MXPA98001877A - Procedimiento para la preparacion de acido 4-(4-(4-(hidroxidifenil)-1-piperidinil)-1-hidroxi-butil)-alfa,alfa-dimetilfenil-acetico y sus derivados fosforilados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestoácido 4-(4-(4-(hidroxidifenil)-1-piperidinil)-1-hidroxibutil)-alfa,alfa-dimetilfenil-acético y sus derivados fosforilados se pueden preparar a partir de alfa-(p-t-butilfenil)-4-(alfa-hidroxi-alfa-fenilbencil)-1-piperidina-butanol con ayuda de hongos del género Cunninghamella o Absidia. Los compuestos de la fórmula II, en la que R1 representa -CH2-O-P(O) (OH)2 y R2 representa -OH, R1 representa -CH3 y R2 representa -O-P(O) (OH)2óR1 representa -COOH y R2 representa -O-P(O) (OH)2, son apropiados como medicamentos con efecto antihistamínico.

Description

- i -Procedimiento para la preparación de ácido 4-(4-(4-(hidroxidifen¡l)-1-piperidinil)-1-h¡droxi-butil)-s.s-dimetilfenil-acético y sus derivados fosforilados El invento concierne a un procedimiento microbiano para preparar ácido 4- (4- (4- (hidroxidifenil) -1-piperidinil) -1-hidroxi-butil) -ot, o.-dimetilfenil-acético (compuesto l) y sus derivados fosforilados a partir de - (p-butil terciario-fenil) -4- (a-hidroxi-a-fenil-bencil) -1-piperidina-butano 1 (compuesto 2) , así como a su utilización como medicamento. Además, el invento concierne a un procedimiento microbiano para la fosforilación del compuesto 1. Es sabido que el compuesto 2 es transformado en el compuesto 1 dentro del cuerpo humano (documentos de patente DE-23.03.306, US-4.254.129, US-4.285.957 y DE-30.07.498) . Además, es sabido que la ebastina es oxidada para dar carebastina con ayuda de microorganismos, por ejemplo del género Cunninghamella (documento DE-40.35.218 ,- Schwarz et al . , Appl . Microbiol . Biotechnol . (1996) 44; páginas 731 -735) . Se encontró por fin que hongos de los géneros Cunninghamella o Absidia transforman selectivamente al compuesto 2 en los compuestos de la fórmula I ó II. La oxidación selectiva solamente en el radical de p-butil terciario-fenilo del compuesto 2 para dar el correspondiente grupo carboxilo es sorprendente, puesto que no son oxidados los dos grupos hidroxilo en el compuesto 2, que también se podrían oxidar.

El invento concierne, por lo tanto, a un procedimiento para la obtención del compuesto de la fórmula I, (I) que está caracterizado porque se incuba - (p-terc. -butilfenil) -4- (o;-hidroxi-o;-fenil-bencil) -1-piperidina-butanol con un hongo del género Cunninghamella o Absidia . Preferiblemente, se emplea un hongo tomado del grupo 5 formado por Cunninghamella blakesleeana, Cunninghamella elegans y Cunninghamella echinulata, especialmente ATCC 8688a, DSM 1905, DSM 1908 y ATCC 9244. Además, mutantes y selectantes de los hongos del género Cunninghamella son apropiados para emplearse en el procedimiento conforme al invento, siempre y cuando que conviertan al compuesto 2 en un compuesto de las fórmulas I y/o II. Además, se pueden emplear hongos del género Cunninghamella para la fosforilación del compuesto 1. La solución nutricia contiene fuentes de carbono, tales como sacarosa, almidón de maíz, dextrosa o melaza, y fuentes de nitrógeno, tales como harina de soja, harina de cacahuete, extracto de malta o acetato de amonio. El medio nutricio contiene también sales inorgánicas, tales como hidrogenofosfato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de calcio, sulfato de calcio, carbonato de calcio, sulfato de magnesio o hidrogenofosfato de potasio. Además, se puede añadir al medio nutricio también una grasa, tal como éster metílico de ácido oleico o aceite de soja. Junto a * esto, se añaden también oligoelementos, tales como sales de hierro, manganeso, cobre, zinc, cobalto u otras sales metálicas . La cultivación de los hongos se efectúa a temperaturas comprendidas entre 20 'C y 35 "C, preferiblemente a 28 *C, a valores de pH de 5 a 9, preferiblemente a pH 8. La cultiva- 30 ción se efectúa en condiciones aerobias primero en un matraz con sacudimiento y luego en un fermentador mediando agitación y ventilación con aire u oxígeno puro. La cultivación de los microorganismos en los fermentadores se efectúa a lo largo de un período de tiempo de 48 a 240 horas, preferiblemente de 70 a 110 horas. La adición del compuesto 2 se efectúa directamente al comienzo de la cultivación, pero puede efectuarse también posteriormente, con preferencia después de aproximadamente 48 horas. La adición del compuesto 2 se efectúa como sustancia sólida, como suspensión o en solución. Disolventes apropiados son etanol, dimetilformamida (DMF) , pero también dimetilsulfóxido (DMSO) , dimetilacetamida (DMA) , dimetoxietano (DME) , tetrahidrofurano (THF) , así como dibutil-, diisopropil- y dietil-formamida, 1-metil-, 1-etil- y l-ciclohexil-pirrolidona, 4-formil-morfolina, l-formil- piperidina, 1-formil-pirrolidina, tetrametil-, tetraetil- y tetrabutil-urea, óxidos de tripiperidino- y tripirrolidino- fosfina, sulfolano o N-metil-caprolactama o mezclas de los mencionados disolventes . También se pueden añadir solubilizantes, tales como ®Tween 80 o dodecilsulfato de 'sodio. 15 El aislamiento del compuesto 1 se efectúa directamente a partir de la solución nutricia o después de haber separado las células, por ejemplo mediante centrifugación o filtración. El aislamiento del compuesto 1 puede efectuarse por extracción con disolventes o por adsorción en resinas hidrófobas, tales como XAD 16, HP 20 o intercambiadores de iones . El invento concierne además a un procedimiento para la preparación de un compuesto de la fórmula II, en la que R1 representa -OH ó -CH2-0-P(0) (OH) 2 y R2 representa -OH, R1 representa -CH3 y R2 representa -O-P(O) (OH) 2 ó R2 representa -O-P(O) (OH) 2 y R1 representa -C(0)OH, caracterizado porque el ot- (p-tere . -butil-fenil) -4- (cu-hidroxi-x-fenil-bencil) -1-piperidina-butanol o eventualmente el ácido 4- (4- (4- (hidroxidifenil) -1-piperidinil) -1-hidroxi-butil) -a, o?-dimetil-acético se incuba con un hongo del género Cunninghamella o Absidia . La reacción se efectúa esencialmente como en el procedimiento para la preparación del compuesto de la fórmula I. Para la preparación del compuesto de la fórmula II, en la que R1 representa -COOH y R2 representa -0-P(0) (0H)2, se emplea preferiblemente el compuesto 1 como substrato de la reacción . El invento concierne además a nuevos compuestos de la fórmula II, en la que R1 representa -CH2-0-P(0) (0H)2 y R2 representa -OH (compuesto 3) R1 representa -CH3 y R2 representa -O-P (O) (OH)2 (compuesto 4) ó R2 representa -O-P (O) (OH)2 y R1 representa -COOH. Además, el invento concierne a un procedimiento para la preparación del compuesto de la fórmula II, en la que R1 representa -OH y R2 representa -OH (triol) , que está caracte-rizado porque se incuba o¿- (p-terc. -butil-fenil) -4- (a-hidroxir-c¿-fenil-bencil) -1-piperidina-butanol con un hongo del género Cunninghamella o Absidia . El invento concierne también a medicamentos, caracterizados por un contenido eficaz de por lo menos un compuesto de la fórmula II y/o de una sal fisiológicamente compatible del compuesto de la fórmula II, junto con un material de vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible.

El invento abarca también sales farmacéuticamente compatibles del compuesto de la fórmula II. Las sales por adición de ácidos farmacéuticamente compatibles de compuestos conformes al invento son las formadas con ácidos inorgánicos u orgánicos apropiados . Ácidos inorgánicos apropiados son por ^^ ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico. A los ácidos orgánicos apropiados pertenecen ácidos carboxílicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido 5 pirúvico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido ciclamé- nico, ácido ascórbico, ácido hidroximaleico, ácido dihidroxi- maleico, ácido benzoico, ácido fenilacético, ácido 4-amino- benzoico, ácido 4-hidroxi-benzoico, ácido antranílico, ácido cinámico, ácido salicílico, ácido 4-amino-salicílico, ácido 2-fenoxi-benzoico, ácido 2-acetoxi-benzoico y ácido mandélico, ácidos sulfónicos tales como ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico y ácido /3-hidroxi-etanosulfónico. También las sales no tóxicas de los compuestos de las anteriores fórmulas con bases inorgánicas u orgánicas entran dentro del marco del invento. A éstas pertenecen por ejemplo las sales con metales alcalinos, tales como sodio, potasio y litio, con metales alcalino-térreos, tales como calcio y magnesio, metales ligeros del Grupo IIIA, tales como aluminio, con aminas orgánicas tales como aminas primarias, secundarias y terciarias, por ejemplo ciclohexilamina, etílamina, piridina, metilaminoetanol y piperazina. , Las sales son formadas de manera convencional, por ejemplo haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula II con el correspondiente ácido o # 25 base. A causa de las propiedades farmacológicas, los compuestos conformes al invento de la fórmula II son apropiados como agentes antihistamínicos, antialergénicos y broncodilatadores . 30 Los compuestos conformes al invento de la fórmula II son apropiados para el tratamiento de rinitis alérgica, asma u otras enfermedades alérgicas . Los compuestos conformes al invento de la fórmula II se pueden administrar por las vías oral, parenteral, por ejemplo subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por introducción intranasal o aplicación sobre mucosas, por ejemplo de la nariz, de la faringe o del tracto bronquial, por ejemplo en forma de una rociada de aerosol, que contiene pequeñas partículas de un compuesto conforme al invento en forma de neblina o polvo. Las cantidades de los compuestos que se han de adminis-trar dependen del paciente y del modo de administración. La cantidad que se ha de administrar puede fluctuar dentro de un amplio margen, de tal manera que resulten unidades de dosis con una cantidad eficaz de aproximadamente 0,01 a 20 mg/kg de peso corporal/día para conseguir el efecto deseado. Por ejemplo, el deseado efecto antihistamínico, antialergénico o broncodilatador se puede conseguir mediante ingestión de una unidad de dosis, tal como por ejemplo de una tableta con 5 a 300 mg del compuesto conforme al invento, preferiblemente con 10 a 200 mg, que se toma de 1 a 4 veces por día. El invento concierne también a un procedimiento para la preparación de un medicamento, que está caracterizado porque se lleva a una forma de administración apropiada por lo menos a un compuesto de la fórmula II con un vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible y eventualmente otras sustancias activas, aditivas o coadyuvantes. Apropiadas formas sólidas o galénicas de preparados son por ejemplo granulados, polvos, grageas, tabletae, (micro) -cápsulas, supositorios, jarabes, zumos, suspensiones, emulsiones, gotas o soluciones inyectables, así como prepara-dos con liberación retardada de la sustancia activa, en cuya preparación encuentran utilización agentes coadyuvantes usuales, tales como materiales de vehículo, y agentes disgregantes, aglutinantes, de revestimiento, de hinchamiento, de deslizamiento o lubricantes, sustancias saboreantes, agentes edulcorantes y solubilizantes . Como materiales coadyuvantes frecuentemente utilizados se citarán carbonato de magnesio, dióxido de titanio, lactosa, manita y otros azúcares, talco, albúmina láctea, gelatina, almidón, celulosa y sus derivados, aceites animales y vegetales tales como aceite de hígado de bacalao, aceite de girasol, cacahuete o sésamo, polietilenglicol y disolventes, tales como por ejemplo agua estéril y alcoholes uni- o pluri-valentes, tales i - como glicerol . Los compuestos conformes al invento de la fórmula II se pueden administrar también como soluciones o suspensiones inyectables en un agente diluyente fisiológicamente compati- 5 ble con un vehículo farmacéutico, que es un líquido estéril tal como agua o un aceite, pudiéndose añadir agentes coadyuvantes tensioactivos y de otros tipos farmacéuticamente admisibles. Ejemplos de aceites apropiados son los de origen del petróleo, animales, vegetales o sintéticos, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja o un aceite mineral. Por lo general, se prefieren agua, una solución de cloruro de sodio, una solución acuosa de dextrosa o similares soluciones W.!--* de azúcares y glicoles, tales como propilenglicol o polietilenglicol como vehículos líquidos, especialmente para soluciones inyectables. Para su utilización como aerosoles, los compuestos conformes al invento son puestos bajo presión en solución o suspensión dentro de un recipiente para aerosoles, en común con agentes propulsores apropiados, por ejemplo agentes propulsores hidrocarbonados tales como propano, butano o isobutano o bien dióxido de carbono o nitrógeno u otros agentes propulsores ecológicamente admisibles y materiales coadyuvantes usuales. Los compuestos se pueden administrar también a partir de una forma sin presión, por ejemplo con * 25 aparatos nebulizadores. Para la administración entran en cuestión animales homeotermos, aves, mamíferos, por ejemplo seres humanos, gatos, perros, caballos, ovejas, toros, vacas, cerdos, corderos , ratas , ratones y cobayas . 30 E j emplo 1 Cultivación de cepas Se siembran 100 µl de una suspensión de esporas de las cepas de Cunninghamella, Cunninghamella blakesleeana FH 001 , Cunninghamella blakesleeana FH 002, Cunninghamella blakesleeana FH 003, Cunninghamella ech±nulata DSM 1905, Cunninghamella echinulata variante elegans ATCC 8688a, Cuninghamella elegans DSM 1908 y Cunninghamella echinulata variante echinulata ATCC 9244 , sobre una placa de agar (20 g/1 de extracto de malta, 2 g/1 de peptona y 20 g/1 de agar, pH 6,5) y se incuban durante 72 h a 28 *C. A continuación, se puede almacenar la placa durante al menos ocho semanas a 4°C. Alternativamente, las cepas se pueden cultivar en condiciones sumergidas en el mismo medio sin adición de agar. Después de cultivar durante 72 h a 28 *C, se mezcla el cultivo con 20 % de glicerol y la suspensión se almacena a aproxima¬ damente —120 °C sobre nitrógeno líquido.

Ejemplo 2 Analítica por cromatografía de líquido a alta presión (HPLC) Preparación de las muestras: Diluir el caldo de cultivo a 1:1 con metanol y agitar la suspensión durante 30 minutos. Separar la fase transparente por centrifugación. 20 Eluyente A: 900 ml de H20 100 ml de acetonitrilo 1 ml de ácido trifluoroacético (TFA) Eluyente B : 900 ml de acetonitrilo * 25 100 ml de H20 1 ml de TFA Detección 215 nm Caudal : 1 ml/min Gradiente 0 min 50 % de B 30 10 min 80 % de B 15 min 80 % de B 16 min 50 % de B 21 min 50 % de B Temperatura de la columna: 55'C 35 Columna : Merck RP 18 5 µm Licrospher 100 longitud 25 cm, diámetro 4 mm Tiempos de retención: compuesto 1 5.4 minutos (min) compuesto 2 9 min triol 5 , 7 min compuesto 3 3.5 min compuesto 4 6, 9 min Ejemplo 3 Escrutinio con cepas de Cunninghamella Se inoculan 100 ml de un medio de escrutinio (5 g/1 de 10 peptona de soja, 5 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de NaCl, 5 g/l de K2HP04 , 3 g/1 de agar y 20 g/1 de glucosa / tratados en autoclave por separado, pH 5,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 1.000 ml) con un trozo de agar de una de las cepas citadas en el Ejemplo 1. La cultivación 15 se efectúa primero durante 48 h a 28 °C y a 180 revoluciones por minuto (rpm) en un máquina sacudidora rotatoria. Después de este período de tiempo, se efectúa la adición de 20 mg del compuesto 2 disueltos en 100 µl de DMF o etanol. Después de 72 horas (h) o, a elección, en un momento anterior, se retira 20 una parte alícuota del cultivo y se mezcla con 50 % de metanol. La suspensión obtenida se suspende con un Ultra- Turrax durante 30 segundos y la suspensión se centrifuga seguidamente a 10.000 xg. El material sobrenadante transparente obtenido se analiza luego mediante HPLC (véase el Ejemplo 2) . En los caldos de cultivo de todas las cepas se pudo detectar, después de un tiempo de incubación de 72 h, el compuesto 1 en una concentración de hasta 5 mg/l.

Ejemplo 4 Producción del compuesto 1 a escala de matraces con diversas cepas de Cunninghamella Se inoculan 100 ml de medio de precultivo (5 g/1 de peptona de soja, 5 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de NaCl, 5 g/1 de K2HP04, 3 g/1 de agar y 20 g/1 de glucosa / tratados en autoclave por separado, pH 5,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 1.000 ml) con un trozo de agar, sobre el que ha crecido en cada caso una de las cepas mencionadas en el Ejemplo 1. La cultivación se efectúa durante 48 h a 28 "C y 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. Se inoculan 100 ml de un medio de producción (5 5 g/1 de peptona de soja, 10 g/1 de líquido de maceración de maíz, 20 g/1 de glucosa, 5 g/1 de NaCl, 1 g/1 de K2HP04, 3 g/1 de agar, 25,1 g/1 de ácido 2- ( [hidroxi-1, 1-bis- (hidroximetil) etil] -amino) etanosulfónico (TES) (sal de sodio), 100 µl de Desmophen, pH 8,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 500 ml) con 10 ml del precultivo antes descrito. La cultivación se efectúa primero durante 48 h a 28'C y 180 f rpm en una máquina sacudidora rotatoria. Después de este período de tiempo se efectúa la adición de 20 mg del compuesto 1, disueltos en 100 µl de DMF. Después de 72 h, se retira una parte alícuota del cultivo y se mezcla con 50 % de metanol. La suspensión obtenida se suspende con un Ultra- Turrax durante 30 segundos y la suspensión se centrifuga a continuación a 10.000 xg. El material sobrenadante transparente obtenido se analiza luego mediante HPLC (Ejemplo 2) .

El análisis proporciona los rendimientos recopilados en la Tabla 1; se encuentran los siguientes compuestos: el compuesto i es el compuesto de la fórmula I; * 25 el compuesto 2 es el compuesto de la fórmula II, en la que R1 representa -CH3 y R2 representa -OH; el compuesto 3 es el compuesto de la fórmula II, en la que R1 representa -CH2-0P(0) (OH) 2 y R2 representa -OH; 30 el compuesto 4 es el compuesto de la fórmula II, en la que R1 representa -CH3 y R2 representa -O-P (O) (OH) 2 y el triol es el compuesto de la fórmula II, en la que 35 R1 representa -OH y R2 representa -OH.

Tabla 1 Ejemplo 5 Preparación mejorada del compuesto 1 a escala de matraces con Cunninghamella echinulata variante elegans ATCC 8688a Se inoculan 100 ml de un medio de precultivo (5 g/1 de peptona de soja, 5 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de NaCl, 5 g/1 de K2HP04, 3 g/1 de agar y 20 g/1 de glucosa (tratados en autoclave por separado), pH 5,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 1.000 ml) con un trozo de agar, sobre el que ha crecido en cada caso una de las cepas citadas en el Ejemplo 1. La cultivación se efectúa durante 48 h a 28 'C y a 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. Se inoculan 100 ml de un medio de producción (5 g/1 de peptona de soja, 5 g/1 de peptona de caseína, 20 g/1 de almidón soluble, 5 g/1 de NaCl, 1 g/1 de 2HP04, 1 g/1 de NH4(S04)2, 3 g/1 de agar, 25,1 g/1 de TES (sal de sodio), 100 µl de Desmophen, pH 8,0, en un matraz Erlenmeyer con un volumen de 500 mi) con 10 ml del precultivo descrito precedentemente. La cultivación se efectúa primero durante 24 h a 28 'C y 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. 30 Después de este período de tiempo se efectúa la adición de 20 mg del compuesto 2, disueltos en 800 µl de etanol. Después de 72 h, se retira una parte alícuota del cultivo y se mezcla con 50 % de metanol. La suspensión obtenida se- suspende con un Ultra-Turrax durante 30 segundos y la suspensión se centrifuga a continuación a 10.000 xg. El material sobrenadante transparente obtenido se analiza luego mediante HPLC (Ejemplo 2) . El análisis arrojó un rendimiento de 145 mg/l del compuesto 1, 6,5 mg/l del triol (2), 22 mg/l del compuesto 3 y 5 mg/l del compuesto 4.

Ejemplo 6 Producción de compuestos de la fórmula II en un fermentador de 10 1 de capacidad Se inoculan 100 ml de un medio de precultivo (5 g/1 de peptona de soja, 5 g/1 de extracto de levadura, 5 g/1 de NaCl, 5 g/1 de K2HP04, 3 g/1 de agar y 20 g/1 de glucosa / tratados en autoclave por separado), pH 5,0, en un matraz de Erlenmeyer con un volumen de 1.000 ml) con un trozo de agar de la cepa Cunninghamella echinulata Var. elegans ATCC 8688a. La cultivación se efectúa durante 48 h a 28 ßC y a 180 rpm en una máquina sacudidora rotatoria. Se inoculan 10 1 de un medio de producción (5 g/1 de peptona de soja, 5 g/1 de extracto de soja, 20 g/1 de glucosa (tratada en autoclave por separado), 5 g/1 de NaCl, 1 g/1 de K2HP04, 100 µl de Desmophen, pH 5,0) con 100 ml del precultivo descrito precedentemente. A continuación, se añade a ello el compuesto 2, de manera que se consigue una concentración final en el fermentador de 200 mg/l del medio de producción. La fermentación se efectúa a 28 °C, 700 rpm y 0,5 wm a lo largo de 96 horas. Según el análisis por HPLC, el caldo de cultivo contiene aproximadamente 10 mg/l del compuesto l, 10 mg/l del triol (2), 100 mg/l del compuesto 3 y 100 mg/l del compuesto 4.

Ejemplo 7 Aislamiento de los compuestos de la fórmula II El caldo de cultivo obtenido según el Ejemplo 6 (8.800 ml) se separa, mediante una centrífuga de vasos (5.000 g/10 minutos), en material sobrenadante (8.000 ml) y biomasa (800 g) y las dos fases se tratan por separado. Al material sobrenadante se le añaden 160 g de una resina adsorbente macroporosa de acrilamida y poliestireno, tal como XAD 7. La adsorción se efectúa con ligera agitación al pH 2,5 y a temperatura ambiente durante 2 horas. La resina adsorbente se separa por filtración y se eluye 4 veces con 160 ml de metanol. Los materiales eluídos se reunieron y concentraron hasta sequedad bajo presión reducida (aproximadamente 50 g de un material sólido oleoso después de liofilización) . La purificación fina se efectúa mediante una HPLC preparativa según el siguiente procedimiento: Eluyente A: 800 ml de H20 200 ml de acetonitrilo 1 ml de TFA Eluyente B: 1.000 ml de acetonitrilo 0, 9 ml de TFA Detección: 215 nm Caudal : 50 ml/min Gradiente : 0 min 0 % de B 60 min 0 % de B 133 min 43 % de B 134 min 100 % de B 157 min 100 % de B Temperatura de la columna: temperatura ambiente Columna: Kromasil, C18, 7 µm longitud 350 mm, diámetro 50 mm Muestra: 5 g de un producto bruto, disueltos en 350 ml de metanol/agua (1:1) A partir de dos pasadas después de haber reunido las correspondientes fracciones, concentrado bajo presión reducida y liofilizado el residuo acuoso, se obtienen 20 mg del compuesto 1 y 160 mg del compuesto 3. La biomasa (800 g) se extrae con n-propanol al 30 % y al 100 % (en total 1.500 ml) y se separa el material sólido mediante filtración a través de capas de filtros (000) . Los materiales filtrados se concentran bajo presión reducida y se obtienen 26,2 g de un material sólido oleoso.

La purificación fina se efectúa mediante una HPLC preparativa según el siguiente procedimiento: Eluyente A: 800 ml de H20 200 ml de acetonitrilo 1 ml de TFA Eluyente B: 1.000 ml de acetonitrilo 0, 9 ml de TFA Detección: 215 nm 10 Caudal : 50 ml/min Gradiente: 0 min 0 de B 34 min 0 de B 121 min 51 de B 148 min 100 de B 15 Temperatura de la columna: temperatura ambiente Columna : Kromasil , C18, 7 µm longitud 350 mm, diámetro 50 mm Muestra: 5 g de producto bruto, disueltos en 400 ml de metanol/agua (1:1) 20 A partir de dos pasadas, después de haber reunido las correspondientes fracciones, concentrado bajo presión reducida y liofilizado el residuo acuoso, se obtienen 4 mg del triol (2), 20 mg del compuesto 4 y 80 mg del compuesto 1.

Ejemplo 8 Caracterización de los compuestos de la fórmula II Junto a la caracterización mediante espectroscopia de UV/VIS, los componentes son caracterizados por -"-H-RMN así como por ESI-EM o FAB-EM. Datos de EM (espectro de masas) : triol (2) ESI-EM: m/e = 488,4 [M+H] + compuesto 1 ESI-EM: m/e = 502,3 [M+H] + compuesto 3 ESI-EM: m/e = 568,3 [M+H] + 35 HR-FAB-EM: m/e = 568,2827 [M+H] + compuesto 4 ESI-EM: m/e = 552,3 [M+H] + Los datos de 1H-RMN se representan en la Tabla 2 : Desviaciones químicas de -"-H en DMSO a 300"K Tabla 2: Ejemplo 9 Efecto sobre la amplitud bronquial de un cobaya narcotizado Las investigaciones se efectuaron según el método de Konzett-Róssler (Arch. exp. Path . U. Pharmak. 195 (71 -74) 1940) en cobayas albinos machos, con un peso corporal de 312-415 g. Los preparados experimentales se aplicaron en una dosis de 10 mg/kg en una suspensión con el volumen de administración de 2 ml/kg de peso corporal. Después de obtener dos valores previos con 20 µg/kg de histamina por vía intravenosa (i. v. ) , se introdujo la sustancia de una vez mediante una sonda para el duodeno y se repitió el ensayo del asma a los 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 y 240 min después de la administración del preparado. Las modificaciones de la amplitud bronquial en comparación con la medición de control se indicó porcentualmente. Por cada dosis se emplearon 6 animales . La estadística se efectuó a través del ensayo t .

Los resultados se representan en la Tabla 3. « Tf la ß: Dosis = 10 mg/kg por vía intraduodenal N = 6/dosis * = suspensión; convertido por cálculo con respecto a la sustancia activa El compuesto 3 alcanzó se efecto máximo con la máxima rapidez (60 min después de la aplicación (p.a) ) y el efecto duró, casi sin disminuir, hasta 240 min. p.a., el compuesto 4 presentó un comienzo más lento del efecto (aproximadamente 150 p.a.), la Terfenadina presentó un valor máximo del efecto después de 150 min. p.a. y un comienzo del efecto después de 60 min. p.a.. Después de 60 min. p.a., los compuestos 3 y 4 son de reacción más rápida y más intensa que la Terfenadina.

Claims (1)

1. * Reivindicaciones 1.- Compuesto de la fórmula II, 15 en la que R1 representa -OH ó -CH2-0-P(0) (OH)2 y R2 representa -OH R representa -CH3 y R2 representa -O-P (O) (OH)2 ó 20 R2 representa -O-P (O) (OH) 2 y R1 representa -COOH. 2. - Procedimiento para la preparación del compuesto de la fórmula II, - 35 w en la que R1 representa -OH ó -CH2-0-P(0) (OH) 2 y R2 representa -OH, R1 representa -CH3 y R2 representa -O-P (O) (OH) 2 ó R2 representa -O-P (O) (OH) 2 y R1 representa -C(0)OH, caracterizado porque el c¿- (p-terc. -butil-fenil) -4- (a-hidroxi- -fenil-bencil) -1-piperidina-butanol o eventualmente el ácido 4- (4- (4- (hidroxidifenil) -1-piperidinil) -1-hidroxi-butil) -c¿, c¿- dimetil-acético se incuba con un hongo del género Cunninghamella o Absidia . 10 3.- Medicamento, caracterizado por un contenido activo en por lo menos un compuesto de la fórmula II según la reivindicación 1 en común con un vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible. 4. - Utilización de por lo menos un compuesto de la 15 fórmula II según la reivindicación 1 para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento de enfermedades alérgicas, rinitis alérgica o asma. 5.- Procedimiento para la preparación de un medicamento según la reivindicación 3 , caracterizado porque se llevan por 20 lo menos un compuesto según la reivindicación l y un vehículo farmacéuticamente apropiado y fisiológicamente compatible a una forma de presentación apropiada. 6. - Procedimiento para la obtención del compuesto de la fórmula I, 25 caracterizado porque se incuba c¿- (p-terc . -butilfenil) -4- (a- hidroxi-a-fenilbencil) -1-piperidina-butanol con un hongo del género Cunninghamella o Absidia . 1 . - Procedimiento según la reivindicación 6, caracteri- 5 zado porque se emplea un hongo tomado del grupo que consta de Cunninghamella blakesleeana, Cunninghamella elegans y Cunninghamella echinulata, especialmente Cunninghamella echinulata DSM 1905, Cunninghamella elegans DSM 1908 y Cunninghamella echinulata ATCC 9244. 10 8.- Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 2, 6 ó 7, caracterizado porque se añade a- (p-terc. - butilfenil) -4- (a--hidroxi-o.-fenilbencil) -1-piperidina-butanol al comienzo de la cultivación del hongo del género Cunninghamella o 24 horas después de este comienzo.