WO2006043525A1

WO2006043525A1 - ウリジン５'－ジリン酸－ｎ－アセチルガラクトサミンの製造法

Info

Publication number: WO2006043525A1
Application number: PCT/JP2005/019081
Authority: WO
Inventors: Kiyoshi Okuyama; Toshitada Noguchi
Original assignee: Yamasa Coporation
Priority date: 2004-10-21
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2006-04-27
Also published as: CA2582686C; EP1816206A1; EP1816206A4; KR20070068365A; US7901912B1; JP4606419B2; KR101123062B1; CN101052724A; CA2582686A1; JPWO2006043525A1; CN101052724B; EP1816206B1

Abstract

　本発明は、オリゴ糖合成の重要な基質であるウリジン５'－ジリン酸－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ）の製造法に関するものであって、ウリジン５'－トリリン酸（ＵＴＰ）とＮ－アセチルガラクトサミン１－リン酸（ＧａｌＮＡｃ１－Ｐ）からウリジン５'－ジリン酸－Ｎ－アセチルガラクトサミンを酵素的に製造する際に、酵素として微生物（但し、病原性微生物を除く）由来のウリジン５'－ジリン酸－Ｎ－アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）を用いることを特徴とし、さらにＧａｌＮＡｃ１－Ｐ、としてＮ－アセチルガラクトサミンキナーゼを用い、Ｎ－アセチルガラクトサミンとリン酸供与体から反応系内で調製したものを用いることができる。本発明により、比較的に安価な基質を用い、ウリジン５'－ジリン酸－Ｎ－アセチルガラクトサミンを効率よく製造できる。

Description

明細書

ゥリジン 5，—ジリン酸 _N_ァセチルガラタトサミンの製造法

技術分野

[0001] 本発明は、オリゴ糖合成の重要な基質であるゥリジン 5' ジリン酸—N ァセチルガラクトサミン (UDP— GalNAc)の製造法に関するものである。

背景技術

[0002] オリゴ糖を酵素合成する方法としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の 2通りの方法が考えられる。糖転移酵素を用いる合成法は、合成収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点で加水分解酵素の逆反応を利用する方法よりも有利であると考えられており、また、近年の組換え DNA技術の進歩により各種糖転移酵素の量産化も該技術の実現ィ匕への後押しとなっている。

[0003] し力しながら、糖転移酵素を用いる合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部のものを除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないのが現状である。たとえば、 UDP— GalNAcの調製法としては、ガラクトサミンを出発原料として使用し、酵素法と化学的なァセチルイ匕を組み合わせて U DP GalNAcを合成する方法が報告されて、る。

[0004] しかし、（A)実験室での小スケール反応に過ぎない、（B)酵素の調製が容易でない、（C)ガラクトサミンのリン酸ィ匕に際して ATP再生系を補う必要があり、反応全工程の収率も低い、（D)反応液中に UDP ガラクトサミンが残留した場合、これと目的とする UDP— GalNAcとの分離が問題となる、等の問題を有し、必ずしも実用的な方法とはなり得な力つた（Methods Enzymol. , 28, 271 - 277, (1972)、 J. Org. Chem. , 57, 152—157. (1992) )。

[0005] また、ゥリジン 5'—ジリン酸一 N ァセチルダルコサミン 4 ェピメラーゼ（UDP— Gl cNAc4 -ェピメラーゼ）を用いてゥリジン 5 '—ジリン酸 N ァセチルダルコサミン（ UDP - GlcNAc)力 UDP - GalNAcを合成する方法が報告されて!、るが（W02 002/050267)、（ィ） UDP— GlcNAc4 ェピメラーゼは動物組織または菌体にごく少量しか存在しな、、（口）糸且換え DNA手法により UDP- GlcNAc4-ェピメラーゼを調製することも可能であるが、この酵素反応は平衡反応であることから転換率は低ヽ上に、基質である UDP— GlcNAcは完全に消費されることなく反応液中に多量に残留するため、 UDP— GalNAcと UDP— GlcNAcとの分離は困難である、といった問題を有し、この方法も実用的な方法としては問題を残して、た。

[0006] 特許文献 l :WO2002Z050267

非特許文献 1 : Methods Enzymol. , 28, 271 - 277, (1972)

非特許文献 2 :J. Org. Chem. , 57, 152- 157. (1992)

非特許文献 3 : Biol. Chem. 271, 23653- 23656, (1996)

非特許文献 4:J. Biol. Chem. 234, 1822- 1827 (1959)

非特許文献 5 :J. Biol. Chem. 273, 27055- 27057 (1998)

非特許文献 6 :J. Biol. Chem. 271, 13147- 13154 (1996)

発明の開示

[0007] したがって、本発明は、安価な基質を用い、酵素的に UDP— GalNAcを効率よく製造できる実用的な方法を提供することを目的とするものである。

[0008] 本発明者らは、 UDP— GalNAcの生合成経路に関して詳細に検討した結果、以下のことを見出し、本発明を完成させた。

[0009] 第 1に、病原性のストレプトコッカス'ァゥレウス（Staphylococcus aureus)、ヒト、ブタ由来の各ゥリジン 5'—ジリン酸 N ァセチルダルコサミンピロホスホリラーゼ（UDP GlcNAcピロホスホリラーゼ）は、下記 (A)の本来の変換反応を触媒する活性を有する他に下記 (B)の変換反応も触媒する活性を有して、ることが報告されて、たが CF . Biol. Chem. 234, 1822- 1827 (1959) , J. Biol. Chem. 273, 27055— 270 57 (1998) , J. Biol. Chem. 271, 13147— 13154 (1996) )、 Staphylococcus aur eus以外の病原性のな!、微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼにはそのような報告はなかったものの、試験の結果、下記 (A)の活性以外にも下記 (B)の活性を有していることを確認した。そして、たとえば大腸菌由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラ一ゼを用い、 N ァセチルガラタトサミン 1—リン酸（GalNAc 1— P)とゥリジン 5' トリリン酸 (UTP)から UDP— GalNAcを合成すれば、 UDP— GlcNAcや UDP ーガラ外サミンなど従来法で問題のあった他の糖ヌクレオチドとの分離の問題を解決できること。

[0010] (A) UDP— GlcNAc +ピロリン酸 UTP + GlcNAcl— P

(B) UDP— GalNAc +ピロリン酸 UTP + GalNAc 1— P

[0011] 次に、 GalNAcl— Pは高価で、化学的にも調製が容易でないため、 N ァセチルガラクトサミン (GalNAc)を酵素的にリン酸ィ匕できないか検討している過程で、 GalN Acをリン酸ィ匕する活性はヒトまたはブタの肝臓または腎臓などの組織中に存在すること力 S報告されており（J. Biol. Chem. 271, 39. 23653— 23656, (1996) )、この酵素によって GalN Acから GalNAc 1 Pを酵素的に調製できること。

[0012] しかし、動物由来の N ァセチルガラタトサミンキナーゼを大腸菌等の微生物を宿主とする系で生産することは困難であり、当該酵素を実用に供することは不可能であつたが、動物由来の N ァセチルガラタトサミンキナーゼをコードする GALK2遺伝子を他の微生物由来のタンパク質 (たとえば、大腸菌 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ）をコードする遺伝子の 3'末端の下流に連結し、融合蛋白質として生産させることで、大腸菌内で活性を有した状態で動物由来の N ァセチルガラタトサミンキナーゼを生産させることができること。

[0013] 更に、このような動物由来の N ァセチルガラタトサミンキナーゼと微生物由来の U DP GlcNAcピロホスホリラーゼ、ある!/、はそれらの融合蛋白質を用、て GalNAcと UTP力も UDP— GalNAcが合成でき、さらに酵母菌体によってアデノシン 5'—トリリン酸 (ATP)生産とゥリジン 5'—モノリン酸（UMP)のリン酸化を行、ながら N ァセチルガラタトサミンキナーゼと大腸菌 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼを作用させることにより、安価な UMPと GalNAcから UDP— GalNAcが合成できることを、それぞれ見出し、本発明を完成させた。

[0014] すなわち、本発明は、 UTPと GalNAcl— Pから UDP— GalNAcを酵素的に製造する方法において、酵素として微生物 (但し、病原性微生物を除く）由来の UDP— G lcNAcピロホスホリラーゼを用いることを特徴とする UDP— GalNAcの製造法に関するものである。

[0015] また、本発明は、前記 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼが微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ遺伝子を用いた組換え DNA手法で調製されたものであることを特徴とする UDP— GalNAcの製造法に関するものである。

[0016] さらに、本発明は、前記 GalNAc 1—P力 N—ァセチルガラタトサミンキナーゼを用 V、、 GalNAcとリン酸供与体力反応系内で調製したものであるあることを特徴とする UDP— GalNAcの製造法に関するものである。

[0017] 本発明においては、前記 N—ァセチノレガラクトサミンキナーゼは、動物由来の N— ァセチルガラタトサミンキナーゼ遺伝子を用いた組換え DNA手法で調製されたものとすることができ、組換え DNA手法を用いて微生物由来の蛋白質との融合蛋白質の形で調製されたものとすることができ、あるいは微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼとの融合蛋白質の形で調製されたものを用いることが可能である。

[0018] また、本発明においては、前記リン酸供与体をアデノシン 5'—トリリン酸 (ATP)とすることができ、前記アデノシン 5 '—トリリン酸 (ATP)が酵母菌体によって生成されるものとしても良い。

[0019] また、本発明の UDP- GalNAcの製造法においては、 UTPを用いる代わりに、微生物菌体ゃ酵素を用いた UTP生成 Z再生系を併用することもでき、 UTPを用いる代わりに UMPと酵母菌体を用いた UMPからの UTP生成系を併用することも可能である。、

[0020] 更に、本発明においては、前記微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ遺伝子は、大腸菌由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ遺伝子 (glmU)とすることが可能である。また、前記 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼによる UDP— Gal NAcの合成に際して、反応系に生成するピロリン酸を分解する酵素を添加しても良い。

[0021] また、本発明においては、前記酵母菌体として、サッカロミセス属、チゴサッカロミセス属、カンディダ属、トルロプシス属、ハンセヌラ属、デバリオミセス属から選ばれる 1又は 2以上の酵母由来の菌体を用いることができ、前記酵母菌体の一例として乾燥酵母菌体を用いることができる。前記酵母菌体を用いる反応に、無機リン酸や所要のエネルギー源を添加することも有益である。

[0022] 更に、本発明においては、前記 N—ァセチルガラタトサミンキナーゼにより調製された GalNAcl— Pの分解を防止するフッ化ナトリウムを添加することもできる。

[0023] 本発明により、微生物由来 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼが GalNAcl— Pと UTP力 UDP - GalNAcを生成する活性があることを見出し、該酵素と動物由来 N ァセチルガラタトサミンキナーゼを用いて、 GalNAcのリン酸化と UDP付カ卩を連動して行うことで UDP— GalNAcを効率的に製造することが初めて可能となった。

[0024] また、 N ァセチノレガラクトサミンキナーゼと UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼを融合タンパク質として生産可能ならしめ、動物由来の N ァセチルガラタトサミンキナーゼの生産を大腸菌内で初めて可能とし、 2種類の酵素を一度に生産することができ、酵素調製が容易になった。

[0025] さらに、酵母菌体によって ATP生産と UMPのリン酸化を行いながら N ァセチルガラクトサミンキナーゼと微生物由来 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼを作用させることにより、安価な UMPと GalNAcから UDP - GalNAcが効率よく合成することができる。

[0026] さらにまた、本発明の方法は、 UDP— GalNAc以外の糖ヌクレオチドがほとんど生成しないため、反応液からの目的の UDP— GalNAc単離精製が極めて簡単に行うことができる。

図面の簡単な説明

[0027] [図 1]図 1は、 GalNAcと UTPからの UDP— GalNAc合成系を示したものである。

[図 2]図 2は、ヒト腎臓由来の N -ァセチルガラタトサミンキナーゼと大腸菌 UDP - G1 cNAcピロホスホリラーゼを共存させた時の UDP— GalNAc生成量の経時変化を示したものである。

[図 3]図 3は、ヒト腎臓由来の N -ァセチルガラタトサミンキナーゼと大腸菌 UDP - G1 cNAcピロホスホリラーゼとの融合タンパク質を用いた時の UDP— GalNAc生成量の経時変化を示したものである。

[図 4]図 4は、ジャーフアーメンターでの合成反応における UDP— GalNAc生成量の経時変化を示したものである。

発明を実施するための最良の形態

[0028] 本発明は、 UTPと GalNAc 1—Pから UDP— GalNAcを酵素的に製造する方法にぉ、て、酵素として微生物由来の UDP - GlcNAcピロホスホリラーゼを用、ることを特徴とする UDP— GalNAcの製造法に関するものである。

[0029] 反応系に添加する UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼとしては、病原性を持たない微生物由来のものを使用することができる。これらの酵素は、それぞれの酵素の遺伝子をクローンィ匕し、微生物菌体内で大量発現させる、いわゆる組換え DNA手法を用 V、て調製することも可能である。微生物由来の UDP - GlcNAcピロホスホリラーゼとしては、エッシェリヒァ（Escherichia)属（Journal of Bacteriology, 175, 6150 (1 99 d) )、サッカロセス (¾accnaromyces) J¾ ( Agricultural Biological Chemistry , 40, 2275 (1976) )、又は-ユーロスポラ（Neurospoa)属（Can. J. Microbiology , 25, 1381 (1979) )に属する微生物由来のものが例示され、特に大腸菌由来の U DP GlcNAcピロホスホリラーゼが好適である。

[0030] このような UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物力得られる酵素調製物などを例示することができる。

[0031] 微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊 (ワーリンダブレンダ一、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理 (リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理 (酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。

[0032] 酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段 (塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種ク口マトグラフィー処理など)を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。

[0033] 微生物菌体力の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼの調製法を具体的に説明すれば、集菌して得られた菌体を超音波処理により菌体を破砕し、菌体破壊液を遠心して上清を得、この上清を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー処理を施し、 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ活性画分を濃縮、脱塩することで目的とする酵素調製物を取得することができる。 [0034] 反応に使用する UTPと GalNAcl— Pは、反応系内でそれぞれを調製してもかまわない。たとえば、 GalNAcl— Pの反応系内での調製は、 N—ァセチルガラタトサミンキナーゼを用い、 GalNAcとリン酸供与体から実施することができる。

[0035] 反応に使用する N—ァセチルガラタトサミンキナーゼは、ヒト、ブタ、マウスなどの哺乳類の腎臓や肝臓、脾臓、肺、心臓、大動脈、脳などの組織に存在し、特に腎臓または肝臓に多く含まれており、これらの組織力も調製可能である。また、反応系に添加する N—ァセチルガラタトサミンキナーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、ブタ肝臓の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。

[0036] しかし、酵素調製の簡便性などの点から、常法に従って N—ァセチルガラタトサミンキナーゼ遺伝子をクローンィ匕し、微生物菌体内で大量発現させる、いわゆる組換え DNA手法により調製することのほうが好都合である。微生物を宿主とし、組換え DN A手法により動物由来の N—ァセチルガラタトサミンキナーゼを調製する場合、通常の方法では目的の酵素が生産されないか、生産されても極めて少量であり、実用に耐えない。このため、宿主と同じ微生物由来の蛋白質 (たとえば、大腸菌 UDP— Glc NAcピロホスホリラーゼ)をコードする遺伝子の下流に連結し、融合蛋白質として生産させることで、大腸菌などの宿主内で活性を有した状態で動物由来の N—ァセチルガラタトサミンキナーゼを生産させることができる。

[0037] 上記融合蛋白質を生産させるための遺伝子の連結、プラスミドの構築、宿主の形質転換、酵素の生産などは、既にこの分野では周知の技術であり、後述実施例に示したように、常法に従って行うことができる。

[0038] 反応に添加する N—ァセチルガラタトサミンキナーゼとしては、 UDP— GlcNAcピ口ホスホリラーゼと同様に、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。

[0039] また、 UTPの反応系内での調製は、微生物菌体ゃ酵素を用いた UTP生成 Z再生系を併用することで実施できる。具体的には、 UMPと酵母菌体を用いた UMP力の UTP生成系を利用することができ、まずこれについて説明する（図 1参照)。 [0040] 使用する酵母菌体としては、糖ヌクレオチドの製造に使用されるものであれば特に制限されない。具体的には、サッカロミセス（Saccharomyces)属、チゴサッカロミセス（ Zygosaccharomyces)属、カンディダ (Candida)属、トノレ口プシス (Torulopsis)属、ハンセヌラ（Hansenula)属、デバリオミセス（Debaryomyces)属などの酵母由来の菌体を例示することができる。このような酵母菌体は、生酵母菌体、乾燥酵母菌体いずれであつても力まわないが、反応収率、取扱いの容易性などの点力も乾燥酵母菌体を用いるのが好ましい。

[0041] また、 UTPの反応系内での調製は、上記の UMPと酵母菌体を用いた UMPからの UTP生成系に限定されるものではなぐたとえば、微生物菌体を用いたォロチン酸からの UTP生成系（特開平 5— 276974号）、あるいは酵素を用いた UTP生成系と AT P再生系とが共役したもの（具体的には、アデニル酸 (AMP)にポリリン酸キナーゼ、アデ-レートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめて ATPを再生しながら UMPにゥリジル酸キナーゼ、および必要によりヌクレオシドニリン酸キナーゼを作用せしめて UT Pを生成する系）などを利用することもできる。

[0042] このような酵素と基質を用いて UDP— GalNAcを製造する条件は、使用する酵素や基質により若干異なる。

(1)酵素として微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼを用い、 UTPと Gal NAc 1 - P力 UDP - GalNAcを酵素的に製造する場合

反応に使用する UTPと GalNAcl— Pは市販品、あるいは公知の方法 (J. Am. Che m. Soc, 115, 2260-2267 (1993))を応用して調製したものを使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約 l〜200mM、好ましくは約 1〜1 OOmMの範囲力適宜設定することができる。

[0043] UDP— GalNAcの合成反応は、例えば pH約 6. 0〜9. 0のリン酸緩衝液中に UT Pと GalNAc 1 - Pを添カロし、この反応液に上記 UDP - GlcNAcピロホスホリラーゼを約 0. 1ユニット Zml以上、好ましくは約 0. 5〜20. 0ユニット Zml添カ卩共存させ、約 5 〜30°C、好ましくは約 5〜25°Cで 1〜70時間程度、必要により撹拌しなから反応させること〖こより実施できる。

[0044] なお、 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼによる UDP— GalNAcの合成反応は、平衡反応であり、 UDP— GalNAcの合成収率を向上させるため、反応系に生成するピロリン酸を分解する酵素（たとえば、ピロホスファターゼ）を 0. 1ユニット Zml以上添加することが好適である。

[0045] (2)酵素として微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼと動物由来の N— ァセチルガラタトサミンキナーゼ、あるいはそれらの融合酵素を用い、 UTPと GalNA cから UDP— GalNAcを酵素的に製造する場合

[0046] 反応に使用する UTPと GalNAcは、市販品を使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約 l〜200mM、好ましくは約 l〜100mMの範囲から適宜設定することができる。

[0047] UDP— GalNAcの合成反応は、例えば pH約 6. 0〜9. 0のリン酸緩衝液中に UT

Pと GalNAcを添加し、この反応液に上記 2種類の酵素をそれぞれ、あるいは融合酵素を約 0. 1ユニット Zml以上、好ましくは約 0. 5-20. 0ユニット Zml添カ卩共存させ

、約 5〜30°C、好ましくは約 5〜25°Cで 1〜70時間程度、必要により撹拌しな力も反応させること〖こより実施できる。

[0048] なお、上記（1)と同様に、ピロリン酸を分解する酵素（たとえば、ピロホスファターゼ）を 0. 1ユニット/ ml以上添加し、さらに N—ァセチルガラタトサミンキナーゼにより調製された GalNAc 1—Pの分解を防止するため、 ImM以上のフッ化ナトリウム添カロすることが好適である。

[0049] (3)酵素として微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼと動物由来の N—ァセチルガラタトサミンキナーゼ、あるいはそれらの融合酵素を用い、酵母菌体を用いた UMPからの UTP生成系を併用し、 UMPと GalNAcから UDP - GalNAcを製造する場合

反応に使用する UMPと GalNAcは、市販品を使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約 l〜200mM、好ましくは約 10〜50mMの範囲から適宜設定することができる。

[0050] UDP— GalNAcの合成反応は、例えば pH約 6. 0〜9. 0のリン酸緩衝液中に UM Pと GalNAcを添加し、この反応液に上記 2種類の酵素それぞれ、あるいは融合酵素を約 0. 1ユニット Zml以上、好ましくは約 0. 5〜20. 0ユニット Zml添カ卩し、さらに酵母菌体を 1〜10% (WZV)共存させ、約 5〜30°Cで 1〜70時間程度、必要により撹拌しな力反応させることにより実施できる。

[0051] 上記反応には、無機リン酸とエネルギー源を反応系に添加するのが好ましい。無機リン酸は、リン酸カリウムなどをそのまま使用することもできるが、リン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。エネルギー源としては、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クェン酸などの有機酸を使用することができる。それぞれの使用濃度は、特に制限されないが、約 10〜： LOOOmM、好ましくは約 100〜500mMの範囲から適宜設定することができる。

[0052] なお、上記反応系には、上記（1)及び（2)の酵素反応と異なり、ピロリン酸を分解する酵素や GalNAcl— Pの分解を防止するためのフッ化ナトリウムなどのフッ化塩を反応系に添加する必要はな、。

[0053] このようにして得られた UDP— GalNAcは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段

(イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することがでさる。

実施例

[0054] 以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例において、反応液中の UDP— GalNAcの定量には HPLC法により行った。すなわち、分離には YMC社製の ODS— AQ312カラムを用い、溶出液として 0. 5Mリン酸一カリウム溶液を用いた。 DNAの調製、制限酵素による切断、 T4DNAリガーゼによる DNA連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular clonmgj (Maniatisら編、 Com Spring Harbor Laboratory, し old Spring Harbor, New YorK(1982) )に従って行った。制限酵素、 ExTaq DNAポリメラーゼ、 T4DNAリガーゼはタカラバイオ (株）より入手した。

[0055] 実施例 1

( 1)ヒト腎臓由来 N—ァセチルガラタトサミンキナーゼをコードする GALK2遺伝子のクローン化

ヒト腎臓由来 cDNAライブラリー (クロンテック社から入手可能)を铸型として、以下に示す 2種類のプライマー DNAを常法に従って合成し、 PCR法によりヒト腎臓 GAL K2遺伝子（Submitted to NCBI、 Accession No. NM— 002044)を増幅した

[0056] プライマー（A)： 5し CGGGGATCCATGGCTACAGAGAGCCCTGCT— 3'

プライマー (B) : 5し TACGTCGACTTAGGCCTCAAGCAAAACCAA- 3'

[0057] PCRによる GALK2遺伝子の増幅は、反応液 100 /ζ 1 (50πιΜ 塩化カリウム、 10 mM トリス塩酸（pH8. 3)、 1. 5mM 塩化マグネシウム、 0. 001%ゼラチン、 0. 2 mM dATP、 0. 2mM dGTP、 0. 2mM dCTP、 0. 2mM dTTP、铸型 DNA 0. lng、プライマー DNA(A)ぉょび（B)各々0. 2 M、 ExTaqDNAポリメラーゼ 2. 5ユニット）をタカラバイオ社製 DNA Thermal Cycler Diceを用いて、熱変性（94°C、 1分）、アニーリング（59°C、 1分）、伸長反応（72°C、 2分)のステップを 30 回繰り返すことにより行った。

[0058] 遺伝子増幅後、 DNAを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、 1. 4kbの DNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 BamHI及び Sailで消化し、同じく制限酵素 BamHI及び Sailで消化したプラスミド pMAL-c2x (New England BioLabs社より入手）と T4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌 K12 M109菌（タカラバイオ株式会社より入手)を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pMAL—h GLK2を単離した。 pMAL— hGLK2は、 maltose binding protein遺伝子の 3' —末の下流の BamHI— Sail切断部位にヒト腎臓 GALK2構造遺伝子を含有する Ba mHI-Sall DNA断片が挿入されたものである。

[0059] (2)ヒト腎臓 GALK2遺伝子産物の調製

プラスミド pMAL— hGLK2を保持する大腸菌 JM109菌を、 100 μ gZmlのアンピシリンを含有する培地（2%ペプトン、 1%酵母エキス、 0. 5%NaCl、 0. 1%ダルコ一ス） 100mlに植菌し、 37°Cで振とう培養した。菌数が 4 X 10⁸個 Zmlに達した時点で培養液に最終濃度 0, 0. 01, 0. 1または 1. OmMの各濃度になるように IPTGを添加し、さらに 25°Cで 20時間それぞれ振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離 (4 °C、 9, 000 X g, 10分）により菌体を回収し、 20mlの緩衝液（50mM リン酸カリウム (pH7. 5) )に懸濁した。ブランソン社製超音波破砕機 (モデル 450ソ-ファー）を用いて氷冷下で超音波処理を行い（50W, 2分， 3回）、 4°C、 12, OOO X gの条件下で

20分間遠心分離し、可溶性画分 (上清)を回収した。

[0060] このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品における N—ァセチルガラクトサミンキナーゼ活性を測定した。その結果を下記表に示す。

[0061] [表 1]

[0062] なお、 N—ァセチルガラタトサミンキナーゼ活性は、以下に示す方法で ATPと Gal NAc力も GalNAcl— Pへのリン酸ィ匕活性を測定、算出したものである。すなわち、 1 OOmM トリス塩酸緩衝液（pH7. 5)、 10mM 塩化マグネシウム、 5mM GalNAc 、 5mM ATP' 3Na、5mM フッ化ナトリウムに N—ァセチルガラタトサミンキナーゼ酵素標品を添加して 37°Cで 10分反応させる。反応液を 5分間の煮沸にて反応を停止し、糖分析機 HPAEC— CD (High— performance anione― exchange chr omatography coupled with conductimetric detection)【こよ分析を行つ。分離にはダイオネタス社製の Carbopac PA1カラム（4 X 250mm)を用い、溶出液として（A) 0. IM NaOH溶液と（B) 0. IM NaOH, 0. 5M 酢酸ナトリウム溶液の濃度勾配（0— 15分： B= l%— 50%、 15— 20分： B= 100%)を用いる。 HPAEC — CD分析結果力も反応液中の GalNAcl— Pの生成量を算出し、 37°Cで 1分間に 1 μ moleの GalNAc 1—Pを生成する活性を 1単位（ユニット）とする。

[0063] (3) UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼの調製

大腸菌（IF03972=NBRC3972)の染色体 DNAから、文献公知の方法（Biosci . Biotechnol. Biochem. , 64 (2) , 386— 392 (2000) )に従って調製した大腸菌 JM109 [pTrc— glmU]をアンピシリンを 100 μ gZml含む 2 Χ ΥΤ培地（Method s Enzymol. , 153, 3— 11, (1987) ) 10mlで一夜 37。Cで培養した。これを、アンピシリンを 100 gZml含む 2 XYT培地 500mlに植菌した。 37°Cで 2時間培養後、 I PTGを終濃度 0. ImMになるように添加し、引き続き 37°Cで一夜培養した。培養終了後、遠心分離 (4°C, 9, OOOxg, 20分）により菌体を回収した。回収した菌体を 50 mM トリス塩酸 (pH7. 5)に懸濁し、ブランソン社製超音波破砕機（モデル 450ソ- ファー）を用いて破砕後（50W, 2分， 3回）、 4。C、 15, OOOrpmの条件下で 20分間遠心分離し、可溶性画分 (上清)を回収した。

[0064] このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品における UDP— GlcNAc ピロホスホリラーゼ活性を測定した。その結果を対照菌 (pTrc99Aを保持する大腸菌 JM109菌）と共に下記表 2に示す。

[0065] [表 2]

[0066] なお、 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ活性は、 Biosci. Biotechnol. Bioch em. , 64 (2) , 386— 392 (2000)に示す方法、すなわち UDP— GlcNAcとピロリン酸カゝら N—ァセチルダルコサミン 1—リン酸と UTPへの分解活性を測定、算出したものである。すなわち、 50mM トリス塩酸緩衝液（pH7. 5)、 5mM 塩化マグネシウム、 3mM ピロリン酸ナトリウム、 ImM UDP— GlcNAcに UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ酵素標品を添加して 37°Cで 5分反応させる。また、ピロリン酸ナトリウム溶液の代わりに水を用い同様の反応を行、、これをコントロールとする。

[0067] 反応液を 5分間の煮沸にて反応を停止し、 HPLCによる分析を行う。分離には YM C社製の ODS— AQ312カラムを用い、溶出液として 0. 5M リン酸一カリウム溶液を用いる。 HPLC分析結果力も反応液中の生じた UTP量を算出し、 37°Cで 1分間に 1 μ moleの UTPを生成する活性を 1単位 (ユニット）とする。

[0068] (4)大腸菌 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼによる UDP— GalNAcの酵素合成

50mM トリス塩酸緩衝液（pH7. 5)、 5mM 塩ィ匕マグネシウム、 ImM 5' -UTP •3Na、 ImM GalNAcl—Pを含む溶液 0. 5mlに上記（3)で調製した所定活性量の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ酵素液（4. 8ユニット）を添カロし、 37°Cで反応を行った。反応途中の反応液から適当量を採取し、 5分間煮沸後遠心分離してその上清を HPLC分析に供した。

[0069] 反応開始後の反応液の分析を行った結果、 ImMの UTPと ImMの GalNAcl リン酸から 0. 33mMの UDP— GalNAcが合成されたことを確認した。さらに反応液に無機ピロホスファターゼ (シグマ社製）を添加することにより平衡が UDP— GalNAc合成側に傾き、合成収率が向上 (60%程度向上)することも確認した。

[0070] 実施例 2

( 1)ヒト N ァセチルガラタトサミンキナーゼおよび大腸菌 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼによる UDP - GalNAcの合成

lOOmM トリス塩酸緩衝液（pH7. 5)、 10mM 塩ィ匕マグネシウム、 5mM 5'— U TP' 3Na、5mM GalNAc、 5mM 5'— ATP' 3Na、 5mM フッ化ナトリウムを含む溶液 0. 2mlに上記実施例 1で調製した所定活性量の N -ァセチルガラタトサミンキナーゼ酵素液（0. 094ユニット）と UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ酵素液（4. 4 ユニット）および無機ピロホスファターゼ (シグマ社製、 0. 5ユニット）を添カ卩し、 37°C で反応を行った。

[0071] 反応途中の反応液から適当量を採取し、 5分間煮沸後遠心分離してその上清を H PLC分析に供した。反応開始 4時間後の反応液の分析を行った結果、 N ァセチルガラクトサミンキナーゼ、 UDP GlcNAcピロホスホリラーゼ及び無機ピロホスファターゼ存在下において、 3. 2mMの UDP— GalNAcが合成されたことを確認した。なお、 N ァセチルガラタトサミンキナーゼを存在させず、 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼおよび無機ピロホスファターゼのみ反応条件下では UDP— GalNAcは生成されなかった。

[0072] 実施例 3

(1)乾燥酵母とヒト N ァセチルガラタトサミンキナーゼおよび大腸菌 UDP— GlcNA cピロホスホリラーゼを用、た UDP - GalNAcの合成

200mM グルコース、 50mM GalNAc, 50mM UMP、 200mM リン酸力リウム（pH8. 0)、 20mM 塩化マグネシウム、 3% (w/v)乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業)を含む溶液 lmlに、実施例 1で調製した組換え酵素 (N—ァセチルガラタトサミンキナーゼ； 0. 32ユニット， UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ； 10. 4ユニット )を添加し、 26°Cで 300rpmの攪拌速度で撹拌しながら反応を行った。また，反応開始 16, 24, 40, 48時間目に 2Mのグルコース溶液を 0. lmLずつ反応液に添加した。経時的に反応液の分析を行った結果を図 2に示す。 UDP— GalNAcの蓄積量は反応 49時間で 32mMに達した。

[0073] 実施例 4

実施例 2及び 3では、二種類の酵素を用いての反応例を示したが、ここでは二種類の酵素を融合タンパク質として生産させたものを用いて UDP— GalNAc合成反応を行った結果を示す。

(1)大腸菌 UDP - GlcNAcピロホスホリラーゼとヒト腎臓由来 N—ァセチルガラタトサミンキナーゼの融合

大腸菌 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ遺伝子発現用プラスミド、 pTrc-glmU を铸型として、以下に示す 2種類のプライマー DNAを常法に従って合成し、 PCR法により glmU遺伝子を含む DNA断片を増幅した。

[0074] プライマー（C)： 5 ' -GAGCGGATAAC AATTTC AC-3 '

プライマー (D) : 5し CCAGGATCCCTTTTTCTTTACCGGACGACG- 3'

[0075] PCRによる glmU遺伝子を含む DNA断片の増幅は、反応液 100 μ 1 (50mM 塩化カリウム、 10mM トリス塩酸（pH8. 3)、 1. 5mM 塩化マグネシウム、 0. 001% ゼラチン、 0. 2mM dATP、 0. 2mM dGTP、 0. 2mM dCTP、 0. 2mM dTTP 、铸型 DNA 0. lng、プライマー DNA(A)ぉょび（B)各々0. 2 M、 ExTaqDNA ポリメラーゼ 2. 5ユニット）をタカラバイオ社製 DNA Thermal Cycler Diceを用いて、熱変性（94°C、 1分）、アニーリング (64°C、 1分）、伸長反応（72°C、 2分)のステップを 30回繰り返すことにより行った。

[0076] DNA断片増幅後、 DNAを文献（Molecular Cloning、前述）の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、 1. 4kbの DNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 EcoRI及び BamHIで消化し、同じく制限酵素 EcoRI及び BamHIで消化したプラスミド pTrc99A (フアルマシア社より入手）と T4DN Aリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌 K12 M109菌 (タカラバイオ株式会社より入手)を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pTrc—glmU3を単離した。 pTrc—glmU3の glmU遺伝子は、終始コドンを欠きその代わりに BamHI認識部位が挿入されたものである。

[0077] つぎに、 pTrc— hGLK2を制限酵素 BamHIと Sailで消化し、 1. 4kb相当の DNA 断片を単離 '精製した。これを同じく制限酵素 BamHIと Sailで消化したプラスミド pTr c glmU3と T4DNAリガーゼを用、て連結した。連結反応液を用、て大腸菌 JM 1 09菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド pTrc—glm U ' hGLK2を単離した。 pTrc—glmU ' hGLK2は、 glmU遺伝子の 3 '—末下流にフレームを揃えて hGLK2遺伝子が連結されたものである。つぎに pTrc—glmU ' hGL K2を制限酵素 Saclと Sailで消化し、 1. 4kb相当の DNA断片を単離 '精製した。これを同じく制限酵素 Saclと Sailで消化したプラスミド pTrc 12— 6と T4DNAリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌 DH1株 (ATCC 33849)を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミド p 12 - 6 -glmU · hGLK2 を単離した。

[0078] なお、プラスミド pTrcl 2— 6は、プラスミドベクター π AG 1 (プラスミドベクター π AG1を保持した大腸菌 K—12株 TNC111菌の寄託番号： FERM BP— 6901 号:平成 11年 9月 30日寄託）と発現プラスミド _PTrc99Aを基に構築され、 pTrc99A の 13—ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し (position 567— 1816bpが欠失）、その欠失部位に Tn903由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたものである（特開 2 001— 103973)。

[0079] (2)大腸菌 glmU遺伝子産物とヒト腎臓 GALK2遺伝子産物の融合タンパク質の調製

プラスミド p l 2— 6—glmU ' hGLK2を保持する大腸菌 DH1株を、 100 μ gZmlのカナマイシンを含有する培地（2%ペプトン、 1 %酵母エキス、 0. 5%NaCl、 0. 1 %グルコース） 50mlに植菌し、 37°Cで振とう培養した。菌数カ X 10⁸個 Zmlに達した時点で培養液に最終濃度 0. ImMになるように IPTGを添カ卩し、さらに 25°Cで 20時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離 (4°C、 9, OOO X g, 10分）により菌体を回収し、 20mlの緩衝液（50mM リン酸カリウム (pH7. 5) )に懸濁した。氷冷下で超音波処理により菌体を破砕し、さらに遠心分離 (4°C、 12, OOO X g、 10分）により菌体残渣を除去した。

[0080] このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品における UDP— GlcNAc ピロホスホリラーゼ活性および N—ァセチルガラタトサミンキナーゼ活性を実施例 1に記載の方法で測定した。その結果を下記表 3に示す。

[0081] [表 3]

[0082] (3)融合タンパク貧を用、た UDP— GalNAcの合成

上記の融合酵素標品を用いて UDP— GalNAc合成を行った。すなわち、 200mM グルコース、 50mM GalNAc、 28mM UMP、 200mM リン酸カリウム（pH8. 0 )、 20mM 塩化マグネシウム、 3% (w/v)乾燥パン酵母 (オリエンタル酵母工業)を含む 2. 5mL溶液に、上記組換え融合酵素液 (N—ァセチルガラタトサミンキナーゼ； 1. 75ユニット、 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ； 88. 9ユニット）を添カ卩して、 27 。C、 lOOrpmで攪拌しながら反応を行った。反応開始から 14, 24, 40時間目にダルコースを 0. 09g反応液に添カ卩した。また、反応開始 24時間後に 0. 5Mの UMP溶液 110 1を反応液に添カ卩した。

[0083] 経時的に反応液を分析した結果を図 3に示す。融合タンパク質を用いた場合でも、個々に調製した両酵素を混合して用、た場合とほぼ同等に UDP— GalNAcが合成され、反応 40時間で UDP— GalNAcは 30mMに達した。

[0084] (4)大腸菌 glmU遺伝子産物とヒト腎臓 GALK2遺伝子産物の融合タンパク質の調製 (スケールアップ）

プラスミド pl2— 6—glmU 'hGLK2を保持する大腸菌 DH1株を、 100 μ gZmlのカナマイシンを含有する培地（2%ペプトン、 1%酵母エキス、 0. 5%NaCl、 0. 1%グルコース） 3mLに接種し、 37°Cでー晚振とう培養した。この培養液の全量を 125mL の同培地に接種し、 37°Cで 8から 11時間振とう培養した。この培養液全量を 5Lの同培地に植菌し、 37°C、通気量 1. Owm、攪拌羽回転数 300rpmの条件で培養した。菌数カ X 10⁸個 Zmlに達した時点で培養液に最終濃度 0. ImMになるように IPT Gを添加し、培養温度を 28°Cに下げて 14時間培養を続けた。培養終了後、菌体を遠心分離（9, OOO X g, 10分）により回収し、 500mlの緩衝液（50mM リン酸力リウム (pH7. 5) )に懸濁した。氷冷下で超音波処理により菌体を破砕したのち、遠心分離（12, OOO X g, 10分）により菌体残渣を除去した。

このように得られた上清画分を酵素標品とし、 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ活性を実施例 1に記載の方法で測定した。その値は 9. 50ユニット/ mgタンパク質でめつに。

[0085] (5) UDP— GalNAc合成反応のスケールアップ

融合酵素標品を用いた UDP— GalN Ac合成反応をスケールアップし、ジャーファーメンターで行った。すなわち、 200mM グルコース、 50mM N—ァセチノレガラタ卜サミン、 28mM UMP、 200mM ジン酸カジクム（pH8. 0)、 20mM 塩ィ匕マグネシゥム、 3% (wZv)乾燥パン酵母 (オリエンタル酵母工業)、および上記組換え融合酵素液（UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ活性として 525, 000ユニット）を添カロして l,500mLにフィルアップし、 27°C、通気量 0. lwm、攪拌羽回転数 150rpmの条件で反応を行った。反応開始から 14, 24, 38時間目にグルコースを 54g反応液に添カロした。また、反応開始 24時間後に 0. 5Mの UMP溶液 66mLを反応液に添カロした。

経時的に反応液を分析した結果を図 4に示す。ジャーフアーメンターで反応した場合でも、 UDP— GalNAcが合成され、反応 40時間で UDP— GalNAcは 35mMに達した。

[0086] <受託証> ai^:

S

SEQUENCE LISTING

110 YAMASA CORPORATION

120 Process for producing uridine 5'— diphospho—N— acetylgalactosamine130 5043-OOlPCT

150 JP P2004-306783

151 2004-10-21

160 4

170 Patentln Ver. 2.1 <211 〉30

く 212〉 DNA

<213> Artincial Sequence

<220>

<223> primer for amplification of GALK2 gene く 400〉 1

cggggatcca tggctacaga gagccctgct

〈210〉 2

く 211〉 30

<212> DNA

<213> Artincial Sequence

<220>

<223> primer for amplification of GALK2 gene く 400〉 2

tacgtcgact taggcctcaa gcaaaaccaa

<210> 3

く 211〉 19

く 212〉 DNA

<213> Artincial Sequence

<220>

く 223〉 primer for amplification of glmU gene く 400〉 3

gagcggataa caatttcac 19 く 210〉 4

く 211〉 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence く 223〉 primer for amplification of glmU gene 〈400〉 4

ccaggatccc tttttcttta ccggacgacg

Claims

請求の範囲

[1] ゥリジン 5'—トリリン酸（UTP)と N ァセチルガラタトサミン 1—リン酸（GalNAcl— P) カもゥリジン 5'—ジリン酸一 N ァセチルガラタトサミン（UDP - GalNAc)を酵素的に製造する方法において、酵素として微生物 (但し、病原性微生物を除く）由来のゥリジン 5 '—ジリン酸 N ァセチルダルコサミンピロホスホリラーゼ（UDP - GlcNAcピ口ホスホリラーゼ）を用、ることを特徴とする UDP - GalNAcの製造法。

[2] 前記 UDP - GlcNAcピロホスホリラーゼが微生物由来の UDP - GlcNAcピロホスホリラーゼ遺伝子を用いた組換え DNA手法で調製されたものであることを特徴とする請求項 1記載の UDP— GalNAcの製造法。

[3] 前記微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼ遺伝子が大腸菌由来の UDP

GlcNAcピロホスホリラーゼ遺伝子 (glmU)であることを特徴とする請求項 2記載の

UDP GalNAcの製造法。

[4] 前記 UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼによる UDP— GalNAcの合成に際して、反応系に生成するピロリン酸を分解する酵素を添加することを特徴とする請求項 1記載の UDP— GalNAcの製造法。

[5] 前記 GalNAcl— P力 N ァセチルガラタトサミンキナーゼを用い、 N ァセチルガラタトサミンとリン酸供与体力反応系内で調製したものであることを特徴とする請求項 1記載の UDP— GalNAcの製造法。

[6] 前記リン酸供与体が、アデノシン 5'—トリリン酸 (ATP)であることを特徴とする請求項

5記載の UDP— GalNAcの製造法。

[7] 前記アデノシン 5'—トリリン酸 (ATP)が酵母菌体によって生成されるものであることを特徴とする請求項 6記載の UDP— GalNAcの製造法。

[8] N ァセチルガラタトサミンキナーゼが動物由来の N ァセチノレガラクトサミンキナーゼ遺伝子を用いた組換え DNA手法で調製されたものであることを特徴とする請求項

5記載の UDP— GalNAcの製造法。

[9] 前記 N ァセチルガラタトサミンキナーゼカ組換え DNA手法を用い、微生物由来の蛋白質との融合蛋白質の形で調製されたものであることを特徴とする請求項 5記載の UDP— GalNAcの製造法。

[10] 動物由来の N—ァセチルガラタトサミンキナーゼ遺伝子（GALK2)を他の微生物由来の蛋白質をコードする遺伝子の 3'末端の下流に連結することで前記融合蛋白質を調整することを特徴とする請求項 9記載の UDP— GalNAcの製造法。

[11] 前記 N—ァセチルガラタトサミンキナーゼカ微生物由来の UDP— GlcNAcピロホスホリラーゼとの融合蛋白質の形で調製されたものを用いることを特徴とする請求項 5 記載の UDP— GalNAcの製造法。

[12] 前記 N—ァセチルガラタトサミンキナーゼにより調製された GalNAcl— Pの分解を防止するフッ化塩を添加することを特徴とする請求項 5記載の UDP— GalNAcの製造法。

[13] 前記 UTPの一部若しくは全部を用いる代わりに、微生物菌体ゃ酵素を用いた UTP 生成 Z再生系を併用したことを特徴とする請求項 1記載の UDP— GalNAcの製造法。

[14] 前記 UTPの一部若しくは全部を用いる代わりに、ゥリジン 5'—モノリン酸 (UMP)と酵母菌体を用いた UMPからの UTP生成系を併用したことを特徴とする請求項 1記載の UDP— GalNAcの製造法。

[15] 前記酵母菌体として、サッカロミセス属、チゴサッカロミセス属、カンディダ属、トルロプシス属、ハンセヌラ属、デバリオミセス属から選ばれる 1又は 2以上の酵母由来の菌体を用、ることを特徴とする請求項 14記載の UDP - GalNAcの製造法。

[16] 前記酵母菌体として、乾燥酵母菌体を用いることを特徴とする請求項 14記載の UD

P— GalNAcの製造法。

[17] 前記酵母菌体を用いる反応に、無機リン酸を添加することを特徴とする請求項 14記載の UDP— GalNAcの製造法。

[18] 前記酵母菌体を用いる反応に、所要のエネルギー源を添加することを特徴とする請求項 14記載の UDP— GalNAcの製造法。