ES2216191T3

ES2216191T3 - Procedimiento para preparar acido 4-(4-(hidroxidifenil)-1-piperidinil)-1-hidroxibutil)-alfa,alfa-dimetilfenilacetico y derivados fosforilados.

Info

Publication number: ES2216191T3
Application number: ES98103599T
Authority: ES
Inventors: Johannes Dr. Meiwes; Manfred Dr. Worm
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-03-11
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2018-03-02
Also published as: TR199800422A2; TR199800422A3; EP0864653B1; HU9800511D0; HU224690B1; BR9803289A; JPH10259191A; JP4077551B2; PL185768B1; AR011185A1; DE59810863D1; US5990127A; CA2231588A1; PT864653E; CA2231588C; HUP9800511A3; CZ296318B6; ATE260983T1; CZ71398A3; EP0864653A1

Abstract

EL COMPUESTO ACIDO 4 - (4 - (4 - (HIDROXIFENIL) - 1 PIPERIDINIL) - 1 -HIDROXIBUTIL) - AL , AL - DIMETILFENIL ACETICO Y SUS DERIVADOS FOSFORILADOS SE PUEDEN PRODUCIR A PARTIR DEL AL - (P - TERC - BUTILFENIL) - 4 - ( AL - HIDROXI - AL FEN ILBENCIL) - 1 - PIPERIDIN - BUTANOL MEDIANTE HONGOS DEL GENERO CUNNINGHAMELLA O ABSIDIA. COMPUESTOS DE FORMULA II EN LA QUE R1 ES - CH 2 - O - P(O)(OH) 2 Y R 2 ES - O H, R 1 ES - CH 3 Y R 2 ES - O P(O)(OH) 2 O R 1 ES - COOH Y R 2 ES - O P(O)(OH) 2 , SON APROPIADOS COMO MEDICAMENTOS CON ACCION ANTIHISTAMINICA.

Description

Procedimiento para preparar ácido 4-(4-(4-hidroxidifenil)-1-piperidinil)-1-hidroxibutil)-\alpha,\alpha-dimetilfenilacético y derivados fosforilados.

El invento concierne a un procedimiento microbiano para preparar derivados fosforilados de \alpha-(p-butil terciario-fenil)-4-(\alpha-hidroxi-\alpha-fenil-bencil)-1-piperidina-butanol (compuesto 2), así como a su utilización como medicamento. Además, el invento concierne a un procedimiento microbiano para la fosforilación de ácido 4-(4-(4-hidroxidifenil)-1-piperidinil)-1-hidroxibutil)-\alpha,\alpha-dimetilacético (compuesto 1).

Es sabido que el compuesto 2 es transformado en el compuesto 1 dentro del cuerpo humano (documentos de patente DE 23 03 306, US-4.254.129, US-4.285.957 y DE 30 07 498). Además, es sabido que la ebastina es oxidada para dar carebastina con ayuda de microorganismos, por ejemplo del género Cunninghamella (documento DE 40 35 218; Schwarz et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (1996) 44; páginas 731-735).

Se encontró ahora que hongos de los géneros Cunninghamella o Absidia transforman selectivamente al compuesto 2 en los compuestos de la fórmula III ó II. La oxidación selectiva solamente en el radical de p-butil terciario-fenilo del compuesto 2 para dar el correspondiente grupo carboxilo es sorprendente, puesto que no son oxidados los dos grupos hidroxilo en el compuesto 2, que también se podrían oxidar.

El invento concierne a un procedimiento para la preparación de un compuesto de la fórmula III,

1

en la que

R^{1} representa -CH_{2}-O-P(O)(OH)_{2} y R^{2} representa -OH,

R^{1} representa -CH_{3} y R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} ó

R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} y R^{1} representa -COOH,

caracterizado porque el \alpha-(p-butil terciario-fenil)-4-(\alpha-hidroxi-\alpha-fenil-bencil)-1-piperidina-butanol o eventualmente el ácido 4-(4-(4-hidroxidifenil)-1-piperidinil)-1-hidroxi-butil)- \alpha,\alpha-dimetil-acético se incuba con un hongo del género Cunninghamella o Absidia.

Preferiblemente, se emplea un hongo del grupo Cunninghamella blakesleeana, Cunninghamella elegans y Cunninghamella echinulata, en particular ATCC 8688a, DSM 1905, DSM 1908 y ATCC 9244. Además, son adecuados mutantes y seleccionantes de los hongos del género Cunninghamella para empleo en el procedimiento conforme al invento, siempre que conviertan el compuesto 2 en un compuesto de las fórmulas III y/o II. Además, pueden emplearse hongos del género Cunninghamella para la fosforilación del compuesto 1.

La solución nutricia contiene fuentes de carbono tal como sacarosa, almidón de maíz, dextrosa o melaza, y fuentes de nitrógeno tal harina de habas de soja, harina de cacahuete, extracto de malta o acetato de amonio.

El medio nutricio contiene también sales inorgánicas tal como hidrógeno-fosfato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de calcio, sulfato de calcio, carbonato de calcio, sulfato de magnesio o hidrógeno-fosfato de potasio. Además, al medio nutricio se le puede añadir también grasa tal como éster metílico de ácido oleico o aceite de soja. Junto a ello también se añaden elementos traza tal como sales de hierro, manganeso, cobre, zinc, cobalto u otras sales de metales.

El cultivo de los hongos se efectúa a temperaturas de 20ºC a 35ºC, preferiblemente a 28ºC, y a valores del pH de 5 a 9, preferiblemente a pH 8. El cultivo se efectúa en condiciones aeróbias, primeramente en un matraz de sacudimiento y después en el fermentador con agitación y ventilación con aire u oxígeno puro. El cultivo de los microorganismos en los fermentadores se efectúa a lo largo de un espacio de tiempo de 48 a 240 horas, preferiblemente de 70 a 110 horas.

La adición del compuesto 2 se efectúa directamente al comienzo del cultivo, pero se puede efectuar también posteriormente, preferiblemente al cabo de aproximadamente 48 horas. La adición del compuesto 2 se efectúa en forma de sustancia sólida, en forma de suspensión o en solución.

Disolventes adecuados son etanol, dimetilformamida (DMF), pero también dimetilsulfóxido (DMSO), diemtilacetamida (DMA), dimetoxietano (DME), tetrahidrofurano (THF), así como dibutil-, diisopropil-, dietil-formamida, 1-metil-, 1-etil-, 1-ciclohexil-pirrolidona, 4-formilmorfolina, 1-formilpiperidina, 1-formilpirrolidina, tetrametilo, tetraetilo, tetrabutilurea, tripiperidino-, tripirrolidino-fosfina-óxido, sulfolano o N-metilcaprolactama, o mezclas de los disolventes mencionados.

También se pueden añadir solubilizantes tal como ®Tween 80 o dodecilsulfato de sodio.

El aislamiento del compuesto de la fórmula III se efectúa directamente a partir de la solución nutricia o después de la separación de las células, por ejemplo por centrifugación o filtración. El aislamiento del compuesto de la fórmula III se puede efectuar por extracción con disolventes o por adsorción en resinas hidrófobas tal como XAD 16, HP 20 o intercambiadores de iones.

Para la preparación del compuesto de la fórmula III, en la que R^{1} representa -COOH y R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2},
se emplea preferiblemente el compuesto 1 como substrato de la reacción.

El invento concierne además a nuevos compuestos de la fórmula II,

2

en la que

R^{1} representa -CH_{2}-O-P(O)(OH)_{2} y R^{2} representa -OH (compuesto 3),

R^{1} representa -CH_{3} y R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} (compuesto 4) ó

R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} y R^{1} representa -COOH.

El invento concierne también a medicamentos, caracterizados por un contenido eficaz de por lo menos un compuesto de la fórmula II y/o de una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la fórmula II, junto con un material de vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible.

El invento abarca también sales farmacéuticamente compatibles del compuesto de la fórmula II. Las sales por adición de ácidos farmacéuticamente compatibles de compuestos conformes al invento son las formadas con ácidos inorgánicos u orgánicos apropiados. Ácidos inorgánicos apropiados son por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico. A los ácidos orgánicos apropiados pertenecen ácidos carboxílicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido ciclaménico, ácido ascórbico, ácido hidroximaleico, ácido dihidroximaleico, ácido benzoico, ácido fenilacético, ácido 4-amino-benzoico, ácido 4-hidroxi-benzoico, ácido antranílico, ácido cinámico, ácido salicílico, ácido 4-amino-salicílico, ácido 2-fenoxi-benzoico, ácido 2-acetoxi-benzoico y ácido mandélico, ácidos sulfónicos tales como ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico y ácido \beta-hidroxi-etanosulfónico. También las sales no tóxicas de los compuestos de las anteriores fórmulas con bases inorgánicas u orgánicas entran dentro del marco del invento. A éstas pertenecen por ejemplo las sales con metales alcalinos, tales como sodio, potasio y litio, con metales alcalino-térreos, tales como calcio y magnesio, metales ligeros del Grupo IIIA, tales como aluminio, con aminas orgánicas tales como aminas primarias, secundarias y terciarias, por ejemplo ciclohexilamina, etilamina, piridina, metilaminoetanol y piperazina. Las sales son formadas de manera convencional, por ejemplo haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula II con el correspondiente ácido o base.

A causa de las propiedades farmacológicas, los compuestos conformes al invento de la fórmula II son apropiados como agentes antihistamínicos, antialergénicos y broncodilatadores.

Los compuestos conformes al invento de la fórmula II son apropiados para el tratamiento de rinitis alérgica, asma u otras enfermedades alérgicas.

Los compuestos conformes al invento de la fórmula II se pueden administrar por las vías oral, parenteral, por ejemplo subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por introducción intranasal o aplicación sobre mucosas, por ejemplo de la nariz, de la faringe o del tracto bronquial, por ejemplo en forma de una rociada de aerosol, que contiene pequeñas partículas de un compuesto conforme al invento en forma de neblina o polvo.

Las cantidades de los compuestos que se han de administrar dependen del paciente y del modo de administración. La cantidad que se ha de administrar puede fluctuar dentro de un amplio margen, de tal manera que resulten unidades de dosis con una cantidad eficaz de aproximadamente 0,01 a 20 mg/kg de peso corporal/día para conseguir el efecto deseado. Por ejemplo, el deseado efecto antihistamínico, antialergénico o broncodilatador se puede conseguir mediante ingestión de una unidad de dosis, tal como por ejemplo de una tableta con 5 a 300 mg del compuesto conforme al invento, preferiblemente con 10 a 200 mg, que se toma de 1 a 4 veces por día.

El invento concierne también a un procedimiento para la preparación de un medicamento, que está caracterizado porque se lleva a una forma de administración apropiada por lo menos a un compuesto de la fórmula II con un vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible y eventualmente otras sustancias activas, aditivas o coadyuvantes.

Apropiadas formas sólidas o galénicas de preparados son por ejemplo granulados, polvos, grageas, tabletas, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, zumos, suspensiones, emulsiones, gotas o soluciones inyectables, así como preparados con liberación retardada de la sustancia activa, en cuya preparación encuentran utilización agentes coadyuvantes usuales, tales como materiales de vehículo, y agentes disgregantes, aglutinantes, de revestimiento, de hinchamiento, de deslizamiento o lubricantes, sustancias saboreantes, agentes edulcorantes y solubilizantes. Como materiales coadyuvantes frecuentemente utilizados se citarán carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manita y otros azúcares, talco, albúmina láctea, gelatina, almidón, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales tales como aceite de hígado de bacalao, aceite de girasol, cacahuete o sésamo, polietilenglicol y disolventes, tales como por ejemplo agua estéril y alcoholes univalentes o multivalentes, tales como glicerol.

Los compuestos conformes al invento de la fórmula II se pueden administrar también como soluciones o suspensiones inyectables en un agente diluyente fisiológicamente compatible con un vehículo farmacéutico, que es un líquido estéril tal como agua o un aceite, pudiéndose añadir agentes coadyuvantes tensioactivos y de otros tipos farmacéuticamente admisibles. Ejemplos de aceites apropiados son los de origen del petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja o un aceite mineral. Por lo general, se prefieren agua, una solución de cloruro de sodio, una solución acuosa de dextrosa o similares soluciones de azúcares, y glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol como vehículos líquidos, especialmente para soluciones inyectables.

Para su utilización como aerosoles, los compuestos conformes al invento son puestos bajo presión en solución o suspensión dentro de un recipiente para aerosoles, en común con agentes propulsores apropiados, por ejemplo agentes propulsores hidrocarbonados tales como propano, butano o isobutano o bien dióxido de carbono o nitrógeno u otros agentes propulsores ecológicamente admisibles y materiales coadyuvantes usuales. Los compuestos se pueden administrar también a partir de una forma sin presión, por ejemplo con aparatos nebulizadores.

Para la administración entran en cuestión animales homeotermos, aves, mamíferos, por ejemplo seres humanos, gatos, perros, caballos, ovejas, toros, vacas, cerdos, corderos, ratas, ratones y cobayas.

Ejemplo 1 Cultivación de cepas

Se siembran 100 \mul de una suspensión de esporas de las cepas de Cunninghamella, Cunninghamella blakesleeana FH 001, Cunninghamella blakesleeana FH 002, Cunninghamella blakesleeana FH 003, Cunninghamella echinulata DSM 1905, Cunninghamella echinulata variante elegans ATCC 8688a, Cuninghamella elegans DSM 1908 y Cunninghamella echinulata variante echinulata ATCC 9244, sobre una placa de agar (20 g/l de extracto de malta, 2 g/l de peptona y 20 g/l de agar, pH 6,5) y se incuban durante 72 h a 28ºC. A continuación, se puede almacenar la placa durante al menos ocho semanas a 4ºC.

Alternativamente, las cepas se pueden cultivar en condiciones sumergidas en el mismo medio sin adición de agar. Después de cultivar durante 72 h a 28ºC, se mezcla el cultivo con 20% de glicerol y la suspensión se almacena a aproximadamente -120ºC sobre nitrógeno líquido.

Ejemplo 2 Analítica por cromatografía de líquido a alta presión (HPLC)

Preparación de las muestras:
	Diluir el caldo de cultivo a 1:1 con metanol y agitar la suspensión durante 30 mi-
	nutos. Separar la fase transparente por centrifugación.
Eluyente A:	900 ml	de H_{2}O
	100 ml	de acetonitrilo
	1 ml	de ácido trifluoroacético (TFA)
Eluyente B:	900 ml	de acetonitrilo
	100 ml	de H_{2}O
	1 ml	de TFA
Detección:	215 nm
Caudal:	1 ml/min
Gradiente:	0 min	50% de B
	10 min	80% de B
	15 min	80% de B
	16 min	50% de B
	21 min	50% de B
Temperatura de la columna:	55ºC
Columna:	Merck RP 18 5 \mum Licrospher 100 longitud 25 cm, diámetro 4 mm
Tiempos de retención:	compuesto 1	5,4 minutos (min)
	compuesto 2	9 min
	triol	5,7 min
	compuesto 3	3,5 min
	compuesto 4	6,9 min

Ejemplo 3 Rastreo con cepas de cunninghamella

Se inoculan 100 ml de un medio de rastreo (5 g/l de peptona de soja, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 5 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de agar y 20 g/l de glucosa / tratados en autoclave por separado, pH 5,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 1.000 ml) con un trozo de agar de una de las cepas citadas en el Ejemplo 1. El cultivo se efectúa primero durante 48 h a 28ºC y a 180 revoluciones por minuto (rpm) en un máquina sacudidora rotatoria. Después de este período de tiempo, se efectúa la adición de 20 mg del compuesto 2 disueltos en 100 \mul de DMF o etanol. Después de 72 horas (h) o, a elección, en un momento anterior, se retira una parte alícuota del cultivo y se mezcla con 50% de metanol. La suspensión obtenida se suspende con un Ultra-Turrax durante 30 segundos y la suspensión se centrifuga seguidamente a 10.000 g. El material sobrenadante transparente obtenido se analiza luego mediante HPLC (véase el Ejemplo 2).

En los caldos de cultivo de todas las cepas se pudo detectar, después de un tiempo de incubación de 72 h, el compuesto 1 en una concentración de hasta 5 mg/l.

Ejemplo 4 Producción del compuesto 1 a escala de matraces con diversas cepas de cunninghamella

Se inoculan 100 ml de medio de precultivo (5 g/l de peptona de soja, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 5 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de agar y 20 g/l de glucosa / tratados en autoclave por separado, pH 5,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 1.000 ml) con un trozo de agar, sobre el que ha crecido en cada caso una de las cepas mencionadas en el Ejemplo 1. El cultivo se efectúa durante 48 h a 28ºC y 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. Se inoculan 100 ml de un medio de producción (5 g/l de peptona de soja, 10 g/l de líquido de maceración de maíz, 20 g/l de glucosa, 5 g/l de NaCl, 1 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de agar, 25,1 g/l de ácido 2-([hidroxi-1,1-bis-(hidroximetil)etil]-amino)etanosulfónico (TES)(sal de sodio), 100 \mul de Desmophen, pH 8,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 500 ml) con 10 ml del precultivo antes descrito. El cultivo se efectúa primero durante 48 h a 28ºC y 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. Después de este período de tiempo se efectúa la adición de 20 mg del compuesto 1, disueltos en 100 \mul de DMF. Después de 72 h, se retira una parte alícuota del cultivo y se mezcla con 50% de metanol. La suspensión obtenida se suspende con un Ultra-Turrax durante 30 segundos y la suspensión se centrifuga a continuación a 10.000 g. El material sobrenadante transparente obtenido se analiza luego mediante HPLC
(Ejemplo 2).

El análisis proporciona los rendimientos recopilados en la Tabla 1; se encuentran los siguientes compuestos:

el compuesto 1 es el compuesto de la fórmula I;

el compuesto 2 es el compuesto de la fórmula II, en la que

R^{1} representa -CH_{3} y R^{2} representa -OH;

el compuesto 3 es el compuesto de la fórmula II, en la que

R^{1} representa -CH_{2}-OP(O)(OH)_{2} y R^{2} representa -OH;

el compuesto 4 es el compuesto de la fórmula II, en la que

R^{1} representa -CH_{3} y R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} y

el triol es el compuesto de la fórmula II, en la que

R^{1} representa -OH y R^{2} representa -OH.

TABLA 1

Cepa	Triol [mg/l]	Compuesto 1 [mg/l]	Compuesto 3 [mg/l]	Compuesto 4 [mg/l]
C. blak. FH 001	4,9	< 1,0	11,9	60,4
C. blak. FH 002	26,0	50,7	42,5	3,0
C. blak. FH 003	2,1	< 1,0	1,6	18,4
C. echinu. ATCC 8688ª	4,7	43,2	27,3	2,2
C. echinu. DSM 1905	13,8	3,3	40,4	23,1
C. el. DSM 1908	17,3	1,1	15,2	37,0
C. ech. ATCC 9244	18,5	5,1	20,7	7,4

Ejemplo 5 Preparación mejorada del compuesto 1 a escala de matraces con Cunninghamella echinulata variante elegans ATCC 8688a

Se inoculan 100 ml de un medio de precultivo (5 g/l de peptona de soja, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 5 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de agar y 20 g/l de glucosa (tratados en autoclave por separado), pH 5,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 1.000 ml) con un trozo de agar, sobre el que ha crecido en cada caso una de las cepas citadas en el Ejemplo 1. El cultivo se efectúa durante 48 h a 28ºC y a 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. Se inoculan 100 ml de un medio de producción (5 g/l de peptona de soja, 5 g/l de peptona de caseína, 20 g/l de almidón soluble, 5 g/l de NaCl, 1 g/l de K_{2}HPO_{4}, 1 g/l de NH_{4}(SO_{4})_{2}, 3 g/l de agar, 25,1 g/l de TES (sal de sodio), 100 \mul de Desmophen, pH 8,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 500 ml) con 10 ml del precultivo descrito precedentemente. El cultivo se efectúa primero durante 24 h a 28ºC y 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria.

Después de este período de tiempo se efectúa la adición de 20 mg del compuesto 2, disueltos en 800 \mul de etanol. Después de 72 h, se retira una parte alícuota del cultivo y se mezcla con 50% de metanol. La suspensión obtenida se suspende con un Ultra-Turrax durante 30 segundos y la suspensión se centrifuga a continuación a 10.000 g. El material sobrenadante transparente obtenido se analiza luego mediante HPLC (Ejemplo 2). El análisis arrojó un rendimiento de 145 mg/l del compuesto 1, 6,5 mg/l del triol (2), 22 mg/l del compuesto 3 y 5 mg/l del compuesto 4.

Ejemplo 6 Producción de compuestos de la fórmula II en un fermentador de 10 l de capacidad

Se inoculan 100 ml de un medio de precultivo (5 g/l de peptona de soja, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, 5 g/l de K_{2}HPO_{4}, 3 g/l de agar y 20 g/l de glucosa / tratados en autoclave por separado), pH 5,0, en un matraz de Erlenmeyer con un volumen de 1.000 ml) con un trozo de agar de la cepa Cunninghamella echinulata Var. elegans ATCC 8688a. El cultivo se efectúa durante 48 h a 28ºC y a 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. Se inoculan 10 l de un medio de producción (5 g/l de peptona de soja, 5 g/l de extracto de soja, 20 g/l de glucosa (tratada en autoclave por separado), 5 g/l de NaCl, 1 g/l de K_{2}HPO_{4}, 100 \mul de Desmophen, pH 5,0) con 100 ml del precultivo descrito precedentemente. A continuación, se añade a ello el compuesto 2, de manera que se consigue una concentración final en el fermentador de 200 mg/l del medio de producción. La fermentación se efectúa a 28ºC, 700 rpm y 0,5 vvm a lo largo de 96 horas.

Según el análisis por HPLC, el caldo de cultivo contiene aproximadamente 10 mg/l del compuesto 1, 10 mg/l del triol (2), 100 mg/l del compuesto 3 y 100 mg/l del compuesto 4.

Ejemplo 7 Aislamiento de los compuestos de la fórmula II

El caldo de cultivo obtenido según el Ejemplo 6 (8.800 ml) se separa, mediante una centrífuga de vasos (5.000 g/10 minutos), en material sobrenadante (8.000 ml) y biomasa (800 g) y las dos fases se tratan por separado.

Al material sobrenadante se le añaden 160 g de una resina adsorbente macroporosa de acrilamida y poliestireno, tal como XAD 7. La adsorción se efectúa con ligera agitación a pH 2,5 y a temperatura ambiente durante 2 horas. La resina adsorbente se separa por filtración y se eluye 4 veces con 160 ml de metanol. Los materiales eluidos se reunieron y concentraron hasta sequedad bajo presión reducida (aproximadamente 50 g de un material sólido oleoso después de liofilización). La purificación fina se efectúa mediante una HPLC preparativa según el siguiente procedimiento:

Eluyente A:	800 ml	de H_{2}O
	200 ml	de acetonitrilo
	1 ml	de TFA
Eluyente B:	1.000 ml	de acetonitrilo
	0,9 ml	de TFA
Detección:	215 nm
Caudal:	50 ml/min
Gradiente:	0 min	0% de B
	60 min	0% de B
	133 min	43% de B
	134 min	100% de B
	157 min	100% de B
Temperatura de la columna:	temperatura ambiente
Columna:	Kromasil, C18, 7 \mum longitud 350 mm, diámetro 50 mm
Muestra:	5 g de un producto bruto, disueltos en 350 ml de metanol/agua (1:1)

A partir de dos pasadas después de haber reunido las correspondientes fracciones, concentrado bajo presión reducida y liofilizado el residuo acuoso, se obtienen 20 mg del compuesto 1 y 160 mg del compuesto 3.

La biomasa (800 g) se extrae con n-propanol al 30% y al 100% (en total 1.500 ml) y se separa el material sólido mediante filtración a través de capas de filtros (K300). Los materiales filtrados se concentran bajo presión reducida y se obtienen 26,2 g de un material sólido oleoso.

La purificación fina se efectúa mediante una HPLC preparativa según el siguiente procedimiento:

Eluyente A:	800 ml	de H_{2}O
	200 ml	de acetonitrilo
	1 ml	de TFA
Eluyente B:	1.000 ml	de acetonitrilo
	0,9 ml	de TFA
Detección:	215 nm
Caudal:	50 ml/min
Gradiente:	0 min	0% de B
	34 min	0% de B
	121 min	51% de B
	122 min	100% de B
	148 min	100% de B
Temperatura de la columna:	temperatura ambiente
Columna:	Kromasil, C18, 7 \mum longitud 350 mm, diámetro 50 mm

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Muestra:

5 g de producto bruto, disueltos en 400 ml de metanol/agua (1:1)

A partir de dos pasadas, después de haber reunido las correspondientes fracciones, concentrado bajo presión reducida y liofilizado el residuo acuoso, se obtienen 4 mg del triol (2), 20 mg del compuesto 4 y 80 mg del compuesto 1.

Ejemplo 8 Caracterización de los compuestos de la fórmula II

Junto a la caracterización mediante espectroscopía de UV/VIS, los componentes son caracterizados por ^{1}H-RMN así como por ESI-EM o FAB-EM.

Datos de EM (espectro de masas):
triol (2)	ESI-EM: m/e = 488,4 [M+H]^{+}
compuesto 1	ESI-EM: m/e = 502,3 [M+H]^{+}
compuesto 3	ESI-EM: m/e = 568,3 [M+H]^{+}
	HR-FAB-EM: m/e = 568,2827 [M+H]^{+}
compuesto 4	ESI-EM: m/e = 552,3 [M+H]^{+}

Los datos de ^{1}H-RMN se representan en la Tabla 2:

Desviaciones químicas de ^{1}H en DMSO a 300ºK.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

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Ejemplo 9 Efecto sobre la amplitud bronquial de un cobaya narcotizado

Las investigaciones se efectuaron según el método de Konzett-Rössler (Arch. exp. Path. U. Pharmak. 195 (71-74) 1940) en cobayas albinos machos, con un peso corporal de 312-415 g. Los preparados experimentales se aplicaron en una dosis de 10 mg/kg en una suspensión con el volumen de administración de 2 ml/kg de peso corporal. Después de obtener dos valores previos con 20 \mug/kg de histamina por vía intravenosa (i. v.), se introdujo la sustancia de una vez mediante una sonda duodenal y se repitió el ensayo del asma a los 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min después de la administración del preparado.

Las modificaciones de la amplitud bronquial en comparación con la medición de control se indicó porcentualmente. Por cada dosis se emplearon 6 animales. La estadística se efectuó a través del ensayo t.

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Claims

1. Compuesto de la fórmula II,

5

en la que

R^{1} representa -CH_{2}-O-P(O)(OH)_{2} y R^{2} representa -OH,

R^{1} representa -CH_{3} y R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} ó

R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} y R^{1} representa -COOH.

2. Procedimiento para la preparación del compuesto de la fórmula III,

6

en la que

R^{1} representa -CH_{2}-O-P(O)(OH)_{2} y R^{2} representa -OH,

R^{1} representa -CH_{3} y R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} ó

R^{2} representa -O-P(O)(OH)_{2} y R^{1} representa -COOH,

caracterizado porque el \alpha-(p-butil terciario-fenil)-4-(\alpha-hidroxi-\alpha-fenil-bencil)-1-piperidina-butanol o eventualmente el ácido 4-(4-(4-(hidroxidifenil)-1-piperidinil)-1-hidroxi-butil)- \alpha,\alpha-dimetil-acético se incuba con un hongo del género Cunninghamella o Absidia.

3. Medicamento, caracterizado por un contenido activo en por lo menos un compuesto de la fórmula II según la reivindicación 1 junto con un vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible.

4. Utilización de por lo menos un compuesto de la fórmula II según la reivindicación 1 para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento de enfermedades alérgicas, rinitis alérgica o asma.

5. Procedimiento para la preparación de un medicamento según la reivindicación 3, caracterizado porque se llevan por lo menos un compuesto según la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible a una forma de administración apropiada.

6. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque se emplea un hongo del grupo de Cunninghamella blakesleeana, Cunninghamella elegans y Cunninghamella echinulata, especialmente Cunninghamella echinulata DSM 1905, Cunninghamella elegans DSM 1908 y Cunninghamella echinulata ATCC 9244.

7. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 2 ó 6, caracterizado porque se añade \alpha-(p-terc.-butilfenil)-4-(\alpha-hidroxi-\alpha-fenilbencil)-1-piperidina-butanol al comienzo del cultivo del hongo del género Cunninghamella o 24 horas después de este comienzo.