 with dilute HCl while the incubation is continued under the same conditions (3 days).
  • the medium then contains 89.5% fexofenadine and 9.5% triol phosphate.
  • a 250 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of medium E is inoculated with Streptomyces platensis NRRL 2364 and cultured as described in Example 1.
  • Half of the culture medium and the biomass, the pH of which is 5.0, is supplemented with 10 mg of terfenadine dissolved in 0.5 ml of ethanol and the incubation is continued for several days under the same conditions. After 3 days, the only metabolite observed is triol (IIIc) (60%); after 7 days the triol yield reaches 67%.
  • Example 6 The other half of the culture medium and the biomass of Example 6 is supplemented with terfenadine (10 mg in 0.5 ml ethanol) and incubated under the same conditions as in Example 6, for 3 days, then brought to pH 8.0 by addition of 7.5 M NaOH. Incubation is continued for 4 additional days and we get 16% triol-phosphate (IIIb), 37% fexofenadine (I) and 26% triol (IIIc).
  • Preculture is carried out in a minimum medium (the carbon source is glucose) in 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of sterile medium.
  • the erlens are seeded with 450 ⁇ l of a glycerol suspension of Streptomyces platensis NRRL 2364 (stock frozen at -80 ° C) and incubated in an orbital shaker (2.5 cm off center) at 34 ° C, 250 RPM for 75 hours .

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de préparation de la Fexofénadine à partir de la Terfénadine par une méthode de bioconversion en utilisant la souche Absidia corymbifera LCP 63-1800 ou Steptomyces platensis NRRL 2364.

Description

La présente invention a pour objet un nouveau procédé de préparation de la Fexofénadine.
La Fexofénadine est un médicament qui possède une activité antihistaminique significative et qui est dépourvu d'effets secondaires. (Efficacy and safety of Fexofenadine hydrochloride for treatment of seasonal allergic rhinitis, Bernstein D.I. et al, Ann. Allergy-Asthma-Immunol. (1997) 79(5) 443-448.
Ce composé est le principal métabolite de la Terfenadine, lui-même agent antihistaminique (D. Mc Tavish, KL Goa et M. Ferill, "terfenadine : an updated review of its pharmacological properties and therapeutic efficiency, Drug 39, 552-574 (1989)).
La Fexofénadine est actuellement préparée par voie chimique, en de nombreuses étapes avec un rendement inférieur à 10 % (Brevets US 5.578.610 et 5.581.011).
D'autres procédés de préparation sont également décrits : Dans Journal of Chromatography, Biomédical application, vol. 571, n° ½, 15/11/91, pages 291-297, Chan K Y et al. décrivent une méthode de séparation des énantiomères de la Terfénadine par chromatographie ainsi que la détermination et la composition énantiomérique de 1a Féxofénadine issue de 1a métabolisation in vivo de 1a Terfénadine.
La demande WO-A-95 00480 décrit des procédés de préparation de 1a Féxofénadine par voie chimique.
La demande EP-A-864653 décrit un procédé de transformation microbiologique de la Terfénadine en Féxofénadine en utilisant comme souche soit Cunninghamella soit Absidia.
La demanderesse se propose donc de trouver une autre voie de synthèse de la Fexofénadine. Le choix s'est alors porté sur une méthode de bioconversion en utilisant l'un des deux types de microorganismes très spécifiques suivants :
  • soit le champignon filamenteux de genre Absidia Corymbifera et notamment Absidia Corymbifera CP 63-1800,
  • soit un Streptomyces et notamment le Streptomyces platensis NRRL 2364.
    • La spécificité de la bioconversion avec ces microorganismes était inattendue : parmi de nombreuses souches étudiées lors d'un screening, ce sont les seules qui permettent l'obtention de la Fexofénadine avec un bon rendement et peu ou pas de produits secondaires.
    L'invention a pour objet un procédé de préparation des composés de formule (I) :
    Figure 00030001
    caractérisé en ce qu'on effectue une bioconversion du ou des composés de formule (II) :
    Figure 00030002
    avec soit une culture d'un microorganisme de genre Absidia corymbifera, soit une culture d'un microorganisme de genre Streptomyces, à un pH compris entre 5,0 et 8,0, afin d'obtenir le ou les composés de formule (I) attendus, qui le cas échéant sont isolés, purifiés et/ou salifiés, les composés de formules (I) ou (II) pouvant être sous les deux formes énantiomères possibles, isolées ou en mélanges. L'astérisque indique la position du carbone asymétrique.
    L'invention a particulièrement pour objet un procédé de préparation tel que décrit ci-dessus dans lequel l'Absidia corymbifera est Absidia corymbifera LCP 63-1800 ou dans lequel le Streptomyces est Streptomyces platensis NRRL 2364.
    La Fexofénadine est un mélange racémique des énantiomères de formule (I). Le procédé a donc plus particulièrement pour objet le procédé tel que décrit précédemment dans lequel on effectue une bioconversion de la Terfenadine, correspondant à un mélange racémique des deux énantiomères de formule (II), afin d'obtenir la Fexofénadine, correspondant à un mélange racémique des énantiomères de formule (I).
    Les Absidia corymbifera et notamment Absidia corymbifera LCP 63-1800 sont accessibles au Laboratoire de Cryptogamie du Muséum d'Histoire Naturelle de Paris.
    Parmi les Streptomyces susceptibles d'être utilisés dans le procédé, objet de cette demande, on peut citer les Streptomyces suivants :
  • · Streptomyces albus
  • · Streptomyces ambofaciens ATCC 15154
  • · Streptomyces antibioticus ATCC 31771
  • · Streptomyces aureofaciens ATCC 10762
  • · Streptomyces djakartensis
  • · Streptomyces erythraeus
  • · Streptomyces felleus DSM 40130
  • · Streptomyces fradiae W3554
  • · Streptomyces griseus NRRL B150
  • · Streptomyces JSP-2 (FH2126)
  • · Streptomyces lividans JT46/pCS2
  • · Streptomyces narbonensis FH 2102
  • · Streptomyces olivaceus ATCC 3335
  • · Streptomyces platensis ATCC 13865
  • · Streptomyces platensis NRRL 2364
  • · Streptomyces rimosus 2234
  • · Streptomyces venezuelae NRRL B-2446.
    • Il est connu de l'homme du métier que l'extrême simplicité des cellules bactériennes, sans noyau distinct, permet de les classer comme procaryotes. C'est le cas des Streptomyces, bactéries filamenteuses, qui sont aérobies et gram-positif. A l'opposé, les autres microorganismes sont nommés eucaryotes comme, par exemple, les champignons filamenteux (fungi) et tout particulièrement Absidia corymbifera. Leurs cellules se différencient notablement des procaryotes par la présence d'un noyau et de nombreux organites cytoplasmiques.
    Le procédé ci-dessus décrit, objet de la présente demande, présente de nombreux avantages. D'une part, il évite la voie chimique qui nécessite de nombreuses étapes de synthèses accompagnées des procédés d'isolement nécessaires à chacune de ces étapes réactionnelles. Dans le cas d'une industrialisation, cette voie peut s'avérer coûteuse et polluante.
    Dans le cas du procédé objet de cette demande, une seule opération est nécessaire et l'étape de purification éventuelle n'a essentiellement pour objet que d'éliminer un produit secondaire qui peut se former lors de la bioconversion, à savoir le triolphosphate qui correspond à l'alcool non encore oxydé en acide, estérifié sous la forme d'un phosphate (formule (IIIb)) décrit plus bas.
    D'autre part ce procédé se prête bien à l'industrialisation. En opérant avec une concentration de produit de départ de 0,5 g/l, le rendement dépasse les 70 % par rapport au produit de départ.
    Parmi les autres avantages de l'utilisation de la voie microbiologique par rapport à la voie chimique, on peut souligner l'aspect non polluant de cette technique, toutes les opérations s'effectuant en milieux aqueux.
    La purification s'effectue selon les méthodes connues de l'homme du métier. Il peut s'agir d'une purification par cristallisation, par chromatographie ou par résine échangeuse d'ions.
    Les réactions de salification peuvent être effectuées dans des conditions usuelles. On opère par exemple en présence de soude éthanolique. On peut également utiliser un sel de sodium tel que le carbonate ou le carbonate acide de sodium ou de potassium. Les sels obtenus peuvent être des sels de métaux alcalins ou alcalinoterreux ou d'ammonium éventuellement substitué.
    La mise en oeuvre de l'oxydation s'effectue selon les méthodes qu'on applique couramment pour l'oxydation microbiologique des molécules organiques à l'aide de cultures de champignons filamenteux (Holland HL, Organic synthesis with oxidative enzymes. VCH publisher, Inc, New York 1992 ; Lacroix I, Biton J and Azerad R, Microbial biotransformation of a synthetic immunomodulating agent HR325, Bioorg. Med. Chem. (1997) 7, 1369-1380 ; Sebek OK, Fungal transformations as a useful method for the organic synthesis of organic compounds, Mycologia 75(2) 383-394, 1983 Azerad, R. Microbial models for drug metabolism, Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology, Vol. 63, page 169, 1999.
    Ainsi, on détermine tout d'abord par voie analytique, en particulier par chromatographie en couche mince ou HPLC, dans des essais préalables, les conditions de fermentation les plus favorables, comme par exemple le choix du milieu nutritif, du solvant de substrat approprié, de la concentration de substrat, des conditions techniques telles que la température, aération, pH, et des périodes optimum pour la culture, l'addition de substrat et le contact du substrat avec le microorganisme.
    Dans une première phase, on effectue la culture à partir d'un inoculum (spores ou mycélium) d'Absidia corymbifera LCP 63-1800 ou d'une bactérie du genre Streptomyces, en particulier Streptomyces platensis NRRL 2364, dans un milieu nutritif liquide à un pH initial de 5 à 7 et à une température de 20 à 30°C, de préférence de 26 à 28°C. L'aération est assurée par agitation rotative des récipients de culture (150 à 250 rpm) ou, en fermenteur, par introduction d'air à un débit d'environ 1 l/min et par litre de bouillon de culture.
    Après un temps variant de 24 à 72 heures, de préférence 60 à 65 heures, on ajoute la terfénadine à une concentration de 0,1 à 1 g/litre, de préférence 0,4 à 0,6 g/litre, en solution dans un solvant organique miscible à l'eau, tel que l'éthanol, l'acétone, le tétrahydrofuranne, la diméthylformamide ou le diméthylsulfoxyde (5 à 20 ml/litre de culture), de préférence l'éthanol (10 ml/litre). L'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions que la culture. Le pH est éventuellement réajusté et maintenu à une valeur de 5,0 à 8,0. La transformation du substrat est avantageusement suivie par analyse par HPLC du surnageant d'incubation ou chromatographie en couche mince d'échantillons extraits par un solvant organique. En général après 48 à 200 heures, il s'est formé des quantités suffisantes de Fexofénadine.
    Une autre procédure consiste à séparer la biomasse du milieu de culture par filtration, la laver à l'eau ou une solution tamponnée de pH neutre, puis la remettre en suspension dans un tampon adéquat, par exemple un tampon phosphate 0,05 M à pH 7, puis ajouter le substrat et poursuivre l'incubation comme décrit précédemment.
    L'isolement et la purification des produits du procédé s'effectuent d'une manière connue en soi. Par exemple, on peut extraire les produits du procédé avec un solvant organique, de préférence l'acétate d'éthyle, ou par adsorption sur une colonne hydrophobe, suivie d'élution par un solvant organique, évaporer le solvant organique, séparer et purifier les produits par chromatographie sur colonne ou par cristallisation.
    L'invention a donc plus particulièrement pour objet, le procédé tel que décrit précédemment dans lequel les conditions de biotransformation sont les suivantes :
  • concentration en terfenadine ajoutée de 0,5 g/l à 10 g/l, et de préférence DE 0,5 g/l à 5 g:l, pH évoluant entre 5,0 et 8,0, température comprise entre 26°C et 28°C et aération par introduction d'un débit d'air d'environ 1 l/mn et par litre de bouillon de culture.
    • Un des objectifs de l'invention est d'ajuster le pH au cours de l'incubation et éventuellement le maintenir à une valeur optimisée, en vue de minimiser la formation de produits secondaires.
    La transformation de la Terfénadine (II) en Fexofénadine (I) par A. corymbifera ou S. platensis met en jeu plusieurs étapes successives, avec la formation intermédiaire du triol (IIIc) et celle de deux produits secondaires non souhaités, la Terfénadine-phosphate (IIIa) et le triolphosphate (IIIb) selon le schéma ci-dessous :
    Figure 00080001
    Figure 00090001
    L'oxydation initiale de la terfénadine (I) en triol (IIIc), produit par le micro-organisme dans le milieu d'incubation, est favorisée par un pH légèrement acide ou neutre(6 < pH < 7) (tableau 2). La formation (apparemment irréversible) de Terfénadine-phosphate (IIIa) reste très limitée dans toutes les conditions étudiées et inférieure à 1-2 %. Par contre, la formation de triol-phosphate (IIIb) représente une part importante des produits d'oxydation accumulés dans le milieu, particulièrement lorsque l'incubation est menée à pH neutre ou alcalin (pH 7,0-8,0) comme le montre le tableau 3 (voir aussi figure 1) ; c'est le pH vers lequel évolue naturellement le milieu d'incubation. Cependant, à pH légèrement plus acide (pH optimum ∼6), une phosphatase d'origine fongique, présente dans le milieu d'incubation, catalyse l'hydrolyse rapide du triol-phosphate (IIIb) (tableau 4, figure 1), tandis que l'oxydation irréversible du triol en fexofénadine est favorisée à pH plus élevé (pH ≥ 7) (tableau 5, figure 1).
    II en résulte plusieurs stratégies possibles pour transformer la quasi-totalité de la Terfénadine en Fexofénadine (si on ne tient pas compte de la très faible quantité de Terfénadine-phosphate formée) :
    • procéder d'abord à l'incubation dans le milieu de culture initialement à un pH d'environ 6,5, sans contrôle du pH, ce qui conduit (en même temps que le pH évolue vers 8,0-8,5) à une transformation complète de la terfénadine en un mélange stationnaire stable de triol-phosphate (IIIb) et de fexofénadine (Fig. 2) (exemples 2 et 3), puis abaisser le pH à une valeur comprise entre 3,5 et 4 afin de favoriser la transformation de (IIIb) en (IIIc) et le laisser remonter lentement et spontanément vers 6,0, jusqu'à disparition complète du triol-phosphate (IIIb), puis réajuster et maintenir le pH aux environs de 8,0, jusqu'à transformation du triol (IIIc) en fexofénadine (Fig. 3) (exemple 4).
    • procéder de la même manière à une incubation dans le milieu de culture, initialement à un pH d'environ 6,5, sans contrôle du pH, (le pH évolue naturellement vers 8,0-8,5) puis abaisser et maintenir celui-ci à une valeur comprise entre 6,0 et 6,5, pH auquel le triol-phosphate (IIIb) est assez rapidement hydrolysé, comme résultat de l'équilibre des activités phosphatase-phosphorylase à ce pH, tandis que le triol (IIIc) est lui-même assez rapidement oxydé, jusqu'à transformation presque complète en fexofénadine (fig. 4) (exemple 5).
    L'invention a donc plus particulièrement pour objet :
    • un procédé tel que défini plus haut dans lequel le pH initialement à environ 6,5,
      • évolue naturellement à 8,0-8,5, ce qui conduit à un mélange de triol-phosphate (IIIb) et de composé de formule (I),
      • est ensuite abaissé à une valeur comprise entre 3,5 et 4 afin de favoriser la transformation du composé intermédiaire de formule (IIIb) en composé intermédiaire de formule (IIIc),
      • puis évolue naturellement à environ 6,0 jusqu'à disparition complète du composé (IIIb),
      • et enfin est réajusté et maintenu à environ 8,0 jusqu'à transformation du composé (IIIc) en Fexofénadine.
    • un procédé tel que défini plus haut dans lequel le pH initialement à environ 6,5
      • évolue naturellement à 8,0-8,5,
      • puis est abaissé et maintenu à une valeur comprise entre 6,3 et 6,8.
    • un procédé tel que défini plus haut dans lequel au cours de l'étape de purification, l'extraction du produit de formule (I) est effectuée dans l'acétate d'éthyle.
    Enfin, l'invention a également pour objet à titre de composé intermédiaire, le composé de formule (IIIc), telle que définie plus haut.
    Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
    Préparation des différents milieux de culture
  • Milieu A : Corn steep liqueur, 10 ml ; NaNO3, 2 g ; MgSO4, 7H2O, 0,5 g ; FeSO4,7H2O, 0,02 g ; KCl, 0,5 g pour 900 ml d'eau distillée. Tampon phosphate (K2HPO4, 2 g ; KH2PO4, 1 g dans 40 ml d'eau distillée) et glucose, 30 g dans 60 ml d'eau distillée, ajoutés au moment de l'ensemencement.
  • Milieu B : Peptone de soja, 5 g ; extrait de levure, 5 g ; MgSO47H2O, 0,5 g ; NaNO3, 2 g ; KCl, 0,5 g ; FeSO4, 7H2O, 0,02 g pour 900 ml d'eau distillée. Tampon phosphate (K2HPO4, 2 g ; KH2PO4, 1 g dans 40 ml d'eau distillée) et glucose, 30 g dans 60 ml d'eau distillée, ajoutés au moment de l 'ensemencement.
  • Milieu C : Peptone de soja, 5 g ; extrait de levure, 5 g ; NaCl, 5 g ; K2HPO4, 5 g pour 900 ml d'eau distillée. Glucose, 100 ml d'une solution à 200 g/L ajoutés au moment de l'ensemencement.
  • Milieu D : Corn steep liqueur, 10 ml ; peptone de soja, 5 g ; NaNO3, 2 g ; MgSO4,7H2O, 0,5 g ; FeSO4,7H2O, 0, 02 g ; KCl, 0,5 g pour 900 ml d'eau distillée. Tampon phosphate (K2HPO4, 2 g ; KH2PO4, 1 g dans 40 ml d'eau distillée) et glucose, 30 g dans 60 ml d'eau distillée, ajoutés au moment de l'ensemencement.
  • Milieu E : Milieu C ajusté à pH 7 avec HCl concentré, avant stérilisation.
    • EXEMPLE 1 : Etude de différents micro-organismes (Screening)
    Pour le screening, les erlens de 250 ml contenant 100 ml de milieu de culture sont ensemencés par une suspension de spores fraíchement récoltés sur milieu solide et la croissance est effectuée dans un incubateur rotatif à 27°C et 200 RPM pendant 66 heures.
    La Terfénadine est ajoutée en solution dans l'éthanol (10 ml/litre) à une concentration finale de 0,2 g/l directement à la biomasse dans son milieu de culture.
    L'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions que la culture pendant 7 jours.
    a) Méthodes analytiques
    Des prélèvements réguliers (1 ml par jour) du surnageant sont effectués en cours d'incubation, centrifugés, micro-filtres et injectés en HPLC sur une colonne de nucléosil C18 (250 x 4 mm ; débit : 1 ml/min; détection à 220 nm et à 60°C ; le solvant est un gradient d'acétonitrile-eau-acide trifluoroacétique (TFA) constitué à partir du mélange CH3CN-eau-TFA (100:900:1) (solvant A) et CH3CN-eau-TFA (900:100:1) (solvant B).
    Dans ces conditions,
    la terfénadine (II) a un temps de rétention de 14,56 min., la terfénadine-P (IIIa), un temps de rétention de 11,8 min., le triol (IIIc), un temps de rétention de 9,61 min., la fexofénadine, un temps de rétention de 9,45 min. et le triol-P (IIIb), un temps de rétention de 7,43 min.
    b) Résultats du screening
    La réalisation d'un screening dans les conditions de culture décrites plus haut a donné, entra autres souches testées, les résultats reportés dans le tableau ci-dessous et a permis de trouver 2 souches, Absidia corymbifera LCP 63-1800 et Streptomyces platensis NRRL 2364, capables de produire en erlen la fexofénadine avec un bon rendement, mais en présence d'une quantité non négligeable de triol phosphate et de triol.
    Métabolisation de la terfénadine par divers microorganismes, 0,2 g/l, 96 h, 27°C.
    Terfénadine Triol-P Fexofénadine Triol Terfénadine-P
    Absidia blakesleeana
    ATCC 6811    		 + - - - -
    Absidia blakesleeana
    ATCC 42838    		 - ± - - -
    Absidia blakesleeana
    ATCC 22617    		 - - - - -
    Absidia blakesleeana
    ATCC 10148b    		 - ± - - -
    Absidia blakesleeana
    ATCC 22739    		 - ± - - -
    Absidia corymbifera
    LCP 63.1800    		 - ± +++ + -
    Absidia corymbifera
    LCP 64.1942    		 - - ± - -
    Absidia corymbifera
    LCP 86.3480    		 - ± ± - -
    Actinomucor elegans
    MMP 2092    		 ± + ± - -
    Aspergillus ochraceus
    ATCC 1008    		 - - ± - -
    Cunninghamella blakesleeana
    ATCC 8688a    		 ± ± - ± ±
    Cunninghamella echinulata
    LCP 73.2203    		 ± - - ± -
    Cunninghamella echiniulata
    NRRL 3655    		 ± ± - ± ±
    Cunninghamella elegans
    ATCC 9245    		 ± - - - +
    Streptomyces platensis
    NRRL 2364    		 - - + +++ -
    c) Purification et caractérisation complète de la fexofénadine formée par Absidia corymbifera LCP 63.1800
    A partir d'un erlen d'Absidia corymbifera (100 ml - 20 mg de terfénadine), après filtration du mycélium et lavage à l'eau, le surnageant est saturé au NaCl puis extrait 3 fois à l'acétate d'éthyle ; la phase organique est séchée sur MgSO4 puis évaporée sous pression réduite pour conduire à 27 mg d'un résidu solide blanchâtre qui est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (230-400 mesh) à l'aide du solvant : CH2Cl2-MeOH-Ni4OH (82,5 : 15 : 2,5). On récupère 12,4 mg de produit pur identique à la fexofénadine authentique. F = 190-195°C.
    d) Etude structurale de la fexofénadine obtenue à l'aide d'Absidia corymbifera LCP 63-1800
    Figure 00150001
    RMN 1H (CD3OD, 250,13 MHz) Δ, ppm : 1,49 (6H, s, 2 CH3) , 1,55-1,82 (8H, m, H-9, H-10 et H-13), 2,73-2,85 (4H, m, H-12), 3,30-3,32 (2H, m, H-11), 4,60 (1H, dd, J=5, 57 et 5, 97 Hz, H-8), 7,17 (2H, d, J=7,17 Hz, H-5), 7,29 (6H, dd, J=7,17 et 7,97 Hz, H-18, H-19 et H-20), 7,39 (2H, d, J=8,37 Hz, H-6), 7,53 (4H, d, J=7,57 Hz, H-17 et H-21).
    RMN 13C (CD3OD, 62,9 MHz) Δ, ppm : 23,7 (CH2, C-10), 27,1 (2 CH2, C-13), 30,2 (2 CH3, C-3), 39,0 (CH2, C-9), 44,9 (CH, C-14), 50,9 (C quat., C-2), 55,4 (2 CH2, C-12), 59,5 (CH2, C-11), 75,9 (CH, C-8), 81,7 (C quat., C-15), 23,7 (CH2, C-10), 128,6 ; 123,9 ; 129,4 et 131,0 (CH, C-5, C-6, C-17, C-18, C-19, C-20 et C-21), 145,2 ; 149,2 et 150,3 (C quat., C-4, C-7 et C-16), 186,3 (C quat., C-1).
    MS (electrospray, ions négatifs), m/z : 500 (M-H+), 456 (M-H+-CO2) , 378 (456-C6H6).
    EXEMPLE 2 : Préparation microbiologique de la Fexofénadine
    On ensemence 10 erlens de 250 ml contenant 100 ml de milieu D par A. corymbifera LCP 63-1800. On ajoute 50 mg de Terfénadine dans 1 ml d'éthanol dans chaque erlen. A J+7, on filtre les 10 erlens sur gaze (le surnageant a un pH égal à 8,0), et on sature au chlorure de sodium pendant 2 heures (pH = 5-6). On extrait 3 fois à l'acétate d'éthyle et sèche sur sulfate de magnésium. Après évaporation sous pression réduite, on obtient 409 mg de produit brut attendu (rendement = 77 %, produit pur à 90 % environ).
    Ce produit est purifié sur colonne de gel de silice (230-400 mesh, 40 g de silice, diamètre = 3 cm) en éluant avec le mélange chlorure de méthylène/méthanol/hydroxyde d'ammonium (82,5-15-2,5). On récupère 312 mg de fexofénadine pure (61,4 %).
    EXEMPLE 3 : Préparation de la fexofénadine en fermenteur (milieu A)
    On effectue la culture d'Absidia corymbifera dans le milieu A (pH 6,5), mais en fermenteur Biolafitte, dans un volume de 5 litres inoculé avec 2.106 spores/litre, à 27°C, avec un débit d'air de 5 litres/min environ et une agitation (turbine hélicoïdale) de 275 tours/min. La biomasse obtenue après 66 heures de culture et qui se présente sous forme de pellets homogènes de 1 mm environ de diamètre a été utilisée pour la bioconversion directement dans le fermenteur de culture. 1,25 g de Terfénadine dans 50 ml d'éthanol sont ajoutés et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 7 jours. A ce stade, le pH est de 8,5 et le milieu d'incubation contient 35 % de fexofénadine et 65 % de triolphosphate. La biomasse est séparée du milieu liquide par filtration. Le filtrat est saturé en NaCl, son pH est ajusté à 6,0 avec HCl dilué et il est extrait 3 fois à l'acétate d'éthyle. Après purification comme décrit dans l'exemple 2, on récupère 350 mg (27 %) de fexofénadine pure. On peut récupérer le triolphosphate (IIIb) dans la phase aqueuse par adsorption sur une colonne de XAD-2 et élution avec le méthanol.
    EXEMPLE 3 bis : Préparation de la fexofénadine en fermenteur (milieu D)
    On effectue la culture d'Absidia corymbifera dans le milieu D (pH 6,5), en fermenteur Biolafitte, dans les mêmes conditions que dans l'exemple 3. La biomasse obtenue après 66 heures de culture est utilisée pour la bioconversion directement dans le fermenteur de culture. 1 g de Terfénadine dans 25 ml d'éthanol sont ajoutés et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 4 jours. A ce stade, le pH est de 8,0 et le milieu d'incubation contient 70 % de fexofénadine et 30 % de triolphosphate qui sont isolés et purifiés comme décrit dans l'exemple 3.
    EXEMPLE 4 : Méthode avec ajustements successifs du pH pour la préparation de la fexofénadine en fermenteur
    On effectue la culture d'Absidia corymbifera dans le milieu D (pH 6,5), dans les conditions décrites dans l'exemple 3. 2,5 g de Terfénadine dans 50 ml d'éthanol sont ajoutés et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 4 jours. A ce stade, le pH est de 8,0 et le milieu d'incubation contient 42 % de fexofénadine, 13 % de triol (IIIc) et 25 % de triolphosphate (IIIb). Le pH est ajusté à 3,5 avec HCl concentré et on continue l'incubation dans les mêmes conditions en laissant le pH du milieu évoluer librement jusqu'à 6 (3 jours). A ce stade, le triol-phosphate (IIIb) a presque totalement disparu au bénéfice du triol. On réajuste le pH à 8,0 et on poursuit l'incubation dans les mêmes conditions pendant 2 jours supplémentaires. Le milieu contient alors 85 % de fexofénadine et 13 % de triol phosphate (IIIb).
    EXEMPLE 5 : Méthode optimisée pour la préparation de la fexofénadine en fermenteur
    On effectue la culture d'Absidia corymbifera dans le milieu D (pH 6,5), dans les conditions décrites dans l'exemple 3. 2,5 g de Terfénadine dans 50 ml d'éthanol sont ajoutés et l'incubation est poursuivie dans les mêmes conditions pendant 4 jours. A ce stade, le pH est de 8,0 et le milieu d'incubation contient 35 % de fexofénadine, 11,5 % de triol (IIIc) et 34 % de triolphosphate (IIIb). Le pH est ajusté et maintenu à 6,0-6,5 avec HCl dilué pendant qu'on continue l'incubation dans les mêmes conditions (3 jours). Le milieu contient alors 89,5 % de fexofénadine et 9,5 % de triol phosphate.
    EXEMPLE 6 :
    On ensemence un erlen de 250 ml contenant 100 ml de milieu E par Streptomyces platensis NRRL 2364 et on cultive comme décrit dans l'exemple 1. Une moitié du milieu de culture et de la biomasse, dont le pH est de 5,0, est additionnée de 10 mg de terfénadine dissoute dans 0,5 ml d'éthanol et l'incubation est poursuivie pendant plusieurs jours dans les mêmes conditions. Après 3 jours, le seul métabolite observé est le triol (IIIc) (60 %) ; après 7 jours le rendement en triol atteint 67 %.
    EXEMPLE 7 :
    L'autre moitié du milieu de culture et de la biomasse de l'exemple 6, est additionnée de terfénadine (10 mg dans 0,5 ml d'éthanol) et incubé dans les mêmes conditions que dans l'exemple 6, pendant 3 jours, puis porté à pH 8,0 par addition de NaOH 7,5 M. L'incubation est poursuivie pendant 4 jours supplémentaires et on obtient 16 % de triol-phosphate (IIIb), 37 % de fexofénadine (I) et 26 % de triol (IIIc).
    Exemple 8 : Préparation de la féxofénadine en fermenteur Préculture
    La préculture est réalisée en milieu minimum (la source de carbone est le glucose) en flacons d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu stérile. Les erlens sont ensemencés par 450 µl d'une suspension glycérolée de Streptomyces platensis NRRL 2364 (stock congelé à -80°C) et incubés en shaker orbital (2,5 cm d'excentration) à 34°C, 250 RPM pendant 75 heures.
    Fermentation / Bioconversion
    La fermentation est réalisée en fermenteurs de volume total 500 ml contenant 300 ml de milieu minimum à 125 g/l de glucose. Le fermenteur est inoculé par 7,5 ml de la préculture décrite ci-dessus. Les conditions de culture sont les suivantes :
    • température régulée à 34°C
    • agitation constante (pas de régulation de pO2)
    • aération constante à 54 l/h (3vvm)
    • pH régulé à 6.0 par ajout de KOH à 20%
    A 48 heures de culture, on ajoute 75 mg de terfénadine solubilisée dans 3 ml d'éthanol. La culture est poursuivie jusqu'à 212 heures d'âge.
    Résultats
    Pour cet essai, on dose la terfénadine et ses dérivés par HPLC reverse après dilution des bouillons au 1/10 dans l'éthanol. On obtient à 212 heures 71% d'avancement de réaction (féxofénadine formée) et un bilan estimé à 82%.
    Vitesse initiale d'oxydation de la Terfénadine en fonction du pH (Biomasse de 66 h, lavée et remise en suspension dans un tampon phosphate 0,05 M en présence de terfénadine 1061 µmol/litre). La mesure effectuée par HPLC correspond à la somme (triol + triol-phosphate + fexofénadine)
    pH Terfénadine oxydée (total) µmol/l/h
    6,3 1,60
    6,5 2,45
    7,0 0,60
    7,5 0,59
    8,0 0,76
    Vitesse initiale (après 2 heures d'incubation) de phosphorylation du triol en fonction du pH (Biomasse de 66 h, lavée et remise en suspension dans un tampon phosphate 0,05 M en présence de triol 186 µmol/litre). On mesure par HPLC le triol-phosphate formé dans le surnageant d'incubation (aucune formation de fexofénadine n'est observée dans les 2 premières heures).
    pH Triol-phosphate µmol/l/h
    6,3 53,5
    6,5 57,0
    7,0 41,5
    7,5 27,0
    8,0 24,0
    Vitesse initiale d'hydrolyse du triol-phosphate en fonction du pH (surnageant d'incubation de 120 heures contenant 272 µmol/litre de triol-phosphate, ajusté et maintenu aux différents pHs par HCl concentré et incubé à 27°C. L'hydrolyse est mesurée en HPLC à la fois par la disparition de triol-phosphate et l'apparition de triol. La vitesse initiale est calculée sur la moyenne des prélèvements effectués pendant les 7,5 premières heures d'hydrolyse.
    Après 4 heures d'incubation Après 24 heures d'incubation Vitesse initiale d'hydrolyse du triol-phosphate µmol/l/h
    triol-phosphate résiduel µmol/l (% hydrolyse) triol apparu µmol/l (% hydrolyse) trial-phosphate résiduel µmol/l (% hydrolyse) triol apparu µmol/l (% hydrolyse)
    4,0 258 (5 %) 12 (4,4 %) 223 (18 %) 35 (13 %) 3,13
    5,0 234 (14 %) 40 (14,7 %) 148 (45,6%) 120 (44,1%) 8,71
    6,0 196 (27,9%) 68 (25 %) 50 (81,7%) 216 (79,4%) 17,49
    6,5 224 (17,6%) 30 (11 %) 140 (48,5%) 131 (48,2%) 8,71
    7,0 237 (12, 9%) 30 (11 %) 167 (38,6%) 109 (40 %) 7,12
    7,5 240 (12 %) 31 (11,4 %) 181 (33 %) 77 (28,3 %) 5,48
    8,0 244 (10 %) 19 (7 %) 197 (28 %) 69 (25,4 %) 4,37
    oxydation du triol mesurée entre 6 h et 24 h d'incubation en fonction du pH (Biomasse de 66 h, lavée et remise en suspension dans un tampon phosphate 0,05 M en présence de triol 186 µmol/litre). Dans cet intervalle de temps où la fexofénadine est formée, la concentration en triol est stationnaire. Les deux produits sont mesurés par HPLC.
    pH Triol aux temps 6-24 h µmol/litre Triol-phosphate aux temps 6-24 h µmol/litre Fexofénadine apparue entre 6 et 24 h µmol/litre (%)
    6,3 110-130 65-27 0 (0)
    6,5 93-96 72-31 15 (15,6)
    7,0 46-58 110-64 25 (45,1)
    7,5 21-43 124-61 30 (69,7)
    8,0 0 20-49 128-41 30 (61, 2)
  • Figure 1 : Récapitulation de l'influence du pH sur les quatre réactions unitaires du métabolisme de la terfénadine par A. blakesleeana. L'échelle des ordonnées a été ramenée par multiplication pour chaque courbe à des valeurs du même ordre.
  • Figure 2 : Bioconversion de la terfénadine (0,2 g/l) en milieu D, sans contrôle de pH.
  • Figure 3 : Bioconversion de la terfénadine (0,5 g/l) en erlen de 100 ml en milieu D avec ajustement du pH de l'incubation à 3,5 (96 h) et 8,0 (168 h).
  • Figure 4 : Bioconversion de la terfénadine (0,5 g/l 27°C, milieu D) en erlen par A. blakesleeana avec modification et maintien du pH de l'incubation à 6,0 après 96 heures.

    • Claims (9)

    1. Procédé de préparation des composés de formule (I) :
      Figure 00220001
      caractérisé en ce qu'on effectue une bioconversion du ou des composés de formule (II) :
      Figure 00220002
      avec soit une culture d'un microorganisme de genre Absidia corymbifera soit une culture d'un microorganisme de genre Streptomyces, à un pH compris entre 5,0 et 8,0, afin d'obtenir le ou les composés de formule (I) attendus, qui le cas échéant sont isolés, purifiés et/ou salifiés, les composés de formules (I) ou (II) pouvant être sous les deux formes énantiomères possibles, isolés ou en mélanges.
    2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l'Absidia corymbifera est Absidia corymbifera LCP 63-1800.
    3. Procédé selon la revendication 1 dans lequel le Streptomyces est Streptomyces platensis NRRL 2364.
    4. Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3 dans lequel on effectue une bioconversion de la Terfénadine, correspondant à un mélange racémique des énantiomères de formule (II), afin d'obtenir la Fexofénadine, correspondant à un mélange racémique des énantiomères de formule (I).
    5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 dans lequel les conditions de biotransformation sont les suivantes :
      concentration en Terfénadine ajoutée d'environ 0,5 à 10 g/l
      pH évoluant entre 5,0 et 8,0
      température comprise entre 26°C et 28°C
      aération par introduction d'un débit d'air d'environ 1 l/minute et par litre de bouillon de culture.
    6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel le pH initialement à environ 6,5,
      évolue naturellement à 8,0-8,5, ce qui conduit à un mélange de triol-phosphate (IIIb) :
      Figure 00230001
      et de composé de formule (I),
      est ensuite abaissé à une valeur comprise entre 3,5 et 4 afin de favoriser la transformation du composé intermédiaire de formule (IIIb) en composé intermédiaire de formule (IIIc) :
      Figure 00240001
      puis évolue naturellement à environ 6,0 jusqu'à disparition complète du composé (IIIb),
      et enfin est réajusté et maintenu à environ 8,0 jusqu'à transformation du composé (IIIc) en Fexofénadine.
    7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans lequel le pH initialement à environ 6,5
      évolue naturellement à 8,0-8,5,
      puis est abaissé et maintenu à une valeur comprise entre 6,3 et 6,8.
    8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que, au cours de l'étape de purification, l'extraction du produit de formule (I) tel que défini à la revendication 1, est effectuée dans l'acétate d'éthyle.
    9. A titre de composé intermédiaire le composé de formule (IIIc) telle que définie à la revendication 6.
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