DE19751498A1 - Verfahren zur Herstellung von 4-(4-(4-(Hydroxydiphenyl)-1-piperidinyl)-1-hydroxybutyl)-alpha,alpha-dimethylphenylessigsäure und phosphorylierter Derivate - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 4-(4-(4-(Hydroxydiphenyl)-1-piperidinyl)-1-hydroxybutyl)-alpha,alpha-dimethylphenylessigsäure und phosphorylierter Derivate

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DE19751498A1
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Johannes Dr Meiwes
Manfred Dr Worm
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Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Aventis Pharmaceuticals Inc
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Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH
Hoechst Marion Roussel Inc
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
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Description

Die Erfindung betrifft ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von 4-(4-(4- (Hydroxydiphenyl)-1-piperidinyl)-1-hydroxybutyl)-α,α-dimethylphenylessigsäure (Verbindung 1) und phosphorylierter Derivate aus α-(p-tertiär-Butylphenyl)-4-(α-hy­ droxy-α-phenylbenzyl)-1-piperidin-butanol (Verbindung 2) sowie deren Verwendung als Arzneimittel.
Es ist bekannt, daß im menschlichen Körper Verbindung 2 in Verbindung 1 umgewandelt wird (DE 23 02 306, US 4,254,129, US 4,285,957, DE 30 07 498). Ferner ist bekannt, daß Ebastin zu Carebastin oxidiert wird mit Hilfe von Mikroorganismen beispielsweise der Gattung Cunninghamella (DE 40 34 218; Schwarz et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. (1996) 44: Seiten 731-735).
Es wurde nun gefunden, daß Pilze der Gattung Cunninghamella die Verbindung 2 selektiv in hohen Ausbeuten in die Verbindungen der Formel I oder II umwandeln. Die selektive Oxidation nur am p-tertiär-Butylphenylrest der Verbindung 2 zur entsprechenden Carboxylgruppe ist überraschend, da die beiden Hydroxylgruppen in der Verbindung 2, die auch oxydiert werden könnten, nicht oxydiert werden.
Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Gewinnung der Verbindung der Formel I
das dadurch gekennzeichnet ist, daß α-(p-tert.-Butylphenyl)-4-(α-hydroxy-α-phenyl­ benzyl)-1-piperidin-butanol mit einem Pilz der Gattung Cunninghamella inkubiert wird.
Bevorzugt wird ein Pilz aus der Gruppe Cunninghamella blakesleeana, Cunninghamella elegans und Cunninghamella echinulata, insbesondere ATCC 8688a, DSM 1905, DSM 1908 und ATCC 9244, eingesetzt. Ferner eignen sich Mutanten und Selektanten der Pilze der Gattung Cunninghamella zum Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren, solange sie die Verbindung 2 in eine Verbindung der Formel I und/oder II umsetzen.
Die Nährlösung enthält Kohlenstoffquellen wie Saccharose, Maisstärke, Dextrose oder Molasse und Stickstoffquellen wie Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Malzextrakt oder Ammoniumacetat.
Das Nährmedium enthält auch anorganische Salze wie Natriumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Calciumsulfat, Calciumcarbonat, Magnesiumsulfat oder Kaliumhydrogenphosphat. Ferner kann dem Nährmedium auch Fett wie Ölsäuremethylester oder Sojaöl zugesetzt werden. Daneben werden auch Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Kupfer-, Zink-, Kobalt- oder andere Metallsalze zugegeben.
Die Kultivierung der Pilze erfolgt bei Temperaturen von 20°C bis 35°C, bevorzugt bei 28°C und bei pH-Werten von 5 bis 9, vorzugsweise bei pH 8. Die Kultivierung erfolgt aerob zunächst im Schüttelkolben und danach im Fermenter unter Rühren und Belüftung mit Luft oder reinem Sauerstoff. Die Kultivierung der Mikroorganismen in den Fermentern erfolgt über einen Zeitraum von 48 bis 240 Stunden, bevorzugt von 70 bis 110 Stunden.
Die Zugabe der Verbindung 2 erfolgt direkt zu Beginn der Kultivierung kann jedoch auch später erfolgen, bevorzugt nach etwa 48 Stunden. Die Zugabe der Verbindung 2 erfolgt als Festsubstanz, als Suspension oder in Lösung.
Geeignete Lösungsmittel sind Ethanol, Dimethylformamid (DMF), aber auch Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylacetamid (DMA), Dimethoxyethan (DME), Tetrahydrofuran (THF) sowie Dibutyl-, Diisopropyl-, diethylformamid, 1-Methyl-, 1-Ethyl-, 1-Cyclohexylpyrrolidon, 4-Formylmorpholin, 1-Formylpiperidin, 1- Formylpyrrolidin, Tetramethyl-, Tetraethyl-, Tetrabutylharnstoff, Tripiperidino-, Tripyrrolidinophosphinoxid, Sulfolan oder N-Methylcaprolactam oder Mischungen der genannten Lösungsmittel.
Es können auch Lösungsvermittler wie ®Tween 80 oder Natriumdodecylsulfat zugefügt werden.
Die Isolierung der Verbindung 1 erfolgt direkt aus der Nährlösung oder nach Abtrennung der Zellen beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration. Die Isolierung der Verbindung 1 kann durch Extraktion mit Lösungsmitteln oder durch Adsorption an hydrophobe Harze wie XAD 16, HP 20 oder Ionenaustauscher erfolgen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel II,
worin
R1 für -OH oder -CH2-O-P(O)(OH)2 und R2 für -OH steht oder
R1 für -CH3 und R2 für -O-P(O)(OH)2 steht,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß α-(p-tert.-Butylphenyl)-4-(α-hydroxy-α-phenyl­ benzyl)-1-piperidin-butanol mit einem Pilz der Gattung Cunninghamella inkubiert wird.
Die Umsetzung erfolgt im wesentlichen wie im Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I.
Die Erfindung betrifft ferner eine neue Verbindung der Formel II, worin
R1 für -CH2-O-P(O)(OH)2 und R2 für -OH (Verbindung 3) steht oder
R1 für -CH3 und R2 für -O-P(O)(OH)2 (Verbindung 4) steht.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel II, worin R1 für -OH und R2 für -OH (Triol) steht, das dadurch gekennzeichnet ist, daß α-(p-tert.-Butylphenyl)-4-(α-hydroxy-α-phenylbenzyl)-1-pipe­ ridin-butanol mit einem Pilz der Gattung Cunninghamella inkubiert wird.
Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel II und/oder eines physiologisch verträglichen Salzes der Verbindung der Formel II zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Trägerstoff.
Die Erfindung umfaßt auch die pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindung der Formel II. Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze erfindungsgemäßer Verbindungen sind solche mit geeigneten anorganischen oder organischen Säuren. Geeignete anorganische Säuren sind zum Beispiele Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Zu den geeigneten Säuren gehören Carbonsäuren wie Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Cyclamensäure, Ascorbinsäure, Hydroxymaleinsäure, Dihydroxymaleinsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, 4-Aminobenzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, Anthranilsäure, Zimtsäure, Salizylsäure, 4-Aminosalizylsäure, 2-Phenoxybenzoesäure, 2-Acetoxybenzoesäure und Mandelsäure, Sulfonsäure wie Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure und β-Hydroxyethansulfonsäure. Auch nicht-toxische Salze der Verbindungen obiger Formeln mit anorganischen oder organischen Basen fallen in den Rahmen der Erfindung. Hierzu gehören zum Beispiel die Salze mit Alkalimetallen wie Natrium, Kalium und Lithium, mit Erdalkalimetallen wie Calcium und Magnesium, Leichtmetallen der Gruppe IIIA wie Aluminium, mit organischen Aminen wie primären, sekundären und tertiären Aminen, zum Beispiel Cyclohexylamin, Ethylamin, Pyridin, Methylaminoethanol und Piperazin. Die Salze werden auf konventionelle Weise gebildet, zum Beispiel, indem man eine Verbindung der Formel II mit der entsprechenden Säure oder Base umsetzt.
Aufgrund der pharmakologischen Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel II als Antihistamine, Antiallergene und Bronchiendilatoren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel II sind geeignet zur Behandlung von allergischer Rhinitis, Asthma oder anderen allergischen Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel II können oral, parenteral, zum Beispiele subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal, durch intranasale Einführung oder Applikation auf Schleimhäute, zum Beispiel der Nase, des Rachens oder des Bronchialtrakts, beispielsweise in Form eines Aerosol-Sprays, der kleine Partikel einer erfindungsgemäßen Verbindung in Nebel- oder Pulverform enthält, verabreicht werden.
Die Mengen der zu verabreichenden Verbindungen hängen vom Patienten und der Art der Verabreichung ab. Die zu verabreichenden Menge kann innerhalb eines breiten Bereichs schwanken, so daß sich Dosiseinheiten mit wirksamer Menge von etwa 0,01 bis 20 mg/kg Körpergewicht/Tag zur Erzielung des gewünschten Effekts ergeben. Beispielsweise kann die gewünschte Antihistamin-, Antiallergen- oder bronchienerweiternde Wirkung erzielt werden durch Aufnahme einer Dosiseinheit wie beispielsweise einer Tablette mit 5 bis 300 mg der erfindungsgemäßen Verbindung, bevorzugt 10 bis 200 mg, die 1- bis 4 mal täglich genommen wird.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung der Formel II mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.
Geeignete feste oder galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten (Mikro)Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel, wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als häufig verwendete Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Cellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuß- oder Sesamöl, Polyethylenglykol und Lösungsmittel wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole wie Glycerin, genannt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel II können auch als injizierbare Lösungen oder Suspensionen in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht werden, der eine sterile Flüssigkeit wie Wasser oder ein Öl ist, wobei oberflächenaktive und andere pharmazeutische zulässige Hilfsmittel zugesetzt werden können. Beispiele geeigneter Öle sind solche aus Erdöl, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs wie Erdnußöl, Sojabohnenöl oder Mineralöl. Im allgemeinen werden Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextroselösung oder ähnliche Zuckerlösungen und Glykole wie Propylenglykol oder Polyethylenglykol als flüssige Träger, insbesondere für injizierbare Lösungen, bevorzugt.
Zur Verwendung als Aerosole werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Lösung oder Suspension in einem Aerosol-Behälter zusammen mit geeigneten Treibmitteln, zum Beispiele Kohlenwasserstoff-Treibmitteln wie Propan, Butan oder Isobutan oder Kohlendioxid oder Stickstoff oder anderen ökologisch zulässigen Treibmitteln und üblichen Hilfsstoffen unter Druck gesetzt. Die Verbindungen können auch aus druckfreier Form verabreicht werden, zum Beispiel mit Vernebelungsgeräten.
Zur Verabreichung in Frage kommen Warmblütler, Vögel, Säugetiere, zum Beispiel Menschen, Katzen, Hunde, Pferde, Schafe, Rinder, Kühe, Schweine, Lämmer, Ratten, Mäuse und Meerschweinchen.
Beispiel 1 Stammhaltung
100 µl einer Sporensuspension der Cunninghamella Stämme Cunninghamella blakesleeana FH 001, Cunninghamella blakesleeana FH 002, Cunninghamella blakesleeana FH 003, Cunninghamella echinulata DSM 1905, Cunninghamella echinulata Variante elegans ATCC 8688a, Cunninghamella elegans DSM 1908 und Cunninghamella echinulata Variante echinulata ATCC 9244 wird auf einer Agarplatte (20 g/l Malzextrakt, 2 g/l Pepton und 20 g/l Agar pH 6,5) ausplattiert und 72 h bei 28°C inkubiert. Anschließend kann die Platte über mindestens acht Wochen bei 4°C gelagert werden.
Alternativ können die Stämme in dem gleichen Medium ohne Zusatz von Agar submers kultiviert werden. Nach einer Kultur über 72 h bei 28°C wird die Kultur mit 20% Glycerin versetzt und die Suspension bei etwa -120°C über flüssigem Stickstoff gelagert.
Beispiel 2
Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)-Analytik
Probenvorbereitung: Kulturbrühe 1 : 1 mit Methanol verdünnen und Suspension 30 Minuten rühren. Abtrennung der Klarphase durch Zentrifugation.
Laufmittel A: 900 ml H2O
100 ml Acetonitril
1 ml Trifluoressigsäure (TFA)
Laufmittel B: 900 ml Acetonitril
100 ml H2O
1 ml TFA
Detektion: 215 nm
Fluß: 1 ml/min
Gradient: 0 min: 50% B
10 min 80% B
15 min: 80% B
16 min: 50% B
21 min: 50% B
Säulentemperatur: 55°C
Säule: Merck RP 18 5 µm Licrospher 100
Länge 25 cm Durchmesser 4 mm
Retentionszeiten: Verbindung 1: 5,4 Minuten (min)
Verbindung 2: 9 min
Triol: 5,7 min
Verbindung 3: 3,5 min
Verbindung 4: 6,9 min
Beispiel 3 Screening mit Cunninghamella Stämmen
100 ml Screeningmedium (5 g/l Sojapepton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 5 g/l K2HPO4, 3 g/l Agar und 20 g/l Glucose/getrennt autoklaviert, pH 5,0 in einem Erlenmeyerkolben mit 1000 ml Volumen) werden mit einem Agarstück eines der in Beispiel 1 genannten Stämme beimpft. Die Kultur erfolgt zunächst 48 h bei 28 °C und 180 Umdrehungen pro Minute (UpM) auf einer rotierenden Schüttelmaschine. Nach dieser Zeit erfolgt die Zugabe von 20 mg der Verbindung 2 gelöst in 100 µl DMF oder Ethanol. Nach 72 Stunden (h) oder wahlweise einem früheren Zeitpunkt wird ein Aliquot der Kultur entnommen und mit 50% Methanol versetzt. Die erhaltene Suspension wird mit einem Ultra-Turrax 30 Sekunden suspendiert und die Suspension anschließend bei 10 000 g zentrifugiert. Der erhaltene klare Überstand wird dann mittels HPLC (siehe Beispiel 2) analysiert.
In der Kulturbrühe von allen Stämmen konnte nach 72 h Inkubationszeit die Verbindung 1 in einer Konzentration von bis zu 5 mg/l nachgewiesen werden.
Beispiel 4 Produktion der Verbindung 1 im Kolbenmaßstab mit verschiedenen Cunninghamella Stämmen
100 ml Vorkulturmedium (5 g/l Sojapepton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 5 g/l K2HPO4, 3 g/l Agar und 20 g/l Glucose/getrennt autoklaviert, pH 5,0 in einem Erlenmeyerkolben mit 1000 ml Volumen) werden mit einem Agarstück, auf dem jeweils einer der in Beispiel 1 genannten Stämme gewachsen ist, beimpft. Die Kultur erfolgt 48 h bei 28°C und 180 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine. 100 ml Produktionsmedium (5 g/l Sojapepton, 10 g/l Cornsteep flüssig, 20 g/l Glucose, 5 g/l NaCl, 1 g/l K2HPO4, 3 g/l Agar, 25,1 g/l 2-([Hydroxy-1,1-bis-(hydroxy­ methyl)ethyl]-amino)ethansulfonsäure (TES) (NatriumsaIz), 100 µl Desmophen, pH 8,0 in einem Erlenmeyerkolben mit 500 ml Volumen) werden mit 10 ml der oben beschriebenen Vorkultur beimpft. Die Kultur erfolgt zunächst 48 h bei 28°C und 180 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine.
Nach dieser Zeit erfolgt die Zugabe von 20 mg Verbindung 1 gelöst in 100 µl DMF. Nach 72 h wird ein Aliquot der Kultur entnommen und mit 50% Methanol versetzt. Die erhaltene Suspension wird mit einem Ultra-Turrax 30 Sekunden suspendiert und die Suspension anschließend bei 10 000 g zentrifugiert. Der erhaltene klare Überstand wird dann mittels HPLC (Beispiel 2) analysiert.
Die Analyse ergibt die in der Tabelle 1 zusammengestellten Ausbeuten; es werden folgende Verbindungen gefunden:
Verbindung 1 ist die Verbindung der Formel I;
Verbindung 2 ist die Verbindung der Formel II, worin R1 für -CH3 und R2 für -OH steht;
Verbindung 3 ist die Verbindung der Formel II, worin R1 für -CH2-O-P(O)(OH)2 und R2 für -OH steht;
Verbindung 4 ist die Verbindung der Formel II, worin R1 für -CH3 und R2 für -O-P(O)(OH)2 steht und
Triol ist die Verbindung der Formel II, worin R1 für -OH und R2 für -OH stehen.
Tabelle 1
Beispiel 5 Verbesserte Herstellung der Verbindung 1 im Kolbenmaßstab mit Cunninghamella echinulata Variation elegans ATCC 8688a
100 ml Vorkulturmedium (5 g/l Sojapepton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 5 g/l K2HPO4, 3 g/l Agar und 20 g/l Glucose (getrennt autoklaviert), pH 5,0 in einem Erlenmeyerkolben mit 1000 ml Volumen) werden mit einem Agarstück, auf dem jeweils einer der in Beispiel 1 genannten Stämme gewachsen ist, beimpft. Die Kultur erfolgt 48 h bei 28 °C und 180 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine. 100 ml Produktionsmedium (5 g/l Sojapepton, 5 g/l Caseinpepton, 20 g/l lösliche Stärke, 5 g/l NaCl, 1 g/l K2HPO4, 1 g/l NH4(SO4)2, 3 g/l Agar, 25,1 g/l TES (Natriumsalz), 100 µl Desmophen, pH 8,0 in einem Erlenmeyerkolben mit 500 ml Volumen) werden mit 10 ml der oben beschriebenen Vorkultur beimpft. Die Kultur erfolgt zunächst 24 h bei 28°C und 180 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine.
Nach dieser Zeit erfolgt die Zugabe von 20 mg Verbindung 2 gelöst in 800 µl Ethanol. Nach 72 h wird ein Aliquot der Kultur entnommen und mit 50% Methanol versetzt. Die erhaltene Suspension wird mit einem Ultra-Turrax 30 Sekunden suspendiert und die Suspension anschließend bei 10 000 g zentrifugiert. Der erhaltene klare Überstand wird dann mittels HPLC (Beispiel 2) analysiert. Die Analyse ergab eine Ausbeute von 145 mg/l Verbindung 1, 6,5 mg/l Triol (2), 22 mg/l Verbindung 3 und 5 mg/l Verbindung 4.
Beispiel 6 Produktion von Verbindungen der Formel II im 10 l-Fermenter
100 ml Vorkulturmedium (5 g/l Sojapepton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, 5 g/l K2HPO4 3 g/l Agar und 20 g/l Glucose/getrennt autoklaviert, pH 5,0 in einem Erlenmeyerkolben mit 1000 ml Volumen) werden mit einem Agarstück des Stammes Cunninghamella echinulata Var. elegans ATCC 8688a beimpft. Die Kultur erfolgt 48 h bei 28°C und 180 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine. 10 l Produktionsmedium (5 g/l Sojapepton, 5 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Glucose (getrennt autoklaviert), 5 g/l NaCl, 1 g/l K2HPO4, 100 µl Desmophen, pH 5,0) werden mit 100 ml der oben beschriebenen Vorkultur beimpft. Anschließend wird die Verbindung 2 dazugegeben, so daß eine Endkonzentration im Fermenter von 200 mg/l Produktionsmedium erreicht wird. Die Fermentation erfolgt bei 28°C, 700 UpM und 0,5 vvm über 96 Stunden.
Nach HPLC-Analyse enthält die Kulturbrühe etwa 10 mg/l Verbindung 1,10 mg/l Triol (2), 100 mg/l Verbindung 3 und 100 mg/l Verbindung 4.
Beispiel 7 Isolierung der Verbindungen der Formel II
Die nach Beispiel 6 erhaltene Kulturbrühe (8800 ml) wird mittels Becherzentrifuge (5000 g/10 Minuten) in Überstand (8000 ml) und Biomasse (800 g) getrennt und beide Phasen separat aufgearbeitet.
Dem Überstand werden 160 g makroporöses Acrylamid-Polystyrol Adsorberharz wie XAD 7 zugesetzt. Die Adsorption erfolgt unter leichtem Rühren bei pH 2,5 und Raumtemperatur über 2 Stunden. Das Adsorberharz wird abfiltriert und mit 4 mal 160 ml Methanol eluiert. Die Eluate wurden vereinigt und unter verminderten Druck zur Trockene eingeengt (etwa 50 g öliger Feststoff nach Lyophilisation).
Die Feinreinigung erfolgt mittels präparativer HPLC nach folgendem Verfahren:
Laufmittel A: 800 ml H2O
200 ml Acetonitril
1 ml TFA
Laufmittel B: 1000 ml Acetonitril
0,9 ml TFA
Detektion: 215 nm
Fluß 50 ml/min
Gradient: 0 min: 0% B
60 min: 0% B
133 min: 43% B
134 min.: 100% B
157 min: 100% B
Säulentemperatur: Raumtemperatur
Säule: Kromasil, C18, 7 µm
Länge 350 mm Durchmesser 50 mm
Probe: 5 g Rohprodukt, gelöst in 350 ml Methanol/Wasser (1 : 1).
Aus zwei Läufen wird nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen unter verminderten Druck und Lyophilisation des wäßrigen Rückstandes 20 mg Verbindung 1 und 160 mg Verbindung 3 erhalten.
Die Biomasse (800 g) wird mit n-Propanol 30%ig und 100%ig (insgesamt 1500 ml) extrahiert und der Feststoff mittels Filtration über Filterschichten (K300) abgetrennt. Die Filtrate werden unter verminderten Druck eingeengt und 26,2 g öliger Feststoff erhalten.
Die Feinreinigung erfolgt mittels präparativer HPLC nach folgendem Verfahren:
Laufmittel A: 800 ml H2O
200 ml Acetonitril
1 ml TFA
Laufmittel B: 1000 ml Acetonitril
0,9 ml TFA
Detektion: 215 nm
Fluß: 50 ml/min
Gradient: 0 min: 0% B
34 min: 0% B
121 min: 51% B
122 min: 100% B
148 min: 100% B
Säulentemperatur: Raumtemperatur
Säule: Kromasil, C18, 7 µm
Länge 350 mm Durchmesser 50 mm
Probe: 5 g Rohprodukt, gelöst in 400 ml Methanol/Wasser (1 : 1).
Aus zwei Läufen werden nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen unter verminderten Druck und Lyophilisation des wäßrigen Rückstandes 4 mg Triol (2), 20 mg Verbindung 4 und 80 mg Verbindung 1 erhalten.
Beispiel 8 Charakterisierung der Verbindungen der Formel II
Neben der Charakterisierung mittels UV/VIS Spektroskopie werden die Komponenten durch 1H-NMR und ESI-MS oder FAB-MS charakterisiert.
MS-Daten:
Triol (2): ESI-MS: m/e = 488.4 [M+H]⁺
Verbindung 1: ESI-MS: m/e = 502.3 [M+H]⁺
Verbindung 3: ESI-MS: m/e = 568.3 [M+H]⁺
HR-FAB-MS: m/e = 568.2827 [M+H]⁺
Verbindung 4: ESI-MS: m/e = 552.3 [M+H]⁺
1H-NMR Daten werden in Tabelle 2 dargestellt:
1H-chemische Verschiebungen in DMSO bei 300°K.
Tabelle 2
Beispiel 9 Wirkung auf die Bronchialweite des narkotisierten Meerschweinchens
Die Untersuchungen erfolgten gemäß der Methode von Konzett-Rössler (Arch. exp. Path. U. Pharmak. 195 (71-74) 1940), an männlichen Albino-Meerschweinchen mit einem Körpergewicht von 312-415 g. Die Versuchspräparate wurden in einer Dosis von 10 mg/kg in einer Suspension mit dem Verabreichungsvolumen von 2 ml/kg Körpergewicht appliziert. Nach zwei Vorwerten mit Histamin 20 µg/kg intravenös (i.v.) wurde die Substanz einmalig mittels einer Zwölffingerdarmsonde eingegeben und die Asthmatestung 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, und 240 min nach Präparatgabe wiederholt.
Die Änderungen der Bronchialweite im Vergleich zur Kontrollmessung wurde prozentual angegeben. Pro Dosis wurden 6 Tiere eingesetzt. Die Statistik erfolgte über den t-Test.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 dargestellt.

Claims (8)

1. Verbindung der Formel II,
worin
R1 für -CH2-O-P(O)(OH)2 und R2 für -OH steht oder
R1 für -CH3 und R2 für -O-P(O)(OH)2 steht.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel II,
worin
R1 für -OH oder -CH2-O-P(O)(OH)2 und R2 für -OH steht oder
R1 für -CH3 und R2 für -O-P(O)(OH)2 steht,
dadurch gekennzeichnet, daß α-(p-tertiär-Butylphenyl)-4-(α-hydroxy-α-phenyl­ benzyl)-1-piperidin-butanol mit einem Pilz der Gattung Cunninghamella inkubiert wird.
3. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Trägerstoff.
4. Verwendung von mindestens einer Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von allergischen Erkrankungen, allergischer Rhinitis oder Asthma.
5. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Trägerstoff in eine geeignete Darreichungsform bringt.
6. Verfahren zur Gewinnung der Verbindung der Formel I,
dadurch gekennzeichnet, daß α-(p-tert.-Butylphenyl)-4-(α-hydroxy-α-phenyl­ benzyl)-1-piperidin-butanol mit einem Pilz der Gattung Cunninghamella inkubiert wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Pilz aus der Gruppe Cunninghamella blakesleeana, Cunninghamella elegans und Cunninghamella echinulata, insbesondere Cunninghamella echinulata Variation elegans ATCC 8688a, Cunninghamella echinulata DSM 1905, Cunninghamella elegans DSM 1908 und Cunninghamella echinulata ATCC 9244, eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 2, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß α-(p-tert.-Butylphenyl)-4-(α-hydroxy-α-phenylbenzyl)-1-pipe­ ridin-butanol zu Beginn der Kultivierung des Pilzes der Gattung Cunninghamella oder 24 Stunden nach Beginn zugegeben wird.
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