KR20020071634A

KR20020071634A - Ｈｐ20 및 에탄올을 이용한 프라바스타틴 전구체 콤펙틴및 그의 유도체의 정제방법

Info

Publication number: KR20020071634A
Application number: KR1020010011790A
Authority: KR
Inventors: 이기우; 탁건태; 김남현; 전종창; 이경미; 차제욱
Original assignee: 코바이오텍 (주)
Priority date: 2001-03-07
Filing date: 2001-03-07
Publication date: 2002-09-13

Abstract

본 발명은 프라바스타틴 전구체 콤펙틴(compactin) 및 그의 유도체의 생산 균주를 발효시켜 수득한 발효액 HP20 수지에 흡착 크로마토그래피로 정제함에 있어서, 흡착 용액 중 에탄올 함량을 0 - 20% 범위에서 흡착시키고, 용리 용액 중의 에탄올 함량을 60%이상이 되도록 하여 고순도로 수득하는 것에 관한 것이다.

Description

ＨＰ20 및 에탄올을 이용한 프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 그의 유도체의 정제방법{A purification method of pravastatin precursor compactin and derivatives thereof using HP20 resin and ethanol}

본 발명은 프라바스타틴 전구체 콤펙틴(compactin) 및 그의 유도체의 농축 및 정제방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 HP20수지와 에탄올을 이용하여 흡착크로마토그래피를 함으로써 프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 그의 유도체를 농축 및 정제한 것이다.

프라바스타틴 전구체 콤펙틴은 콜레스테롤 농도를 저하시킬 수 있는 물질로서 미합중국 특허공고 제 3,983,140호 및 영국특허 제 1,453,425호에 개시되어 있다. 이는 콜레스테롤 농도를 저하시킴으로써 과지방혈증, 특히 고지혈증으로 인한 심근경색증 또는 동맥경화증과 같은 심장병에 효과가 있는 물질이다.

이러한 프라바스타틴 전구체의 제조방법에 사용되는 균주로는 페니실리움 브레비콤팩틴(Penicillium brevicompactin), 페니실마이세스속(Penicilmyces sp.), 트리코데르마 론기브라이아튬(Tricoderma longibraiatum), 트리코데르마 슈도코닌기이(Tricoderma psudokoning), 하이포마이세스 크리소포러스(Hyphomyceschrisopomus) 및 페니실리움 시트리눔(Phenicillium citrinum)을 들 수 있다[일본국 특허 공고 제 (평)4-349034호]. 이러한 균주 또는 화학적 변환작용에 의해 프라바스타틴 전구체가 제조될 수 있다. 또한 대한민국 특허 제 0186758호에는 글리오클라디움속(Gliocladium sp.) YJ-9515 (KCTC 02528BP)를 호기적으로 배양하여 프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 그의 유도체를 제조하는 방법이 개시되어 있다.

대한민국 특허 제 100212482호에는 스트렙토마이세스 엑스포리아투스 (Streptomyces exfoliatus) YJ-118를 이용하여 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법이 개시되어 있고, 제 0186706호에는 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종(Streptomyces roseochromogenes subsp.)인 KTCC 12385의 배양액에 프라바스타틴 전구체를 첨가·배양하여 프라바스타틴 나트륨을 제조하는 방법이 기술되어 있다.

본 발명은 프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 그의 유도체를 정제하는 방법을 제공하는 것이다. 대한민국 특허 제 0186706호에서는 스트렙토마이세스 로세오크로모게네스 아종 KCCM 1285 균체를 배양한 배양액을 정제하여 프라바스타틴 나트륨염을 수득하는 방법을 기술하고 있는데, 이 정제 방법에서는 배양액을 pH를 조절하여 1-4시간정도 교반하고 원심분리하여 균체를 제거하는 단계; 원심분리한 상등액을 HP20수지를 이용한 흡착 컬럼 크로마토그래피로 흡착 후, 다시 세척하는 단계; 용리액으로 용리시키는 단계 등 수 단계의 복잡한 과정을 거쳐 프라바스타틴 나트륨을 수득하였다.

본 발명은 이러한 수 단계의 공정을 단순히 배양액을 HP20 수지에 통과시키고 다시 용리시키는 최소한의 단계로 구성된 프라바스타틴 전구체 콤펙틴의 정제방법을 제공한다.

본 발명은 글리오클라디움속(Gliocladium sp.) 및 페니실리움(Penicilium sp.)를 배양하여 제조된 프라바스타틴 전구체 콤펙틴을 HP20수지 및 에탄올을 사용하여 친화 크로마토그래피로 정제하는 것이며, 특히 에탄올을 흡착용액 및 용리용액에 사용함에 있어서 흡착용액중 0-20% 범위로 하고, 용리용액중 60% 이상이 되도록 조절하는 방법에 그 특징이 있다.

본 발명에서 사용되는 생산균주 글리오클라디움속 및 페니실리움속은 일반적으로 알려진 곰팡이 배양법을 사용할 수 있으나, 균주보존 배지 계대용 배지제조 및 종배양, 본 배양을 위한 여러단계의 종배양 및 배지제조, 이에 따른 진탕 배양, 및 목적물을 푀대 생성시킬 수 있는 배양기술 방법을 사용할 수 있다. 글리오클라디움속 균주는 일반적으로 10-36℃의 온도에서 성장한다. 이중, 프라바스타틴 전구체 생산을 위한 최적의 온도는 23-28℃이고, 가장 적절한 온도는 25℃이다. 성장가능한 pH는 4.0-8.0이며, 최적 pH는 5.0-6.0이다[대한민국 특허 제0186758호].

상기 균주를 배양시 배양 배지의 탄소원은 포도당, 글리세롤, 맥아당을 사용할 수 있고, 질소원으로는 콘스팁 리쿼(Corn stip liquor), 트립톤, 소이빈 펩톤, 탈지대두박, 이스트엑기스 및 질산나트륨을, 무기염류로는 황산마그네슘, 황산암모늄 및 제일인산염을 포함할 수 있다. 이러한 배지에서 호기적 조건하에서 배양가능하다.

본 발명에서 사용된 프라바스타틴 전구체를 수득하기 위한 균주의 배지조건 및 배양조건은 대한민국 특허 제 0186758호(영진약품)에 기술된 바와 같다.

본 발명은 상기 균주 등으로부터 배양된 프라바스타틴 전구체를 추가의 원심분리 또는 여과 등의 공정을 거치지 아니하고 흡착용액 및 용리용액으로 에탄올을 사용하고, 이의 농도를 조절함으로써 HP20 수지에의 흡착성을 이용함으로써 고수율로 프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 이의 유도체를 정제하는 것에 관한 것이다.

실시예 1: 글리오클라디움 속 균주를 이용한 경우 에탄올 농도의 영향

글리오클라디움 속 균주로 발효한 여액을 콤펙틴과 그의 유도체 함량 0.5 g/l로 하고, 알콜 함량을 하기 표 1과 같은 농도로 조절하여, 이 용액 20L를 HP20 1000ml에 흡착시켰다.

흡착액 중의 에탄올 농도(%)	0	10	20	30	40	50
흡착 통과액 중의 콤펙틴 및 그 유도체의 함량(g)	0.0	0.0	0.0	1.2	8.0	9.1
흡착율(%)	100	100	100	88	20	9

흡착액 중의 알콜 함량이 0-30% 범위인 경우 흡착율이 80%이상이었지만, 40%이상의 농도에서는 흡착율이 20%이하였다.

실시예 2: 페니실리움속 균주를 이용한 경우 에탄올 농도의 영향

페니실리움속 균주로 발효한 여액을 콤펙틴과 그의 유도체의 함량을 1.0 g/l이 되도록 조절하고, 알콜 함량을 하기 표 2와 같은 농도로 조절한 용액 10 L를 HP20 1000 ml에 흡착시킨다.

흡착액 중의 에탄올 농도(%)	0	10	20	30	40	50
흡착 통과액 중의 콤펙틴 및 그 유도체의 함량(g)	0.0	0.0	0.0	1.2	8.1	9.2
흡착율(%)	100	100	100	98	19	8

흡착액 중에 알코올 함량이 0 -30%범위에서 흡착율이 80%이상이었으나, 40%이상의 농도에서는 20%이하이었다.

실시예 3

프라바스타틴 생산균주로는 글리오클라디움속(Gliocladium sp.) 및 페니실마이세스속(Penicilmyces sp.) 균주를 사용하여 이 균주를 배양한다. 상기 배양액을 여과하여, 상기 여과액에 프라바스타틴 콤펙틴 및 그의 유도체 함량이 0.5g/l, 알콜 함량 10%이 되도록 물을 첨가한다. 이 배양물의 희석액 20L(총 10g)을 HP20 컬럼 1000ml에 흡착시킨 후, 알콜 농도를 달리한 용리액 5L로 용리한 후 용리한 용액중의 콤펙틴 및 그의 유도체의 함량 및 순도를 측정하였다. 색도는 흡착전의 흡착액중의 총 색도를 100으로 환산하였다. 색도는 OD660nm로 측정하였다.

용리용매중의 알콜 함량(%)	0	10	20	30	40	50	60	80	100
용리한 용액 중의 콤펙틴 및 그 유도체의 함량(g)	0.0	0.0	0.0	1.1	6.5	8.9	9.1	8.9	9.2
용리율(%)	0	0	0	11	65	89	91	89	92
색도(%)	10	10	10	13	21	26	25	27	24

프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 그의 유도체를 정제 또는 농축할 경우 용리액중에 콤펙틴과 그의 유도체의 용리율은 용리용액중에 알콜 함량이 0 - 30%범위에서는 11% 이하였으나, 알콜 함량 40%에서는 65%이었고, 60%이상에서는 90%이상이었다. 갈색의 색도는 원액의 80%이상이 감소하였다. 용리액의 용량은 흡착액의 1/4로 농축되었다.

실시예4: 용리용액중에 함유되어 있는 에탄올 함량과 용리한 후에 함유된 콤펙틴과 그의 유도체의 함량

페니실리움속 균주를 배양한액을 한 영액에 물과 알콜을 넣어 콤펙틴과 그의 유도체의 함량을 2g/L, 알콜 함량을 0 %로 조절한 액 5L(총 10g)l를 HP20 컬럼 1000 ml에 흡착시킨 다음 알콜 농도를 달리한 용리액 5L로 각각 용리하여 용리액중의 콤펙틴과 그의 유도체의 함량과 색도를 측정하였다. 색도는 흡착전의 흡착액중의 총 색도를 100으로 하여 환산하였다.

용리용매중의 에탄올 함량(%)	0	10	20	30	40	50	60	80	100
용리한 용액 중의 콤펙틴 및 그 유도체의 함량(g)	0	0	0	1.2	6.8	8.2	9.2	9.1	9.3
용리율(%)	0	0	0	12	68	82	92	91	93
색도(%)	9	11	10	15	21	23	20	25	27

콤펙틴과 그의 유도체를 정제 또는 농축할 경우 용리액중에 콤펙틴과 그의 유도체의 용리율은 용리용액중에 알콜 함량을 0 - 30%범위에서 12%이하였으나, 알콜 함량 40%에서는 68%이었고, 60%이상에서는 90% 이상이었다. 갈색의 색도는 원액의 75%이상이 감소하였다. 용리한 액중에는 물보다 비점이 낮은 알콜 함량이 50% 이상이 되므로 저온에서 농축하는데 효과적이고 에너지가 절약된다.

본 발명에 따라 에탄올 농도를 조절하여 HP20 수지로 흡착 크로마토그래피함으로써 프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 그의 유도체를 정제하는 경우, 그 정제공정이 최소화되어 비용과 시간이 절감되는 효과가 있다.

Claims

프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 그의 유도체의 생산 균주를 발효시켜 발효액을 수득하는 단계;

상기 발효액을 흡착용액으로 에탄올을 사용하여 HP20 수지에서 흡착 크로마토그래피하는 단계; 및

프라바스타틴 전구체 콤펙틴 및 그의 유도체를 용리액으로 에탄올을 사용하여 회수하는 단계를 포함하는 프라바스타틴의 전구체인 콤펙틴과 그의 유도체를 정제하는 방법에 있어서,

흡착 용액 중 에탄올 함량을 0 - 20% 범위에서 흡착시키고, 용리 용액 중의 에탄올 함량을 60%이상이 되도록 함을 특징으로 하는 방법.