JPWO2006043525A1 - ウリジン５’−ジリン酸−ｎ−アセチルガラクトサミンの製造法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、オリゴ糖合成の重要な基質であるウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）の製造法に関するものであって、ウリジン５'−トリリン酸（ＵＴＰ）とＮ−アセチルガラクトサミン１−リン酸（ＧａｌＮＡｃ１−Ｐ）からウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンを酵素的に製造する際に、酵素として微生物（但し、病原性微生物を除く）由来のウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）を用いることを特徴とし、さらにＧａｌＮＡｃ１−Ｐ、としてＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼを用い、Ｎ−アセチルガラクトサミンとリン酸供与体から反応系内で調製したものを用いることができる。本発明により、比較的に安価な基質を用い、ウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミンを効率よく製造できる。
Description
本発明は、オリゴ糖合成の重要な基質であるウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）の製造法に関するものである。
オリゴ糖を酵素合成する方法としては、オリゴ糖の加水分解酵素の逆反応を利用する方法および糖転移酵素を利用する方法の２通りの方法が考えられる。糖転移酵素を用いる合成法は、合成収率や複雑な構造を持つオリゴ糖合成への応用といった点で加水分解酵素の逆反応を利用する方法よりも有利であると考えられており、また、近年の組換えＤＮＡ技術の進歩により各種糖転移酵素の量産化も該技術の実現化への後押しとなっている。
しかしながら、糖転移酵素を用いる合成法で用いる糖供与体である糖ヌクレオチドは、一部のものを除き依然として高価で、量的にも試薬レベルのわずかな供給量でしか提供し得ないのが現状である。たとえば、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの調製法としては、ガラクトサミンを出発原料として使用し、酵素法と化学的なアセチル化を組み合わせてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを合成する方法が報告されている。
しかし、（Ａ）実験室での小スケール反応に過ぎない、（Ｂ）酵素の調製が容易でない、（Ｃ）ガラクトサミンのリン酸化に際してＡＴＰ再生系を補う必要があり、反応全工程の収率も低い、（Ｄ）反応液中にＵＤＰ−ガラクトサミンが残留した場合、これと目的とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとの分離が問題となる、等の問題を有し、必ずしも実用的な方法とはなり得なかった（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２８，２７１−２７７，（１９７２）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５７，１５２−１５７．（１９９２））。
また、ウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン４−エピメラーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼ）を用いてウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを合成する方法が報告されているが（ＷＯ２００２／０５０２６７）、（イ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ４−エピメラーゼは動物組織または菌体にごく少量しか存在しない、（ロ）組換えＤＮＡ手法によりＵＤＰ-ＧlcＮＡc４-エピメラーゼを調製することも可能であるが、この酵素反応は平衡反応であることから転換率は低い上に、基質であるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃは完全に消費されることなく反応液中に多量に残留するため、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとの分離は困難である、といった問題を有し、この方法も実用的な方法としては問題を残していた。
したがって、本発明は、安価な基質を用い、酵素的にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを効率よく製造できる実用的な方法を提供することを目的とするものである。
本発明者らは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの生合成経路に関して詳細に検討した結果、以下のことを見出し、本発明を完成させた。
第１に、病原性のストレプトコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ヒト、ブタ由来の各ウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）は、下記（Ａ）の本来の変換反応を触媒する活性を有する他に下記（Ｂ）の変換反応も触媒する活性を有していることが報告されていたが（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４，１８２２−１８２７（１９５９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２７０５５−２７０５７（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１３１４７−１３１５４（１９９６））、Staphylococcus aureus以外の病原性のない微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼにはそのような報告はなかったものの、試験の結果、下記（Ａ）の活性以外にも下記（Ｂ）の活性を有していることを確認した。そして、たとえば大腸菌由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを用い、Ｎ−アセチルガラクトサミン１−リン酸（ＧａｌＮＡｃ１−Ｐ）とウリジン５'−トリリン酸（ＵＴＰ）からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを合成すれば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃやＵＤＰ−ガラクトサミンなど従来法で問題のあった他の糖ヌクレオチドとの分離の問題を解決できること。
（Ａ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ＋ピロリン酸 ⇔ ＵＴＰ＋ＧｌｃＮＡｃ１−Ｐ
（Ｂ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ＋ピロリン酸 ⇔ ＵＴＰ＋ＧａｌＮＡｃ１−Ｐ
（Ｂ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ＋ピロリン酸 ⇔ ＵＴＰ＋ＧａｌＮＡｃ１−Ｐ
次に、ＧａｌＮＡｃ１−Ｐは高価で、化学的にも調製が容易でないため、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を酵素的にリン酸化できないか検討している過程で、ＧａｌＮＡｃをリン酸化する活性はヒトまたはブタの肝臓または腎臓などの組織中に存在することが報告されており（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３９．２３６５３−２３６５６，（１９９６））、この酵素によってＧａｌＮＡｃからＧａｌＮＡｃ１−Ｐを酵素的に調製できること。
しかし、動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼを大腸菌等の微生物を宿主とする系で生産することは困難であり、当該酵素を実用に供することは不可能であったが、動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼをコードするＧＡＬＫ２遺伝子を他の微生物由来のタンパク質（たとえば、大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）をコードする遺伝子の３'末端の下流に連結し、融合蛋白質として生産させることで、大腸菌内で活性を有した状態で動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼを生産させることができること。
更に、このような動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼと微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ、あるいはそれらの融合蛋白質を用いてＧａｌＮＡｃとＵＴＰからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが合成でき、さらに酵母菌体によってアデノシン５'−トリリン酸（ＡＴＰ）生産とウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）のリン酸化を行いながらＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼと大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを作用させることにより、安価なＵＭＰとＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが合成できることを、それぞれ見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、ＵＴＰとＧａｌＮＡｃ１−ＰからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを酵素的に製造する方法において、酵素として微生物（但し、病原性微生物を除く）由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを用いることを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法に関するものである。
また、本発明は、前記ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼが微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法で調製されたものであることを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法に関するものである。
さらに、本発明は、前記ＧａｌＮＡｃ１−Ｐが、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼを用い、ＧａｌＮＡｃとリン酸供与体から反応系内で調製したものであるあることを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法に関するものである。
本発明においては、前記Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼは、動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法で調製されたものとすることができ、組換えＤＮＡ手法を用いて微生物由来の蛋白質との融合蛋白質の形で調製されたものとすることができ、あるいは微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼとの融合蛋白質の形で調製されたものを用いることが可能である。
また、本発明においては、前記リン酸供与体をアデノシン５'−トリリン酸（ＡＴＰ）とすることができ、前記アデノシン５'−トリリン酸（ＡＴＰ）が酵母菌体によって生成されるものとしても良い。
また、本発明のUDP-GalNAcの製造法においては、ＵＴＰを用いる代わりに、微生物菌体や酵素を用いたＵＴＰ生成／再生系を併用することもでき、ＵＴＰを用いる代わりにＵＭＰと酵母菌体を用いたＵＭＰからのＵＴＰ生成系を併用することも可能である。、
更に、本発明においては、前記微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子は、大腸菌由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子（ｇｌｍＵ）とすることが可能である。また、前記ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼによるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成に際して、反応系に生成するピロリン酸を分解する酵素を添加しても良い。
また、本発明においては、前記酵母菌体として、サッカロミセス属、チゴサッカロミセス属、カンディダ属、トルロプシス属、ハンセヌラ属、デバリオミセス属から選ばれる１又は２以上の酵母由来の菌体を用いることができ、前記酵母菌体の一例として乾燥酵母菌体を用いることができる。前記酵母菌体を用いる反応に、無機リン酸や所要のエネルギー源を添加することも有益である。
更に、本発明においては、前記Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼにより調製されたＧａｌＮＡｃ１−Ｐの分解を防止するフッ化ナトリウムを添加することもできる。
本発明により、微生物由来ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼがＧａｌＮＡｃ１−ＰとＵＴＰからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成する活性があることを見出し、該酵素と動物由来Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼを用いて、ＧａｌＮＡｃのリン酸化とＵＤＰ付加を連動して行うことでＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを効率的に製造することが初めて可能となった。
また、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼとＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを融合タンパク質として生産可能ならしめ、動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼの生産を大腸菌内で初めて可能とし、２種類の酵素を一度に生産することができ、酵素調製が容易になった。
さらに、酵母菌体によってＡＴＰ生産とＵＭＰのリン酸化を行いながらＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼと微生物由来ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを作用させることにより、安価なＵＭＰとＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが効率よく合成することができる。
さらにまた、本発明の方法は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ以外の糖ヌクレオチドがほとんど生成しないため、反応液からの目的のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ単離精製が極めて簡単に行うことができる。
本発明は、ＵＴＰとＧａｌＮＡｃ１−ＰからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを酵素的に製造する方法において、酵素として微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを用いることを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法に関するものである。
反応系に添加するＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼとしては、病原性を持たない微生物由来のものを使用することができる。これらの酵素は、それぞれの酵素の遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させる、いわゆる組換えＤＮＡ手法を用いて調製することも可能である。微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼとしては、エッシェリヒア（Escherichia）属（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７５，６１５０（１９９３））、サッカロミセス（Saccharomyces）属（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，２２７５（１９７６））、又はニューロスポラ（Neurospoa）属（Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５，１３８１（１９７９））に属する微生物由来のものが例示され、特に大腸菌由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼが好適である。
このようなＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。
微生物菌体からのＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの調製法を具体的に説明すれば、集菌して得られた菌体を超音波処理により菌体を破砕し、菌体破壊液を遠心して上清を得、この上清を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー処理を施し、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ活性画分を濃縮、脱塩することで目的とする酵素調製物を取得することができる。
反応に使用するＵＴＰとＧａｌＮＡｃ１−Ｐは、反応系内でそれぞれを調製してもかまわない。たとえば、ＧａｌＮＡｃ１−Ｐの反応系内での調製は、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼを用い、ＧａｌＮＡｃとリン酸供与体から実施することができる。
反応に使用するＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼは、ヒト、ブタ、マウスなどの哺乳類の腎臓や肝臓、膵臓、肺、心臓、大動脈、脳などの組織に存在し、特に腎臓または肝臓に多く含まれており、これらの組織から調製可能である。また、反応系に添加するＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼは、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、ブタ肝臓の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。
しかし、酵素調製の簡便性などの点から、常法に従ってＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させる、いわゆる組換えＤＮＡ手法により調製することのほうが好都合である。微生物を宿主とし、組換えＤＮＡ手法により動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼを調製する場合、通常の方法では目的の酵素が生産されないか、生産されても極めて少量であり、実用に耐えない。このため、宿主と同じ微生物由来の蛋白質（たとえば、大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）をコードする遺伝子の下流に連結し、融合蛋白質として生産させることで、大腸菌などの宿主内で活性を有した状態で動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼを生産させることができる。
上記融合蛋白質を生産させるための遺伝子の連結、プラスミドの構築、宿主の形質転換、酵素の生産などは、既にこの分野では周知の技術であり、後述実施例に示したように、常法に従って行うことができる。
反応に添加するＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼとしては、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼと同様に、当該活性を有する限りどのような形態であってもよい。具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。
また、ＵＴＰの反応系内での調製は、微生物菌体や酵素を用いたＵＴＰ生成／再生系を併用することで実施できる。具体的には、ＵＭＰと酵母菌体を用いたＵＭＰからのＵＴＰ生成系を利用することができ、まずこれについて説明する（図１参照）。
使用する酵母菌体としては、糖ヌクレオチドの製造に使用されるものであれば特に制限されない。具体的には、サッカロミセス（Saccharomyces）属、チゴサッカロミセス（Zygosaccharomyces）属、カンディダ（Candida）属、トルロプシス（Torulopsis）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、デバリオミセス（Debaryomyces）属などの酵母由来の菌体を例示することができる。このような酵母菌体は、生酵母菌体、乾燥酵母菌体いずれであってもかまわないが、反応収率、取扱いの容易性などの点から乾燥酵母菌体を用いるのが好ましい。
また、ＵＴＰの反応系内での調製は、上記のＵＭＰと酵母菌体を用いたＵＭＰからのＵＴＰ生成系に限定されるものではなく、たとえば、微生物菌体を用いたオロチン酸からのＵＴＰ生成系（特開平５−２７６９７４号）、あるいは酵素を用いたＵＴＰ生成系とＡＴＰ再生系とが共役したもの（具体的には、アデニル酸（ＡＭＰ）にポリリン酸キナーゼ、アデニレートキナーゼ及びポリリン酸を作用せしめてＡＴＰを再生しながらＵＭＰにウリジル酸キナーゼ、および必要によりヌクレオシド二リン酸キナーゼを作用せしめてＵＴＰを生成する系）などを利用することもできる。
このような酵素と基質を用いてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを製造する条件は、使用する酵素や基質により若干異なる。
（１）酵素として微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを用い、ＵＴＰとＧａｌＮＡｃ１−ＰからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを酵素的に製造する場合
反応に使用するＵＴＰとＧａｌＮＡｃ１−Ｐは市販品、あるいは公知の方法（J. Am. Chem. Soc., 115, 2260-2267 (1993)）を応用して調製したものを使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約１〜２００ｍＭ、好ましくは約１〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
（１）酵素として微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを用い、ＵＴＰとＧａｌＮＡｃ１−ＰからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを酵素的に製造する場合
反応に使用するＵＴＰとＧａｌＮＡｃ１−Ｐは市販品、あるいは公知の方法（J. Am. Chem. Soc., 115, 2260-2267 (1993)）を応用して調製したものを使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約１〜２００ｍＭ、好ましくは約１〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成反応は、例えばｐＨ約６．０〜９．０のリン酸緩衝液中にＵＴＰとＧａｌＮＡｃ１−Ｐを添加し、この反応液に上記ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを約０．１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは約０．５〜２０．０ユニット／ｍｌ添加共存させ、約５〜３０℃、好ましくは約５〜２５℃で１〜７０時間程度、必要により撹拌しなから反応させることにより実施できる。
なお、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼによるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成反応は、平衡反応であり、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成収率を向上させるため、反応系に生成するピロリン酸を分解する酵素（たとえば、ピロホスファターゼ）を０．１ユニット／ｍｌ以上添加することが好適である。
（２）酵素として微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼと動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ、あるいはそれらの融合酵素を用い、ＵＴＰとＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを酵素的に製造する場合
反応に使用するＵＴＰとＧａｌＮＡｃは、市販品を使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約１〜２００ｍＭ、好ましくは約１〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成反応は、例えばｐＨ約６．０〜９．０のリン酸緩衝液中にＵＴＰとＧａｌＮＡｃを添加し、この反応液に上記２種類の酵素をそれぞれ、あるいは融合酵素を約０．１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは約０．５〜２０．０ユニット／ｍｌ添加共存させ、約５〜３０℃、好ましくは約５〜２５℃で１〜７０時間程度、必要により撹拌しなから反応させることにより実施できる。
なお、上記（１）と同様に、ピロリン酸を分解する酵素（たとえば、ピロホスファターゼ）を０．１ユニット／ｍｌ以上添加し、さらにＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼにより調製されたＧａｌＮＡｃ１−Ｐの分解を防止するため、１ｍＭ以上のフッ化ナトリウム添加することが好適である。
(3)酵素として微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼと動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ、あるいはそれらの融合酵素を用い、酵母菌体を用いたＵＭＰからのＵＴＰ生成系を併用し、ＵＭＰとＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを製造する場合
反応に使用するＵＭＰとＧａｌＮＡｃは、市販品を使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約１〜２００ｍＭ、好ましくは約１０〜５０ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
反応に使用するＵＭＰとＧａｌＮＡｃは、市販品を使用することができる。使用濃度としては、特に制限されないが、それぞれ約１〜２００ｍＭ、好ましくは約１０〜５０ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成反応は、例えばｐＨ約６．０〜９．０のリン酸緩衝液中にＵＭＰとＧａｌＮＡｃを添加し、この反応液に上記２種類の酵素それぞれ、あるいは融合酵素を約０．１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは約０．５〜２０．０ユニット／ｍｌ添加し、さらに酵母菌体を１〜１０％（ｗ／ｖ）共存させ、約５〜３０℃で１〜７０時間程度、必要により撹拌しなから反応させることにより実施できる。
上記反応には、無機リン酸とエネルギー源を反応系に添加するのが好ましい。無機リン酸は、リン酸カリウムなどをそのまま使用することもできるが、リン酸緩衝液の形態で使用するのが好ましい。エネルギー源としては、グルコース、フラクトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸を使用することができる。それぞれの使用濃度は、特に制限されないが、約１０〜１０００ｍＭ、好ましくは約１００〜５００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
なお、上記反応系には、上記（１）及び（２）の酵素反応と異なり、ピロリン酸を分解する酵素やＧａｌＮＡｃ１−Ｐの分解を防止するためのフッ化ナトリウムなどのフッ化塩を反応系に添加する必要はない。
このようにして得られたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析など）により単離精製することができる。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。なお、実施例において、反応液中のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの定量にはＨＰＬＣ法により行った。すなわち、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍリン酸一カリウム溶液を用いた。ＤＮＡの調製、制限酵素による切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｍａｎｉａｔｉｓら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ ＹｏｒＫ（１９８２））に従って行った。制限酵素、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼはタカラバイオ（株）より入手した。
実施例１
（１）ヒト腎臓由来Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼをコードするＧＡＬＫ２遺伝子のクローン化
ヒト腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社から入手可能）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりヒト腎臓ＧＡＬＫ２遺伝子（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ＮＣＢＩ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２０４４）を増幅した。
（１）ヒト腎臓由来Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼをコードするＧＡＬＫ２遺伝子のクローン化
ヒト腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社から入手可能）を鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりヒト腎臓ＧＡＬＫ２遺伝子（Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ＮＣＢＩ、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００２０４４）を増幅した。
プライマー（Ａ）：5'-CGGGGATCCATGGCTACAGAGAGCCCTGCT-3'
プライマー（Ｂ）：5'-TACGTCGACTTAGGCCTCAAGCAAAACCAA-3'
プライマー（Ｂ）：5'-TACGTCGACTTAGGCCTCAAGCAAAACCAA-3'
ＰＣＲによるＧＡＬＫ２遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２μＭ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をタカラバイオ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（５９℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
遺伝子増幅後、ＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．４ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化し、同じく制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（タカラバイオ株式会社より入手）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＭＡＬ−ｈＧＬＫ２を単離した。ｐＭＡＬ−ｈＧＬＫ２は、ｍａｌｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子の３'−末の下流のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断部位にヒト腎臓ＧＡＬＫ２構造遺伝子を含有するＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
（２）ヒト腎臓ＧＡＬＫ２遺伝子産物の調製
プラスミドｐＭＡＬ−ｈＧＬＫ２を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が４×１０８個／ｍｌに達した時点で培養液に最終濃度０，０．０１，０．１または１．０ｍＭの各濃度になるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃で２０時間それぞれ振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（４℃、９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、２０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５））に懸濁した。ブランソン社製超音波破砕機（モデル４５０ソニファー）を用いて氷冷下で超音波処理を行い（５０Ｗ，２分，３回）、４℃、１２，０００×ｇの条件下で２０分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。
プラスミドｐＭＡＬ−ｈＧＬＫ２を保持する大腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が４×１０８個／ｍｌに達した時点で培養液に最終濃度０，０．０１，０．１または１．０ｍＭの各濃度になるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃で２０時間それぞれ振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（４℃、９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、２０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５））に懸濁した。ブランソン社製超音波破砕機（モデル４５０ソニファー）を用いて氷冷下で超音波処理を行い（５０Ｗ，２分，３回）、４℃、１２，０００×ｇの条件下で２０分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。
このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品におけるＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ活性を測定した。その結果を下記表に示す。
なお、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ活性は、以下に示す方法でＡＴＰとＧａｌＮＡｃからＧａｌＮＡｃ１−Ｐへのリン酸化活性を測定、算出したものである。すなわち、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、５ｍＭ ＡＴＰ・３Ｎａ、５ｍＭ フッ化ナトリウムにＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ酵素標品を添加して３７℃で１０分反応させる。反応液を５分間の煮沸にて反応を停止し、糖分析機 ＨＰＡＥＣ−ＣＤ（Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏrｍａｎｃｅ ａｎｉｏｎｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｄｕｃｔｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）による分析を行う。分離にはダイオネクス社製のＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１カラム（４×２５０ｍｍ）を用い、溶出液として（Ａ）０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液と（Ｂ）０．１Ｍ ＮａＯＨ，０．５Ｍ 酢酸ナトリウム溶液の濃度勾配（０−１５分：Ｂ＝１％−５０％、１５−２０分：Ｂ＝１００％）を用いる。ＨＰＡＥＣ−ＣＤ分析結果から反応液中のＧａｌＮＡｃ１−Ｐの生成量を算出し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＧａｌＮＡｃ１−Ｐを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（３）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼの調製
大腸菌（ＩＦＯ３９７２＝ＮＢＲＣ３９７２）の染色体ＤＮＡから、文献公知の方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（２），３８６−３９２（２０００））に従って調製した大腸菌ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ］をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む２×ＹＴ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３，３−１１，（１９８７））１０ｍｌで一夜３７℃で培養した。これを、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む２×ＹＴ培地５００ｍｌに植菌した。３７℃で２時間培養後、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加し、引き続き３７℃で一夜培養した。培養終了後、遠心分離（４℃，９，０００ｘｇ，２０分）により菌体を回収した。回収した菌体を５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）に懸濁し、ブランソン社製超音波破砕機（モデル４５０ソニファー）を用いて破砕後（５０Ｗ，２分，３回）、４℃、１５，０００ｒｐｍの条件下で２０分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。
大腸菌（ＩＦＯ３９７２＝ＮＢＲＣ３９７２）の染色体ＤＮＡから、文献公知の方法（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（２），３８６−３９２（２０００））に従って調製した大腸菌ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ］をアンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む２×ＹＴ培地（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３，３−１１，（１９８７））１０ｍｌで一夜３７℃で培養した。これを、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む２×ＹＴ培地５００ｍｌに植菌した。３７℃で２時間培養後、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加し、引き続き３７℃で一夜培養した。培養終了後、遠心分離（４℃，９，０００ｘｇ，２０分）により菌体を回収した。回収した菌体を５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５）に懸濁し、ブランソン社製超音波破砕機（モデル４５０ソニファー）を用いて破砕後（５０Ｗ，２分，３回）、４℃、１５，０００ｒｐｍの条件下で２０分間遠心分離し、可溶性画分（上清）を回収した。
このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ活性を測定した。その結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９菌）と共に下記表２に示す。
なお、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ活性は、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（２），３８６−３９２（２０００）に示す方法、すなわちＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃとピロリン酸からＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸とＵＴＰへの分解活性を測定、算出したものである。すなわち、５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、３ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃにＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ酵素標品を添加して３７℃で５分反応させる。また、ピロリン酸ナトリウム溶液の代わりに水を用い同様の反応を行い、これをコントロールとする。
反応液を５分間の煮沸にて反応を停止し、ＨＰＬＣによる分析を行う。分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＡＱ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍ リン酸−カリウム溶液を用いる。ＨＰＬＣ分析結果から反応液中の生じたＵＴＰ量を算出し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＵＴＰを生成する活性を１単位（ユニット）とする。
（４）大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼによるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの酵素合成
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ５'−ＵＴＰ・３Ｎａ、１ｍＭ ＧａｌＮＡｃ１−Ｐを含む溶液０．５ｍｌに上記（３）で調製した所定活性量のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ酵素液（４．８ユニット）を添加し、３７℃で反応を行った。反応途中の反応液から適当量を採取し、５分間煮沸後遠心分離してその上清をＨＰＬＣ分析に供した。
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ５'−ＵＴＰ・３Ｎａ、１ｍＭ ＧａｌＮＡｃ１−Ｐを含む溶液０．５ｍｌに上記（３）で調製した所定活性量のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ酵素液（４．８ユニット）を添加し、３７℃で反応を行った。反応途中の反応液から適当量を採取し、５分間煮沸後遠心分離してその上清をＨＰＬＣ分析に供した。
反応開始後の反応液の分析を行った結果、１ｍＭのＵＴＰと１ｍＭのＧａｌＮＡｃ１−リン酸から０．３３ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが合成されたことを確認した。さらに反応液に無機ピロホスファターゼ（シグマ社製）を添加することにより平衡がＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ合成側に傾き、合成収率が向上（６０％程度向上）することも確認した。
実施例２
（１）ヒトＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼおよび大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼによるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成
１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ５'−ＵＴＰ・３Ｎａ、５ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、５ｍＭ ５'−ＡＴＰ・３Ｎａ、５ｍＭ フッ化ナトリウムを含む溶液０．２ｍｌに上記実施例１で調製した所定活性量のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ酵素液（０．０９４ユニット）とＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ酵素液（４．４ユニット）および無機ピロホスファターゼ（シグマ社製、０．５ユニット）を添加し、３７℃で反応を行った。
（１）ヒトＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼおよび大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼによるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成
１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ５'−ＵＴＰ・３Ｎａ、５ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、５ｍＭ ５'−ＡＴＰ・３Ｎａ、５ｍＭ フッ化ナトリウムを含む溶液０．２ｍｌに上記実施例１で調製した所定活性量のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ酵素液（０．０９４ユニット）とＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ酵素液（４．４ユニット）および無機ピロホスファターゼ（シグマ社製、０．５ユニット）を添加し、３７℃で反応を行った。
反応途中の反応液から適当量を採取し、５分間煮沸後遠心分離してその上清をＨＰＬＣ分析に供した。反応開始４時間後の反応液の分析を行った結果、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ及び無機ピロホスファターゼ存在下において、３．２ｍＭのＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが合成されたことを確認した。なお、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼを存在させず、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼおよび無機ピロホスファターゼのみ反応条件下ではＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは生成されなかった。
実施例３
（１）乾燥酵母とヒトＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼおよび大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成
２００ｍＭ グルコース、５０ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、５０ｍＭ ＵＭＰ、２００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、３％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）を含む溶液１ｍｌに、実施例１で調製した組換え酵素（Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ；０．３２ユニット，ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ；１０．４ユニット）を添加し、２６℃で３００ｒｐｍの攪拌速度で撹拌しながら反応を行った。また，反応開始１６，２４，４０，４８時間目に２Ｍのグルコース溶液を０．１ｍＬずつ反応液に添加した。経時的に反応液の分析を行った結果を図２に示す。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの蓄積量は反応４９時間で３２ｍＭに達した。
（１）乾燥酵母とヒトＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼおよび大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成
２００ｍＭ グルコース、５０ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、５０ｍＭ ＵＭＰ、２００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、３％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）を含む溶液１ｍｌに、実施例１で調製した組換え酵素（Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ；０．３２ユニット，ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ；１０．４ユニット）を添加し、２６℃で３００ｒｐｍの攪拌速度で撹拌しながら反応を行った。また，反応開始１６，２４，４０，４８時間目に２Ｍのグルコース溶液を０．１ｍＬずつ反応液に添加した。経時的に反応液の分析を行った結果を図２に示す。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの蓄積量は反応４９時間で３２ｍＭに達した。
実施例４
実施例２及び３では、二種類の酵素を用いての反応例を示したが、ここでは二種類の酵素を融合タンパク質として生産させたものを用いてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ合成反応を行った結果を示す。
（１）大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼとヒト腎臓由来Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼの融合
大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子発現用プラスミド、ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりｇｌｍＵ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
実施例２及び３では、二種類の酵素を用いての反応例を示したが、ここでは二種類の酵素を融合タンパク質として生産させたものを用いてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ合成反応を行った結果を示す。
（１）大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼとヒト腎臓由来Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼの融合
大腸菌ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子発現用プラスミド、ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵを鋳型として、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりｇｌｍＵ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。
プライマー（C）：5'-GAGCGGATAACAATTTCAC-3'
プライマー（D）：5'-CCAGGATCCCTTTTTCTTTACCGGACGACG-3'
プライマー（D）：5'-CCAGGATCCCTTTTTCTTTACCGGACGACG-3'
ＰＣＲによるｇｌｍＵ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅は、反応液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）および（Ｂ）各々０．２μＭ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をタカラバイオ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（６４℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
ＤＮＡ断片増幅後、ＤＮＡを文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、前述）の方法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．４ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社より入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（タカラバイオ株式会社より入手）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ３を単離した。ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ３のｇｌｍＵ遺伝子は、終始コドンを欠きその代わりにＢａｍＨＩ認識部位が挿入されたものである。
つぎに、ｐＴｒｃ−ｈＧＬＫ２を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、１．４ｋｂ相当のＤＮＡ断片を単離・精製した。これを同じく制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ３とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ・ｈＧＬＫ２を単離した。ｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ・ｈＧＬＫ２は、ｇｌｍＵ遺伝子の３'−末下流にフレームを揃えてｈＧＬＫ２遺伝子が連結されたものである。つぎにｐＴｒｃ−ｇｌｍＵ・ｈＧＬＫ２を制限酵素ＳａｃＩとＳａｌＩで消化し、１．４ｋｂ相当のＤＮＡ断片を単離・精製した。これを同じく制限酵素ＳａｃＩとＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ１２−６とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＤＨ１株（ＡＴＣＣ ３３８４９）を形質転換し、得られたカナマイシン耐性形質転換体よりプラスミドｐ１２−６−ｇｌｍＵ・ｈＧＬＫ２を単離した。
なお、プラスミドｐＴｒｃ１２−６は、プラスミドベクター πＡＧ１（プラスミドベクター πＡＧ１を保持した大腸菌 Ｋ−１２株 ＴＮＣ１１１菌の寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６９０１号：平成１１年９月３０日寄託）と発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａを基に構築され、ｐＴｒｃ９９Ａのβ−ラクタマーゼ遺伝子が完全に欠失し（position ５６７―１８１６ｂｐが欠失）、その欠失部位にＴｎ９０３由来のカナマイシン耐性遺伝子が挿入されたものである（特開２００１−１０３９７３）。
（２）大腸菌ｇｌｍＵ遺伝子産物とヒト腎臓ＧＡＬＫ２遺伝子産物の融合タンパク質の調製
プラスミドｐ１２−６−ｇｌｍＵ・ｈＧＬＫ２を保持する大腸菌ＤＨ１株を、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）５０ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が４×１０８個／ｍｌに達した時点で培養液に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（４℃、９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、２０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５））に懸濁した。氷冷下で超音波処理により菌体を破砕し、さらに遠心分離（４℃、１２，０００×ｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
プラスミドｐ１２−６−ｇｌｍＵ・ｈＧＬＫ２を保持する大腸菌ＤＨ１株を、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）５０ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌数が４×１０８個／ｍｌに達した時点で培養液に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃で２０時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離（４℃、９，０００×ｇ，１０分）により菌体を回収し、２０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５））に懸濁した。氷冷下で超音波処理により菌体を破砕し、さらに遠心分離（４℃、１２，０００×ｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
このように得られた上清画分を酵素標品とし、酵素標品におけるＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ活性およびＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ活性を実施例１に記載の方法で測定した。その結果を下記表３に示す。
（３）融合タンパク質を用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成
上記の融合酵素標品を用いてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ合成を行った。すなわち、２００ｍＭ グルコース、５０ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、２８ｍＭ ＵＭＰ、２００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、３％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）を含む２．５ｍＬ溶液に、上記組換え融合酵素液（Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ；１．７５ユニット、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ；８８．９ユニット）を添加して、２７℃、１００ｒｐｍで攪拌しながら反応を行った。反応開始から１４，２４，４０時間目にグルコースを０．０９ｇ反応液に添加した。また、反応開始２４時間後に０．５ＭのＵＭＰ溶液１１０μｌを反応液に添加した。
上記の融合酵素標品を用いてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ合成を行った。すなわち、２００ｍＭ グルコース、５０ｍＭ ＧａｌＮＡｃ、２８ｍＭ ＵＭＰ、２００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、３％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）を含む２．５ｍＬ溶液に、上記組換え融合酵素液（Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼ；１．７５ユニット、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ；８８．９ユニット）を添加して、２７℃、１００ｒｐｍで攪拌しながら反応を行った。反応開始から１４，２４，４０時間目にグルコースを０．０９ｇ反応液に添加した。また、反応開始２４時間後に０．５ＭのＵＭＰ溶液１１０μｌを反応液に添加した。
経時的に反応液を分析した結果を図３に示す。融合タンパク質を用いた場合でも、個々に調製した両酵素を混合して用いた場合とほぼ同等にＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが合成され、反応４０時間でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは３０ｍＭに達した。
（４）大腸菌ｇｌｍＵ遺伝子産物とヒト腎臓ＧＡＬＫ２遺伝子産物の融合タンパク質の調製（スケールアップ）
プラスミドｐ１２−６−ｇｌｍＵ・ｈＧＬＫ２を保持する大腸菌ＤＨ１株を、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）３mLに接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液の全量を１２５ｍLの同培地に接種し、３７℃で８から１１時間振とう培養した。この培養液全量を５Ｌの同培地に植菌し、３７℃、通気量１．０ｖｖｍ、攪拌羽回転数３００ｒｐｍの条件で培養した。菌数が４×１０８個／ｍｌに達した時点で培養液に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、培養温度を２８℃に下げて１４時間培養を続けた。培養終了後、菌体を遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により回収し、５００ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５））に懸濁した。氷冷下で超音波処理により菌体を破砕したのち、遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
このように得られた上清画分を酵素標品とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ活性を実施例１に記載の方法で測定した。その値は９．５０ユニット/mgタンパク質であった。
プラスミドｐ１２−６−ｇｌｍＵ・ｈＧＬＫ２を保持する大腸菌ＤＨ１株を、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する培地（２％ペプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコース）３mLに接種し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液の全量を１２５ｍLの同培地に接種し、３７℃で８から１１時間振とう培養した。この培養液全量を５Ｌの同培地に植菌し、３７℃、通気量１．０ｖｖｍ、攪拌羽回転数３００ｒｐｍの条件で培養した。菌数が４×１０８個／ｍｌに達した時点で培養液に最終濃度０．１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、培養温度を２８℃に下げて１４時間培養を続けた。培養終了後、菌体を遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により回収し、５００ｍｌの緩衝液（５０ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ７．５））に懸濁した。氷冷下で超音波処理により菌体を破砕したのち、遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分）により菌体残渣を除去した。
このように得られた上清画分を酵素標品とし、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ活性を実施例１に記載の方法で測定した。その値は９．５０ユニット/mgタンパク質であった。
（５）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ合成反応のスケールアップ
融合酵素標品を用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ合成反応をスケールアップし、ジャーファーメンターで行った。すなわち、２００ｍＭ グルコース、５０ｍＭ Ｎ−アセチルガラクトサミン、２８ｍＭ ＵＭＰ、２００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、３％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）、および上記組換え融合酵素液（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ活性として５２５，０００ユニット）を添加して１,５００ｍＬにフィルアップし、２７℃、通気量０．１ｖｖｍ、攪拌羽回転数１５０ｒｐｍの条件で反応を行った。反応開始から１４，２４，３８時間目にグルコースを５４ｇ反応液に添加した。また、反応開始２４時間後に０．５ＭのＵＭＰ溶液６６ｍLを反応液に添加した。
経時的に反応液を分析した結果を図４に示す。ジャーファーメンターで反応した場合でも、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが合成され、反応４０時間でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは３５ｍＭに達した。
融合酵素標品を用いたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ合成反応をスケールアップし、ジャーファーメンターで行った。すなわち、２００ｍＭ グルコース、５０ｍＭ Ｎ−アセチルガラクトサミン、２８ｍＭ ＵＭＰ、２００ｍＭ リン酸カリウム（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、３％（ｗ／ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母工業）、および上記組換え融合酵素液（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ活性として５２５，０００ユニット）を添加して１,５００ｍＬにフィルアップし、２７℃、通気量０．１ｖｖｍ、攪拌羽回転数１５０ｒｐｍの条件で反応を行った。反応開始から１４，２４，３８時間目にグルコースを５４ｇ反応液に添加した。また、反応開始２４時間後に０．５ＭのＵＭＰ溶液６６ｍLを反応液に添加した。
経時的に反応液を分析した結果を図４に示す。ジャーファーメンターで反応した場合でも、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが合成され、反応４０時間でＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは３５ｍＭに達した。
＜受託証＞
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<110> YAMASA CORPORATION
<120> Process for producing uridine 5'-diphospho-N-acetylgalactosamine
<130> 5043-001PCT
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第１に、病原性のスタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ヒト、ブタ肝臓由来の各ウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）は、下記（Ａ）の本来の変換反応を触媒する活性を有する他に下記（Ｂ）の変換反応も触媒する活性を有していることが報告されていたが（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４，１８２２−１８２７（１９５９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２７０５５−２７０５７（１９９８）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，１３１４７−１３１５４（１９９６））、Staphylococcus aureus以外の病原性のない微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼにはそのような報告はなかったものの、試験の結果、下記（Ａ）の活性以外にも下記（Ｂ）の活性を有していることを確認した。そして、たとえば大腸菌由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼを用い、Ｎ−アセチルガラクトサミン１−リン酸（ＧａｌＮＡｃ１−Ｐ）とウリジン５'−トリリン酸（ＵＴＰ）からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを合成すれば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃやＵＤＰ−ガラクトサミンなど従来法で問題のあった他の糖ヌクレオチドとの分離の問題を解決できること。
ＰＣＲによるｇｌｍＵ遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅は、反応液１００μｌ（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭ ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ ｄＧＴＰ、０．２ｍＭ ｄＣＴＰ、０．２ｍＭ ｄＴＴＰ、鋳型ＤＮＡ ０．１ｎｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）および（Ｄ）各々０．２μＭ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユニット）をタカラバイオ社製 ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリング（６４℃、１分）、伸長反応（７２℃、２分）のステップを３０回繰り返すことにより行った。
Claims (18)
- ウリジン５'−トリリン酸（ＵＴＰ）とＮ−アセチルガラクトサミン１−リン酸（ＧａｌＮＡｃ１−Ｐ）からウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）を酵素的に製造する方法において、酵素として微生物（但し、病原性微生物を除く）由来のウリジン５'−ジリン酸−Ｎ−アセチルグルコサミンピロホスホリラーゼ（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ）を用いることを特徴とするＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼが微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法で調製されたものであることを特徴とする請求項１記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子が大腸菌由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼ遺伝子（ｇｌｍＵ）であることを特徴とする請求項２記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼによるＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの合成に際して、反応系に生成するピロリン酸を分解する酵素を添加することを特徴とする請求項１記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記ＧａｌＮＡｃ１−Ｐが、Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼを用い、Ｎ−アセチルガラクトサミンとリン酸供与体から反応系内で調製したものであることを特徴とする請求項１記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記リン酸供与体が、アデノシン５'−トリリン酸（ＡＴＰ）であることを特徴とする請求項５記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記アデノシン５'−トリリン酸（ＡＴＰ）が酵母菌体によって生成されるものであることを特徴とする請求項６記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼが動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ遺伝子を用いた組換えＤＮＡ手法で調製されたものであることを特徴とする請求項５記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼが、組換えＤＮＡ手法を用い、微生物由来の蛋白質との融合蛋白質の形で調製されたものであることを特徴とする請求項５記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 動物由来のＮ−アセチルガラクトサミンキナーゼ遺伝子（ＧＡＬＫ２）を他の微生物由来の蛋白質をコードする遺伝子の３'末端の下流に連結することで前記融合蛋白質を調整することを特徴とする請求項９記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼが、微生物由来のＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃピロホスホリラーゼとの融合蛋白質の形で調製されたものを用いることを特徴とする請求項５記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記Ｎ−アセチルガラクトサミンキナーゼにより調製されたＧａｌＮＡｃ１−Ｐの分解を防止するフッ化塩を添加することを特徴とする請求項５記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記ＵＴＰの一部若しくは全部を用いる代わりに、微生物菌体や酵素を用いたＵＴＰ生成／再生系を併用したことを特徴とする請求項１記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記ＵＴＰの一部若しくは全部を用いる代わりに、ウリジン５'−モノリン酸（ＵＭＰ）と酵母菌体を用いたＵＭＰからのＵＴＰ生成系を併用したことを特徴とする請求項１記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記酵母菌体として、サッカロミセス属、チゴサッカロミセス属、カンディダ属、トルロプシス属、ハンセヌラ属、デバリオミセス属から選ばれる１又は２以上の酵母由来の菌体を用いることを特徴とする請求項１４記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記酵母菌体として、乾燥酵母菌体を用いることを特徴とする請求項１４記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記酵母菌体を用いる反応に、無機リン酸を添加することを特徴とする請求項１４記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
- 前記酵母菌体を用いる反応に、所要のエネルギー源を添加することを特徴とする請求項１４記載のＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの製造法。
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