JP2004261127A - ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃヌクレオチドを工業的規模で大量かつ安価に生産できる方法を提供する。
【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド又はＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド又はＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質。（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質。
【選択図】 なし
【解決手段】下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド又はＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド又はＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法。（Ａ）特定のアミノ酸配列を含むタンパク質。（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＧｌｃＮＡｃヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
まず、本明細書中で共通して用いる略号について説明する。
【０００３】
ＡＤＰ：アデノシン ５’−二リン酸
ＤＭＡＢ：ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）
ｄＴＤＰ：デオキシチミジン５’−二リン酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
Ｇａｌ：ガラクトース
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｇｌｃ：グルコース
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＩＰＴＧ：イソプロピル １−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ １−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）
ＮＡＤ＋：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＵＤＰ：ウリジン５’−二リン酸
タンパク質糖鎖の構成成分であるＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃは、稀少糖であり、生体内ではＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ Ｃ４−エピメラーゼによって可逆的に生合成される。しかし、これらの稀少糖を工業的規模で大量かつ安価に生産できる方法は未だ確立されていない。特に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは高価であるのに対して、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは安価に入手できることから、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを工業的規模で大量かつ安価に生産できる方法が望まれていた。
【０００４】
非特許文献１には、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＧａｌＥタンパク質の全アミノ酸配列とｇａｌＥ遺伝子の全ヌクレオチド配列が開示されている。
【０００５】
【非特許文献１】
シュローゲル，Ｏ．（Ｓｃｈｒｏｇｅｌ，Ｏ．）ら、“バチルス・サブチリス ｏｒｆ １，２，３，４， ｐｅｐＴ 及び ｇａｌＥ遺伝子（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｏｒｆｓ １，２，３，４， ｐｅｐＴ ａｎｄ ｇａｌＥ ｇｅｎｅｓ）”、Ｘ９９３３９、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成９年２月１３日、ＮＣＢＩ、［平成１５年３月３日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１４２９２５３＆ｄｏｐｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ＞しかしＧａｌＥが、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとを相互に変換する活性を有すること、及び、ＧａｌＥが有するこの活性は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性よりも、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性の方がより高いことについては、開示も示唆もない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＧａｌＥやその融合タンパク質、ＧａｌＥを有効成分とする触媒、ＧａｌＥを用いるＧｌｃＮＡｃヌクレオチドやＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法等を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＧａｌＥやその融合タンパク質、ＧａｌＥを有効成分とする触媒、ＧａｌＥを用いるＧｌｃＮＡｃヌクレオチドやＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法等を提供するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質（以下「本発明タンパク質」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質。
【０００９】
本発明タンパク質は、配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１０】
また本発明は、本発明タンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質（以下「本発明融合タンパク質」という）を提供する。本発明融合タンパク質は、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１１】
また本発明は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する能力を有する触媒（以下「本発明触媒１」という）を提供する。
【００１２】
また本発明は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する能力を有する触媒（以下「本発明触媒２」という）を提供する。
【００１３】
以下、本発明触媒１と本発明触媒２とを併せて、単に「本発明触媒」という。
【００１４】
また本発明は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒１を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドの生産方法（以下「本発明生産方法１」という）を提供する。
【００１５】
また本発明は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒２を、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法（以下「本発明生産方法２」という）を提供する。
【００１６】
以下、「本発明生産方法１」及び「本発明生産方法２」とを併せて、単に「本発明生産方法」という。
【００１７】
本発明生産方法における「ヌクレオチド」は、ＵＤＰ又はｄＴＤＰであることが好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、発明の実施の形態によって詳説する。
本発明タンパク質
本発明タンパク質は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質。
【００１９】
なお、天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように（Ａ）のタンパク質に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められない（Ｂ）のタンパク質も、本発明タンパク質に包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４））。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には（Ａ）のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質である。上記の（Ｂ）のタンパク質は、このようなタンパク質を規定するものである。
【００２０】
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基からなるタンパク質の場合、２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。
【００２１】
（Ｂ）のタンパク質は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有する必要がある。
【００２２】
このような活性を有するか否かは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として、目的のタンパク質を作用させることにより、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが産生されるか否かを検出することによって判定できる。例えば、後述の実施例に示すようなＤＭＡＢアッセイや、ＨＰＬＣによる解析、キャピラリー電気泳動による解析等によって調べることができる。
【００２３】
このような方法によって、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を保持しているアミノ酸の欠失、置換、挿入又は転位を有する変異体を容易に選択することができる。
【００２４】
本発明タンパク質は、なかでも配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００２５】
本発明タンパク質の製造方法は特に限定されず、天然物から上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を単離してもよく、化学合成等によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよく、遺伝子工学的手法によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよい。遺伝子工学的手法によって本発明タンパク質を製造する具体的方法については、後述する「本発明融合タンパク質」の説明を参照されたい。
＜２＞本発明融合タンパク質
本発明融合タンパク質は、本発明タンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質である。
【００２６】
本明細書における「他のペプチド」という用語は、「ポリペプチド」を含む概念として用いる。
【００２７】
本発明融合タンパク質としては、本発明タンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質等が例示される。このような本発明融合タンパク質は、精製又は分析を容易にすることができるというメリットがある。上記マーカーペプチドとしては例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、ＦＬＡＧとの融合タンパク質については抗ＦＬＡＧ抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。
【００２８】
ここで好ましいのは、配列番号４のアミノ酸配列で示されるペプチド（Ｈｉｓタグ）との融合タンパク質である。このＨｉｓタグは、配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列の直前に融合させることが好ましい。すなわち本発明融合タンパク質は、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００２９】
この融合タンパク質は、後述の実施例に示す通り、配列番号３のヌクレオチド配列を、配列番号１の第６１番目のヌクレオチドの直前の位置に連続して結合させたＤＮＡを発現させることによって製造することができる。
【００３０】
本発明融合タンパク質（本発明タンパク質）は、以下の通り製造することができる。
【００３１】
まず、本発明タンパク質のうち、前記（Ａ）のタンパク質（配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ａ）」という）を用意する。このＤＮＡは、配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なったヌクレオチド配列を有するＤＮＡが存在するが、配列番号１におけるヌクレオチド番号６１〜１０８６で示されるヌクレオチド配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。このＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ９９３３９として登録されている。
【００３２】
また、本発明タンパク質のうち、前記（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ｂ）」という）についても、前記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、例えば「ＤＮＡ（ａ）」若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００３３】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００３４】
上記ＤＮＡ（ａ）又はＤＮＡ（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いたタンパク質の発現は、当該ＤＮＡが保持されたベクター（好ましくは発現ベクター）を用いて行うことが好ましい。ＤＮＡのベクターへの組込みは、通常の方法によって行うことができる。
【００３５】
ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系としては、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）と、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＥＺＺＺ１８（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＣＨ１１０（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＢＡＤ（インビトロゲン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社製）又はｐＳＥ４２０（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、ＣＯＳ細胞や３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などの哺乳類細胞と、ｐＧＩＲ２０１（Ｋｉｔａｇａｗａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ， Ｊ． Ｃ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， １３９４−１４０１）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ．， ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８， ５３２２）、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ， Ｈ．， Ｙａｍａｎｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｊ． （１９９１） Ｇｅｎｅ １０８， １９３−２００）、ｐＣＭＶ−２（イーストマン コダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）製）、ｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら，Ｍｅｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０， ２７（１９９０））又はｐＳＶＬ（ファルマシア バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせのほか、宿主細胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に原核細胞（特に大腸菌細胞）とｐＥＴ１５ｂとの組み合わせが好ましい。
【００３６】
ＤＮＡを組込むベクターは、目的とするタンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることができる。ＤＮＡからのタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、通常の方法に従って行うことができる。
【００３７】
例えば、目的とするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを適当な宿主に導入することによって宿主を形質転換し、この形質転換体を生育させ、その生育物から発現されたタンパク質を採取することによって行うことができる。
【００３８】
ここで「生育」とは、形質転換体である細胞や微生物自体の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養された宿主細胞・分泌物・排出物等を包含する概念である。生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わせて適宜選択できる。
【００３９】
生育物からのタンパク質の採取も、タンパク質の公知の抽出・精製方法によって行うことができる。
【００４０】
例えば目的とするタンパク質が、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。また目的とするタンパク質が細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によって目的とするタンパク質を抽出することができ、その抽出物をそのまま用いてもよい。
【００４１】
これらの培地や抽出物から、タンパク質をさらに精製することもできる。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、目的とするタンパク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００４３】
目的とするタンパク質が製造されたか否かは、アミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析することによって確認することができる。
＜３＞本発明触媒
本発明触媒１は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する能力を有する触媒である。また本発明触媒２は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する能力を有する触媒である。
【００４４】
本発明触媒は、本発明タンパク質及び本発明融合タンパク質の少なくとも一方を含有していればよい。すなわち本発明触媒としては、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質自体をそのまま本発明触媒としてもよく、両者の混合物を用いてもよく、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質に加えて、これらのタンパク質に悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の成分を含有させてもよい。
【００４５】
本発明触媒の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合し、又は担体に包括させた固定化酵素形態のいずれであってもよい。
【００４６】
本発明触媒１はＧａｌＮＡｃヌクレオチドをＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに変換する際に用いることができる。また本発明触媒２はＧｌｃＮＡｃヌクレオチドをＧａｌＮＡｃヌクレオチドに変換する際に用いることができる。また本発明触媒１と本発明触媒２の有効成分は同一であることから、本発明触媒を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドからＧｌｃＮＡｃヌクレオチドへの変換と、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドからＧａｌＮＡｃヌクレオチドへの変換を同一反応系内で同時に行うために用いてもよい。
＜４＞本発明生産方法
本発明生産方法１は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒１を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドの生産方法である。また本発明生産方法２は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒２を、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法である。
【００４７】
本発明生産方法における「ヌクレオチド」は、ＵＤＰ又はｄＴＤＰであることが好ましい。
すなわち、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドやＧｌｃＮＡｃヌクレオチドは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃやＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、あるいはｄＴＤＰ−ＧａｌＮＡｃやｄＴＤＰ−ＧｌｃＮＡｃであることが好ましい。
【００４８】
本発明生産方法においては、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質及び本発明触媒の少なくともいずれか１つを、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドやＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させればよい。これらのタンパク質と、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドやＧｌｃＮＡｃヌクレオチドとの「接触」の方法は、これらの分子が相互に接触して酵素反応が生ずる状態となる限りにおいて特に限定されず、例えば前者に後者を添加してもよく、後者に前者を添加してもよく、両者を同時に添加してもよい。
【００４９】
また、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒を担体（例えば、ゲル、ビーズ、膜、プレート等）に固定させ、これにＧａｌＮＡｃヌクレオチド及びＧｌｃＮＡｃヌクレオチドの少なくとも一方を接触させてもよい。
【００５０】
両者を接触させた後の反応の条件は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒が作用する条件である限りにおいて特に限定されない。
【００５１】
例えばこれらのタンパク質の至適ｐＨ付近で反応させることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。例えば、ｐＨ７付近で反応させることが好ましい。
【００５２】
またこのときの温度も、これらのタンパク質の活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、３５℃〜３７℃程度が例示される。
【００５３】
また本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒の活性を増加させる物質がある場合には、その物質を添加してもよい。例えば、Ｍｇ等の二価イオンを用いることによって、これらタンパク質の活性が上昇する。
【００５４】
逆に、Ｃｕ等を用いた場合には本発明タンパク質、本発明融合タンパク質及び本発明触媒の活性が阻害されることから、本発明生産方法におけるこのような二価イオンの使用は避けることが好ましい。
【００５５】
反応時間は、ｐＨ条件、温度条件、作用させるタンパク質及び基質の量、並びにどの程度の生産量を所望するか等によって適宜調節することができる。反応時間を長くすれば生産量を増すことができ、反応時間を短くすれば生産量を減ずることができる。
【００５６】
また本発明生産方法には、このような接触工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
【００５７】
本発明生産方法により、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド又はＧｌｃＮＡｃヌクレオチドから、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド又はＧａｌＮＡｃヌクレオチドを生産することができる。これらが生産されたか否かは、例えば、後述の実施例に示すようなＤＭＡＢアッセイや、ＨＰＬＣによる解析、キャピラリー電気泳動による解析等によって調べることができる。
【００５８】
また、生成物中からＧｌｃＮＡｃヌクレオチド又はヌクレオチド−ＧａｌＮＡを単離する方法等は、公知の方法によって行うことができる。
【００５９】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらによって本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
１．ＧａｌＥタンパク質の調製
（１）ｇａｌＥのクローニングと発現
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８のｇａｌＥ遺伝子（配列番号１のヌクレオチド番号６１から１０８６で示されるＤＮＡ）を、常法に従ってＰＣＲ増幅した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。
【００６０】
ｇａｌＥ１５−Ｆ ｃａｔａｔｇｇｃａａｔａｃｔｔｇｔｔａｃｔｇｇ（配列番号５）
ｇａｌＥ１５−Ｒ ｇｇａｔｃｃｔｔａｔｔｃｃｇｃａｃｔｃｔｔａｔａｃｃ（配列番号６）
１０２９ｂｐのＰＣＲ増幅断片をｐＵＣ１９に挿入した後、シーケンスを確認した。これをｐＥＴ１５ｂ（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎ ｔａｇ， Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅ１−ＢａｍＨ１サイトに挿入して発現プラスミドｐＥＴｇａｌＥ１５を構築した。この発現プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ＧａｌＥ発現株を作製した。
【００６１】
ＧａｌＥタンパク質の発現は、以下の通り行った。
【００６２】
ＧａｌＥ発現株を、アンピシリン（３３μｇ／１００ｍｌ）を含有する１００ｍｌ ＬＢ培地（１Ｌ中に、１０ｇ ポリペプトン、５ｇ 酵母抽出物、１０ｇ ＮａＣｌを含有する）中、３７℃で４時間培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近に達した時、ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭになるよう添加した。ＩＰＴＧ添加後３７℃で４時間培養した後、６，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄して菌体を回収した。
（２）ＧａｌＥタンパク質の精製
回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕した。超音破砕の強度は「１８０」とし、４℃で５分間破砕した。破砕液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して細胞抽出液を回収した。磁性ニッケルカラム（Ｎｉ−ＮＴＡカラム；ＱＩＡＧＥＮ社製）をＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール；ｐＨ８．０）で平衡化した。細胞抽出液をカラムに流し、イミダゾール濃度を５０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭの順に徐々に上昇させてタンパク質を溶出させた。その後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムへの結合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【００６３】
発現されたＧａｌＥタンパクが含まれる画分を透析した。カットオフ ３０００ Ｄａの透析膜を使用し、透析外液としては２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用した。その後、さらに限外ろ過によってタンパク質液を約６倍の濃度まで濃縮した。この濃縮後の液を「ＧａｌＥ溶液」として、酵素活性を測定した。
（３）酵素活性の測定
上記の（２）で得られたＧａｌＥ溶液を用いて、酵素活性を測定した。酵素活性の測定は、以下の（ａ）又は（ｂ）の方法で行った。
（ａ）ＤＭＡＢアッセイ
（ｉ）「ＧａｌＥ溶液」（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液）に、終濃度１．０ｍＭ となるように基質（１７．１μｇ／３５μｌ）を添加して５０μｌとした。この溶液中に含まれるタンパク質（ＧａｌＥ）の量は、１．６μｇであった。
（ｉｉ）３７℃で２０分〜６０分間インキュベートした後、０．１Ｍ ＨＣｌを１０μｌ添加し、次いで６分間煮沸することによって反応を完全に停止させた。その後０．１Ｍ ＮａＯＨを１０μｌ添加して中和した。
（ｉｉｉ）０．２Ｍの四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．１）を１４０μｌ添加して、すぐに３分間煮沸した。
（ｉｖ）１０５０μｌのＤＭＡＢ試薬を添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＭＡＢ試薬は以下の通り調製した。
【００６４】
氷酢酸／ＨＣｌ＝９／１（ｖ／ｖ）の溶液でＤＭＡＢの１０％溶液を調製し、このＤＭＡＢ溶液を使用直前にさらに氷酢酸で１／１０に希釈して、ＤＭＡＢ試薬とした。
（ｖ）インキュベート後、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（ｂ）ＵＤＰ−グルコースオキシダーゼ−結合アッセイ（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓｓａｙ）
（ｉ）「ＧａｌＥ溶液」（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液）に、終濃度１．０ｍＭ となるように基質を添加して４４μｌとした。この溶液中に含まれるタンパク質（ＧａｌＥ）の量は、１．４μｇであった。
【００６５】
また、ＵＤＰ−Ｇｌｃ及びＵＤＰ−Ｇａｌの相互変換には、ＮＡＤ＋の存在が必須となることから、反応液中に１ｍＭのＮＡＤ＋を含有するものについても同様にして測定した。
（ｉｉ）３７℃で３０分〜２時間インキュベートした後、０．１Ｍ ＨＣｌを添加し、次いで６分間煮沸することによって反応を完全に停止させた。その後０．１ＮのＮａＯＨを添加して中和した。
（ｉｉｉ）以下の試薬を５０ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解し、この溶液４００μｌを反応液に添加した。
【００６６】
２２Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ｐＨ５．５））
７Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）
０．３ｍｇ ｏ−ジアニシジン（ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ）
（ｉｖ）３７℃で３０分間インキュベートした後、６Ｍ ＨＣｌを６００μｌ添加した。
（ｖ）その後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（４）至適反応温度
酵素反応を２０℃〜６０℃の範囲で行い、その酵素活性の変化をＤＭＡＢアッセイで解析した。
（５）至適反応ｐＨ
酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）又はグリシン（ｐＨ９．０〜１０．０）（いずれも２０ｍＭ）中で、７μｇのＧａｌＥと１ｍＭの基質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）（全容量５０μｌ）を３７℃で３０秒間反応させた。
（６）熱安定性
ＧａｌＥ溶液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．０）中で２０℃〜６０℃の間で１時間インキュベートした後、４℃で保存して、ＤＭＡＢアッセイに付した。
（７）ｐＨ安定性
上記の至適反応ｐＨの解析で用いた緩衝液中でＧａｌＥを４℃で一晩インキュベートしたものをＤＭＡＢアッセイに付した。酵素反応の条件は、前記のＤＭＡＢアッセイによる至適反応ｐＨの解析と同様である。
（８）二価イオンの要求性
二価の金属イオン（Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋又はＺｎ２＋）又はＥＤＴＡを、それぞれ終濃度４ｍＭになるように添加して、ＤＭＡＢアッセイで解析した。
（９）Ｋｍ値及びＶｍａｘの測定
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．０）中で、各濃度の基質に０．６μｇのＧａｌＥを添加して、３５℃で３０秒間反応させてＤＭＡＢアッセイによって解析した。
（９）ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣ（陰イオン交換クロマトグラフィー）は、以下の通り行った。
５μｌのサンプル溶液をＰａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸカラム（４．６ ｘ １２５ｍｍ）にアプライした。溶出は、３０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．５）を用いて、流速１ｍｌ／分、温度３７℃で行った。溶出された糖ヌクレオチドは、２６０ｎｍにおける吸光度で検出した。
２．実験の結果
（１）Ｎｉ−ＮＴＡカラムへの結合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、約３７ｋＤａ付近に一本のバンドが出現したことから、ＧａｌＥの発現及び精製が確認された。
（２）基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて、ＤＭＡＢアッセイを行った結果を図１に示す。図１における「実線（丸印）」は基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用いた場合の、「破線（四角印）」は基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【００６７】
この結果、発現されたＧａｌＥは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対して活性（触媒能）を持つことが確認された。また図１から、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが優先的にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ変換されていることが示された。このことから、発現されたＧａｌＥを用いるとＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する反応の方が進みやすいことが確認された。
【００６８】
上記のＤＭＡＢアッセイと同様の条件で、２時間反応させることによって得られた生産物をＨＰＬＣで解析した。その結果を図２に示す。図２の「１」は、基質がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ単独の場合（ＧａｌＥの非存在下）における結果を、「２」は基質がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ単独の場合（ＧａｌＥの非存在下）の結果を、「３」は基質がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ単独の場合（ＧａｌＥの存在下）の結果を、「４」は基質がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ単独の場合（ＧａｌＥの存在下）の結果をそれぞれ示す。
【００６９】
この結果からも、発現されたＧａｌＥを用いるとＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する反応の方が進みやすいことが確認された。
（３）ＵＤＰ−グルコースオキシダーゼ−結合アッセイを行った結果を図３に示す。図３における「三角印」は基質としてＵＤＰ−Ｇａｌを用いた場合の、「丸印」は基質としてＵＤＰ−Ｇｌｃを用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【００７０】
この結果、発現されたＧａｌＥは、ＵＤＰ−ＧａｌとＵＤＰ−Ｇｌｃに対しても活性（触媒能）を持つことが確認された。また図３からＵＤＰ−Ｇａｌが優先的にＵＤＰ−Ｇｌｃに変換されていることが示された。このことから、発現されたＧａｌＥを用いるとＵＤＰ−ＧａｌをＵＤＰ−Ｇｌｃに変換する反応の方が進みやすいことが確認された。
（４）至適反応温度
基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて至適反応温度を検討した結果を図４に示す。いずれを基質として用いた場合であっても、至適反応温度は３５℃〜３７℃の間であった。
（５）至適反応ｐＨ
ＤＭＡＢアッセイによって解析した結果を図５に示す。図５の左側は、基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用いた場合の結果を、右側は、基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いた場合の結果を示す。この結果、いずれの基質を用いた場合においても、至適反応ｐＨは７付近にあることが示された。
（６）熱安定性
熱安定性の解析結果を図６に示す。この結果、少なくとも３０℃以下（ｐＨ７．０、１時間）で安定であることが示された。
（７）ｐＨ安定性
ｐＨ安定性の解析結果を図７に示す。この結果、少なくともｐＨ６〜８の間（４℃、一晩）で安定であることが示された。
（８）二価イオンの要求性
種々の二価の金属イオンを用いてＤＭＡＢアッセイを行った。結果を以下に示す。Ｃｕを用いた場合にはＧａｌＥの活性が大きく阻害された。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性（触媒能）は、Ｃｏ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉによって上昇した。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性（触媒能）は、Ｍｇによって上昇した。
【００７１】
【表１】
【００７２】
（９）Ｋｍ値及びＶｍａｘの測定
Ｋｍ値及びＶｍａｘの値を算出した。結果を以下に示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
【００７５】
【発明の効果】
本発明タンパク質及び本発明融合タンパク質は本発明触媒に利用することができ極めて有用である。また本発明触媒を用いると、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃヌクレオチドを工業的規模で大量かつ安価に製造でき、これによって本発明生産方法が提供されることから極めて有用である。本発明生産方法も、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃヌクレオチドを簡便、迅速、大量、安価に生産することができ極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、ＤＭＡＢアッセイを行った結果を示す。
【図２】基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、ＨＰＬＣ解析を行った結果を示す。
【図３】基質としてＵＤＰ−Ｇａｌ又はＵＤＰ−Ｇｌｃを用い、ＵＤＰ−グルコースオキシダーゼ−結合アッセイを行った結果を示す。
【図４】基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、至適反応温度をＤＭＡＢアッセイで解析した結果を示す。
【図５】基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、至適反応ｐＨをＤＭＡＢアッセイで解析した結果を示す。
【図６】熱安定性をＤＭＡＢアッセイで解析した結果を示す。
【図７】ｐＨ安定性をＤＭＡＢアッセイで解析した結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なＧｌｃＮＡｃヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
まず、本明細書中で共通して用いる略号について説明する。
【０００３】
ＡＤＰ：アデノシン ５’−二リン酸
ＤＭＡＢ：ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド（ｐ−ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ）
ｄＴＤＰ：デオキシチミジン５’−二リン酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
Ｇａｌ：ガラクトース
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン
Ｇｌｃ：グルコース
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチルグルコサミン
ＩＰＴＧ：イソプロピル １−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ １−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）
ＮＡＤ＋：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＵＤＰ：ウリジン５’−二リン酸
タンパク質糖鎖の構成成分であるＧｌｃＮＡｃ及びＧａｌＮＡｃは、稀少糖であり、生体内ではＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ Ｃ４−エピメラーゼによって可逆的に生合成される。しかし、これらの稀少糖を工業的規模で大量かつ安価に生産できる方法は未だ確立されていない。特に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは高価であるのに対して、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは安価に入手できることから、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを工業的規模で大量かつ安価に生産できる方法が望まれていた。
【０００４】
非特許文献１には、バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＧａｌＥタンパク質の全アミノ酸配列とｇａｌＥ遺伝子の全ヌクレオチド配列が開示されている。
【０００５】
【非特許文献１】
シュローゲル，Ｏ．（Ｓｃｈｒｏｇｅｌ，Ｏ．）ら、“バチルス・サブチリス ｏｒｆ １，２，３，４， ｐｅｐＴ 及び ｇａｌＥ遺伝子（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｏｒｆｓ １，２，３，４， ｐｅｐＴ ａｎｄ ｇａｌＥ ｇｅｎｅｓ）”、Ｘ９９３３９、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成９年２月１３日、ＮＣＢＩ、［平成１５年３月３日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝１４２９２５３＆ｄｏｐｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ＞しかしＧａｌＥが、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとを相互に変換する活性を有すること、及び、ＧａｌＥが有するこの活性は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性よりも、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性の方がより高いことについては、開示も示唆もない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＧａｌＥやその融合タンパク質、ＧａｌＥを有効成分とする触媒、ＧａｌＥを用いるＧｌｃＮＡｃヌクレオチドやＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法等を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ＧａｌＥやその融合タンパク質、ＧａｌＥを有効成分とする触媒、ＧａｌＥを用いるＧｌｃＮＡｃヌクレオチドやＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法等を提供するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質（以下「本発明タンパク質」という）を提供する。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質。
【０００９】
本発明タンパク質は、配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１０】
また本発明は、本発明タンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質（以下「本発明融合タンパク質」という）を提供する。本発明融合タンパク質は、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００１１】
また本発明は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する能力を有する触媒（以下「本発明触媒１」という）を提供する。
【００１２】
また本発明は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する能力を有する触媒（以下「本発明触媒２」という）を提供する。
【００１３】
以下、本発明触媒１と本発明触媒２とを併せて、単に「本発明触媒」という。
【００１４】
また本発明は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒１を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドの生産方法（以下「本発明生産方法１」という）を提供する。
【００１５】
また本発明は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒２を、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法（以下「本発明生産方法２」という）を提供する。
【００１６】
以下、「本発明生産方法１」及び「本発明生産方法２」とを併せて、単に「本発明生産方法」という。
【００１７】
本発明生産方法における「ヌクレオチド」は、ＵＤＰ又はｄＴＤＰであることが好ましい。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、発明の実施の形態によって詳説する。
本発明タンパク質
本発明タンパク質は、下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質。
【００１９】
なお、天然に存在するタンパク質には、それをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のタンパク質の細胞内及び精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないタンパク質と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように（Ａ）のタンパク質に対して構造的に若干の差違があってもその機能については大きな違いが認められない（Ｂ）のタンパク質も、本発明タンパク質に包含される。人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４））。また、ある種のタンパク質は、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるタンパク質に存在するシグナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、又は活性型タンパク質への転換に際して除去される。このようなタンパク質は、一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には（Ａ）のタンパク質と同等の機能を有するタンパク質である。上記の（Ｂ）のタンパク質は、このようなタンパク質を規定するものである。
【００２０】
本明細書において「数個のアミノ酸」とは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性が失われない程度の変異を起こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば６００アミノ酸残基からなるタンパク質の場合、２〜３０程度、好ましくは２〜１５、より好ましくは２〜８以下の数を示す。
【００２１】
（Ｂ）のタンパク質は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有する必要がある。
【００２２】
このような活性を有するか否かは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを基質として、目的のタンパク質を作用させることにより、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが産生されるか否かを検出することによって判定できる。例えば、後述の実施例に示すようなＤＭＡＢアッセイや、ＨＰＬＣによる解析、キャピラリー電気泳動による解析等によって調べることができる。
【００２３】
このような方法によって、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を保持しているアミノ酸の欠失、置換、挿入又は転位を有する変異体を容易に選択することができる。
【００２４】
本発明タンパク質は、なかでも配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００２５】
本発明タンパク質の製造方法は特に限定されず、天然物から上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を単離してもよく、化学合成等によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよく、遺伝子工学的手法によって上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を製造してもよい。遺伝子工学的手法によって本発明タンパク質を製造する具体的方法については、後述する「本発明融合タンパク質」の説明を参照されたい。
＜２＞本発明融合タンパク質
本発明融合タンパク質は、本発明タンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質である。
【００２６】
本明細書における「他のペプチド」という用語は、「ポリペプチド」を含む概念として用いる。
【００２７】
本発明融合タンパク質としては、本発明タンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質等が例示される。このような本発明融合タンパク質は、精製又は分析を容易にすることができるというメリットがある。上記マーカーペプチドとしては例えばプロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、ＧＳＴ（グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ）などが挙げられる。例えばプロテインＡとの融合タンパク質は、ＩｇＧを結合させた固相を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製することができる。同様に、Ｈｉｓタグとの融合タンパク質については磁性ニッケルを結合させた固相を用いることができ、ＦＬＡＧとの融合タンパク質については抗ＦＬＡＧ抗体を結合させた固相を用いることができる。またインスリンシグナルとの融合タンパク質は、細胞外（培地等）に分泌されることから、細胞破砕等の抽出操作が不要となる。
【００２８】
ここで好ましいのは、配列番号４のアミノ酸配列で示されるペプチド（Ｈｉｓタグ）との融合タンパク質である。このＨｉｓタグは、配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列の直前に融合させることが好ましい。すなわち本発明融合タンパク質は、配列番号２におけるアミノ酸番号１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることが好ましい。
【００２９】
この融合タンパク質は、後述の実施例に示す通り、配列番号３のヌクレオチド配列を、配列番号１の第６１番目のヌクレオチドの直前の位置に連続して結合させたＤＮＡを発現させることによって製造することができる。
【００３０】
本発明融合タンパク質（本発明タンパク質）は、以下の通り製造することができる。
【００３１】
まず、本発明タンパク質のうち、前記（Ａ）のタンパク質（配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質）をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ａ）」という）を用意する。このＤＮＡは、配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、遺伝暗号の縮重によって種々の異なったヌクレオチド配列を有するＤＮＡが存在するが、配列番号１におけるヌクレオチド番号６１〜１０８６で示されるヌクレオチド配列によって特定されるＤＮＡが好ましい。このＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ９９３３９として登録されている。
【００３２】
また、本発明タンパク質のうち、前記（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下「ＤＮＡ（ｂ）」という）についても、前記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質をコードするものである限りにおいて特に限定されない。このようなＤＮＡとしては、例えば「ＤＮＡ（ａ）」若しくは当該ＤＮＡに相補的なＤＮＡ又はこれらのＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが例示される。
【００３３】
ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）等参照）。「ストリンジェントな条件」として具体的には、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃でハイブリダイズさせ、次いで室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液、５０℃下で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙げられる。
【００３４】
上記ＤＮＡ（ａ）又はＤＮＡ（ｂ）のいずれかを保持するＤＮＡを用いたタンパク質の発現は、当該ＤＮＡが保持されたベクター（好ましくは発現ベクター）を用いて行うことが好ましい。ＤＮＡのベクターへの組込みは、通常の方法によって行うことができる。
【００３５】
ＤＮＡを導入するベクターとしては、例えば、導入したＤＮＡを発現させることができる適当な発現ベクター（ファージベクター或いはプラスミドベクター等）を使用することができ、本発明ベクターを組込む宿主細胞に応じて適宜選択できる。このような宿主−ベクター系としては、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）と、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＫＫ２３３−３（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＥＺＺＺ１８（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＣＨ１１０（ファルマシア バイオテック社製）、ｐＢＡＤ（インビトロゲン社製）、ｐＲＳＥＴ（インビトロゲン社製）又はｐＳＥ４２０（インビトロゲン社製）等の原核細胞用の発現ベクターとの組み合わせ、ＣＯＳ細胞や３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などの哺乳類細胞と、ｐＧＩＲ２０１（Ｋｉｔａｇａｗａ， Ｈ．， ａｎｄ Ｐａｕｌｓｏｎ， Ｊ． Ｃ． （１９９４） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， １３９４−１４０１）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｓ．， ａｎｄ Ｎａｇａｔａ， Ｓ． （１９９０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １８， ５３２２）、ｐＣＸＮ２（Ｎｉｗａ， Ｈ．， Ｙａｍａｎｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ， Ｊ． （１９９１） Ｇｅｎｅ １０８， １９３−２００）、ｐＣＭＶ−２（イーストマン コダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）製）、ｐＣＥＶ１８、ｐＭＥ１８Ｓ（丸山ら，Ｍｅｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２０， ２７（１９９０））又はｐＳＶＬ（ファルマシア バイオテック社製）等の哺乳類細胞用発現ベクターの組み合わせのほか、宿主細胞として昆虫細胞、酵母、枯草菌などが例示され、これらに対応する各種ベクターが例示される。上述の宿主−ベクター系の中でも特に原核細胞（特に大腸菌細胞）とｐＥＴ１５ｂとの組み合わせが好ましい。
【００３６】
ＤＮＡを組込むベクターは、目的とするタンパク質とマーカーペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたものを用いることができる。ＤＮＡからのタンパク質の発現及び発現されたタンパク質の採取も、通常の方法に従って行うことができる。
【００３７】
例えば、目的とするＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを適当な宿主に導入することによって宿主を形質転換し、この形質転換体を生育させ、その生育物から発現されたタンパク質を採取することによって行うことができる。
【００３８】
ここで「生育」とは、形質転換体である細胞や微生物自体の増殖や、形質転換体である細胞を組み込んだ動物・昆虫等の生育を含む概念である。また、ここでいう「生育物」とは、形質転換体を生育させた後の培地（培養液の上清）及び培養された宿主細胞・分泌物・排出物等を包含する概念である。生育の条件（培地や培養条件等）は、用いる宿主に合わせて適宜選択できる。
【００３９】
生育物からのタンパク質の採取も、タンパク質の公知の抽出・精製方法によって行うことができる。
【００４０】
例えば目的とするタンパク質が、培地（培養液の上清）中に分泌される可溶性の形態で産生される場合には、培地を採取し、これをそのまま用いてもよい。また目的とするタンパク質が細胞質中に分泌される可溶性の形態、又は不溶性（膜結合性）の形態で産生される場合には、窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、又はこれらの組み合わせ等の処理操作によって目的とするタンパク質を抽出することができ、その抽出物をそのまま用いてもよい。
【００４１】
これらの培地や抽出物から、タンパク質をさらに精製することもできる。精製は、不完全な精製（部分精製）であっても、完全な精製であってもよく、目的とするタンパク質の使用目的等に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００４３】
目的とするタンパク質が製造されたか否かは、アミノ酸配列、作用、基質特異性等を分析することによって確認することができる。
＜３＞本発明触媒
本発明触媒１は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する能力を有する触媒である。また本発明触媒２は、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する能力を有する触媒である。
【００４４】
本発明触媒は、本発明タンパク質及び本発明融合タンパク質の少なくとも一方を含有していればよい。すなわち本発明触媒としては、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質自体をそのまま本発明触媒としてもよく、両者の混合物を用いてもよく、本発明タンパク質又は本発明融合タンパク質に加えて、これらのタンパク質に悪影響を与えず、かつ、本発明の効果に影響を与えない限りにおいて、他の成分を含有させてもよい。
【００４５】
本発明触媒の形態も限定されず、溶液形態、凍結形態、凍結乾燥形態、担体と結合し、又は担体に包括させた固定化酵素形態のいずれであってもよい。
【００４６】
本発明触媒１はＧａｌＮＡｃヌクレオチドをＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに変換する際に用いることができる。また本発明触媒２はＧｌｃＮＡｃヌクレオチドをＧａｌＮＡｃヌクレオチドに変換する際に用いることができる。また本発明触媒１と本発明触媒２の有効成分は同一であることから、本発明触媒を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドからＧｌｃＮＡｃヌクレオチドへの変換と、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドからＧａｌＮＡｃヌクレオチドへの変換を同一反応系内で同時に行うために用いてもよい。
＜４＞本発明生産方法
本発明生産方法１は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒１を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドの生産方法である。また本発明生産方法２は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒２を、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法である。
【００４７】
本発明生産方法における「ヌクレオチド」は、ＵＤＰ又はｄＴＤＰであることが好ましい。
すなわち、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドやＧｌｃＮＡｃヌクレオチドは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃやＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、あるいはｄＴＤＰ−ＧａｌＮＡｃやｄＴＤＰ−ＧｌｃＮＡｃであることが好ましい。
【００４８】
本発明生産方法においては、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質及び本発明触媒の少なくともいずれか１つを、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドやＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させればよい。これらのタンパク質と、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドやＧｌｃＮＡｃヌクレオチドとの「接触」の方法は、これらの分子が相互に接触して酵素反応が生ずる状態となる限りにおいて特に限定されず、例えば前者に後者を添加してもよく、後者に前者を添加してもよく、両者を同時に添加してもよい。
【００４９】
また、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒を担体（例えば、ゲル、ビーズ、膜、プレート等）に固定させ、これにＧａｌＮＡｃヌクレオチド及びＧｌｃＮＡｃヌクレオチドの少なくとも一方を接触させてもよい。
【００５０】
両者を接触させた後の反応の条件は、本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒が作用する条件である限りにおいて特に限定されない。
【００５１】
例えばこれらのタンパク質の至適ｐＨ付近で反応させることが好ましく、当該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応を行うことがより好ましい。例えば、ｐＨ７付近で反応させることが好ましい。
【００５２】
またこのときの温度も、これらのタンパク質の活性が保持されている限りにおいて特に限定されないが、３５℃〜３７℃程度が例示される。
【００５３】
また本発明タンパク質、本発明融合タンパク質又は本発明触媒の活性を増加させる物質がある場合には、その物質を添加してもよい。例えば、Ｍｇ等の二価イオンを用いることによって、これらタンパク質の活性が上昇する。
【００５４】
逆に、Ｃｕ等を用いた場合には本発明タンパク質、本発明融合タンパク質及び本発明触媒の活性が阻害されることから、本発明生産方法におけるこのような二価イオンの使用は避けることが好ましい。
【００５５】
反応時間は、ｐＨ条件、温度条件、作用させるタンパク質及び基質の量、並びにどの程度の生産量を所望するか等によって適宜調節することができる。反応時間を長くすれば生産量を増すことができ、反応時間を短くすれば生産量を減ずることができる。
【００５６】
また本発明生産方法には、このような接触工程が少なくとも含まれていればよく、さらに他の工程が含まれていてもよい。
【００５７】
本発明生産方法により、ＧａｌＮＡｃヌクレオチド又はＧｌｃＮＡｃヌクレオチドから、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド又はＧａｌＮＡｃヌクレオチドを生産することができる。これらが生産されたか否かは、例えば、後述の実施例に示すようなＤＭＡＢアッセイや、ＨＰＬＣによる解析、キャピラリー電気泳動による解析等によって調べることができる。
【００５８】
また、生成物中からＧｌｃＮＡｃヌクレオチド又はヌクレオチド−ＧａｌＮＡを単離する方法等は、公知の方法によって行うことができる。
【００５９】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を具体的に説明する。しかしながら、これらによって本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
１．ＧａｌＥタンパク質の調製
（１）ｇａｌＥのクローニングと発現
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８のｇａｌＥ遺伝子（配列番号１のヌクレオチド番号６１から１０８６で示されるＤＮＡ）を、常法に従ってＰＣＲ増幅した。なお、ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである。
【００６０】
ｇａｌＥ１５−Ｆ ｃａｔａｔｇｇｃａａｔａｃｔｔｇｔｔａｃｔｇｇ（配列番号５）
ｇａｌＥ１５−Ｒ ｇｇａｔｃｃｔｔａｔｔｃｃｇｃａｃｔｃｔｔａｔａｃｃ（配列番号６）
１０２９ｂｐのＰＣＲ増幅断片をｐＵＣ１９に挿入した後、シーケンスを確認した。これをｐＥＴ１５ｂ（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎ ｔａｇ， Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅ１−ＢａｍＨ１サイトに挿入して発現プラスミドｐＥＴｇａｌＥ１５を構築した。この発現プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ＧａｌＥ発現株を作製した。
【００６１】
ＧａｌＥタンパク質の発現は、以下の通り行った。
【００６２】
ＧａｌＥ発現株を、アンピシリン（３３μｇ／１００ｍｌ）を含有する１００ｍｌ ＬＢ培地（１Ｌ中に、１０ｇ ポリペプトン、５ｇ 酵母抽出物、１０ｇ ＮａＣｌを含有する）中、３７℃で４時間培養した。ＯＤ６００ｎｍが０．５付近に達した時、ＩＰＴＧを終濃度が０．４ｍＭになるよう添加した。ＩＰＴＧ添加後３７℃で４時間培養した後、６，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄して菌体を回収した。
（２）ＧａｌＥタンパク質の精製
回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、超音波破砕した。超音破砕の強度は「１８０」とし、４℃で５分間破砕した。破砕液を１５，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心して細胞抽出液を回収した。磁性ニッケルカラム（Ｎｉ−ＮＴＡカラム；ＱＩＡＧＥＮ社製）をＢｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール；ｐＨ８．０）で平衡化した。細胞抽出液をカラムに流し、イミダゾール濃度を５０ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭの順に徐々に上昇させてタンパク質を溶出させた。その後、Ｎｉ−ＮＴＡカラムへの結合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【００６３】
発現されたＧａｌＥタンパクが含まれる画分を透析した。カットオフ ３０００ Ｄａの透析膜を使用し、透析外液としては２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用した。その後、さらに限外ろ過によってタンパク質液を約６倍の濃度まで濃縮した。この濃縮後の液を「ＧａｌＥ溶液」として、酵素活性を測定した。
（３）酵素活性の測定
上記の（２）で得られたＧａｌＥ溶液を用いて、酵素活性を測定した。酵素活性の測定は、以下の（ａ）又は（ｂ）の方法で行った。
（ａ）ＤＭＡＢアッセイ
（ｉ）「ＧａｌＥ溶液」（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液）に、終濃度１．０ｍＭ となるように基質（１７．１μｇ／３５μｌ）を添加して５０μｌとした。この溶液中に含まれるタンパク質（ＧａｌＥ）の量は、１．６μｇであった。
（ｉｉ）３７℃で２０分〜６０分間インキュベートした後、０．１Ｍ ＨＣｌを１０μｌ添加し、次いで６分間煮沸することによって反応を完全に停止させた。その後０．１Ｍ ＮａＯＨを１０μｌ添加して中和した。
（ｉｉｉ）０．２Ｍの四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．１）を１４０μｌ添加して、すぐに３分間煮沸した。
（ｉｖ）１０５０μｌのＤＭＡＢ試薬を添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＭＡＢ試薬は以下の通り調製した。
【００６４】
氷酢酸／ＨＣｌ＝９／１（ｖ／ｖ）の溶液でＤＭＡＢの１０％溶液を調製し、このＤＭＡＢ溶液を使用直前にさらに氷酢酸で１／１０に希釈して、ＤＭＡＢ試薬とした。
（ｖ）インキュベート後、５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。
（ｂ）ＵＤＰ−グルコースオキシダーゼ−結合アッセイ（ＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ ａｓｓａｙ）
（ｉ）「ＧａｌＥ溶液」（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液）に、終濃度１．０ｍＭ となるように基質を添加して４４μｌとした。この溶液中に含まれるタンパク質（ＧａｌＥ）の量は、１．４μｇであった。
【００６５】
また、ＵＤＰ−Ｇｌｃ及びＵＤＰ−Ｇａｌの相互変換には、ＮＡＤ＋の存在が必須となることから、反応液中に１ｍＭのＮＡＤ＋を含有するものについても同様にして測定した。
（ｉｉ）３７℃で３０分〜２時間インキュベートした後、０．１Ｍ ＨＣｌを添加し、次いで６分間煮沸することによって反応を完全に停止させた。その後０．１ＮのＮａＯＨを添加して中和した。
（ｉｉｉ）以下の試薬を５０ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解し、この溶液４００μｌを反応液に添加した。
【００６６】
２２Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ｐＨ５．５））
７Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）
０．３ｍｇ ｏ−ジアニシジン（ｏ−ｄｉａｎｉｓｉｄｉｎｅ）
（ｉｖ）３７℃で３０分間インキュベートした後、６Ｍ ＨＣｌを６００μｌ添加した。
（ｖ）その後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。
（４）至適反応温度
酵素反応を２０℃〜６０℃の範囲で行い、その酵素活性の変化をＤＭＡＢアッセイで解析した。
（５）至適反応ｐＨ
酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜６．０）、Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ６．０〜７．０）、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）又はグリシン（ｐＨ９．０〜１０．０）（いずれも２０ｍＭ）中で、７μｇのＧａｌＥと１ｍＭの基質（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）（全容量５０μｌ）を３７℃で３０秒間反応させた。
（６）熱安定性
ＧａｌＥ溶液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．０）中で２０℃〜６０℃の間で１時間インキュベートした後、４℃で保存して、ＤＭＡＢアッセイに付した。
（７）ｐＨ安定性
上記の至適反応ｐＨの解析で用いた緩衝液中でＧａｌＥを４℃で一晩インキュベートしたものをＤＭＡＢアッセイに付した。酵素反応の条件は、前記のＤＭＡＢアッセイによる至適反応ｐＨの解析と同様である。
（８）二価イオンの要求性
二価の金属イオン（Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋又はＺｎ２＋）又はＥＤＴＡを、それぞれ終濃度４ｍＭになるように添加して、ＤＭＡＢアッセイで解析した。
（９）Ｋｍ値及びＶｍａｘの測定
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．０）中で、各濃度の基質に０．６μｇのＧａｌＥを添加して、３５℃で３０秒間反応させてＤＭＡＢアッセイによって解析した。
（９）ＨＰＬＣ
ＨＰＬＣ（陰イオン交換クロマトグラフィー）は、以下の通り行った。
５μｌのサンプル溶液をＰａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ ＳＡＸカラム（４．６ ｘ １２５ｍｍ）にアプライした。溶出は、３０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．５）を用いて、流速１ｍｌ／分、温度３７℃で行った。溶出された糖ヌクレオチドは、２６０ｎｍにおける吸光度で検出した。
２．実験の結果
（１）Ｎｉ−ＮＴＡカラムへの結合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、約３７ｋＤａ付近に一本のバンドが出現したことから、ＧａｌＥの発現及び精製が確認された。
（２）基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて、ＤＭＡＢアッセイを行った結果を図１に示す。図１における「実線（丸印）」は基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用いた場合の、「破線（四角印）」は基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【００６７】
この結果、発現されたＧａｌＥは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに対して活性（触媒能）を持つことが確認された。また図１から、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが優先的にＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ変換されていることが示された。このことから、発現されたＧａｌＥを用いるとＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する反応の方が進みやすいことが確認された。
【００６８】
上記のＤＭＡＢアッセイと同様の条件で、２時間反応させることによって得られた生産物をＨＰＬＣで解析した。その結果を図２に示す。図２の「１」は、基質がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ単独の場合（ＧａｌＥの非存在下）における結果を、「２」は基質がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ単独の場合（ＧａｌＥの非存在下）の結果を、「３」は基質がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ単独の場合（ＧａｌＥの存在下）の結果を、「４」は基質がＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ単独の場合（ＧａｌＥの存在下）の結果をそれぞれ示す。
【００６９】
この結果からも、発現されたＧａｌＥを用いるとＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する反応の方が進みやすいことが確認された。
（３）ＵＤＰ−グルコースオキシダーゼ−結合アッセイを行った結果を図３に示す。図３における「三角印」は基質としてＵＤＰ−Ｇａｌを用いた場合の、「丸印」は基質としてＵＤＰ−Ｇｌｃを用いた場合の結果をそれぞれ示す。
【００７０】
この結果、発現されたＧａｌＥは、ＵＤＰ−ＧａｌとＵＤＰ−Ｇｌｃに対しても活性（触媒能）を持つことが確認された。また図３からＵＤＰ−Ｇａｌが優先的にＵＤＰ−Ｇｌｃに変換されていることが示された。このことから、発現されたＧａｌＥを用いるとＵＤＰ−ＧａｌをＵＤＰ−Ｇｌｃに変換する反応の方が進みやすいことが確認された。
（４）至適反応温度
基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いて至適反応温度を検討した結果を図４に示す。いずれを基質として用いた場合であっても、至適反応温度は３５℃〜３７℃の間であった。
（５）至適反応ｐＨ
ＤＭＡＢアッセイによって解析した結果を図５に示す。図５の左側は、基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを用いた場合の結果を、右側は、基質としてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用いた場合の結果を示す。この結果、いずれの基質を用いた場合においても、至適反応ｐＨは７付近にあることが示された。
（６）熱安定性
熱安定性の解析結果を図６に示す。この結果、少なくとも３０℃以下（ｐＨ７．０、１時間）で安定であることが示された。
（７）ｐＨ安定性
ｐＨ安定性の解析結果を図７に示す。この結果、少なくともｐＨ６〜８の間（４℃、一晩）で安定であることが示された。
（８）二価イオンの要求性
種々の二価の金属イオンを用いてＤＭＡＢアッセイを行った。結果を以下に示す。Ｃｕを用いた場合にはＧａｌＥの活性が大きく阻害された。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性（触媒能）は、Ｃｏ、Ｍｇ、Ｍｎ、Ｎｉによって上昇した。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性（触媒能）は、Ｍｇによって上昇した。
【００７１】
【表１】
（９）Ｋｍ値及びＶｍａｘの測定
Ｋｍ値及びＶｍａｘの値を算出した。結果を以下に示す。
【００７３】
【表２】
【発明の効果】
本発明タンパク質及び本発明融合タンパク質は本発明触媒に利用することができ極めて有用である。また本発明触媒を用いると、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃヌクレオチドを工業的規模で大量かつ安価に製造でき、これによって本発明生産方法が提供されることから極めて有用である。本発明生産方法も、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃヌクレオチドを簡便、迅速、大量、安価に生産することができ極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、ＤＭＡＢアッセイを行った結果を示す。
【図２】基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、ＨＰＬＣ解析を行った結果を示す。
【図３】基質としてＵＤＰ−Ｇａｌ又はＵＤＰ−Ｇｌｃを用い、ＵＤＰ−グルコースオキシダーゼ−結合アッセイを行った結果を示す。
【図４】基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、至適反応温度をＤＭＡＢアッセイで解析した結果を示す。
【図５】基質としてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを用い、至適反応ｐＨをＤＭＡＢアッセイで解析した結果を示す。
【図６】熱安定性をＤＭＡＢアッセイで解析した結果を示す。
【図７】ｐＨ安定性をＤＭＡＢアッセイで解析した結果を示す。
Claims (9)
- 下記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は転位したアミノ酸配列を含み、かつ、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する活性又はＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する活性を有するタンパク質。 - 配列番号２におけるアミノ酸番号２１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
- 請求項１又は２に記載のタンパク質と他のペプチドとの融合タンパク質。
- 配列番号２におけるアミノ酸番号１〜３５９で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項３に記載の融合タンパク質。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃをＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに変換する能力を有する触媒。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃに変換する能力を有する触媒。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項５に記載の触媒を、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドの生産方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質又は請求項６に記載の触媒を、ＧｌｃＮＡｃヌクレオチドに接触させる工程を少なくとも含む、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドの生産方法。
- 「ヌクレオチド」がＵＤＰ又はｄＴＤＰであることを特徴とする、請求項８に記載の生産方法。
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| CN109402152A (zh) * | 2018-11-09 | 2019-03-01 | 沈阳农业大学 | 一种高效表达制备udp-葡萄糖-4-差向异构酶的方法 |
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2003
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