JP2009027971A - Nアセチルガラクトサミンの製造方法 - Google Patents
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【解決手段】出発原料であるNアセチルグルコサミンを、酵素を含む反応溶液と、ATPおよびUDP−糖の存在下で作用させることにより、Nアセチルガラクトサミンを製造する方法。
【選択図】なし
Description
[1] 出発原料であるNアセチルグルコサミンを、ATPおよびUDP−糖の存在下で、以下の(i)〜(iii)の酵素と同時に作用させることにより、Nアセチルガラクトサミンを製造する方法:
(i) UDP−NアセチルグルコサミンをUDP−Nアセチルガラクトサミンに変換する酵素;
(ii) UDP−NアセチルグルコサミンとNアセチルガラクトサミン1−リン酸間でUMP単位の交換反応をする酵素;ならびに
(iii) NアセチルグルコサミンとATPからNアセチルグルコサミン1−リン酸とADPを生じる酵素およびNアセチルガラクトサミンとATPからNアセチルガラクトサミン1−リン酸とADPを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素。
[3] UDP−糖が、UDP−グルコースまたはUDP−Nアセチルグルコサミンである、[2]の方法。
[5] UDP−グルコース4−エピメラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に由来する、[4]の方法。
[7] UDP−グルコース−ヘキソース1リン酸ウリジリルトランスフェラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に由来する、[6]の方法。
[9] Nアセチルヘキソサミン1キナーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に由来する、[8]の方法。
[11] 作用させる全ての酵素が、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に由来する[10]の方法。
[12] さらに、製造されたNアセチルガラクトサミンを精製する工程を含む、[1]〜[9]のいずれかの方法。
図中の略語:
GlcNAc:Nアセチルグルコサミン
GlcNAc1P:Nアセチルグルコサミン1−リン酸
UDP−GalNAc:UDP−Nアセチルガラクトサミン
UDP−GlcNAc:UDP−Nアセチルグルコサミン
GalNAc1P:Nアセチルガラクトサミン1−リン酸
GalNAc:Nアセチルガラクトサミン。
Nアセチルヘキソサミン1キナーゼの調製
ビフィドバクテリウム・ロンガムのNアセチルヘキソサミン1キナーゼの遺伝子配列(配列番号1)を基に、以下のプライマー作製し:
フォーワードプライマー:aacggaccccatatgaccgaaagcaatgaagttttattc(配列番号2)
リバースプライマー:gctgacctcgagcctggcagcctccatgatgtcggctac(配列番号3)、
ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM 1217株のゲノムDNAを鋳型としてNアセチルヘキソサミン1キナーゼのORF全長をPCRにより増幅した。
ビフィドバクテリウム・ロンガムのUDPグルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの配列(配列番号4)を基に、以下のプライマーを作製し:
フォーワードプライマー:gatatatacatatgaacgatcagctgaccgaggta(配列番号5)
リバースプライマー:tgacctctcgagcctagcggcaaaaccaaggctttcga(配列番号6)、
ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM 1217株のゲノムDNAを鋳型としてUDPグルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝子をPCRにより増幅した。
ビフィドバクテリウム・ロンガムのUDPグルコース−4−エピメラーゼの配列(配列番号7)を基に、以下のプライマーを作製し:
フォーワードプライマー:gatatacatatgactactgttctggttacgggc(配列番号8)
リバースプライマー:ctgctcctcgagctccgcgtcgcggaaaccgttggggttc(配列番号9)、
ビフィドバクテリウム・ロンガムJCM 1217株のゲノムDNAを鋳型としてUDPグルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ遺伝子をPCRにより増幅した。
以上のようにして得た酵素を以下の反応液に用いた。
[反応液1]
100mM MOPS緩衝液(pH6.5)中に、最終濃度が600mMのNアセチルグルコサミン、0.6mMのUDP−Nアセチルグルコサミン、2.0mMのATP、10mMの塩化マグネシウム、0.05%アジ化ナトリウム、1.0U/mlのNアセチルヘキソサミン1キナーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)、0.05U/mlのUDPグルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)、50U/mlのUDPグルコース−4−エピメラーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)となるように、それぞれを加えて反応液1を調製した。
100mM MOPS緩衝液(pH6.5)中に、最終濃度が600mMのNアセチルグルコサミン、0.6mMのUDP−グルコース、0.75mMのATP、10mMの塩化マグネシウム、0.05%アジ化ナトリウム、10U/mlのNアセチルヘキソサミンキナーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)、0.05U/mlのUDPグルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)、100U/mlのUDPグルコース−4−エピメラーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)となるように、それぞれを加えて反応液2を調製した。
100mM MOPS緩衝液(pH6.5)中に、最終濃度が600mMのNアセチルグルコサミン、0.2mMのUDP−グルコース、1.0mMのATP、10mMの塩化マグネシウム、0.05%アジ化ナトリウム、10U/mlのNアセチルヘキソサミンキナーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)、0.05U/mlのUDPグルコース−ヘキソース−1−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)、100U/mlのUDPグルコース−4−エピメラーゼ(ビフィドバクテリウム・ロンガム由来精製酵素)となるように、それぞれを加えて反応液を調製した。
実施例2で調製した反応液1、反応液2、および反応液3をそれぞれ恒温器で30℃、5日間インキュベートし、酵素反応を行った。反応終了後、反応液を適宜希釈して高速液体クロマトグラフィー(島津製作所製)を用いて、NアセチルグルコサミンとNアセチルガラクトサミンの濃度を調べ、モル収率を算出した。
NアセチルグルコサミンとNアセチルガラクトサミンの分離は、カラム剤:イオン交換樹脂(ダウエックス、ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー製)、流速:0.5ml/min、移動相:水、の条件下で行うことができる。反応液を電気透析し脱塩した後、サンプル5mlをカラム(2.6cm×40cm、200mlカラム剤)に供し、4mlずつ分画した。各フラクションをHPLCで分析した結果を図2に示す。図2に示すようにNアセチルグルコサミンとNアセチルガラクトサミンを分離し、Nアセチルガラクトサミンを精製することができる。
Claims (12)
- 出発原料であるNアセチルグルコサミンを、ATPおよびUDP−糖の存在下で、以下の(i)〜(iii)の酵素と同時に作用させることにより、Nアセチルガラクトサミンを製造する方法:
(i) UDP−NアセチルグルコサミンをUDP−Nアセチルガラクトサミンに変換する酵素;
(ii) UDP−NアセチルグルコサミンとNアセチルガラクトサミン1−リン酸間でUMP単位の交換反応をする酵素;ならびに
(iii) NアセチルグルコサミンとATPからNアセチルグルコサミン1−リン酸とADPを生じる酵素およびNアセチルガラクトサミンとATPからNアセチルガラクトサミン1−リン酸とADPを生じる酵素、またはその両活性を持つ酵素。 - UDP−糖が、UDP−グルコース、UDP−ガラクトース、UDP−Nアセチルグルコサミン、UDP−Nアセチルガラクトサミンおよびそれらの少なくとも2つの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- UDP−糖が、UDP−グルコースまたはUDP−Nアセチルグルコサミンである、請求項2に記載の方法。
- (i)の酵素が、UDP−グルコース4−エピメラーゼである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- UDP−グルコース4−エピメラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に由来する、請求項4に記載の方法。
- (ii)の酵素が、UDP−グルコース−ヘキソース1リン酸ウリジリルトランスフェラーゼである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- UDP−グルコース−ヘキソース1リン酸ウリジリルトランスフェラーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に由来する、請求項6に記載の方法。
- (iii)の酵素が、Nアセチルヘキソサミン1キナーゼである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- Nアセチルヘキソサミン1キナーゼが、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に由来する、請求項8に記載の方法。
- (i)の酵素としてUDP−グルコース4−エピメラーゼ、(ii)の酵素としてUDP−グルコース−ヘキソース1リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、(iii)の酵素としてNアセチルヘキソサミン1キナーゼを同時に作用させる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 作用させる全ての酵素が、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)に由来する、請求項10に記載の方法。
- さらに、製造されたNアセチルガラクトサミンを精製する工程を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
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