JP2024517696A - 純粋なＬＮＦＰ－Ｉのインビボ産生のためのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの同定 - Google Patents

Abstract

本開示は、ＬＮＦＰ－Ｉを産生させるためのＬＮＴ産生株への、特にα－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする、特異的な異種遺伝子（ｓｍｏｂとして示される）の同定及び導入を開示する。ｓｍｏｂ遺伝子は、汽水湖沼堆積物から単離される硫黄酸化細菌である、生物スルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｃｕｌｔｕｒｅ／ＤＳＭ－１０２９３９）に由来する。【選択図】図１

Description

発明の詳細な説明

［分野］
本開示は、主要なＨＭＯ化合物としてＬＮＦＰ－Ｉを産生するためのＬＮＴ産生株への、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする特異的な異種遺伝子の同定及び導入を開示する。

［背景］
ＨＭＯの化学合成に関連する課題を回避するために、いくつかの酵素的方法及び発酵手法が開発されている。２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースなどのいくつかのＨＭＯのための発酵に基づく工程が開発されてきた。発酵に基づく工程は一般的に、遺伝子改変された細菌株、例えば組み換えエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））などを利用する。

ＨＭＯの発酵工程などの生合成産生は、ＨＭＯ製造に対する、価値のある、コスト効率の良い、大規模適用可能な解決策である。その方法は、所望のオリゴ糖の合成のために必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現できるように構築された遺伝子改変細菌によるものであり、ＨＭＯ前駆体としてヌクレオチド糖の細菌の固有のプールを利用する。

ＨＭＯの生物工学的産生における最近の開発によって、細菌発現系の所定の固有の限界を克服することが可能になってきた。例えば、ＨＭＯ産生細菌細胞は、細菌でのヌクレオチド糖の制限された細胞内プールを増加させるために（国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット）、ＨＭＯ産生に関与する酵素の活性を改良するために（国際公開第２０１６／０４０５３１号パンフレット）又は合成されたＨＭＯの細胞外培地中への分泌を促進するために（国際公開第２０１０／１４２３０５号パンフレット、国際公開第２０１７／０４２３８２号パンフレット）、遺伝子改変され得る。

さらに、組み換え細胞での関心対象の遺伝子の発現は、例えば、近年、国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレットに記載されているようなものなど、特定のプロモーター配列又は他の遺伝子発現調節因子を用いることによって調節され得る。

近年、国際公開第２０１９００８１３３号パンフレットに記載されるように、フコシル化ＨＭＯの産生が改善され、多くのフコシルトランスフェラーゼが同定され、機能性促進が示され、従って生成物の産生量が増大した。例において、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択を発現するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、国際公開第２０１９００８１３３号パンフレットにおいて、ＬＮＦＰ－Ｉを産生可能であることが示されたが、かなりの副産物ＨＭＯを伴う。

このように、ＨＭＯを産生するための代替的な遺伝子改変が求められているものの、依然として満たされていない。

［概要］
本明細書中で、発明者らは、ＬＮＦＰ－Ｉの生合成産生について以前開示されたα－１，２－フコシルトランスフェラーゼよりも優れており、副産物形成の技術的問題を克服し、ＬＮＦＰ－Ｉタイター及び収率を向上させる、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｓｍｏｂを開示する。

Ｓｍｏｂの発現は、次に、副産物のレベルを低く維持しながら、生成物形成を促進し、ＬＮＦＰ－Ｉのタイターを上昇させる、スクロース利用系又は１つ以上の代謝経路修飾など、さらなる遺伝子修飾と組み合わせられ得る。

本開示は最初に、次の段階を含む、１つ以上のフコシル化ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を作製するための方法に関する：
ａ）配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシル－トランスフェラーゼタンパク質又は配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする組み換え核酸を含む、ＨＭＯを産生可能な遺伝子改変細胞を提供する段階と；
ｂ）前記核酸を発現させるために適切な細胞培養培地において（ａ）による細胞を培養する段階と；
ｃ）段階（ｂ）で産生されたＨＭＯを回収する段階。

本開示は、さらに、配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質又は配列番号１と少なくとも７０％同一である、例えば少なくとも７５％同一である、又は例えば少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする組み換え核酸配列を含む遺伝子改変細胞に関する。

本開示は、配列番号２と少なくとも７０％同一である組み換え核酸配列を含む核酸コンストラクトにも関する。

本開示は、さらに、１つ以上のＨＭＯの製造における、本明細書中に記載のような遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトの使用に関する。

［詳細な説明］
本明細書中で開示される何れの方法の工程も、明示的に規定されない限り、開示される正確な順序で実施される必要はない。

本開示は、フコシル化されたオリゴ糖を作製するための方法に関し、前記フコシル化されたオリゴ糖を作製するために遺伝子改変細胞が使用される。前記遺伝子改変細胞は、ドナー基質からアクセプター分子にフコース残基を転移させることが可能な異種α－１，２－フコシルトランスフェラーゼを発現させるために遺伝子改変されており、前記α－１，２－フコシルトランスフェラーゼは、アクセプター分子としてラクトースに対してよりもアクセプター分子としてラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）に対して特異性が高い。

［α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ－ｓｍｏｂ］
本開示は、α－１，２－フコシル－トランスフェラーゼをコードする特異的な異種遺伝子（ｓｍｏｂとして示される）の同定及び、ＬＮＦＰ－Ｉを生成させるための、ＬＮＴ産生株へのその導入を指す。ｓｍｏｂ遺伝子は、生物スルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ／ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ／ｃａｔａｌｏｇｕｅ／ｄｅｔａｉｌｓ／ｃｕｌｔｕｒｅ／ＤＳＭ－１０２９３９）由来であり、これは汽水湖沼堆積物から単離される硫黄酸化細菌である。

好ましい例示的な実施形態では、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼＳｍｏｂをコードするアミノ酸配列は、配列番号１と１００％同一であり、これは、スルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）由来であるＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ ＷＰ＿１２６４５５３９２．１である。

他のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、例えばＦｕｔＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ ｒｅｆ．ｎｏ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１）などとは異なり、Ｓｍｏｂ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼは、ＬＮＴを選択的にフコシル化することが可能であり、一方でラクトースに対しては活性が非常に低い。これらの有益な効果は、ディープウェルアッセイで確認されており、図１～５並びに以下の実施例における発酵データを参照されたい。細菌細胞に由来するα－１，２－フコシルトランスフェラーゼが本明細書中で提供される。前記フコシルトランスフェラーゼは、それらのフコシルトランスフェラーゼ活性に対するアクセプター分子としてラクト－Ｎ－テトラオースを利用する。前記フコシルトランスフェラーゼは、アクセプター分子としてのＬＮＴに基づくフコシル化されたオリゴ糖を合成するために使用され得る。

このように、ＦｕｔＣ又はＦｕｃＴ５４と比較してより高いＬＮＦＰ－ＩタイターがＳｍｏｂで達成され得るだけでなく（図１Ａ）、ＦｕｔＣ酵素の特異性が低い結果である２’－ＦＬの顕著な形成が回避され得る（図２）。

図３～５で示されるように、得られる最終ＨＭＯプロファイルは、ＦｕｔＣ、ＦｕｃＴ５４又はＳｍｏｂ酵素がＬＮＴ産生株において導入される場合、顕著に異なる。特に、ｓｍｏｂ発現細胞から得られるＨＭＯプロファイルは、ほぼ全てＬＮＦＰ－Ｉ（９１％）からなる（図５）。

Ｓｍｏｂ酵素に対する本明細書に記載の特性は、ヒト病原体ではないスルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）などの微生物がＨＭＯにおいてこのような活性を有し得る酵素を保持するという意味で非常に興味深い。さらにより興味深いことに、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるＳｍｏｂ酵素の発現の結果、同一である株バックグラウンドにおいて及び同じ調節エレメントの制御下で及び同じ遺伝子用量で発現される場合、他のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、例えばＦｕｃＴ５４酵素（国際公開第２０１９／００８１３３号パンフレットでも開示されるＧｅｎｂａｎｋ ｒｅｆ．ｎｏ：ＷＰ＿０１３０３１０１０．１）などと比較して、はるかに高いＬＮＦＰ－Ｉタイターが得られ得る。

また、ＬＮＴを特異的にフコシル化し、ラクトースをフコシル化しない能力は、酵素（例えばＦｕｔＣ）改変の試みの結果であると予想され得る。しかし、汽水湖沼堆積物などの本来なら予想外の生息地において見出される天然の微生物により産生される野生型酵素が、ＨＭＯ分子、即ちＬＮＴに対して、所望のフコシル化特異性を示し得る。

α－１，２－フコシル－トランスフェラーゼは、α－１，２連結を介してＯ－抗原反復単位のガラクトース残基上にフコースを付加することに関与する。タンパク質の配列は、機能性の喪失なく変更され得る。

Ｓｍｏｂ α－１，２－フコシル－トランスフェラーゼの機能は、α－１，２カップリングを通じてアクセプターのＧａｌ部分上へドナー分子からのフコシル部分を転移させることである。ドナーは、例えば、アクセプター分子が、ラクトース、ＬＮＴ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉである場合、ＧＤＰ－フコースである。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、Ｓｍｏｂ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ又はその機能性相同体は、ラクトース及び／又はＬＮＴ上へＧＤＰ－フコースからフコシル基を転移させ、従って２’－ＦＬ及び／又はＬＮＦＰ－Ｉを生成させる（図１０を参照）。同様に、本酵素は、ＧＤＰ－フコースからフコシル基をラクトース上に転移させ、従って２’－ＦＬを生成させる。

Ｓｍｏｂ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの活性は、ラクトースに対してよりもＬＮＴのフコシル化に対して高い。

Ｓｍｏｂ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼは、ラクトースにおいて活性が低く、ＬＮＴにおいて活性が高い。ＬＮＴにおけるＳｍｏｂ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの高い活性及びラクトースにおける前記α－１，２－フコシルトランスフェラーゼの低い活性の例は、実施例１で示す。

１つ以上の例示的な実施形態では、組み換え核酸は、配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質又は配列番号１と少なくとも７０％同一である、例えば少なくとも７１％同一である、少なくとも７２％同一である、少なくとも７３％同一である、少なくとも７４％同一である、少なくとも７５％同一である、少なくとも７６％同一である、少なくとも７７％同一である、少なくとも７８％同一である、少なくとも７９％同一である、少なくとも８０％同一である、少なくとも８１％同一である、少なくとも８２％同一である、少なくとも８３％同一である、少なくとも８４％同一である、少なくとも８５％同一である、少なくとも８６％同一である、少なくとも８７％同一である、少なくとも８８％同一である、少なくとも８９％同一である、少なくとも９０％同一である、少なくとも９１％同一である、少なくとも９２％同一である、少なくとも９３％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９５％同一である、少なくとも９６％同一である、少なくとも９７％同一である、少なくとも９８％同一である、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする。

１つ以上の現在好ましい例示的な実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも７５％同一である。

［配列同一性］
２つ以上の核酸又はアミノ酸配列の文脈において、「［所定の］％の配列同一性」という用語は、２つ以上の配列が、核酸又はアミノ酸の比較ウィンドウ又は指定された配列にわたって最大一致について比較し、整列させたとき、所与のパーセントで共通するヌクレオチド又はアミノ酸残基を有することを意味する（即ち、配列は、少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）。核酸配列又はアミノ酸配列のパーセント同一性は、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、又は手動によるアラインメント及び目視によって測定され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照）。この定義は、欠失及び／又は付加を有する試験配列の相補体及び配列並びに置換を有するものにも適用される。パーセント同一性、配列類似性の決定に、またアラインメントに適切であるアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９（１９９７）に記載されている。ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋は、本開示の核酸及びタンパク質に対するパーセント配列同一性を決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公式に入手可能である。一般的に使用されている配列アラインメントアルゴリズムの例は、
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、
ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、
ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）又は
ＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）である。

好ましくは、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７，）、好ましくはバージョン５．０．０以降（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ ｎｅｅｄｌｅ／で利用可能）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実行されるような、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を用いて決定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（３０ ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリクスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される：（同一の残基ｘ１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）。

好ましくは、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）、１０好ましくはバージョン５．０．０以後のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実行されるようなＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１ ９７０、上出）を使用して決定される。用いられるパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ及びＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリクスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）の出力が同一性パーセントとして用いられ、以下のように算出される：（同一のデオキシリボヌクレオチドｘ１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）。

［機能性相同体］
本明細書中に記載のようなタンパク質／ヌクレオチドの機能性相同体は、その元々の機能性を保持する、遺伝コード中に変更を有するタンパク質／ヌクレオチドである。機能性相同体は、突然変異誘発により得られ得る。機能性相同体は、タンパク質／ヌクレオチドの機能性と比較して、少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の残存する機能性を有するべきである。

開示されるアミノ酸配列の何れか１つの機能性相同体はまた、より高い機能性を有し得る。本明細書中に記載のような機能性相同体は、ＨＭＯ収率、純度、バイオマス形成減少、遺伝子改変細胞の生存能、遺伝子改変細胞のロバスト性又は消耗品の減少という点で、ＨＭＯ産生に寄与することが可能である。

［１つ以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生させるための方法］
工業生産においてＳｍｏｂ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼを適用する場合、複合ＨＭＯの酵素性生産においてより高い変換率を達成することが可能である。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本開示は、次の段階を含む、１つ以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生させるための方法に関する：
ａ）配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシル－トランスフェラーゼタンパク質又は配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする組み換え核酸を含む、ＨＭＯを産生可能な遺伝子改変細胞を提供する段階と；
ｂ）前記核酸を発現させるために適切な細胞培養培地において（ａ）による細胞を培養する段階と；
ｃ）段階（ｂ）で産生されたＨＭＯを回収する段階。

一実施形態では、１つ以上のＨＭＯは、好ましくは２’－ＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ及びＤＦＬからなる群から選択される、少なくとも１つのフコシル化ＨＭＯを含有する。

別の実施形態では、１つ以上のＨＭＯは、好ましくは２’－ＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ及びＬＮＤＦＨ－Ｉからなる群から選択される、少なくとも１つのフコシル化ＨＭＯを含有する。

好ましい実施形態では、本方法は、ＬＮＦＰ－１を主に産生し、つまり、産生される総ＨＭＯの７０％超がＬＮＦＰ－Ｉである。本発明の文脈において、ＬＮＦＰ－Ｉは、ＨＭＯ産物又は主要なＨＭＯとも呼ばれ得る。

［ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）］
本発開示の文脈において、「オリゴ糖」という用語は、いくつかの単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。いくつかの実施形態では、好ましいオリゴ糖は、３、４、５又は６単糖単位からなる糖ポリマー、即ち三糖、四糖、五糖又は六糖である。本開示の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。

これに関連して、「ヒトミルクオリゴ糖」又は「ＨＭＯ」という用語は、ヒト母乳中で見出される複合糖質を意味する。ＨＭＯは、１つ以上のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル及び／又は１つ以上のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端でラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、１つ以上のα－Ｌ－フコピラノシル及び／又はα－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分によって修飾され得る。

この点において、非酸性（又は中性）ＨＭＯは、シアリル残基を欠き、酸性ＨＭＯは、それらの構造に少なくとも１つのシアリル残基を有する。非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化されてもよいし又はされなくてもよい。このような中性の非フコシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３’－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴａ）、フコシル－ＬＳＴａ（ＦＬＳＴａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴｂ）、フコシル－ＬＳＴｂ（ＦＬＳＴｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴｃ）、フコシル－ＬＳＴｃ（ＦＬＳＴｃ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳ－ＬＮＴ）が挙げられる。

本開示の文脈において、ラクトースは、ＨＭＯ種であるとみなされない。

［１つ以上のＨＭＯ］
「１つ以上のＨＭＯ」という用語は、ＨＭＯ産生細胞が単一のＨＭＯ構造（第１のＨＭＯ）又は複数のＨＭＯ構造（第２、第３などのＨＭＯ）を産生可能であり得ることを意味する。１つの細胞からの複数のＨＭＯ構造は、特に細胞が複数のグリコシルトランスフェラーゼを含有する場合であるが、それは、これがＨＭＯ副産物形成に至ることが多いからである。典型的には、副産物ＨＭＯは、主要ＨＭＯの前駆体又は主要ＨＭＯのさらなる修飾の産物の何れかである。いくつかの実施形態では、優勢な量の生成物ＨＭＯ及び少量の副産物ＨＭＯを産生することが所望され得る。本明細書に記載したＨＭＯ産生のための細胞及び方法は、規定のＨＭＯプロファイルを有するＨＭＯ生成物の制御された産生、例えば、一実施形態では、生成物ＨＭＯが混合物の他のＨＭＯ（即ち副産物ＨＭＯ）と比較して優勢なＨＭＯとなる、即ち生成物ＨＭＯが他の副産物ＨＭＯより多量に産生される、ＨＭＯ混合物の産生を可能にし；他の実施形態では、同じＨＭＯ混合物を産生する細胞が、生成物ＨＭＯよりも多量に１つ以上の副産物ＨＭＯを産生するように調整され得る。例えば、主要なＨＭＯ ＬＮＦＰ－Ｉの産生中、２’－ＦＬ及びいくつかのＤＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ及び潜在的にまたＬＮｎＨ、パラ－ＬＮＨの顕著な量が発酵後に存在することが多く、これらは副産物ＨＭＯとみなされ得るが、また最終ＨＭＯ産物の一部として所望され得る。本発明の遺伝子修飾細胞を用いて、ＬＮＦＰ－Ｉ生成物中の２’－ＦＬのレベルを顕著に低下させ得る。

［ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）ブレンド物］
「ブレンド物」又は「ＨＭＯブレンド物」という用語は、２つ以上のＨＭＯ及び／又はＨＭＯ前駆体、例えばＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＨ、ＬＮｎＨ、ｐ－ＬＮＨ、ｐ－ＬＮｎＨ、２’－ＦＬ、３ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ＬＮＦＰ－ＩＩＩ、ＬＮＦＰ－Ｖ、Ｆ－ＬＮｎＨ、ＤＦ－ＬＮＨ Ｉ、ＤＦ－ＬＮＨ ＩＩ、ＤＦ－ＬＮＨ Ｉ、ＤＦ－パラ－ＬＮＨ、ＤＦ－パラ－ＬＮｎＨ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＦＳＬ、Ｆ－ＬＳＴａ、Ｆ－ＬＳＴｂ、Ｆ－ＬＳＴｃ、ＬＳＴａ、ＬＳＴｂ、ＬＳＴｃ及びＤＳ－ＬＮＴから選択されるＨＭＯなどであるが限定されないものの混合物を指す。

いくつかの例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞が単一のＨＭＯを産生することが好まれ得、他の好ましい例示的な実施形態では、複数のＨＭＯ構造を産生する遺伝子改変細胞が好まれ得る。

いくつかの例示的な実施形態では、大量の主要な１種又は複数種のＨＭＯ及び少量の副産物ＨＭＯを産生することが所望され得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、１つ以上のフコシル化ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を生成させる。本発明に関連して、これは、１つ以上のフコシル化ＨＭＯを含むことを意味し、１つ以上のフコシル化ＨＭＯの産生が、発酵工程において副産物ＨＭＯとして産生されるＬＮＴ－ＩＩ及びＬＮＴのような、中性コアＨＭＯなどの他のＨＭＯの存在を除外しないことを理解されたい。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＤＦＨ－Ｉ及びＤＦＬからなる群から選択される１つ以上のＨＭＯを産生し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、２’－ＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＤＦＨ－Ｉ及びＤＦＬからなる群から選択される１つ以上のフコシル化ＨＭＯを産生し得る。好ましくは、少なくともＬＮＦＰ－Ｉが存在する。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、２’－ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ及びＬＮＦＰ－Ｉである、１つ以上のＨＭＯを産生し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、２’－ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ及びＬＮＦＰ－Ｉである、１つ以上のＨＭＯを産生し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、ＬＮＦＰ－Ｉ及び潜在的に２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ及び／又はＬＮＴの１つ以上である、１つ以上のＨＭＯを産生し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、ＬＮＦＰ－Ｉ及び潜在的に２’－ＦＬ、ＤＦＬ及び／又はＬＮＴの１つ以上である、１つ以上のＨＭＯを産生し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、ＬＮＦＰ－Ｉ及びＬＮＴである、１つ以上のＨＭＯを産生し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬである、１つ以上のＨＭＯを産生し得る。

［主要なＨＭＯ］
「主要な」という用語は、本明細書中で、回収されたＨＭＯの総量の７０モル％超、例えば７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％超などであるが限定されない単一ＨＭＯ種を定義するために使用される。同じ定義は、ＨＭＯのブレンド物に適用され、これは、例えば２つのＨＭＯのブレンド物が回収されたＨＭＯの総量の７０％超である場合、この２つのＨＭＯのブレンド物が「主要」であることを意味する。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、１つ以上のＨＭＯを産生し得、産生されるこの主要なＨＭＯは、ＬＮＦＰ－Ｉ、２’－ＦＬ及び／又はＬＮＴである。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、１つ以上のＨＭＯを産生し、産生される主要なＨＭＯはＬＮＦＰ－Ｉである。具体的に、ＬＮＦＰ－Ｉは、総ＨＭＯの７０モル％超、例えば総ＨＭＯの７５％超、例えば８０％超、例えば８５％超、例えば９０％超、例えば９５モル％超などで産生される。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、１つ以上のＨＭＯを産生し得、産生される主要なＨＭＯは、ＬＮＴ及びＬＮＦＰ－Ｉのブレンド物である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、１つ以上のＨＭＯを産生し得、産生される主要なＨＭＯは、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉのブレンド物である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、１つ以上のＨＭＯを産生し得、産生される主要なＨＭＯは、ＬＮＦＰ－Ｉ及びＬＮＴ－ＩＩのブレンド物である。

［主要なＨＭＯとしてのＬＮＦＰ－Ｉ］
本開示を伴う１つの目的は、ＧＤＰ－フコース及びラクトースが２’－ＦＬ生合成経路で独占的に使用されないが、代わりにＬＮＦＰ－Ｉ経路に対して利用可能なままであり、ＬＮＦＰ－Ｉ経路に対して向けられると同時に、より高いＬＮＦＰ－Ｉタイターを達成することである。これは、発酵終了時に得られるＨＭＯプロファイルが、ＬＮＦＰ－Ｉから殆ど独占的に構成されるので、発酵によるＬＮＦＰ－Ｉの産生に対する工業的工程の開発を促進する。従って、本明細書中に記載の方法の１つの長所は、産生細胞により２－’ＦＬが最小レベルでしか形成されない、発酵によるＬＮＦＰ－Ｉの産生が可能になることである。

１つ以上の現在好ましい例示的な実施形態では、産生される主要なＨＭＯはＬＮＦＰ－Ｉである。具体的に、ＬＮＦＰ－Ｉは、総ＨＭＯの７０モル％超、例えば総ＨＭＯの７５％超、例えば８０％超、例えば８５％超、例えば９０％超、例えば９５モル％超などで産生される。

ラクト－Ｎ－フコ－ペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）は、五糖、より正確には、フコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース及びグルコース（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）から構成される中性フコシル化五糖である。それは、ヒト母乳中に天然に存在する。ＬＮＦＰ－Ｉは、腸細胞壁への病原体付着の阻害を介した免疫的健康及び毒素への結合を介した抗菌効果を支持する。ＬＮＦＰ－Ｉはまた、ビフィドバクテリウム属の増殖に対して良い影響も有し、これは腸の健康に有益である。

主にＬＮＦＰ－Ｉを産生させることは、大規模である場合に特に困難であり、また、本開示は、主にＬＮＦＰ－Ｉを産生させるための有効な手段を提供する。

実施例セクション及び特に図５から見られるように、Ｓｍｏｂ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼは、ｓｍｏｂ発現細胞で検出される、高レベルのＬＮＦＰ－Ｉ産生及び他のＨＭＯの非常に低いタイターにより明らかにされるように、ＬＮＴに対して高い特異性を示し、同時にラクトースに対して示す特異性は非常に低い。従って、ＬＮＴ合成に必要な２つのグリコシルトランスフェラーゼ（β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）及びさらにＳｍｏｂ酵素を発現する本明細書中で示される遺伝子改変細胞は、殆ど独占的にＬＮＦＰ－Ｉを産生する。

１つ以上の例示的な実施形態では、最終ＨＭＯブレンド物におけるＬＮＦＰ－Ｉモル％割合は、７０％超、例えば７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％超などであるが限定されない。

このように、本開示は、既にＬＮＴを産生するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、中性ＨＭＯブレンド物のＬＮＦＰ－Ｉ含量を増加させるか又は殆ど「純粋な」ＬＮＦＰ－Ｉ ＨＭＯ生成物又は少なくとも高い比率のＬＮＦＰ－Ｉ：ＨＭＯ副産物を生じさせるインビボ産生工程を確立するかの何れかのために、有利に使用され得ることを明らかにする。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書中に記載の方法は、１つ以上のＨＭＯの産生に関し、回収されたＨＭＯは、８０～９９．９％、好ましくは９０～９９．９％のＬＮＦＰ－Ｉを含有する。

［性能評価］
１つ以上の例示的な実施形態では、改変ＨＭＯ産生株の性能を２つの部分で評価する。最初に、同等な培養条件下での濃度として測定される、１つ以上のある特定のＨＭＯのＨＭＯタイターにおける％変化によって、全体的な生産性を評価する。第２に、ある特異的な標的ＨＭＯと別の特異的なＨＭＯ副産物との間の比率又は標的ＨＭＯと全てのＨＭＯの合計との間の比率によって、ある特定の生成物組成物の品質を評価した。ＨＭＯ比率は、全ての例においてモル比率として、ｘ：ｙとしての絶対比の形態で又は％で与えられる相対比率としての何れかで与えられる。本発明の目的に対して、ラクトースは、ＨＭＯとみなされない。

［他のＨＭＯ］
［２’－ＦＬ］
２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ又は２’Ｏ－フコシルラクトース）は、三糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、及びＤ－グルコース単位で構成されるフコシル化中性三糖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）である。それは、ヒト母乳中で天然に存在する最も優勢なヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）であり、全てのＨＭＯの約３０％を占める。遺伝子改変細胞において又は酵素反応において、ラクトース及びフコシルドナーとのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素反応によって２’－ＦＬが主に産生される。

１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書中に記載の方法により産生されるＨＭＯは、２’－フコシルラクトースである。

［ＬＮＴ－ＩＩ］
ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）は、三糖、より正確には、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース及びグルコース（ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成される中性三糖である。それは、ヒトミルク中に天然に存在する。

１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書中に記載の方法により産生されるＨＭＯは、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩである。

［ＬＮＴ］
ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）は、四糖、より正確には、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトース及びグルコース（Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃβ１－３Ｇａｌβ１－４Ｇｌｃ）で構成される中性四糖である。それは、ヒトミルク中に天然に存在する。

１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書中に記載の方法により産生されるＨＭＯは、ラクト－Ｎ－テトラオースである。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法は、１つ以上のＨＭＯを産生し得、産生される主要なＨＭＯはＬＮＴである。

［ＤＦＬ］
ジフコシルラクトース（ＤＦＬ又は２’，３－ジ－Ｏ－フコシルラクトース）は、四糖、より正確には、Ｌ－フコース、Ｄ－ガラクトース、Ｌ－フコース及びＤ－グルコースで構成されるフコシル化中性四糖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）Ｇｌｃ）である。それは、ヒトミルク中に天然に存在する。

［ＨＭＯブレンド物のモル比率］
本明細書中で開示される方法により産生されるＨＭＯ生成物は、比率でも与えられ得る。本明細書中で記載の場合、「比率」は、２つのＨＭＯ間又は１つのＨＭＯと他のＨＭＯの合計との間のモル比率として理解される。ＨＭＯ比率は、全ての例においてモル比率として、ｘ：ｙとしての絶対比率の形態で又は％で与えられる相対比率としての何れかで、与えられる。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、段階ｃ）において回収されたＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬのモル比率は、２０：１～１：１の範囲、例えば１５：１、１０：１、５：１、１：１などであるが限定されないか、又は２’－ＦＬは前記生成物中に存在しない。

１つ以上の例示的な実施形態では、段階ｃ）で回収されるＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、１０００：１～１：１の範囲、例えば１００：１、８０：１、５０：１、２５：１、１５：１、１０：１、５：１、１：１などであるが限定されないか、又はＬＮＴは前記生成物中に存在しない。

［回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬのモル比率］
１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中又は最終生成物中のＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬのモル比率は、１５：１～２：１の範囲である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中又は最終生成物中のＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬのモル比率は、１５：１～３：１の範囲、例えば１４：１～７：１の範囲、例えば１３：１～９：１の範囲などである。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬのモル比率は、１５：１～１０：１の範囲、例えば１４：１～１１：１の範囲など、例えば１３：１～１２：１の範囲などである。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬのモル比率は、１０：１、５：１又は３：１である。

［回収されたＨＭＯにおけるＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴの比率］
１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、１０００：１～１０：１の範囲である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、５００：１～１００：１の範囲である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、８００：１～２００：１の範囲である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、１０００：１～５００：１の範囲である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、９５０：１～７５０：１の範囲である。

例示的な実施形態では、本発明の方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、１００：１、８０：１、５０：１又１０：１である。

別の例示的な実施形態では、本発明の方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、９０：１～１１：１の範囲である。

別の例示的な実施形態では、本発明の方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、５０：１～２０：１の範囲である。

別の例示的な実施形態では、本発明の方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、１０：１を上回るが、１００：１を下回り、例えば２０：１を上回るが、９０：１を下回るか、又は例えば５０：１を上回るが９９：１を下回るなどである。

別の例示的な実施形態では、本発明の方法による段階ｃ）の回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率は、１０：１を上回るが、１００：１を下回り、例えば１５：１を上回るが、５０：１を下回るか、又は例えば２０：１を上回るが４０：１を下回るなどである。

［ＨＭＯの非存在］
１つ以上の例示的な実施形態では、ＬＮＴ－ＩＩは、回収されたＨＭＯには存在しない。

ＨＭＯは、前記ＨＭＯの量が、回収されたＨＭＯの総量の１％未満、例えば回収されたＨＭＯの総量の、０．９％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満などであるが限定されない量を構成する場合、本明細書中に記載の方法の段階ｃ）において回収されたＨＭＯには存在しないとみなされる。

１つ以上の例示的な実施形態では、２’－ＦＬ及び／又はＬＮＴ－ＩＩ及び／又はＬＮＴ及び／又はＬＮＤＦＨ－Ｉ及び／又はＤＦＬは存在しない。

１つ以上の例示的な実施形態では、ＬＮＴ－ＩＩ及び／又はＬＮＴは存在しない。

１つ以上の例示的な実施形態では、２’－ＦＬ及び／又はＬＮＤＦＨ－Ｉ及び／又はＤＦＬは存在しない。

［培養］
本文脈において、培養は、制御された条件下で、一般的にはその天然の環境外で、細胞を増殖させる工程、従って多数の細胞を育てる、増殖させる及び成長させるために使用される方法を指す。

［細胞培養培地］
本文脈において、増殖培地又は培養培地は、微生物、細胞又は小型の植物の増殖を支持するように設計された液体又はゲルである。培地は、エネルギーの適切な供給源を含み、細胞周期を調節する化合物を含み得る。培養培地は、半規定、即ち複合培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含有するものであってもよいし、又は複合化合物を含まない化学的に規定されたものであってもよい。例示的な適切な培地は、実験例で提供する。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は最少培地である。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、ラクトース、グリセロール、スクロース、グルコース及びフルクトースを含有する群から選択される１つ以上のエネルギー炭素源が補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、グリセロール、スクロース及びグルコースを含有する群から選択される１つ以上のエネルギー及び炭素源が補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、グリセロール、スクロース及び／又はグルコースが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、グリセロール及び／又はグルコースが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、スクロース及び／又はグルコースが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、グリセロール及び／又はスクロースが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、スクロースのみが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培地は、唯一の炭素及びエネルギー源としてスクロースを含有する。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、グルコースのみが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、唯一の炭素及びエネルギー源としてグルコースを含有する。

［スクロース発酵］
バイオテクノロジー産業は、スクロースのような大量及び安価な炭素源により燃料が与えられるエアロビックな生体工程を開発する努力をしており、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、唯一の炭素及びエネルギー源としてスクロースを利用可能である。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、スクロース利用系を発現する。このような系は、細胞にとって内因性であり得るが、これは、細胞がスクロースを利用できない場合、異種でもあり得る。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、１つ以上の異種ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、これにより、前記遺伝子改変細胞の唯一の炭素及びエネルギー源としてのスクロースの利用が可能になる。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＰＴＳ依存性のスクロース利用輸送系及び／又はスクロースを加水分解してフルクトース及びグルコースにすることが可能な異種ポリペプチドをコードする組み換え核酸配列を含み得る。

このような細胞は、炭素及びエネルギー源としてスクロースを利用可能である。例えば、本明細書中で開示される方法の段階ｂ）による培養段階は、２段階のスクロース供給を含み、細胞増殖を緩徐化し、高い細胞密度培養で産生される生成物の含量を向上させるために、第１の供給相で継続的に添加されたものよりも少ないスクロースの量を培養に継続的に添加することによる第２の供給相がある。

第２の供給相中に細胞培養へと継続的に添加されるスクロースの供給速度は、第１の供給相中に継続的に添加されるスクロースの供給速度よりも、３０～４０％前後低い。

両供給相の間、ラクトースを継続的に、好ましくは同じ供給溶液中でスクロースとともに、又は連続的に添加し得る。

任意選択的に、培養は、かなりの量の未使用アクセプターが細胞外分画において第２の相後に残ったままである場合、第３の供給相をさらに含む。

次に、好ましくはアクセプターの消費まで、第２の供給相に対して設定された同じ供給速度前後で、アクセプターを添加することなく、スクロースの添加が継続される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、前記遺伝子改変細胞の唯一の炭素エネルギー源としてのスクロースの利用を可能にする１つ以上の異種ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含み得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、ｓｃｒＹＡ及びｓｃｒＢＲオペロンをさらに含む、ＰＴＳ依存性スクロース利用系から選択されるスクロース利用系を発現する。１つのＰＴＳ依存性スクロース系は、国際公開第２０１５１９７０８２号パンフレットに記載されている。

１つ以上の例示的な実施形態では、ｓｃｒＹＡオペロンによりコードされるポリペプチドは、配列番号９及び１０［ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］によるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は、配列番号９及び１０［ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］の何れか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号９及び１０［ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］のうち何れか１つの機能性相同体である。

１つ以上の例示的な実施形態では、ｓｃｒＢＲオペロンによりコードされるポリペプチドは、配列番号１１及び１２［ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］によるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は、配列番号１１及び１２［ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］の何れか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号１１及び１２［ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］のうち何れか１つの機能性相同体である。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、スクロースをグルコース及びフルクトースへと加水分解することが可能なポリペプチドから選択されるスクロース利用系を発現する。好ましくは、スクロースをグルコース及びフルクトースへと加水分解可能なポリペプチは、単一の異種酵素である。

１つ以上の例示的な実施形態では、スクロースをフルクトース及びグルコースへと加水分解可能なポリペプチドは、配列番号１３若しくは１４［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ］、又は配列番号１３若しくは１４［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ］の何れか１つと少なくとも８０％同一である、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一などであるアミノ酸配列を有する、配列番号１３若しくは１４［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ及びＢｆｆ］の何れか１つの機能性相同体からなる群から選択される。

［ＳｃｒＢ、ＳｃｒＲ、ＳｃｒＹ及びＳｃｒＡ］
ＳｃｒＢは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿００００５６８５３．１に対して１００％同一である異種ポリペプチド又は少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体であり、スクロース－６－リン酸ヒドロラーゼである。

ＳｃｒＲは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０００８５１０６２．１と１００％同一である異種ポリペプチド又は少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体であり、スクロースリプレッサータンパク質である。

ＳｃｒＹは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＣＡＡ４０６５７．１と１００％同一である異種ポリペプチド又は少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体であり、スクロースポリンである。

ＳｃｒＡは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＣＡＡ４０６５８．１と１００％同一である異種ポリペプチド又は少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体であり、スクロース特異的酵素ＩＩである。

本文脈において、スクロース利用系は、取り込み及びスクロースからフルクトース及びグルコースへの加水分解並びに系自身のＤＮＡレベル調節を可能にする異種ポリペプチドの群である。

［Ｂｆｆ又はＳａｃＣ＿ＡｇａＩ］
ＳａｃＣ＿ＡａｇＩは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿１０３８５３２１０．１と１００％同一である異種ポリペプチド又は少なくとも８０％同一である、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体であり、グリコシドヒドロラーゼとして特徴づけられ、インベルターゼ及び／又はスクロースヒドロラーゼとしての今回の開示機能に従う。

Ｂｆｆは、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＢＡＤ１８１２１．１と１００％同一である異種ポリペプチド又は少なくとも８０％同一である、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する機能性相同体であり、β－フルクトフラノシダーゼである。

本文脈において、インベルターゼ又はスクロースヒドロラーゼは、スクロースをフルクトース及びグルコースへと加水分解可能な酵素である。

［回収］
本文脈における「回収」という用語は、発酵の終了後に、産生されたＨＭＯを回収することに関する。１つ以上の例示的な実施形態では、これは、バイオマス（即ち宿主細胞）及び培養培地の両方に含まれる、即ちバイオマスからの発酵ブロスの分離前に／分離をせずに、ＨＭＯを回収することを含み得る。他の実施形態では、産生されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスから個別に、即ち培養培地（即ち発酵ブロス）からのバイオマスの分離後／分離に続いて回収され得る。段階ｃ）の定義は、発酵後である。

培地からの細胞の分離は、当業者にとって周知の方法の何れか、例えば、何れかの適切な種類の遠心分離又はろ過により実行され得る。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスの収集直後に続け得るか、又は適切な条件で発酵ブロスを貯蔵した後の段階で実行され得る。残留しているバイオマス（又は全発酵）からの産生されたＨＭＯの回収には、バイオマス（即ち産生細胞）からのその抽出が含まれる。これは、当技術分野の何れかの適切な方法により、例えば超音波処理、煮沸／加熱、ホモジナイズ、リゾチームを用いた酵素的溶解又は凍結及び破砕により行われ得る。

発酵からの回収後、ＨＭＯは、さらなる加工処理及び精製に利用可能である。

［遺伝子改変細胞］
本開示は、上記のようなｓｍｏｂ α－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする組み換え核酸配列を含む遺伝子改変細胞に関する。本開示はさらに、フコシル化オリゴ糖を作製するための方法での使用のための遺伝子改変細胞に関する。前記遺伝子改変細胞は、ドナー基質からアクセプター分子にフコース残基を転移させることが可能である異種フコシル－トランスフェラーゼを発現するように遺伝子改変されており、前記アクセプター分子は、好ましくはラクト－Ｎ－テトラオースである。

「遺伝子改変細胞」は、本明細書中で使用される場合、組み換え核酸配列により形質転換されているか又は遺伝子移入されている細胞として理解される。従って、「遺伝子改変細胞」は、本文脈において、組み換え核酸配列により形質転換されているか又は遺伝子移入されている宿主細胞として理解される。

本発明の態様は、配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質又は配列番号１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする組み換え核酸配列を含む遺伝子改変細胞である。

本発明のさらなる実施形態では、遺伝子改変細胞は、基質としてのラクトースからＬＮＦＰ－Ｉを産生することを可能にするＬＮＴ産生細胞である。好ましくは、遺伝子改変細胞は、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸配列及び／又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。

２’－ＦＬの形成を減少させるため、フコースよりもラクトースへのＮ－アセチル－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の付加を優遇するために、フコシルトランスフェラーゼ活性と比較して、細胞においてβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ活性を上昇させることが好ましいものであり得る。

さらなる実施形態では、コピー数を増加させること及び／又は発現を制御するために強力な調節エレメントを選択することの何れかにより、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ発現レベルを上昇させる。

さらなる実施形態では、コピー数を増加させること及び／又は発現を制御するために強力な調節エレメントを選択することの何れかにより、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ発現レベルを上昇させる。

さらなる実施形態では、コピー数を増加させること及び／又は発現を制御するために強力な調節エレメントを選択することの何れかにより、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの両方の発現レベルを上昇させる。

本発明のさらなる実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、調節エレメント、特にプロモーター及びアクチベーター、リプレッサー欠失、機能性酵素、例えば糖排出輸送体など、さらなるグリコシルトランスフェラーゼ、コラン酸経路修飾など、以下のセクションに記載のさらなる修飾を含有し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、本細胞は、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＤＦＨ－Ｉ及びＤＦＬからなる群から選択される１つ以上のＨＭＯを作製可能である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ及びＬＮＦＰ－Ｉからなる群から選択される１つ以上のＨＭＯを作製可能である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞により産生される主要なＨＭＯはＬＮＦＰ－Ｉである。

遺伝子改変細胞は、哺乳動物細胞株を含むＨＭＯ産生に有用な何れかの細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、真核又は原核起源の単細胞微生物である。

宿主細胞として機能し得る適切な微生物細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞及び真菌細胞が挙げられる。

遺伝子改変細胞（宿主細胞）は、例えば、細菌細胞又は酵母細胞であり得る。好ましい一実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞などの原核細胞である。

［細菌宿主細胞］
細菌宿主細胞に関して、原則として、限定されないが、それらは、関心対象の遺伝子を挿入するための遺伝的操作を可能にする限り、真正細菌（グラム陽性又はグラム陰性）又は古細菌であり得、製造規模で培養し得る。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度への培養を可能にする特性を有する。本発明によるＨＭＯの工業的組み換え産生のために適切である細菌宿主細胞の非限定的例は、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、シトロバクター・フロインジイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）又はキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）であり得る。バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）及びバチルス・サーキュサンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）を含むバチルス属（ｇｅｎｕｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌も使用され得る。同様に、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベチクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパツス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）及びラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）含むが限定されない、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）及びラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）の細菌が、本発明の方法を使用して改変され得る。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びプロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）も、本明細書中に記載の本発明のための適切な細菌種である。本発明の一部としてまた、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）及びエンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ））、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）及びビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ））、スポロラクトバチルス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属種、ミクロモモスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ）属種、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属種及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びシュードモナス・エアルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））由来の、本明細書中に記載されるように改変された株も挙げられる。

本発明によるＨＭＯの産業的組み換え産生に適した真菌宿主細胞の非限定例は、酵母細胞、例えばコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属種若しくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属種であり得、例示的な種は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｆ．ソラニイ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、Ｆ．グラミネアルム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）であり得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本発明は、遺伝子改変細胞に関し、その細胞は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２株又はＤＥ３に由来する。

［発現の制御］
本文脈において、「発現を制御する」という用語は、ｍＲＮＡへの遺伝子の転写及びその続くタンパク質への翻訳が制御される遺伝子発現に関する。遺伝子発現は主に、大きくは、調節エレメントなどであるが限定されない、ＤＮＡ上の特異的部位へのタンパク質の結合の結果として、転写レベルで制御される。

上記のように、改変ストラテジーは、複数の方法で適用され得る：
１）コピー数
２）転写又は翻訳レベルでのこれらの遺伝子の何れかのコピーの発現の制御
３）ＨＭＯ産生工程におけるキー遺伝子の発現を阻止する調節因子の欠失
４）ＨＭＯ産生工程においてキー遺伝子の発現を活性化する及び／又は促進する調節因子の過剰発現。

活性化された糖ＧＤＰ－フコース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－グルコサミニル及びＵＤＰ－Ｇａｌ（ドナー糖）の合成及びそれぞれＬＮＴ－ＩＩ又は２’－ＦＬ、ＬＮＴ及びＬＮＦＰ－Ｉを形成させるためのラクトース、ＬＮＴ－ＩＩ及びＬＮＴ（アクセプター糖）の修飾を含む、遺伝子コピー数及び／又はＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬ生合成経路に直接関与する酵素をコードする遺伝子の発現の上昇は、特にＬＮＦＰ－Ｉにおいて望ましい。

１つ以上の例示的な実施形態では、細胞の異なる異種及び／又はネイティブ遺伝子Ｉの発現は、総ＨＭＯ収量及び／又は１つ以上の選択されたＨＭＯ、例えばＬＮＦＰ－Ｉなどの総ＨＭＯのモル％の何れかを上昇させる最適なバランスを達成するように制御される。

［過剰発現］
様々な分子機序によって、適切なレベルで及び適用された産生工程と関連する条件下で遺伝子が発現されることが確実になる。例えば、転写の調節は、次の影響の経路にまとめられ得る；転写機構及びエピジェネティック（転写に影響を及ぼすＤＮＡ構造における非配列変化）内の制御因子の遺伝学的（関心対象の遺伝子との制御因子の直接的な相互作用）、調整及び／又は相互作用。

何れかの遺伝子に対する決定的な閾値未満への遺伝子発現の低下の結果、突然変異体表現型が得られることが知られているが、それは、このような欠損が基本的に標的遺伝子の機能の部分的又は完全喪失の何れかを模倣するからであり、同時にネイティブ遺伝子の発現上昇は、細胞又は生物にとって有益又は破壊的の両方であり得る。

遺伝子の過剰発現は、転写を促進するためのキー遺伝子調節配列又は転写に正の影響を与える配列エレメントを構成するエンハンサーに結合する転写活性化因子により直接達成され得る。同様に、遺伝子の直接的な過剰発現は、ゲノムにおいて単純にそのコピー数を増加させるか又はそのネイティブプロモーターをより高い強度のプロモーターに置き換えるか、又はさらに対応するｍＲＮＡのリボソームへの結合を制御する配列、即ち遺伝子のコード配列の上流に存在するＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ配列を修飾することによって、達成され得る。

さらに、遺伝子の過剰発現は、通常は関心対象の遺伝子のコード配列周辺のキー調節配列に結合し、それによりその転写を阻害する転写リプレッサーの部分的又は完全な不活性化を通じて間接的に達成することもできる。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、タンパク質の過剰発現は、前記タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって、及び／又は適切なエレメントを選択するか又は余分なゲノムコピーを付加する、及び／又は通常は結合し、発現を抑制する非機能性（又は非存在）遺伝子産物を付与することによって、提供され得る。

［コピー数の増加］
コピー数の変動は、あるタイプの構造的変動である：具体的に、これは、タンパク質をコードする遺伝子を表す場合、結果として同じタンパク質をコードする遺伝子の数が増加する、塩基対の相当な数の複製又は増大の一タイプである。このような変動は、天然に多くの種で起こり得るが、宿主細胞を遺伝子修飾することによっても導入され得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、発現は、所望の遺伝子のコピー数を増加させることによって制御される。細胞中に高コピー数を有するプラスミドを導入することによるか又は宿主細胞のゲノムに遺伝子のさらなるコピーを導入するかの何れかによってコピー数を増加させ得る。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本開示は、前記タンパク質をコードする遺伝子のコピー数を増加させることによって、及び／又は適切な調節エレメントを選択することによって、タンパク質の過剰発現がもたらされる方法に関する。

［調節エレメント］
遺伝子改変細胞は、組み換え遺伝子及び／又は相同若しくは異種起源の核酸を含み得る。前記組み換え遺伝子及び／又は核酸の発現は、調節エレメントを含む１つ以上の核酸配列によって調節され得る。

「調節エレメント」という用語は、例えばコード配列を含む核酸配列の発現を調整する調節核酸配列として理解されたい。

一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられるが限定されない。

１つ以上の例示的な実施形態では、組み換え核酸の発現は、調節エレメントを含む１つ以上の核酸配列によって調節される。

１つ以上の例示的な実施形態では、１つ又は複数の調節エレメントは、プロモーター配列を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、組み換え調節エレメントは、異なるプロモーターから組み合わせられたエレメントとともに、２つ以上のプロモーター配列又は組み換えプロモーター配列を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、組み換え調節エレメントは、本発明の遺伝子改変細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列を調節するために適切な単一のプロモーター配列を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、組み換え調節エレメントは、本発明の遺伝子改変細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列を調節するために適切な同一であるプロモーター配列とともに２つ以上の調節エレメントを含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、組み換え調節エレメントは、本発明の遺伝子改変細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列を調節するために適切な非同一性のプロモーター配列とともに２つ以上の調節エレメントを含む。

調節構造、即ち、転写因子結合部位の遺伝子ごとの分布及びそれらの部位に結合する転写因子の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）を複数の異なる増殖条件で使用し得、調節エレメントとして作用する、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム全体からの１００を超える遺伝子がある。従って、本明細書中に記載のように１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の異種又はネイティブ核酸配列の転写及び／又は転写レベルの調節を可能にする何れかのプロモーター配列が適切であり得る。

［プロモーター］
遺伝子及び／又は核酸配列の発現を調節する上記のような１つ又は複数の調節エレメントは、１つ以上のプロモーター配列を含み得、このプロモーター配列は、関心対象の遺伝子の核酸配列の発現を調節するその意味において関心対象の遺伝子の核酸配列に操作可能に連結される。

「操作可能に連結される」という用語は、本明細書中で使用される場合、２つ以上の核酸（例えばＤＮＡ）セグメント間の機能的関係を指す。操作可能に連結される、とは、転写される配列に対する転写調節配列（プロモーター配列、シグナル配列又は一連の転写因子結合部位など）の機能的関係を指す。例えば、プロモーター配列は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調整する場合、コード配列に操作可能に連結されている。従って、「プロモーター配列」という用語は、ＤＮＡポリマーにおいて通常遺伝子の前にあり、ｍＲＮＡへの転写開始のための部位を提供するＤＮＡ配列を指す。あるＤＮＡポリマーにおける、通常は遺伝子の「上流」でもある（即ち先行する）「調節因子」ＤＮＡ配列は、転写開始の頻度（又は速度）を決定するタンパク質に結合する。「プロモーター／調節因子配列」又は「制御」ＤＮＡ配列とまとめて呼ばれる、機能的ＤＮＡポリマーにおける選択された遺伝子（又は一連の遺伝子）に先行するこれらの配列は、遺伝子の転写（及び最終的な発現）が起こるか否かを決定するために協働する。ＤＮＡポリマーにおいて遺伝子に続き、ｍＲＮＡへの転写の終結のためのシグナルを提供するＤＮＡ配列は、転写「終結」配列と呼ばれる。

一般に、転写される配列に操作可能に連結されるプロモーター配列は、転写配列に物理的に隣接しており、即ち、それらは、シス作用性である。

プロモーターなどの調節エレメントは、言及されるグリコシルトランスフェラーゼ、輸送体及びコラン酸遺伝子クラスターの発現を制御し、この調節エレメントは、コンストラクトのコード配列の前に来るはずである（プロモーター／調節エレメント＋コード配列）。コンストラクトは、ゲノムに組み込まれ得るか、又はこれは、プラスミド若しくは別のエピソーム性エレメントの形態で細胞に導入され得る。

プロモーターは、異種起源のものであるか、遺伝的に修飾された細胞に固有のものであり得るか、又はそれは、異種のエレメント及び／又は固有のエレメントを組み合わせた組み換えプロモーターであり得る。一般に、プロモーターは、ネイティブ、異種及び／又は合成核酸配列を含み得、２つ以上の核酸配列又は上述のような同じ若しくは異なる起源を組み換え、それによって相同、異種又は合成核プロモーター配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）及び／又は相同、異種又は合成核調節エレメント（ｎｕｃｌｅｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）を生じさせる組み換え核酸配列であり得る。

生成物の産生を増大させる１つの方法は、グリコシルトランスフェラーゼ、輸送体又はグリコシルドナーの生合成経路に関与する酵素など、生成物を産生するのに用いられる所望の酵素活性の産生を調節することであり得る。

所望の酵素の発現を推進するプロモーター強度を増大させることは、こうする１つの方法であり得る。プロモーターの強度は、β－ガラクトシダーゼ活性が、以前に説明されるようにアッセイされるｌａｃＺ酵素アッセイを用いて評価され得る（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７２を参照）。簡潔には、細胞をＺ－緩衝液中で希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム（０．１％）及びクロロホルムにより透過処理する。ＬａｃＺアッセイは、３０℃で実行される。試料を予め加熱し、２００μｌオルト－ニトロ－フェニル－β－ガラクトシダーゼ（４ｍｇ／ｍｌ）の添加によってアッセイを開始し、試料が僅かに黄色に変化したときに５００μｌの１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３を添加することによって停止させる。オルトニトロフェノールの放出は、その後、４２０ｎｍでの光学密度の変化として判定する。特定の活性は、ミラーユニット（ＭＵ）［Ａ４２０／（ｍｉｎ＊ｍｌ＊Ａ６００）］で報告する。活性が１０，０００ＭＵを超える調節要素は、強いとみなされ、活性が３，０００ＭＵ未満の調節要素は、弱いとみなされ、その間にあるものは、中間の強度を有する。強い調節要素の例は、およそ１４．０００ＭＵの活性を有するＰｇｌｐＦプロモーターであり、弱いプロモーターの例は、ＩＰＴＧにより誘導された場合におよそ２３００ＭＵの活性を有するＰｌａｃである。下記の表４は、ＰｇｌｐＦプロモーターと比較した強度に従って選別される本発明の様々な適切なプロモーターを例示する。

或いは、産生を最適化するために１つ以上のタンパク質の発現レベルのバランスをとることが必要である場合、所望の強度、例えば中程度又は低い強度、を有するプロモーターを使用することは有益であり得る。

本発明の実施形態では、本発明の選択された核酸配列の発現は、表５で同定されるようなＰｇｌｐＦ（配列番号２７）又はＰｌａｃ（配列番号３６）又はＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号２４）又はＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号２５）又はＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号２６）又はこれらのプロモーターのバリアントの制御下である。

特異的なＰｇｌｐＦバリアントは、配列番号２２、２８、２９、３０、３２、３３又は３４からなる群から選択され得る。特異的なＰｌａｃバリアントは配列番号２８である。特異的なＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲバリアントは、配列番号１５、１６、１７、１９、２０、２１、２３又は３１からなる群から選択され得る。

ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲプロモーター配列のさらなる適切なバリアントが、それぞれ又は（ｏｒ）国際公開第２０１９／１２３３２４号パンフレット及び国際公開第２０２０／２５５０５４号パンフレットに記載されている（参照によって本明細書に組み込まれる）。

１つ以上の例示的な実施形態では、調節エレメントは、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、ｐｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９、ＰｍｇｌＢ＿１６ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６及びＰｇｌｐＡ＿１６ＵＴＲからなる群から選択されるプロモーター配列など、強度が高いか又は中程度であるプロモーターである。

オン言及される実施形態では（Ｉｎ ｏｎ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）、プロモーターは、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、ｐｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８及びＰｍｇｌＢ＿１６ＵＴＲからなる群から選択される強いプロモーターである。これは、特にグリコシルトランスフェラーゼの発現のために有利であり得る。

別の実施形態では、プロモーターは、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６及びＰｇｌｐＡ＿１６ＵＴＲなどの中程度の強度のプロモーターからなる群から選択される。

別の実施形態では、プロモーターは、Ｐｌａｃ＿ｗｔ． ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１などの強度が低いプロモーターからなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示の組み換え核酸配列コンストラクトの発現の調節のための調節エレメントは、ｇｌｐＦＫＸオペロンプロモーター配列、ＰｇｌｐＦである。

現在好ましい実施形態では、プロモーター配列はＰｇｌｐＦである。

１つ以上の例示的な実施形態では、プロモーター配列は、ＰＢＡＤ、Ｐｔｅｔ、Ｐｘｙｌ、ＰｓａｃＢ、ＰｘｙｌＡ、ＰｒｐＲ、ＰｎｉｔＡ、ＰＴ７、Ｐｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ、ＰｎｉｓＡ、Ｐｂ、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、Ｐｌａｃ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ及びＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、プロモーター配列は、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９及びＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、プロモーター配列は、ＰｇｌｐＦ及びＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８からなる群から選択される。ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８は、プロモーター配列の下流に改変されたリボソーム結合部位配列を含むＰｇｌｐＦ配列の改変バージョンである。

グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸以外に、コード配列は、１つ以上の遺伝子調節タンパク質及び／又は産生宿主生物の代謝酵素及び／又はネイティブ若しくは異種の糖排出輸送体及び／又は炭素及びエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするタンパク質をコードする１つ以上の組み換え核酸も含み得る。

［リプレッサー］
１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書中で開示される遺伝子改変細胞は、通常は調節エレメントに結合し、前記調節エレメントにより調節される本開示のタンパク質の何れかの発現を抑制する、非機能性遺伝子産物又は遺伝子産物欠損を含む。

通常は結合し、本文脈において調節エレメントにより推進される発現を抑制する非機能性（又は非存在）遺伝子産物という用語は、関心対象の遺伝子のコード配列の上流及び具体的には前記遺伝子のプロモーター領域の、ＤＮＡ結合部位に関する。

１つ以上の例示的な実施形態では、細胞は、通常結合し、配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシル－トランスフェラーゼタンパク質の発現を抑制する非機能性（又は非存在）遺伝子産物又は配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシル－トランスフェラーゼタンパク質の発現を制御するための調節エレメントの上流の領域を有し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、前記遺伝子産物は、ＤＮＡ－結合転写リプレッサーＧｌｐＲである。

［ＧｌｐＲ］
ＧｌｐＲは、転写調節因子のＤｅｏＲファミリーに属し、グリセロール－３－リン酸レギュロンのリプレッサーとして作用し、これは異なるオペロンにおいて構築される。この調節因子は、ｇｌｐＥＧＲオペロンの一部であり、さらにこれはまた、独立した（ｇｌｐＲ）転写単位として構成的に発現され得る。さらに、調節されるオペロンは、誘導原、グリセロール又はグリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）の存在下及びグルコース非存在下でエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を増殖させる場合に誘導される。誘導原の非存在下で、このリプレッサーは、２０－核酸長ＤＮＡ標的部位からなる逆方向反復配列にタンデムに結合する。

ｇｌｐＲ遺伝子と関連して、「非機能性又は非存在」という用語は、細菌ゲノムからの対応する核酸配列（例えばｇｌｐＦ由来プロモーターを下方制御することが可能なｇｌｐＲをコードする配列番号４２又はそのバリアント）の完全又は部分的欠失によるｇｌｐＲ遺伝子の不活性化を指す。ｇｌｐＲ遺伝子は、ＤＮＡ－結合転写リプレッサーＧｌｐＲをコードする。このように、ＰｇｌｐＦファミリーのプロモーター配列は、ＰｇｌｐＦプロモーターと関連する転写活性をさもなくば低下させるリプレッサー遺伝子が欠失しているために、遺伝子改変細胞においてより活性が高くなる。

１つ以上の例示的な実施形態では、ｇｌｐＲ遺伝子が欠失している。

ｇｌｐＲ遺伝子の欠失は、細胞において全てのＰｇｌｐＦプロモーターからのＧｌｐＲにより強制される転写抑制を排除し得、このように、全てのＰｇｌｐＦに基づくカセットからの遺伝子発現を促進する。

［活性化因子］
１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書中で開示される遺伝子改変細胞は、前記調節エレメントにより調節される本開示のタンパク質の何れかの発現を促進する過剰発現された遺伝子産物を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示の細胞は、配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシル－トランスフェラーゼタンパク質の発現を促進する過剰発現された遺伝子産物又は配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシル－トランスフェラーゼタンパク質の発現を制御するための調節エレメントの上流の領域を含み得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、前記遺伝子産物は、ｃＡＭＰ ＤＮＡ－結合転写二重調節因子ＣＲＰである。

［ＣＲＰ］
ＣＲＰは、転写因子のＣＲＰ－ＦＮＲスーパーファミリーに属する。ＣＲＰは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子のいくつかの発現を調節し、このうち多くは、二次炭素源の異化反応に関与する。環状ＡＭＰによる活性化時に、（ｃＡＭＰ）ＣＲＰは、特異的なプロモーター配列に直接結合し、この結合は、直接的な相互作用を通じてＲＮＡポリメラーゼを動員し、これが次に、関心対象の遺伝子の発現につながるプロモーター配列に続く核酸配列の転写を活性化する。従って、ＣＲＰの過剰発現は、関心対象の遺伝子／核酸配列の発現促進につながり得る。他の機能の中で、ＣＲＰは、ＰｇｌｐＦプロモーターにおいてその機能を発揮し、ここでこれは、リプレッサーＧｌｐＲとは逆に、ＰｇｌｐＦファミリーのプロモーター配列を活性化する。このように、本開示の遺伝子改変細胞におけるＣＲＰの過剰発現は、ＰｇｌｐＦファミリーのプロモーターにより調節される遺伝子の発現を促進する。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、ｃｒｐ遺伝子が過剰発現される。

２’－ＦＬ産生株における本開示で示唆されるようなＧｌｐＲ及び／又はＣＲＰの遺伝子改変は、これらの株による２’－ＦＬの全体的産生にとって有益である。

［核酸コンストラクト］
本開示の態様は、配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシル－トランスフェラーゼタンパク質又は配列番号１と少なくとも７０％同一である、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする異種核酸配列を含む核酸コンストラクトの提供である。

１つ以上の例示的な実施形態では、核酸コンストラクトは、配列番号２と少なくとも７０％同一である、例えば、配列番号２と、例えば８０％超、例えば８５％超、例えば９０％超、例えば９５％超又は例えば９９％超同一である、組み換え核酸配列を含む。

例示的な実施形態では、核酸コンストラクトは、配列番号２と同一である組み換え核酸配列を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、核酸コンストラクトは、配列番号３、４、５、６、７、８の何れか１つと少なくとも７０％同一である核酸配列を有する、組み換え核酸配列又は機能性相同体を含む。配列番号３、４、５、６、７及び８は、ＨＭＯを細胞から輸送可能なポリペプチドをコードする。これらのコンストラクトは、機能性であるか又は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤＷＰ＿０１７４８９９１４．１、ＷＰ＿０９２６７２０８１．１、ＥＥＱ０８２９８．１、ＷＰ＿０８７８１７５５６．１、ＷＰ＿０４８７８５１３９．１又はＷＰ＿０６０４４８１６９．１の何れか１つの何れか１つ（ａｎｙ ｏｎｅ ｏｆ ａｎｙ ｏｎｅ ｏｆ）と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿０１７４８９９１４．１、ＷＰ＿０９２６７２０８１．１、ＥＥＱ０８２９８．１、ＷＰ＿０８７８１７５５６．１、ＷＰ＿０４８７８５１３９．１又はＷＰ＿０６０４４８１６９．１の何れか１つの機能性相同体である 。

１つ以上の例示的な実施形態では、本発明は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿１０３８５３２１０．１及びＢＡＤ１８１２１．１のうち何れか１つの、スクロースをフルクトース及びグルコースへと加水分解可能なポリペプチド又はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿１０３８５３２１０．１及びＢＡＤ１８１２１．１のうち何れか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿１０３８５３２１０．１及びＢＡＤ１８１２１．１の何れか１つの機能性相同体をコードする、配列番号９又は１０と少なくとも７０％同一である、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一である組み換え核酸配列をさらに含む核酸コンストラクトに関する。

核酸コンストラクトは、組み換え核酸配列であり得る。交換可能に使用される、「組み換え核酸配列」、「組み換え遺伝子／核酸／ＤＮＡコーディング」又は「コード核酸配列」という用語は、適切な制御配列、即ち、プロモーター配列の制御下にある場合、ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される一連の連続的非重複トリプレット（コドン）を含む、人工的核酸配列（即ち、核酸配列を作製するために標準的な実験室方法を使用してインビトロで作製される）を意味する。

コード配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端、翻訳開始コドン（ＡＵＧ、ＧＵＧ又はＵＵＧ）及び翻訳終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）でのオープンリーディングフレームのすぐ上流に配置されるリボソーム結合部位によって決定される。コード配列として、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成及び組み換え核酸配列が挙げられ得るが限定されない。

「核酸」という用語には、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子が含まれる。遺伝コードの縮重の結果として、所与のタンパク質をコードする多数の核酸配列が生成され得ることが理解される。

現在好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、配列番号２と同一である組み換え核酸配列を含み、この核酸配列は、配列番号１のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする。

［組み換え核酸配列］
組み換え核酸配列は、コードＤＮＡ配列、例えば、遺伝子、又は非コードＤＮＡ配列、例えばプロモーター配列などの調節ＤＮＡであり得る。

従って、例示的な一実施形態では、本発明は、コード核酸配列、即ち、関心対象の遺伝子、例えばフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、の組み換えＤＮＡ配列及び非コード調節ＤＮＡ配列、例えばプロモーターＤＮＡ配列、例えばｌａｃオペロン若しくはｇｌｐオペロンのプロモーター配列に由来する組み換えプロモーター配列、又は別のゲノムプロモーターＤＮＡ配列に由来するプロモーター配列、又は合成プロモーター配列を含む核酸コンストラクトに関し、ここで、コード配列及びプロモーター配列は、操作可能に連結される。

例示的な一実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、ベクターＤＮＡの一部であり得、別の実施形態では、コンストラクトは、宿主細胞のゲノムにおいて組み込まれる発現カセット／カートリッジである。

従って、「核酸コンストラクト」という用語は、ゲノムの遺伝子の発現を改変するか、又はコンストラクト中に含まれ得る遺伝子／コードＤＮＡ配列を発現させるために標的細胞、例えば細菌細胞中に「移植」することが意図される、核酸の人工的に構築されたセグメント、特にＤＮＡセグメントを意味する。

コンストラクト（発現カセット）において含まれる関心対象の核酸コンストラクトの細菌ゲノム中への組み込みは、従来の方法により、例えばａｔｔＴｎ７部位について記載されているように、染色体上の特異的部位に相同であるフランキング配列を含有する直線状カートリッジを用いることにより（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．）；組み換えにファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能が介在する核酸配列のゲノム組み込みのための方法により（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８ Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組み換えに基づく方法により（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）；又は陽性クローン、即ち例えばマーカー遺伝子若しくは遺伝子機能の損失若しくは獲得によって選択され得る発現カセットを保有するクローンにより、達成され得る。

上記のように、本開示は、関心対象の核酸又は遺伝子の発現のための調節エレメントの使用を可能にし、従って、核酸コンストラクトは、上の「プロモーター」のセクションに記載されるプロモーター配列など、調節エレメントを含む１つ以上の組み換え核酸配列をさらに含み得る。

実施例及び上記で示されるように、前記プロモーター配列がＰｇｌｐＦである核酸コンストラクトを使用することによって特に良好な結果が達成される。

本発明の別の例示的な実施形態では、プロモーター配列は、ｌａｃオペロンプロモーター配列、Ｐｌａｃである。

［機能性酵素］
１つ以上のＨＭＯの合成を可能にするために、本発明の組み換え細胞は、ＨＭＯ産生に対する実行可能な工業的工程を可能にする活性がある必要な機能性酵素をさらに含み得る。

［糖排出輸送体］
過去１０年にわたり、いくつかの新しく有効な糖排出輸送体タンパク質が同定され、それぞれが、異なる組み換え産生ＨＭＯに対する特異性を有し、前記タンパク質を発現する組み換え細胞の開発は、大規模な工業的ＨＭＯ製造にとって有利である。糖輸送は、オリゴ糖などであるが限定されない糖の輸送に関する。

本明細書中に記載の遺伝子改変細胞は、糖排出輸送体をコードする組み換え核酸も含み得る。糖排出輸送体は、例えば本明細書中で記載のような方法においてＨＭＯのレベルを促進し得る。１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、糖排出輸送体として作用する遺伝子産物をさらに含む。

本明細書中に記載のような遺伝子改変細胞の細胞質又は周辺質から産生培地への及び／又は産生培地から細胞質又は周辺質への１つ／又は複数のＨＭＯの流入及び／又は流出輸送が開示される。

細胞質又は周辺質から産生培地へ及び／又は産生培地から遺伝子改変細胞の細胞質又は周辺質へ１つ以上のＨＭＯを輸送可能な、本明細書中で開示されるような遺伝子改変細胞において発現されるポリペプチドは、糖輸送可能なポリペプチドである。

従って、本文脈において、糖輸送は、ＨＭＯなどであるが限定されない糖の流出及び／又は流入輸送を意味し得る。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書中に記載の方法に従う遺伝子改変細胞は、糖流出輸送体として作用する遺伝子産物をさらに含む。糖流出輸送体として作用する遺伝子産物は、遺伝子改変細胞において発現される組み換え核酸配列によってコードされ得る。糖流出輸送体をコードする組み換え核酸配列は、遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれ得る。これは、プラスミド由来であり得るか、又はこれはエピソーム性発現エレメントの一部であり得る。

［ＭＦＳ輸送体］
代表的な糖排出輸送体は、メジャーファシリテーター（Ｍａｊｏｒ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）スーパーファミリータンパク質の亜種である。ＭＦＳ輸送体は、細胞膜を横断する、オリゴ糖のような糖などであるが限定されない分子の輸送を促進する。

「メジャーファシリテーター（Ｍａｊｏｒ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）スーパーファミリー（ＭＦＳ）」という用語は、二次活能動輸送体クラスの大型で非常に多様なファミリーを意味し、これは、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオンなどを含む、一連の様々な基質を輸送することに寄与する。

「ＭＦＳ輸送体」という用語は、本文脈において、細胞膜を通じたオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの輸送、好ましくは細胞質から細胞培地への本明細書中に記載のような遺伝子改変細胞によって合成されるＨＭＯ／オリゴ糖の輸送を促進するタンパク質を意味する。さらに、又は或いは、ＭＦＳ輸送体は、ＨＭＯ又はオリゴ糖とみなされない分子、例えばラクトース、グルコース、細胞代謝物及び／又は毒素の流出も促進し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送体タンパク質は、Ｂａｄ、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｆｒｅｄ、Ｖａｇ及びＭａｒｃからなる群から選択される。

１つ以上の現在好ましい例示的な実施形態では、糖排出輸送体は、Ｎｅｃ又はＹｂｅｒＣである。

［Ｂａｄ］
交換可能に「Ｂａｄタンパク質」又は「Ｂａｄ輸送体」又は「Ｂａｄ」として本明細書中で特定されるＭＦＳ輸送体タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有し；本明細書中で配列番号３として特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿０１７４８９９１４．１を有するアミノ酸配列と１００％同一性を有するアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送体タンパク質はＢａｄである。

［Ｎｅｃ］
配列番号４のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、交換可能に「Ｎｅｃタンパク質」又は「Ｎｅｃ輸送体」又は「Ｎｅｃ」として本明細書中で特定され；ｎｅｃタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｎｅｃコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｎｅｃ遺伝子」又は「ｎｅｃ」として本明細書中で特定され；配列番号４として本明細書中で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送体タンパク質は、Ｎｅｃである。さらなる実施形態では、糖排出輸送体は、配列番号４のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号４のうち何れか１つと少なくとも７０％同一である、例えば少なくとも８０％同一である、例えば少なくとも８５％同一である、例えば少なくとも９０％同一である、例えば少なくとも９５％同一である又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する機能性相同体である。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送タンパク質は、Ｎｅｃである。

［ＹｂｅｒＣ］
配列番号５のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、交換可能に「ＹｂｅｒＣタンパク質」又は「ＹｂｅｒＣ輸送体」又は「ＹｂｅｒＣ」として本明細書中で特定され；ｙｂｅｒＣタンパク質をコードする核酸配列は、「ＹｂｅｒＣコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｙｂｅｒＣ遺伝子」又は「ｙｂｅｒＣ」として本明細書中で特定され；配列番号５として本明細書中で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＥＥＱ０８２９８．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送タンパク質は、ＹｂｅｒＣである。さらなる実施形態では、糖排出輸送体は、配列番号５のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号５の何れか１つと少なくとも７０％同一である、例えば少なくとも８０％同一である、例えば少なくとも８５％同一である、例えば少なくとも９０％同一である、例えば少なくとも９５％同一である又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する機能性相同体である。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送タンパク質は、ＹｂｅｒＣである。

［Ｆｒｅｄ］
配列番号６のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、交換可能に「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄ輸送体」又は「Ｆｒｅｄ」として本明細書中で特定され；ｆｒｅｄタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｆｒｅｄコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｆｒｅｄ遺伝子」又は「ｆｒｅｄ」として本明細書中で特定され；配列番号６として本明細書中で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送タンパク質はＦｒｅｄである。

［Ｖａｇ］
配列番号７のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、交換可能に「Ｖａｇタンパク質」又は「Ｖａｇ輸送体」又は「Ｖａｇ」として本明細書中で特定され；ｖａｇタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｖａｇコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｖａｇ遺伝子」又は「ｖａｇ」として本明細書中で特定され；配列番号７として本明細書中で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿０４８７８５１３９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送タンパク質は、Ｖａｇである。

［Ｍａｒｃ］
配列番号８のアミノ酸配列を有するＭＦＳ輸送体タンパク質は、交換可能に「Ｍａｒｃタンパク質」又は「Ｍａｒｃ輸送体」又は「Ｍａｒｃ」として本明細書中で特定され；ｍａｒｃタンパク質をコードする核酸配列は、「Ｍａｒｃコード核酸／ＤＮＡ」又は「ｍａｒｃ遺伝子」又は「Ｍａｒｃ」として本明細書中で特定され；配列番号８として本明細書中で特定されるアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿０６０４４８１６９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送タンパク質は、Ｍａｒｃである。

１つ以上の例示的な実施形態では、Ｂａｄ、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｆｒｅｄ、Ｖａｇ及びＭａｒｃからなる群から選択される糖排出輸送体及び／又はＭＦＳ輸送タンパク質は、機能性相同体であり得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、糖排出輸送体機能性相同体は、配列番号３、４、５、６、７又は８の何れか１つと、少なくとも７０％同一である、例えば少なくとも８０％同一である、例えば少なくとも８５％同一である、例えば少なくとも９０％同一である、例えば少なくとも９５％同一である、又は例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。

［グリコシルトランスフェラーゼ］
１つ以上のＨＭＯを合成することを可能とするために、本明細書中に記載の組み換え細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する機能性酵素をコードする少なくとも１つの組み換え核酸を含む。ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、（染色体組み込みによって）遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれ得るか、又は或いは、これは、遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれ得るコンストラクト中に含まれ得るか、又はプラスミドＤＮＡに挿入され、プラスミド由来として発現され得る。ＨＭＯの産生のために２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼ、例えばＬＮＴ又はＬＮｎＴが必要とされる場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する異なる酵素をコードする２つ以上の組み換え核酸、例えばＬＮＴ産生のためのβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の組み換え核酸）と組み合わせたβ－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の組み換え核酸）がゲノムにおいて組み込まれ得、コンストラクトにおいて含まれ得、及び／又はプラスミドから発現され得、ここで、第１及び第２の組み換え核酸は、互いに独立して、染色体内又はプラスミド上に組み込まれ得る。

グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質／酵素（グリコシルトランスフェラーゼ）は、様々な実施形態において、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼ、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を有する酵素から選択され得る。

例えば、２’－ＦＬの産生には、改変された細胞が活性のあるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現することが必要であり；ＬＮＴの産生のために、改変された細胞が、少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼを発現する必要があり；ＬＮＦＰ－Ｉの産生には、改変された細胞が、少なくとも２つのグリコシルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ及びβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼと組み合わせて少なくとも１つの活性のあるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素を発現することが必要である。産生細胞により含まれる組み換え遺伝子によってコードされ得るグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のいくつかの非限定的な実施形態は、表１の非限定例から選択され得る。

［ベータ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ］
β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒβ－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼとしても知られる）は、ベータ－１，３－連結ＵＤＰ－Ｎ－アセチル－グルコサミンのＮ－アセチル－グルコサミンをラクトース又は別のアクセプター分子に転移させる能力を含む何れかのタンパク質である。好ましくは、本明細書中で使用されるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼは、遺伝子改変細胞の種に由来せず、即ちβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、異種起源である。β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼの非限定例は、表１で与えられる。β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼバリアントも有用であり得、好ましくはこのようなバリアントは、表１におけるβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼの１つと、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０、例えば少なくとも９５％同一である。

改変細菌中での中性Ｎ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生もまた当技術分野で公知である（例えば、Ｇｅｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６３ ８３－９０を参照）。

ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－フコヘキサオースＶ（ＬＮＦＰ－ＶＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＤＦＨ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＤＦＨ－ＩＩ）及びラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）などのＮ－アセチルグルコサミン含有ＨＭＯの産生のために、遺伝子改変細胞は、機能不全のｌａｃＺ遺伝子を含み、これは、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒβ－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子又はその機能性相同体若しくは断片を含むように修飾される。

この外因遺伝子は、いくつかの供給源の何れか１つから得られ得、例えばＮ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｇｅｎｂａｎｋ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＡＦ４２２５８．１又はＷＰ＿０３３９１１４７３．１）又はＮ．ゴノロエア（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｇｅｎｂａｎｋ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＣＦ３１２２９．１）から記載されるｌｇｔＡ遺伝子である。

本発明の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、配列番号４０のβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ又は配列番号４０と少なくとも８０％同一である、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体の少なくとも１コピーを含む。本発明の遺伝子改変細胞において、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼの少なくともｔｏコピー（ａｔ ｌｅａｓｔ ｔｏ ｃｏｐｉｅｓ）を有することは、有利であり得る。

任意選択的に、さらなる外因性グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、外因性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒ β－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼを含む細菌内おいて同時発現され得る。例えば、ＬＮＴ産生細胞を作製するために、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子をＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ：Ｇａｌα／β－Ｒβ－３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ遺伝子と同時発現させる。

［β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ］
β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－ガラクトースのガラクトースをＮ－アセチル－グルコサミニル部分へ、ベータ－１，３－連結のアクセプター分子へ、転移させる能力を含む何れかのタンパク質である。好ましくは、本明細書中で使用されるβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼは、遺伝子改変細胞の種由来ではなく、即ちβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、異種由来又は外因性である。β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼの非限定例を表２で与える。β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼバリアントも有用であり得、好ましくはこのようなバリアントは、表１のβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼのうち１つと少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０、例えば少なくとも９５％同一である。

この外因性β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子は、いくつかの供給源の何れか１つから得られ得、例えば、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、ｇａｌＴＫ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＢＤ１８２０２６．１と相同）から、又はｗｂｇＯ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＷＰ＿０００５８２５６３．１）から、又はＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、ｊｈｐ０５６３遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＥＺ５５６９６．１）から、又はストレプトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）Ｉｂ型ＯＩ２、ｃｐｓｌＢＪ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＡＢ０５０７２３から記載されるものである。上記の酵素の何れかの機能的バリアント及び断片もまた、開示される発明により包含される。

本発明の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、配列番号４１のβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ又は配列番号４１と少なくとも８０％同一、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体の少なくとも１コピーを含む。本発明の遺伝子改変細胞においてβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼの少なくとも１コピーを有することは有利であり得る。

例示的な一実施形態では、第１及び第２の組み換え核酸の両方とも、産生細胞の染色体に安定に組み込まれ；別の現在の例示的な実施形態では、第１及び第２のグリコシルトランスフェラーゼの少なくとも一方がプラスミド由来である。

［ラクトースパーミアーゼ］
本発明では、ラクトースは、ＬＮＴ－ＩＩの合成のための基質として使用され、次にＬＮＴ－ＩＩは、ＬＮＴ（又はＬＮｎＴ）の合成のための基質として使用され、次にＬＮＴ（又はＬＮｎＴ）がＬＮＦＰ－Ｉの合成のための基質として使用される。従って、本発明の遺伝子改変細胞は、細胞へとラクトースを取り込むことが可能なはずである。ラクトースが天然において一部の微生物に取り込まれる一方で、他の微生物はそれを行う能力を欠く。ラクトース取り込みを可能にするために、このような微生物は、ラクトースを取り入れるために遺伝子改変される必要がある。従って、本発明の実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、細胞へのラクトースの取り込みが可能である。

本発明の細胞へのラクトース取り込みを可能にするための１つの方法は、ラクトースパーミアーゼの発現によるものである。ラクトース取り込み経路を含む微生物において、内因性ラクトースパーミアーゼタンパク質などであるが限定されない内因性ラクトース取り込み経路の過剰発現及び／又は異種ラクトースパーミアーゼなどであるが限定されない異種ラクトース取り込み経路の組み込みは、前記微生物のラクトース取り込みを促進するために使用され得る。従って、本発明の実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、内因性ラクトースパーミアーゼタンパク質を過剰発現し、及び／又は異種ラクトースパーミアーゼを発現する。

［β－ガラクトシダーゼ］
１つ以上のＨＭＯを産生可能な遺伝子改変細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、外因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子又は外因性β－ガラクトシダーゼ遺伝子を含み得、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、外因性ｌａｃＺ遺伝子（例えばＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ Ｖ００２９６（ＧＩ：４１９０１））を含む。

ＨＭＯ産生宿主細胞は、何れかのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子を含まないか又は不活性である遺伝子を含むように遺伝子操作される。この遺伝子は、細菌ゲノム由来の対応する核酸配列の完全若しくは部分欠失によって不活性化され得るか、又は遺伝子配列は、それが転写されない方法で変異させられるか、又は転写される場合、転写物が翻訳されないか、又はタンパク質（即ちβ－ガラクトシダーゼ）に翻訳される場合、そのタンパク質は、対応する酵素活性がない。このように、ＨＭＯ産生細菌は、ＨＭＯの産生のために有益である増加した細胞内ラクトースプールを蓄積する。

［グリコシルドナー－ヌクレオチド活性化糖経路］
本発明の方法を実行する場合、好ましくは、活性化糖ヌクレオチドがグリコシルドナーとして働くグリコシルトランスフェラーゼが介在するグリコシル化反応が起こる。活性化糖ヌクレオチドは一般に、リン酸化されたグリコシル残基がヌクレオシドに取り付けられている。特定のグリコシルトランスフェラーゼ酵素は特定の糖ヌクレオチドのみを受け取る。従って、好ましくは、以下の活性化糖ヌクレオチドがグリコシル転移に関与する：グルコース－ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸。本開示による遺伝子修飾された細胞は、グルコース－ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＧＤＰ－フコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン及びＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）からなる群から選択されるヌクレオチド活性化糖を産生するための１つ以上の経路を含み得る。表５において、以下は、それらが産生するために使用され得るグリコシルドナー及びＨＭＯ産物の非限定例であり、このリストは完全なものではあり得ない。

本発明の方法の一実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、デノボ経路により、上記の１つ以上の活性化糖ヌクレオチドを産生可能である。この点に関して、活性化糖ヌクレオチドは、グリセロール、スクロース、フルクトース又はグルコースのような単純炭素源から出発する多段階反応シーケンスにおいて、各糖ヌクレオチドのデノボ生合成経路に関与する酵素の作用下で細胞によって産生される（単糖代謝に関する概説について、例えばＨ．Ｈ．Ｆｒｅｅｚｅ ａｎｄ Ａ．Ｄ．Ｅｌｂｅｉｎ：Ｃｈａｐｔｅｒ ４：Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｉｎ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅｄｓ．Ａ．Ｖａｒｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００９）を参照）。

活性化された糖ヌクレオチドのデノボ生合成経路に関与する酵素は、細胞中に天然に存在し得るか、又は遺伝子技術若しくは組み換えＤＮＡ技術（それらは、全て当業者の一般知識の一部である）によって細胞中に導入され得る。

別の実施形態では、遺伝子修飾された細胞は、得られた単糖を糖ヌクレオチドのために利用し得る。サルベージ経路において、分解したオリゴ糖に由来する単糖がキナーゼによってリン酸化されて、ピロホスホリラーゼによってヌクレオチド糖に変換される。手順に関与する酵素は、宿主細胞とは異種のもの又は宿主細胞に固有のものであり得る。

［コラン酸遺伝子クラスター］
フコシル化ＨＭＯの産生の場合、コラン酸遺伝子クラスターは、十分なＧＤＰ－フコースの存在を確実にするために重要である。エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、ＧＤＰ－フコースは、細菌細胞壁の主要なオリゴ糖である細胞外多糖類コラン酸の産生における中間体である。本発明の文脈において、コラン酸遺伝子クラスターは、ＧＤＰ－フコースのデノボ合成に関与する酵素をコードし（ｇｍｄ、ｗｃａＧ、ｗｃａＨ、ｗｃａｌ、ｍａｎＢ、ｍａｎＣ）、一方で、ｗｃａＪなどのＧＤＰ－Ｌ－フコースの下流の遺伝子の１つ又はいくつかは、ＧＤＰ－フコースからコラン酸への変換を防ぐために欠失させられ得る。

ＧＤＰ－フコースの形成に寄与するコラン酸遺伝子クラスターは、次の遺伝子を含むか又はそれらからなる：タンパク質ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｒ Ｐ０ＡＣ８８）をコードする遺伝子ｇｍｄ；タンパク質ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＥＣ１．１．１．２７１、ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｒ Ｐ３２０５５）をコードするｗｃａＧ（ｆｃｌ）；タンパク質ＧＤＰ－マンノースマンノシルヒドロラーゼヒドロラーゼ（ＥＣ３．６．１．－、ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｒ Ｐ３２０５６）をコードするｗｃａＨ；コラン酸生合成グリコシルトランスフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｒ Ｐ３２０５７）をコードするｗｃａＩ；タンパク質ホスホマンノムターゼ（ＥＣ５．４．２．８、ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｒ Ｐ２４１７５）をコードするｍａｎＢ及びタンパク質マンノース－１－ホスファートグアニリルトランスフェラーゼグアニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．７．７．１３、ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｒ Ｐ２４１７４）をコードするｍａｎＣ。

１つ以上の例示的な実施形態では、ＧＤＰ－フコースの形成に寄与するコラン酸遺伝子クラスターは、そのネイティブゲノム遺伝子座から発現され得る。発現は、ＧＤＰ－フコース形成を増加させるために能動的に調整され得る。発現は、ネイティブプロモーターを関心対象のプロモーターと交換する及び／又はネイティブではない別のゲノム遺伝子座からの遺伝子クラスターを発現させるか若しくはコラン酸遺伝子クラスター若しくは特異的なその遺伝子をエピソーム性に発現させることにより前記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させることによって、調整され得る。

本開示に関連して、「ネイティブゲノム遺伝子座」という用語は、コラン酸遺伝子クラスターに関して、遺伝子改変細胞のゲノムにおける遺伝子クラスターの元来の及び天然の位置に関する。

［遺伝子改変細胞の使用］
本開示はまた、配列番号２と少なくとも７０％同一である組み換え核酸配列を含む遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトの何らかの商業的な使用にも関し、この核酸配列は、配列番号１のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ又は例えば配列番号１と少なくとも８０％同一である、例えば少なくとも８５％同一である、又は例えば少なくとも９０％同一である、又は例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトは、１つ以上のＨＭＯ、特に１つ以上のフコシル化ＨＭＯの製造において使用される。１つ以上のＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＤＦＬ ｐＬＮｎＨ及びＬＮＤＦＨ－Ｉからなる群から選択され得、１つ以上のフコシル化ＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＤＦＬ ｐＬＮｎＨ及びＬＮＤＦＨ－Ｉからなる群から選択され得る。１つ以上のフコシル化ＨＭＯはさらに、他のＨＭＯ、例えばＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ又はさらにシアル酸付加ＨＭＯなどを含み得る。

現在好ましい実施形態では、１つ以上のＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ及びＬＮＤＦＨ－Ｉからなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞及び／又は核酸コンストラクトは、複数のＨＭＯの製造において使用され、１つ以上のＨＭＯが、２’－ＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ及びＬＮＤＦＨ－Ｉからなる群から選択される。

別の例示的な実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸コンストラクトは、複数のフコシル化ＨＭＯの製造で使用され、このＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ及びＬＮＤＦＨ－Ｉである。

別の例示的な実施形態では、本開示による遺伝子改変細胞及び／又は核酸コンストラクトは、複数のＨＭＯの製造で使用され、このＨＭＯは、２’－ＦＬ、ＬＮＴ及びＬＮＦＰ－Ｉである。

別の例示的な実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸コンストラクトは、複数のＨＭＯの製造で使用され、このＨＭＯは、２’－ＦＬ及びＬＮＦＰ－Ｉである。

別の例示的な実施形態では、本発明による遺伝子改変細胞及び／又は核酸コンストラクトは、２つ以上のＨＭＯの製造で使用され、このＨＭＯは、ＬＮＴ及びＬＮＦＰ－Ｉである。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞及び／又は核酸コンストラクトは、ＬＮＦＰ－Ｉの製造で使用される。

１つ以上の例示的な実施形態では、上記の１つ以上のＨＭＯは、主要なＨＭＯとしてＬＮＦＰ－Ｉを含有する。具体的に、ＬＮＦＰ－Ｉは、総ＨＭＯの７０モル％超、例えば総ＨＭＯの例えば７５％超、例えば８０％超、例えば８５％超、例えば９０％超、例えば９５％超を構成する。

［ＨＭＯの製造］
１つ以上のＨＭＯを産生させるために、当技術分野で公知の手順に従って、適切な炭素源、例えばグルコース、グリセロール、スクロースなどの存在下で、本明細書に記載のような遺伝子改変細胞が培養され、産生されたＨＭＯが、培養培地及び培養工程中に形成される微生物バイオマスから回収される。その後、ＨＭＯは、当技術分野で公知の手順、例えば国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレット、国際公開第２０１７／１８２９６５号パンフレット又は国際公開第２０１７／１５２９１８号パンフレットなどに記載されている手順に従って精製され、精製されたＨＭＯは、食品成分、栄養補助食品、医薬品として、又は何らかの他の目的に、例えば研究用に使用される。

ＨＭＯの製造は通常、より大きな体積で培養を実施することによって行われる。本発明の意味における「製造する」及び「製造規模」という用語は、最小体積が５Ｌの培養ブロスを用いた発酵を規定する。製造スケール又は大規模産生は一般的に、最小体積１，０００Ｌ、例えば１０，０００Ｌ、例えば５０，０００Ｌ、例えば１００，０００Ｌ、例えば２００，０００Ｌ、例えば３００，０００Ｌの培養ブロスなど、での発酵である。通常、「製造規模」工程は、関心対象の生成物を含有する大きな体積の調製物を処理可能であり、例えば、治療用化合物又は組成物の場合、臨床試験並びに市場供給の需要を満たす量の関心対象のＨＭＣを得ることができることによって規定される。大きな体積であることに加えて、製造規模の方法は、振盪フラスコによる培養のような単純な実験室規模の方法とは対照的に、撹拌、通気、栄養素供給、プロセスパラメーター（ｐＨ、温度、溶存酸素圧、背圧など）の監視及び制御のための機器を装備しているバイオリアクター（発酵槽）の技術系の使用を特徴とする。大体のところ、本開示の実施例に記載される振盪フラスコ、卓上バイオリアクター又はディープウェル形式などの実験室規模の方法における発現系の挙動により、製造バイオリアクターの複雑な環境におけるその系の挙動の予測が可能になる。

発酵工程に使用される適切な細胞培地に関して、制限はない。培養培地は、半規定、即ち複合培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含有するものであってもよいし、又は複合化合物を含まない化学的に規定されたものであってもよい。炭素及びエネルギー源としてスクロースが使用される場合、最小培地が適切であり得る。

［製造された生成物］
遺伝子改変細胞又は核酸コンストラクトの使用に従う「製造された生成物」という用語は、１つ以上の生成物ＨＭＯとして意図される１つ以上のＨＭＯを指す。様々な生成物が上に記載されている。

有利には、本明細書中で開示される方法は、副産物対生成物の比率の低下及び生成物の全収量（及び／又は総計でのＨＭＯ）の増加の両方をもたらす。この生成物形成と比較して少ない副産物形成は、生成物産生の増加を促進し、産生及び生成物回収工程の両方の効率を向上させ、ＨＭＯの優れた製造手順を提供する。

製造される生成物は、１つ以上のＨＭＯを含む、粉末、組成物、懸濁液又はゲルであり得る。

［表］

［全般］
記載の方法と関連して上で論じられる何れの特性及び／又は態様も、本明細書中に記載の細胞、核酸コンストラクト及びその使用と同様に適用されることを理解されたい。

培養及び発酵という用語は、交換可能に使用される。

ラクト－Ｎ－トリオース、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ ＩＩ、ＬＮＴ２及びＬＮＴ ２という用語は、交換可能に使用される。

遺伝子修飾された及び遺伝子改変されたという用語は交換可能に使用される。

本明細書中で開示される特性の各具体的バリエーションは、別段具体的に述べられない限り、本開示の全ての他の実施形態に適用され得る。

一般に、本明細書で使用される全ての用語は、別段明示的に規定されないか又は述べられない限り、当技術分野におけるそれらの通常の意味に従って解釈されるべきであり、本開示の全ての態様及び実施形態に適用可能である。

「１つの（ａ）／１つの（ａｎ）／その（ｔｈｅ）［細胞、配列、遺伝子、輸送体、段階など］」についての全ての言及は、別段明示的に述べられない限り、前記細胞、配列、遺伝子、輸送体、段階などの少なくとも１つの例についての言及であると率直に解釈されるべきである。

本開示を例示するために以下に次の図面及び実施例を提供する。それらは、例示を意図したものであり、決して限定するものとして解釈されるべきではない。

ＬＮＴを産生するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１ Ｋ１２株に導入されるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択は、最終的なＨＭＯブレンド物のＨＭＯ含量において大きな影響がある。ｆｕｔＣを発現する細胞と比較した、ｆｕｃＴ５４発現細胞及びｓｍｏｂ発現細胞の最終ＬＮＦＰ－Ｉタイターの％変化。 ＦｕｔＣ、ＦｕｃＴ５４又はＳｍｏｂ酵素を発現する株についての、ＬＮＦＰ－Ｉと２’－ＦＬとのモル比率。 ｆｕｔＣ遺伝子を発現する株ＭＰ１により得られる最終ＨＭＯブレンド物中の各ＨＭＯのモル濃度％割合。 ｆｕｃＴ５４遺伝子を発現する株ＭＰ２により得られる最終ＨＭＯブレンド物中の各ＨＭＯのモル濃度％割合。 ｓｍｏｂ遺伝子を発現する株ＭＰ３により得られる最終ＨＭＯブレンド物中の各ＨＭＯのモル濃度％割合。 総試料の分析により明らかにされるような、ＭＦＳ輸送体を発現しないｓｍｏｂ発現細胞（株ＭＰ４）の最終ＨＭＯタイターと比較して示される、ｎｅｃ（株ＭＰ５及びＭＰ７）又はｙｂｅｒＣ（株ＭＰ６）遺伝子のゲノムコピーを有するｓｍｏｂ発現株についての最終ＨＭＯタイター。株ＭＰ４に対して参照レベル（１００％として与えられる）を示す。 総試料の分析により明らかにされるような、ＭＦＳ輸送体を発現しないｓｍｏｂ発現細胞（株ＭＰ４）及びｎｅｃ（株ＭＰ５及びＭＰ７）又はｙｂｅｒＣ（株ＭＰ６）遺伝子のゲノムコピーを有する細胞についての最終ＨＭＯブレンド物中のＬＮＦＰ－Ｉの割合（モル濃度％で）。 対応する培養の上清分画の分析により明らかにされるような、ＭＦＳ輸送体を発現しないｓｍｏｂ発現細胞（株ＭＰ４）の最終ＨＭＯタイターと比較して示される、ｎｅｃ（株ＭＰ５及びＭＰ７）又はｙｂｅｒＣ（株ＭＰ６）遺伝子のゲノムコピーを有するｓｍｏｂ発現株についての最終ＨＭＯタイター。株ＭＰ４に対して参照レベル（１００％として与えられる）を示す。 ＭＦＳ輸送体を発現しないｓｍｏｂ発現細胞（株ＭＰ４）及びｎｅｃ（株ＭＰ５及びＭＰ７）又はｙｂｅｒＣ（株ＭＰ６）遺伝子のゲノムコピーを有するｓｍｏｂ発現細胞の培養中の上清中で検出されるＬＮＦＰ－Ｉの割合（総ＬＮＦＰ－Ｉの％）。 ＬＮＦＰ－Ｉ及び２’－ＦＬをそれぞれラクトースから産生させるための経路。２’ＦＬは、フコースをラクトースに付加する酵素α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（α－１，２－ｆｔ）の存在下でラクトースから１段階で産生される。ＬＮＦＰ－Ｉの産生は、β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ（β－１，３－ＧｌｃＮａｃＴ）がＮ－アセチルグルコサミンをラクトースに付加してＬＮＴ－ＩＩを形成させ、それにβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（β－１，３－ＧａｌＴ）がガラクトースを付加してＬＮＴを形成させ、ＬＮＴ上でα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（α－１，２－ｆｔ）がフコースを付加してＬＮＦＰ－Ｉを形成させる、３段階の工程である。実施例１で例示されるように、異なるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼは、異なる基質特異性を有し得、即ちＦｕｔＣは、ラクトースに対してより高い特異性を有すると思われ、一方でｓｍｏｂは、基質としてＬＮＴに対してより高い特異性を有すると思われる。 主要な及び／又は唯一の炭素源及び／又はエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするタンパク質を発現するか又は発現しないＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞についての、スクロースにおけるバッチ増殖プロファイル。株ＭＰ５は、スクロースを利用可能ではなく、一方で株ＭＰ８及びＭＰ９は、それぞれ１つ又は２つのＰｇｌｐＦ推進型ゲノムコピーに由来する、細胞外スクロースヒドロラーゼＳａｃＣ＿Ａｇａｌを発現する。

［実施例］
［実施例１－中性ＨＭＯブレンド物中のＬＮＦＰ－Ｉ含量は、発現されるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼの選択により調整され得る。］
［ディープウェルアッセイにおいて試験した株ＭＰ１、ＭＰ２及びＭＰ３の遺伝子型の説明］
本願において構築した株（遺伝子改変細胞）は、遺伝子型：Ｆ^－、λ^－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４であるエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１に基づいた。次の修飾があるプラットフォーム株「ＭＤＯ」を作製するためにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１株に対してさらなる修飾を行った：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモーターの挿入。

Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムへの関心対象の挿入又は欠失の方法は、当業者にとって周知である。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体への遺伝子カセットの挿入は、特異的な選択マーカー遺伝子及びスクリーニング方法とともに遺伝子ゴルジング（ｇｏｒｇｉｎｇ）（例えば、Ｈｅｒｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ ２００４ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：２６７３－８１及びＷａｒｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（４）：ｅ３６を参照）を用いて行われ得る。

プラットフォーム株（「ＭＤＯ」）に基づいて、完全染色体株ＭＰ１、ＭＰ３及びＭＰ２を得るために、表２でまとめた修飾を行った。これらの株は、五糖ＨＭＯ、ＬＮＦＰ－Ｉを産生し得る。Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのグリコシルトランスフェラーゼ酵素ＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチログルコサミン（ａｃｅｔｙｌｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）トランスフェラーゼ）及びＨ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのＧａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）が３つの株全てで存在する。

さらに、これらの株のそれぞれは、表２で示されるようにα－１，２－フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の単ゲノムコピーを保有し、その発現は、合成誘導性プロモーターＰｇｌｐＦにより推進される。

具体的に、株ＭＰ１は、ｆｕｔＣ遺伝子（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）２６６９５，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，３１，１２６５－１２７４，ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０８０４７３８６５．１）の単一ＰｇｌｐＦ推進型コピーを発現し、株ＭＰ３は、ｆｕｃＴ５４遺伝子（シデロキシダンス・リトトロピクス（Ｓｉｄｅｒｏｘｙｄａｎｓ ｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）ＥＳ－１１、国際公開第２０１９００８１３３Ａ１号パンフレット、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＷＰ＿０１３０３１０１０．１）の単一ＰｇｌｐＦ推進型コピーを発現し、株ＭＰ３は、ｓｍｏｂ遺伝子（スルフリフレクサス・モビリス（Ｓｕｌｆｕｒｉｆｌｅｘｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）、本開示の配列番号１）の単一ＰｇｌｐＦ推進型コピーを発現する。

本実施例は、天然で見出されるα－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、Ｓｍｏｂを初めて記載し、ＬＮＴに対する前例のない高い特異性を示し、同時にラクトースに対して非常に低い特異性を示す。以前試験したα－１，２－フコシルトランスフェラーゼに反して、ＬＮＴ合成のために必要な２つのグリコシルトランスフェラーゼ（配列番号４０及び４１）及びＳｍｏｂ酵素を同時に発現する細胞は、ほぼＬＮＦＰ－Ｉだけを産生する。このように、本開示は、既にＬＮＴを産生するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１ Ｋ１２株のゲノムに単一の異種遺伝子、ｓｍｏｂを導入する単純な株改変アプローチが、中性ＨＭＯブレンド物のＬＮＦＰ－Ｉ含量を増加させるか又はほぼ「純粋な」ＬＮＦＰ－Ｉ ＨＭＯ産物を生じさせるインビボ産生工程を確立するかの何れかのためにどのように有利に使用され得るかを明らかにする。

参照：表２．株ＭＰ１、ＭＰ３及びＭＰ２の遺伝子型

［株の特徴評価のための適用されたディープウェルアッセイプロトコールの説明］
４日間プロトコールを使用して、９６ディープウェルプレートにおいて本実施例で開示された株をスクリーニングした。最初の２４時間中、前培養物を高密度に増殖させてから、遺伝子発現の誘導及び生成物形成を可能にする培地に移した。より詳細には、第１日に、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基本最少培地を用いて新鮮な前培養物を調製した。前培養物を３４℃、１０００ｒｐｍの振盪で２４時間インキュベートし、その後、さらに新しい基本最少培地（ＢＭＭ、ｐＨ７．５）に移してメインの培養を開始した。新しいＢＭＭに硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（１００ｍＬあたり５０μｌ）及び１０％ラクトース溶液のボーラス（１００ｍｌあたり５ｍｌ）を補充した。さらに、グルコースがＣ制限増殖に適した速度で放出されるようにスクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ）を添加することとともに、５０％スクロース溶液を炭素源として提供した。メインの培養物を２８℃及び１０００ｒｐｍの振盪で７２時間インキュベートした。

総ブロスの分析のために、９６ウェルプレートを１００℃で煮沸し、続いて遠心分離し、最終的に上清をＨＰＬＣにより分析した。上清試料のために、マイクロタイタープレートの最初の遠心分離の後に、ＨＰＬＣによる直接的な分析のために０．１ｍＬの上清を取り出した。ペレット試料の場合、細胞を最初に洗浄し、次いで脱イオン水中で溶解させ、遠心分離した。遠心分離に続いて、再懸濁、煮沸、遠心分離及び最終的な上清の分析後、細胞内部のＨＭＯ含量についてペレットを分析した。

［ディープウェルアッセイの結果］
ＦｕｔＣ酵素は、ＬＮＴよりもラクトースに対して高い特異性を有することが知られているので、ｆｕｔＣ発現細胞では２’－ＦＬの形成が優勢である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９９，３１，１２６５－１２７４）。従って、インビボでＬＮＦＰ－Ｉ合成を促進するために、ラクトースよりもＬＮＴに対して高い特異性を示すＦｕｔＣ以外のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼを同定することが望ましい。これは、特許である国際公開第２０１９００８１３３Ａ１号パンフレットで以前試されており、ＦｕｃＴ５４酵素を含め、いくつかのα－１，２－フコシルトランスフェラーゼがＬＮＴに対する高い特異性を付随した。

発明者らの実験において、ＦｕｔＣ、ＦｕｃＴ５４又はＳｍｏｂ酵素を発現する株を構築し、ディープウェルアッセイで特徴評価し、培養の総ブロスから試料を回収した。上記の７２時間プロトコールに続いて、ＨＰＬＣによって、ＨＭＯ含量について全ての試料を分析した。ｆｕｔＣ発現細胞のＨＭＯ含量と比較して、試験した株のＨＭＯ含量、即ちｆｕｃＴ５４発現細胞及びｓｍｏｂ発現細胞の％ＨＭＯ含量、の相対的な差異を計算するために、各試料における検出されたＨＭＯの濃度を使用した。ＨＰＬＣ分析により決定されるＨＭＯ濃度に基づいて、ＬＮＦＰ－Ｉ対２’－ＦＬ比率も計算した。最後に、各株の全体的なＨＭＯプロファイルを報告するために、各株により得られる最終ブレンド物中の各ＨＭＯのモル濃度％割合を計算した。

ディープウェル培養における総試料の分析及び上述の計算により明らかになるように、本開示で同定される酵素、即ちＳｍｏｂは、ＬＮＴに対するその固有の高い特異性ゆえに、ＬＮＦＰ－Ｉを産生するという点で、ＦｕｔＣ及びＦｕｃＴ５４酵素よりも優れていると思われる。図１で示されるように、ｆｕｃＴ５４遺伝子（株ＭＰ２）及びｓｍｏｂ遺伝子（株ＭＰ３）を発現する株の最終的なＬＮＦＰ－Ｉタイターは、ｆｕｔＣ遺伝子を発現する株（株ＭＰ１）で達成したＬＮＦＰ－Ｉタイターよりもそれぞれ４０％及び７０％高い。同様に、ｆｕｔＣ発現細胞における１：１のＬＮＦＰ－Ｉ／２’－ＦＬ比率は、ｆｕｃＴ５４発現細胞において２：１、ｓｍｏｂ発現細胞において１１：１に変化する。（図２）。図３～５で示されるように、ｆｕｔＣ、ｆｕｃＴ５４又はｓｍｏｂ遺伝子を発現する細胞により得られるブレンド物中のＨＭＯ含量は、株間で顕著に異なる。具体的に、株ＭＰ１（ＦｕｔＣ）により送達されたＨＭＯブレンド物中でのほぼ５０％：５０％のＬＮＦＰ－Ｉ：２’ＦＬ含量は、株ＭＰ２（ＦｕｃＴ５４）ではほぼ７０％：３０％になるか、又は株ＭＰ３（Ｓｍｏｂ）ではさらに９０％：１０％となる。

これらの結果は、ＬＮＦＰ－Ｉが濃縮された中性ＨＭＯブレンド物を作製するためのＳｍｏｂ酵素又は非常に望ましい株改変目的である殆どＬＮＦＰ－Ｉしか産生しない細胞によりもたらされるユニークな長所を強調する。また、Ｓｍｏｂ酵素が前に同定されたＦｕｃＴ５４酵素（国際公開第２０１９００８１３３Ａ１号パンフレット）よりも高い程度まで上記予想に合致することは予想外であり、それにより、ＨＭＯの分野における本開示のインパクトが強まる。

［実施例２－Ｓｍｏｂ酵素及び異種ＭＦＳ輸送体Ｎｅｃ又はＹｂｅｒＣの何れかの同時発現は、効率的なＬＮＦＰ－Ｉ細胞ファクトリーのために重要である。］
［ディープウェルアッセイで試験した株ＭＰ４、ＭＰ５、ＭＰ６及びＭＰ７の遺伝子型の説明］
実施例１に記載のプラットフォーム株（「ＭＤＯ」）に基づいて、表３でまとめられた修飾を行い、完全染色体株ＭＰ４、ＭＰ５、ＭＰ６及びＭＰ７を得た。これらの株は、五糖ＨＭＯ ＬＮＦＰ－Ｉを産生し得る。Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのグリコシルトランスフェラーゼ酵素ＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチログルコサミン（ａｃｅｔｙｌｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）トランスフェラーゼ、配列番号４０）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのＧａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ、配列番号４１）及びＳ．モビリス（Ｓ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からのＳｍｏｂ（α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ（配列番号１）が４つの株全てにおいて存在する。さらに、株ＭＰ６は、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）からのメジャーファシリテーター（Ｍａｊｏｒ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）スーパーファミリー（ＭＦＳ）ＹｂｅｒＣの異種輸送体（配列番号５）を発現し、一方で株ＭＰ５及びＭＰ７は、ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）からの異種ＭＦＳ輸送体Ｎｅｃ（配列番号４）を発現する。後者の２つの株間の唯一の相違は、ｎｅｃ遺伝子の発現を推進するプロモーターの強度にあり、即ちＰｇｌｐＦ推進ｎｅｃコピーが株ＭＰ５に存在し、一方で株ＭＰ７は、Ｐｌａｃプロモーターの制御下でｎｅｃ遺伝子を発現する。

本発明の実施例は、かなりの割合の生成物が培養上清中で見出される、高タイターでＬＮＦＰ－Ｉを産生する非常に効率的なＬＮＦＰ－Ｉ細胞ファクトリーを構築するための最適化された株改変アプローチを記載する。本明細書中に記載のアプローチ後、ＬＮＦＰ－Ｉ以外のＨＭＯは、改変細胞により送達される総ＨＭＯブレンド物の少ない割合しか構成しない。本発明の実施例の枠組みにおいて、既にＬＮＴを産生するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１ Ｋ１２株のゲノムに異種遺伝子、ｓｍｏｂ及びｎｅｃ又はｙｂｅｒＣの導入は、有利に、上記の有益な形質を有する効率的なＬＮＦＰ－Ｉ細胞ファクトリーを送達するために、ｌｇｔＡ遺伝子に対して高いコピー数で使用され得る。

参照：表３．株ＭＰ４、ＭＰ５、ＭＰ６及びＭＰ７のゲノムタイプ

［株の特徴評価のための適用されたディープウェルアッセイプロトコールの説明］
４日間プロトコールを使用して、９６ディープウェルプレートにおいて本発明の実施例で開示される株をスクリーニングした。最初の２４時間中、前培養物を高密度に増殖させてから、遺伝子発現の誘導及び生成物形成を可能にする培地に移した。より詳細には、第１日に、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基本最少培地を用いて新鮮な前培養物を調製した。前培養物を３４℃及び１０００ｒｐｍの振盪で２４時間インキュベートし、次いで、新しい基本最少培地（ＢＭＭ、ｐＨ７．５）にさらに移してメインの培養を開始した。新しいＢＭＭに硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（１００ｍＬあたり５０μｌ）及び２０％ラクトース溶液のボーラス（１７５ｍｌあたり１０ｍｌ）を補充した。さらに、グルコースがＣ制限増殖に適した速度で放出されるように、スクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ）を添加することとともに、５０％スクロース溶液を炭素源として提供した。メイン培養物を２８℃及び１０００ｒｐｍの振盪で７２時間インキュベートした。

総ブロスの分析のために、１００℃で９６ウェルプレートを煮沸し、続いて遠心分離し、最終的にＨＰＬＣにより上清を分析した。上清試料に対して、マイクロタイタープレートの最初の遠心分離の後、ＨＰＬＣによる直接的な分析のために０．１ｍＬの上清を採取した。ペレット試料に対して、細胞を最初に洗浄し、次いで脱イオン水中で溶解させ、遠心分離した。遠心分離に続いて、再懸濁、煮沸、遠心分離及び最終的な上清の分析後、細胞内部におけるＨＭＯ含量についてペレットを分析した。

［ディープウェルアッセイの結果］
多くの宿主遺伝子並びに関心対象のＨＭＯのインビボ合成に関与する酵素をコードする異種遺伝子の発現は、所望のＨＭＯ産物が高タイターで形成され、一方で主な産物以外の分子（即ち、前駆体又は大幅に修飾された糖）の形成が少量であるという最適な発酵アウトプットを達成するために細かく調整する必要がある。さらに、関心対象の新たに形成されるＨＭＯの排出は、細胞に対してＨＭＯにより課される浸透圧ストレスを軽減するために、細胞外部に排出することを必要とする。糖排出輸送体の同定及びそれらの発現の細かいバランスは、このような産生系の成功のための重要な要素であり得る。しかし、前駆体又はその伸長型ではなく、関心対象のＨＭＯのみが選択される糖排出輸送体と結合し、それにより排出されるべきであるため、この課題は困難であり得る。

ＬＮＦＰ－Ｉ合成に関与する酵素の発現のバランスをとるための次のいくつかの株改変ラウンド後、細胞からＬＮＦＰ－Ｉ産物を排出可能であることが証明された糖輸送体、即ちＮｅｃ及びＹｂｅｒＣも（図９）ＬＮＦＰ－Ｉ産生系において導入された。適切な株を構築し、前のセクションに記載のようなディープウェルアッセイにおいて特徴評価した。培養物の総ブロス並びに上清及びペレット分画から試料を回収した。上記の７２時間プロトコール後、ＨＰＬＣによってＨＭＯ含量について全ての試料を分析した。試験された株のＨＭＯ含量における％定量的な差異、即ち異種輸送体を発現しない細胞のＨＭＯ含量と比較したｎｅｃ発現細胞及びｙｂｅｒＣ発現細胞の％ＨＭＯ含量を計算するために、各試料中の検出されたＨＭＯの濃度を使用した。

ディープウェル培養中の総試料の分析により明らかにされるように、グリコシルトランスフェラーゼのバランスが取れた発現とともにＬＮＦＰ－Ｉ系において輸送体が発現される場合、ＬＮＦＰ－Ｉタイターの小規模の上昇が達成され得、即ち株ＭＰ４（輸送体なし）よりも株ＭＰ７（Ｎｅｃ）について最大１０％高いＬＮＦＰ－Ｉタイターが観察される（図６）。さらに、ＬＮＦＰ－Ｉ産生株における糖排出輸送体の導入は、最終的なブレンド物中の他のＨＭＯの存在量の劇的な変化を誘導する。具体的に、ＬＮＴ ＩＩは、全ての輸送体発現細胞の総ブロスに存在せず、後者は、糖輸送体を発現しない株（株ＭＰ４）と比較して、およそ２０％低い２’－ＦＬ及び最大４０％高いＬＮＴタイター（株ＭＰ６及びＭＰ５）を達成する（図６）。輸送体発現細胞に対して観察されるＬＮＴタイターの比較的高い上昇（最大４０％）は、全ての４つの株に対して報告されるＬＮＴ濃度の低値に起因し得るということに注目されたい。

相対的な最終ＬＮＦＰ－Ｉタイターの僅かな上昇及びＭＦＳ発現細胞に対して観察される他のＨＭＯの相対的存在量の劇的な変化は、最終ＨＭＯブレンド物において測定された絶対ＬＮＦＰ－Ｉ割合（％）において予想通り反映された。具体的に、総試料の分析により明らかにされるように、最終ＨＭＯブレンド物中のＬＮＦＰ－Ｉの絶対的割合は、Ｎｅｃ輸送体（株ＭＰ５及びＭＰ７）を発現する細胞についてはおよそ８８％に到達し、一方でこの割合は、ＭＦＳ輸送体を発現しない細胞についてはおよそ８１％に対応した（図７）。

ディープウェル培養で試験された株の上清及び総試料の分析から、輸送体発現細胞について、ＬＮＴ ＩＩ、ＬＮＴ及び２’－ＦＬの観察された相対的存在量の変化に関して同様の傾向が明らかになった（図６及び８）。しかし、上清試料の分析から、ＬＮＦＰ－Ｉに関する際立った事実が明らかになった。詳細には、Ｐｌａｃプロモーターの制御下でＮｅｃ輸送体を発現する株ＭＰ７により達成され得るＬＮＦＰ－Ｉタイターの相対的な全体的上昇は僅かしかないものの（図６）、この株の細胞外ＬＮＦＰ－Ｉの割合は糖輸送体を発現しない株ＭＰ４よりもかなり高い（最大３０％）（図８）。同じ傾向は、ＹｂｅｒＣ輸送体（株ＭＰ６）又はＰｇｌｐＦ推進ゲノムコピーからのＮｅｃ輸送体（株ＭＰ５）を発現する株に対して観察される（図８）。

ＭＦＳを発現しない細胞と比較した場合のＭＦＳ発現細胞に対するＬＮＦＰ－Ｉの上清割合の顕著な増加は、対応する培養の上清中で検出された絶対的ＬＮＦＰ－Ｉ割合（％）において予想通り反映された。詳細には、ＭＦＳ輸送体を発現しない細胞（株ＭＰ４）については上清中で総ＬＮＦＰ－Ｉの２４％しか検出されず、一方でＮｅｃ輸送体を発現する細胞については培養の上清中で合成されたＬＮＦＰ－Ｉのおよそ３８％が検出された（図９）。

要するに、β－１，３－Ｎ－アセチログルコサミン（ａｃｅｔｙｌｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）トランスフェラーゼＬｇｔＡ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼＧａｌＴＫ、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼＳｍｏｂ及びＭＦＳ 輸送体Ｎｅｃ又はＹｂｅｒＣの何れかのバランスが取れた発現は、生産性が高いＬＮＦＰ－Ｉ細胞ファクトリーの作製のための有効な株改変ストラテジーを構成する。このような微生物系は、高タイターでＬＮＦＰ－Ｉを産生し、その生成物の顕著な割合が培養の上清で見出され、ＬＮＦＰ－Ｉ以外のＨＭＯは、改変された細胞により送達される総ＨＭＯブレンド物の僅かな割合にしか相当しない。

［実施例３－ＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロース利用技術は、複雑な五糖ＬＮＦＰ－Ｉを産生するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を改変するためにうまく適用され得る。］
［株ＭＰ５、ＭＰ８及びＭＰ９の遺伝子型の説明］
実施例１に記載のプラットフォーム株（「ＭＤＯ」、ＭＰ１）に基づき、完全染色体株ＭＰ５、ＭＰ８及びＭＰ９を得るために、表６でまとめられた修飾を行った。

これらの株は、五糖ＨＭＯ ＬＮＦＰ－Ｉ、四糖ＨＭＯ ＬＮＴ及び三糖ＨＭＯ ２’－ＦＬを産生し得る。Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）からのグリコシルトランスフェラーゼ酵素ＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチログルコサミン（ａｃｅｔｙｌｏｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）トランスフェラーゼ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）からのＧａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）、Ｓ．モビリス（Ｓ．ｍｏｂｉｌｉｓ）からのＳｍｏｂ（α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ）及びローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）からの異種ＭＦＳ輸送体Ｎｅｃが３つの株全てにおいて存在する。株ＭＰ５に反して、（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）からの遺伝子ｓａｃＣ＿Ａｇａｌアビバクテリウム・ガリナルがそれらのゲノム上に１つ又は２つの遺伝子座でそれぞれ組み込まれるので、株ＭＰ８及びＭＰ１１は、炭素及びエネルギー源としてスクロースを利用し得る。

本発明は、複合五糖ＬＮＦＰ－Ｉを産生する改変されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に炭素及び／又はエネルギー源としてスクロースを利用する能力を付与するために、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌなどの細胞外インベルターゼの導入がどのように有利に使用され得るかを明らかにする。以下の表で示されるような株ＭＰ５及びＭＰ８又はＭＰ９の間の唯一の相違は、前者にＳａｃＣ＿Ａｇａｌ酵素がないこと及び後者２つの株にはＳａｃＣ＿Ａｇａｌ酵素が存在することである。株ＭＰ８はｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子の１つのＰｇｌｐＦ推進型コピーを有するが、株ＭＰ９は２つのこのようなコピーを有する。

本発明の実施形態では、スクロースを含有するバッチ培養中でｓａｃＣ＿Ａｇａｌ－発現細胞がロバストに増殖するだけでなく、これらはまた、流加培養発酵工程において高タイターでＬＮＦＰ－Ｉを産生することが明らかになる。

［増殖監視アッセイ中に適用されるプロトコールの説明］
２．５日間プロトコールを用いて９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて本発明の実施例で開示される株をスクリーニングした。最初の２４時間中に細胞を高密度に増殖させ、次の３６時間では、主要な炭素及びエネルギー源としてスクロースを含有する培地に細胞を移した。具体的には、第１日に、２０％グルコースを含有するＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉブロスを使用して新鮮な接種物を調製した。調製した培養物の３４℃でのインキュベーションの２４時間後に、硫酸マグネシウム及びチアミンを補給した基本最少培地（２００ｕＬ）へと細胞を移し、炭素源としての２０％グルコース溶液及び１５ｇ／Ｌスクロース溶液の初回ボーラスを細胞に与えた。新しい培地の接種後、７２時間にわたり２８℃、１２００ｒｐｍで細胞を振盪した。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＶａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅマイクロプレートリーダーと適合するマイクロタイタープレートにおいてバッチ培養方式で細胞を増殖させた。

［発酵プロトコール］
３０ｇ／Ｌグルコース又はスクロース（それぞれＡＬ－Ｘ１６及びＡＬ－Ｘ１７）及びＮＨ_４Ｈ_２ＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ、ＮａＯＨ、クエン酸、微量元素溶液、消泡剤及びチアミンから構成されるミネラル培地からなる１００ｍＬのミネラル培養培地で開始して、２５０ｍＬ発酵槽（Ａｍｂｒ２５０ ＨＴ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を培養した。最初の撹拌のカスケード及びその後の７００ｒｐｍ（最大４５００ｒｐｍまで）、１ＶＶＭ（最大３ＶＶＭまで）で開始する空気流によって溶解酸素レベルを２０％に維持した。８．５％ＮＨ_４ＯＨ溶液による滴定によってｐＨを６．８に維持した。１０ｇ／Ｌグルコース（ＡＬ－Ｘ１６）又はスクロース（ＡＬ－Ｘ１７）、（ＮＨ_４）_２ＨＰＯ４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＭｇＳＯ_４ｘ７Ｈ_２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、クエン酸、微量元素溶液、消泡剤及びチアミンから構成される前培養物からの２％（ｖ／ｖ）接種物を用いて培養を開始した。基本最少培地中に含有されたグルコース又はスクロースの枯渇後、炭素制限状態を維持する速度で、グルコース（ＡＬ－Ｘ１６）又はスクロース（ＡＬ－Ｘ１７）含有フィード溶液を継続的に発酵槽に添加した。温度は最初３３℃であったが、フィーディングの３時間後、３０℃に低下した。フィード開始の３６時間後、次いで１９時間ごとに、ラクトースを２５％ラクトース一水和物溶液のボーラス添加として添加し、ラクトースが律速因子となるのを防いだ。細胞の増殖、代謝活性及び代謝状態は、反射率及びＣＯ_２放出速度のオンライン測定によって追跡した。発酵を通じて、ＨＰＬＣを使用してＨＭＯ産物、ラクトース及び他の少量の副産物の濃度を決定するために試料を採取した。

［アッセイにおける増殖監視の結果］
上記の６０時間プロトコールを使用して増殖監視アッセイにおいて株を試験し、スクロースの存在下でバッチ方式で培養を操作した。それらの遺伝子構成（即ち、スクロース利用と直接関連するＳａｃＣ＿Ａｇａｌ酵素の発現又はそれがないこと）に応じたスクロースにおいて増殖するための様々な株の能力を評価するために、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸシステムにより報告される培養吸収（６００ｎｍ）における生データを使用して、試験株、即ちＭＰ５、ＭＰ８及びＭＰ９についてのスクロースにおける増殖曲線を調べた。データ分析ソフトウエアＳｋａｎＩｔを使用して、全ての増殖曲線を抽出し、様々な計算を実行した。

図１１で示されるように、そのゲノムにおいてｓａｃＣ＿Ａｇａｌを保有しない株ＭＰ５は、調製したバッチ培養で存在する培地中で提供されるスクロースでは増殖し得ない。僅かな増殖後（提供されるグルコースレベルが低く、培地中に存在し得るスクロースが部分的に分解される可能性があるため）、株ＭＰ５は、平坦な増殖プロファイルを有する（図１１）。それに対して、それぞれｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子の１つ又は２つのＰｇｌｐＦ推進コピーを保有する株ＭＰ８及びＭＰ９は、経時的にスクロースにおいてよく増殖し、株ＭＰ５よりもはるかに高い光学密度値に到達する（図１０）。株ＭＰ８及びＭＰ９が殆ど同一である増殖プロファイルを有することも特筆に値するものであり、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子の１つのＰｇｌｐＦ推進型コピーは、スクロースでのロバストな増殖を支持するのに十分であるはずであることが示される（図１１）。

このように、本開示は、正常な細胞生理を有するフレックス燃料株（複数の炭素源における増殖が可能）を作製するための効率的な株改変ツールを示し、これにより、当技術分野で公知の他の多遺伝子スクロース利用技術（例えばｓｃｒＢＲＹＡ）と比較してｓａｃＣ＿Ａｇａｌ発現細胞において代謝負担がおそらく低いことが示され得る。

本発明の実施例では、ＭＰ５として表４で特定されるＬＮＦＰ－Ｉ発現宿主細胞にＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロースインベルターゼを導入した。詳細には、ＰｇｌｐＦプロモーターの制御下にｓａｃＣ＿Ａｇａｌ遺伝子を配置し、１コピー（株ＭＰ８）又は２コピー（株ＭＰ９）で染色体中に組み込む。また、ｓａｃＣ＿Ａｇａｌ発現細胞はスクロースを含有するバッチ培養においてロバストに増殖するだけでなく、これらはまた、下の発酵結果で示されるように流加発酵培養法において高タイターでＬＮＦＰ－Ｉを産生することが本明細書により明らかになる。

［発酵の結果］
ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＴ、２’ＦＬ及びＬＮＴ－ＩＩの産生は、産生される総ＨＭＯの割合％として示される。株ＭＰ５を用いて単一の発酵を行い、一方で株ＭＰ９の発酵は２つ組で行った。発酵エンドポイントデータを表５で示す。一般に、選択された発酵工程において、株ＭＰ５及びＭＰ９の両方がＬＮＦＰ－Ｉを高レベル及び同様のタイターで産生していた。

具体的に、スクロースにおいて増殖できない株、即ちＭＰ５は、グルコースに基づく工程（ＡＬ－Ｘ１６）が実行された場合、３種類のＨＭＯからなるＨＭＯプロファイルをもたらした。詳細には、株ＭＰ５のＨＭＯプロファイルは、およそ９５％ＬＮＦＰ－Ｉ、１％ＬＮＴ及び４％２’－ＦＬを含有する（表５）。ＰｇｌｐＦプロモーター制御下でｓａｃＣ＿Ａｇａｌを発現する株（株ＭＰ９）は、スクロースに基づく工程（ＡＬ－Ｘ１７）が実行された場合、株ＭＰ５と比較して、少々多い量の２’－ＦＬを産生した。特に、株ＭＰ９のＨＭＯプロファイルはおよそ９０％ＬＮＦＰ－Ｉ及び１０％２’－ＦＬを含有するが、ＬＮＴはない（表５）。

結論として、ＳａｃＣ＿Ａｇａｌスクロース利用技術は、このように改変された細胞を使用して高レベルのＬＮＦＰ－Ｉ産生を可能にし、これは、炭素源としてグルコースを使用して得られたものと非常に類似したＨＭＯプロファイルをもたらす。

［配列］
本願は、優先権主張ＤＫ ＰＡ ２０２１ ７０２５０における修正された配列リストに列挙される配列であるような、参照により本明細書によって組み込まれる、テキスト方式及び電子方式の配列リストを含有する。表４で示されない配列のまとめは以下である。
配列番号１［ｓｍｏｂタンパク質］
配列番号２［ｓｍｏｂ遺伝子］
配列番号３［ｂａｄ］
配列番号４［ｎｅｃ］
配列番号５［ＹｂｅｒＣ］
配列番号６［Ｆｒｅｄ］
配列番号７［Ｖａｇ］
配列番号８［Ｍａｒｃ］
配列番号９［ｓｃｒＹ］
配列番号１０［ｓｃｒＡ］
配列番号１１［ｓｃｒＢ］
配列番号１２［ｓｃｒＲ］
配列番号１３［ＳａｃＣ＿ＡｇａＩタンパク質］
配列番号１４［Ｂｆｆタンパク質］
配列番号４０［ｌｇｔＡ］
配列番号４１［ＧａｌＴＫ］
配列番号４２［ＧｌｐＲ］

Claims (27)

1. １つ以上のフコシル化ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）を産生するための方法であって、
   ａ．配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシル－トランスフェラーゼタンパク質又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする組み換え核酸を含む、フコシル化ＨＭＯを産生可能な遺伝子改変細胞を提供する段階と、
   ｂ．前記核酸を発現させるための適切な細胞培養培地中で、（ａ）に記載の細胞を培養する段階と、
   ｃ．段階（ｂ）で産生されたＨＭＯを回収する段階と、
   を含む、方法。
2. 前記１つ以上のフコシル化ＨＭＯが、２’－ＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＤＦＬ及びＬＮＤＦＨ－Ｉからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. ＬＮＦＰ－１を主に産生する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 段階ｃ）の前記回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：２’－ＦＬのモル比率が２０：１～２：１の範囲となる、請求項１～３の何れか一項に記載の方法。
5. 段階ｃ）の前記回収されたＨＭＯ中のＬＮＦＰ－Ｉ：ＬＮＴのモル比率が１０００：１～１０：１の範囲となる、請求項１～４の何れか一項に記載の方法。
6. ＬＮＴ－ＩＩ及び／又はＬＮＴ及び／又はＬＮＤＦＨ－Ｉ及び／又はＤＦＬが前記回収されたＨＭＯ中に存在しない、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
7. 前記遺伝子改変細胞が、唯一の炭素及びエネルギー源としてのスクロース中で培養される、請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
8. 前記遺伝子改変細胞が、Ｎｅｃ及び／又はＹｂｅｒＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１及びＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ ＥＥＱ０８２９８．１）又は配列番号４若しくは５のうち何れか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体から選択されるＭＦＳ輸送体タンパク質をコードする異種ヌクレオチド配列を含む、請求項１～７の何れか一項に記載の方法。
9. 配列番号１で示されるようなα－１，２－フコシルトランスフェラーゼタンパク質又は配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする組み換え核酸配列を含む、遺伝子改変細胞。
10. 次のものからなる群から選択される糖排出輸送体をコードする核酸配列をさらに含む、請求項９に記載の遺伝子改変細胞：
    ａ．配列番号４又は配列番号４と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする核酸配列、
    ｂ．配列番号５又は配列番号５と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体をコードする核酸配列。
11. β－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項９又は１０に記載の遺伝子改変細胞。
12. β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸配列さらに含む、請求項９～１１の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
13. コピー数を増加させることによる、及び／又は発現を制御するために強い調節エレメントを選択することによるかの何れかでβ－１，３－Ｎ－アセチル－グルコサミニルトランスフェラーゼ及び／又はβ－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ発現レベルを上昇させる、請求項１１又は１２に記載の遺伝子改変細胞。
14. ２’－ＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ及びＬＮＤＦＨ－Ｉ及びＤＦＬからなる群から選択される１つ以上のフコシル化ＨＭＯを産生可能である、請求項９～１３の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
15. 前記細胞により産生される前記主なフコシル化ＨＭＯがＬＮＦＰ－Ｉである、請求項９～１４の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
16. Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される、請求項９～１５の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
17. 前記組み換え核酸の前記発現が、調節エレメントを含む１つ以上の核酸配列により調節される、請求項９～１６の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
18. 前記１つ又は複数の調節エレメントが、ＰｇｌｐＦ（配列番号２７）又はＰｌａｃ（配列番号３６）又はＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号２４）又はＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号２５）又はＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号２６）又は表４で同定されるようなこれらのプロモーターのバリアントからなる群から選択されるプロモーター配列を含む、請求項９～１７の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
19. 前記プロモーター配列がＰｇｌｐＦである、請求項１８に記載の遺伝子改変細胞。
20. 前記遺伝子改変細胞がスクロース利用系を発現する、請求項１５～１９の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞。
21. 前記スクロース利用系が、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＩＤ：ＷＰ＿１０３８５３２１０．１及びＢＡＤ１８１２１．１又は配列番号１３若しくは１４の何れか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能性相同体からなる群から選択される、スクロースをフルクトース及びグルコースに加水分解可能なポリペプチドである、請求項２０に記載の遺伝子改変細胞。
22. 配列番号２と少なくとも８０％同一である、組み換え核酸配列を含む核酸コンストラクト。
23. ＰｇｌｐＦ（配列番号２７）又はＰｌａｃ（配列番号３６）又はＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０（配列番号２４）又はＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号２５）又はＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号２６）又は表４で同定されるようなこれらのプロモーターのバリアントからなる群から選択されるプロモーター配列とともに調節エレメントを含む１つ以上の組み換え核酸配列をさらに含む、請求項２２に記載の核酸コンストラクト。
24. 前記プロモーターがＰｇｌｐＦである、請求項２２又は２３に記載の核酸コンストラクト。
25. １つ以上のフコシル化ＨＭＯの産生における、請求項９～２１の何れか一項に記載の遺伝子改変細胞又は請求項２２～２４の何れか一項に記載の核酸コンストラクトの使用。
26. 前記１つ以上のフコシル化ＨＭＯが、２’－ＦＬ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＤＦＬ及びＬＮＤＦＨ－Ｉからなる群から選択される、請求項２５に記載の使用。
27. 前記細胞により産生される前記主なＨＭＯがＬＮＦＰ－Ｉである、請求項２５又は２６に記載の使用。

Images