KR100186706B1 - 프라바스타틴 나트륨의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프라바스타틴 나트륨의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 미생물 배양액에 프라바스타틴 전구체인 다음 화학식 1의 (I) 또는 (II) 화합물을 첨가·배양하여 화합물(III)의 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 데 있어서 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주를 사용함으로써 균주의 효소적 하이드록실화 반응을 이용하여 종래 균주에 비하여 생산성이 높게 고지혈증 치료제로 유용한 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기식에서 R은 카르복실기 또는 Na원자로 치환된 카르복실기이다.

Description

프라바스타틴 나트륨의 제조방법

본 발명은 프라바스타틴 나트륨의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 미생물 배양액에 프라바스타틴 전구체인 다음 화학식 1의 (I) 또는 (II) 화합물을 첨가·배양하여 화합물(III)의 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 데 있어서 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주를 사용함으로써 균주의 효소적 하이드록실화 반응을 이용하여 종래 균주에 비하여 생산성이 높게 고지혈증 치료제로 유용한 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기식에서 R은 카르복실기 또는 Na원자로 치환된 카르복실기이다.

고지혈증(Hyperlipemia)이란 혈액중의 지질이 증가한 상태를 말하는데, 혈액중에는 콜레스테롤, 트리글리세라이드(중성지방), 인지질 및 유리지방산 등 4종류의 지질이 있다. 이중, 실제 임상학적으로 문제가 되는 것은 콜레스테롤이 증가한 경우, 트리글리세라이드가 증가한 경우 및 양쪽 모두가 증가한 경우인데 이들 3가지 상태를 일반적으로 고지혈증이라 한다.

고지혈증 판단은 공복시 혈청 콜레스테롤이 220 mg/㎗ 이상, 트리글리세라이드가 150 mg/㎗ 이상, HDL-콜레스테롤이 40 mg/㎗ 이하일 경우를 고지혈증인 것으로 판단한다.

한편, 콜레스테롤과 병의 발병과의 관계에서 LDL-콜레스테롤치를 1% 낮추면 발병율을 2% 정도 억제할 수 있다. 또한 HDL-콜레스테롤을 1 mg/㎗ 작용시키지 않으면 발병율을 3% 정도로 감소시킬 수 있음을 증명하였다(Castelli, JAMA 256 : 2835, 1986). 이같은 결과로부터 고지혈증 치료를 하면 반드시 동맥경화의 최종 치료 효과가 있음을 알 수 있다.

일반적으로 포화지방산의 섭취가 적고 혈청 콜레스테롤치가 낮으면 허혈성 심질환자의 발생이 적게되는데 근래들어 우리나라에서는 식생활이나 도시생활이 급속하게 서구화되어 혈청 콜레스테롤을 상승, 허혈성심질환이 급속하게 증가 추세에 있다.

이에따라 콜레스테롤치를 감소시킬 수 있는 약제 개발이 진행되고 있으며, 이중 프라바스타틴 나트륨(Pravastatin Sodium)은 콜레스테롤 생합성 과정에서 하이드록실메틸글르타릴 Co-A(이하, HMG Co-A) 효소의 생성을 저해하여 콜레스테롤 생성을 억제하는 역할을하여 고지혈증의 치료에 유용하다.

지금까지의 프라바스타틴 나트륨은 미생물 배양액에 상기 화학식 1의 (I) 또는 (II)로 나타내어지는 전구체를 첨가하여 배양함으로써 제조되는 바, 이때 미생물로는 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces rhoseochromogenes) NRRL-1233, 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces rhoseochromogenes) IFO-3363 또는 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces rhoseochromogenes) IFO-3411을 사용하였다(미국특허 제 4,346,227 호).

그러나, 상기와 같은 미생물의 배양액내에서 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 경우 특히, 상기 화학식 1의 (I) 및 (II) 화합물에 대해 생육저해를 받기 때문에 저농도로 상기 화학식 1의 (I) 및 (II)를 첨가하여야 하며, 이로인해 생산성이 떨어지는 문제가 있었다.

본 발명은 상기와 같은 종래 프라바스타틴 나트륨의 제조방법의 문제점을 해결하기 위하여 상기 화학식 1의 (I) 또는 (II) 화합물에 대한 높은 내성을 갖는 균주로서 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 미생물 배양액에 상기 화학식 1의 (I) 또는 (II)로 나타내어지는 프라바스타틴 전구체를 첨가하여 배양함으로써 종래 균주에 비하여 높은 생산성으로 고지혈증 치료제인 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

도 1은 본발명에 따른 프라바스타틴 나트륨의 적외선 흡수 스펙트럼이고,

도 2는 본발명에 따른 프라바스타틴 나트륨의 13C-NMR 스펙트럼이며,

도 3은 본발명에 따른 프라바스타틴 나트륨의 NMR 스펙트럼(DEPT)이다.

본 발명은 미생물 배양액에 상기 화학식 1의 (I) 또는 (II)로 나타내어지는 프라바스타틴 전구체를 첨가하고 배양하여 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법에 있어서, 상기 미생물로는 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주를 사용하는 것을 그 특징으로 한다.

이와같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 상기 화학식 1의 (I) 또는 (II) 화합물로부터 미생물 또는 미생물 추출물에 의한 효소적 하이드록실화 반응에 의해서 고지혈증 치료제인 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 통상의 미생물 배양을 이용한 프라바스타틴 나트륨의 제조와 동일한 조건하에서 프라바스타틴 나트륨을 제조하는데, 본 발명에서 사용한 미생물은 공지된 것으로서 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주를 사용한다.

상기한 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주는 유전자원센타로부터 분양받은 균주이다.

이같은 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주는 일반적으로 알보사이클린(Albocycline)을 생산하는 데 적용되어 왔으며, 모노타입(monotype) 특성을 갖는 것으로 알려져 있다(참고문헌 :J. Antibiot 21;85(1968)).

프라바스타틴을 생산하는 상기의 미생물을 생물공학적으로 돌연변이 등에 의해 형질변환시켜 목적화합물을 제조할 수 있으며, 플라스미드 유전자 조작 등을 본 발명에 사용할 수 있다.

이와같은 미생물을 프라바스타틴 나트륨의 제조에 적용한 예는 없으며, 이를 이용하여 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 경우 고농도 기질을 첨가할 수 있으며, 부산물 생성이 적은 잇점이 있다.

상기 미생물을 이용하여 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법은 우선, 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주를 포도당, 효모추출물, 맥아추출물, 옥수수 침지액 및 탄산칼슘을 함유하는 제 1 배지에 접종한 다음 이를 2∼3일 동안 진탕배양한 후, 이를 포도당, 효모추출물, CSL 및 탈지대두박을 함유하는 제 2 배지배양액에 접종하여 다시 진탕배양한다.

이때, 제 1 배지의 조성 및 제 2 배지의 조성은 다음과 같다.

배지(1) : 포도당 0.5∼4.0%, 효모추출물 1.0∼3.0%, 맥아추출물 3.0∼7.0% 옥수수 침지액 0.5∼3.0% , 탄산칼슘 0.1∼0.3%

배지(2) : 포도당 0.2∼0.7%, 효모추출물 0.1∼0.5%, 옥수수 침지액 0.1∼0.5% , 탈지대두박 0.5∼3.0%

그 다음 여기에, 상기 화학식 1의 (I) 또는 (II)의 전구체를 0.02∼0.03% 씩 최종농도가 0.08∼0.12% 될때까지 첨가하고 이를 27 ℃에서 진탕배양한다.

그리고 나서, 배양액 중에서 프라바스타틴 나트륨을 분리 정제하는데, 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 흡착수지에 흡착시킨 컬럼에서 증류수로 세척한다. 세척이 완료된 후 흡착된 프라바스타틴 나트륨을 유기용매를 이용하여 용출시키고, 얻어진 용출액을 액체 크로마토그라피법을 반복 수행하여 정제하여 프라바스타틴 나트륨을 얻는다.

상기한 바와 같이 제 2 배지에 프라바스타틴 전구체를 첨가한 후 2∼3일째에 포도당을 첨가하는 것은 포도당이 하이드록실 반응의 에너지원 및 촉매작용을 하기 때문이다.

한편, 본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 프라바스타틴 전구체를 첨가하고 진탕배양하여 2∼3일 후에 포도당을 0.3∼0.5%, 바람직하기로는 0.5∼1.0% 첨가할 수도 있는데, 이는 균체 생육 및 효소반응 에너지원으로서 생산성을 향상시키는데 있어서 바람직하다.

이와같은 방법으로 제조된 프라바스타틴 나트륨은 종래의 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces rhoseochromogenes) NRRL-1233, 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces rhoseochromogenes) IFO-3363 또는 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces rhoseochromogenes) IFO-3411 보다 기질첨가 농도 및 생산성이 높다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 상세히 설명하면 다음과 같은바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes Subsp.) KCCM 12385 균체를 아래와 같은 조성을 갖는 배지(1) 20 ㎖를 각각 포함하는 120 ㎖용 삼각 플라스크에 접종하였다. 그 다음, 접종한 삼각플라스크를 27℃, 200 rpm으로하여 2일간 진탕 배양시킨후 다음과 같은 조성을 갖는 배지(2) 400 ㎖를 각각 포함하는 2 ℓ 용 배플플라스크(baffled flask) 5개에 20 ㎖씩 접종하여 27 ℃, 150 rpm으로 1일간 진탕 배양시켰다. 1일간 배양후 상기 화학식 1의 (I) 화합물을 0.03 % w/v 하루 간격으로 첨가하여 최종농도가 0.12 % W/V될 때까지 각각의 플라스크에 첨가하였다. 그리고 계속해서 27 ℃에서 150 rpm으로 6일간 진탕배양시켰다. 배양 종료후 배양액을 pH 8.0∼11.0, 바람직하기로는 pH 8.5∼9.5로 조절하여 실온에서 1시간∼1일간, 바람직하기는 1∼4시간 교반한후 원심분리하여 균체를 제거하였으며, 상등액을 HP-20(삼양사 제품)수지에 흡착시킨 컬럼을 pH 7.0∼8.0으로 조절한 증류수로 충분히 세척하였다. 세척이 끝난후에 흡착된 프라바스타틴 나트륨염을 50 % v/v 수성 아세톤 또는 50 % v/v 수성 에탄올, 바람직하기는 50% v/v 수성 에탄올로서 용출시켜 프라바스타틴 나트륨염을 함유한 분획을 얻었다. 이 분획을 감압농축한후 얻어진 생성물을 분취용 액체 크로마토그래피(컬럼 : Symmatric C18, 50 % v/v 수성 에탄올, 1 ㎖/min)를 반복 수행하여 정제하여 프라바스타틴 나트륨 600 mg을 얻었다.

배지(1):pH 7.2로 보정

포도당 2.0% 효모추출물 2.0%

맥아추출물 5.0% 옥수수 침지액 2.0%

탄산칼슘 0.2%

배지(2) : pH 7.2로 보정

포도당 1.0 효모추출물 0.2%

옥수수 침지액 0.3% 탈지대두박 1.5%

실시예 2

상기 실시예 1과 같은 방법으로 프라바스타틴 나트륨을 제조하되, 다만 상기 미생물 배양액에상기 화학식 1의 (II) 화합물을 첨가하여 진탕배양한 지 2일후 포도당 0.7 %(W/V)를 각각의 플라스크에 첨가하여 3일간 계속 진탕 배양시켰다. 배양 완료후 배양액으로부터 정제된 프라바스타틴 나트륨 800 mg을 얻었다.

비교예 : 미국특허 제 4,346,227 호

스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces rhoseochromogenes) NRRL 1233을 사용하여 포도당 2.0%, 옥수수 침지액 0.2%, K2HPO4 0.15%, 효모추출물 0.1%, MgSO4·7H2O 0.15%, ZnSO4·7H2O 0.001%, NH4NO3 0.1%, 펩톤 0.1%, 수도물 잔액(pH7.0으로 조절)의 배지 100 ㎖를 각각 포함하는 500 용 플라스크 20개에 접종시켰다.

플라스크를 26 ℃, 120 spm으로하여 2일간 진탕배양시켰다. 2일 배양 끝무렵에 ML-236B의 나트륨을 최종농도가 0.05 w/v%될때까지 각각의 플라스크에 첨가하였다. 26 ℃, 120 spm으로하여 5일간 더 배양을 계속하였다. 배양이 완료된 후 상기 실시예 1과 같은 방법으로 정제하여 최종적으로 프라바스타틴 나트륨 120 mg을 얻었다.

상기 실시예에서의 기질농도는 0.08∼0.12%인 반면 비교예의 경우는 0.05%이고, 프라바스타틴 나트륨 생산량은 본 발명의 경우 300∼400 mg이고 비교예의 경우는 60 mg이다.

실험예

상기 실시예 1 및 비교예에 따라 제조된 프라바스타틴 나트륨에 대하여 분자량, 자외선흡광도, 적외선흡광도, 선광도 및 핵자기공명분석을 하였으며, 그 결과는 도 1∼3 및 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

도 2 : 13C- NMR 스펙트라상에서 프라바스타틴 나트륨의 화학적 이동

(200 MHz, D2O, δppm), C-1(182.73), C-2(47.42), C-3(70.16), C-4(37.46), C-5(66.77), C-6(35.99), C-7(26.37), C-8(39.34), C-9(39.44), C-10(73.23), C-11(45.82), C-12(72.74), C-13(140.07), C-14(138.51), C-15(127.52), C-16(129.26), C-17(33.19), C-18(18.80), C-19(-), C-20(182.33), C-21(44.18), C-22(28.99), C-23(13.65), C-24(15.21)

한편, DEPT 스펙트럼 분석을 하였으며 그 결과는 도 3에 나타낸 바와 같으며 이를 풀어쓰면 다음 표 2에 나타낸 바와 같다.

상기한 바와 같이 본 발명에서와 같이 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주의 배양액에 프라바스타틴 전구체를 첨가하고 배양하여 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 경우 종래 균주인 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스(Streptomyces rhoseochromogenes) 보다 기질첨가 농도가 0.05%(w/v)보다 높은 0.08∼0.12%이며, 생산성도 종래 균주의 경우 60 mg/ℓ보다 높은 300∼400 mg/ℓ의 효과를 얻을 수 있다.

Claims (3)

1. 미생물 배양액에 다음 화학식 1의 (I) 또는 (II)로 나타내어지는 프라바스타틴 전구체를 첨가하고 배양하여 화합물(III)의 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법에 있어서, 상기 미생물로는 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.) KCTC 12385 균주를 사용하는 것을 특징으로 하는 프라바스타틴 나트륨의 제조방법.

   [화학식 2]

   상기식에서 R은 카르복실기 또는 Na원자로 치환된 카르복실기이다.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 미생물 배양액에 프라바스타틴 전구체를 첨가하고 2∼3일후에 포도당을 첨가하는 것을 특징으로 하는 프라바스타틴 나트륨의 제조방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 포도당은 0.3∼1.5 %(w/v) 농도로 첨가되는 것을 특징으로하는 프라바스타틴 나트륨의 제조방법.