JP2024517144A - 細胞中のラクトース取り込みを改変することによるｈｍｏの形成の増強 - Google Patents

Abstract

本発明は、増強されたオリゴ糖輸送能力を含む遺伝子改変細胞において、１つ以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特にＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴを産生する方法に関する。遺伝子改変細胞は、１つ以上のＨＭＯの産生を可能にする一連の遺伝子改変と、ラクトース及び産生されたＨＭＯの輸送を増強する一連の遺伝子改変とを含む。【選択図】図２

Description

発明の詳細な説明

［分野］
本発明は、増強されたオリゴ糖輸送能力を含む遺伝子改変細胞において、１つ以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特にＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴを産生する方法に関する。遺伝子改変細胞は、１つ以上のＨＭＯの産生を可能にする一連の遺伝子改変と、ラクトース及び産生されたＨＭＯの輸送を増強する一連の遺伝子改変とを含む。

［背景］
ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒトの発達に重要な機能が発見されることにより、過去１０年間で非常に感心が高まっている。それらのプレバイオティクス特性に加えて、ＨＭＯは、更なる好ましい効果と結び付けられ、それらの適用分野が拡大している。ＨＭＯの健康上の利点により、それらを乳児用調製粉乳及び乳児食などの食品並びに消費者用健康食品のために使用するための承認が可能となっている。

現在まで、少なくとも１１５種のＨＭＯの構造が確認されており、はるかにより多くの構造がヒト乳中に存在する可能性がある。

ＨＭＯの利用可能性が限定的であるため、効率的な商業生産、すなわち大規模生産が強く望まれている。化学合成により、食品及び医療用途に必要とされる量及び品質での大規模製造は、依然として提供されていない。更に、ＨＭＯの化学合成経路には、いくつかの有害な化学物質が関与しており、最終製品に汚染リスクがもたらされる。

ＨＭＯの化学合成に関連する欠点を回避するために、いくつかの酵素法及び発酵手法が開発されている。２’－フコシルラクトース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、３’－シアリルラクトース及び６’－シアリルラクトースなどのいくつかのＨＭＯのために、発酵に基づくプロセスが開発されている。発酵に基づくプロセスでは、通常、組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの遺伝子改変細菌株又はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母を利用する。

改変細菌株におけるＨＭＯの生合成産生は、ＨＭＯを製造するために、利用価値の高く、コスト効率がよく、大規模に適用可能な解決策である。これは、改変された糖ヌクレオチド合成経路などの代謝工学を改変した遺伝子改変細菌に依拠するものであり、所望のオリゴ糖の合成に必要とされるグリコシルトランスフェラーゼを発現するように構成され、多くの場合、ＨＭＯ前駆体として細菌のヌクレオチド糖のプールを利用する。

ＨＭＯの生物工学的産生における近年の開発により、細菌発現系の特定の固有の限界を克服することが可能となっている。例えば、ＨＭＯ産生細菌細胞は、細菌内でのヌクレオチド糖の制限された細胞内プールを増加させるため（国際公開第２０１２１１２７７７号パンフレット）、ＨＭＯ産生に関与する酵素の活性を向上させるため（国際公開第２０１６０４０５３１号パンフレット）又はＨＭＯ前駆体の取り込み及び合成されたＨＭＯの細胞外培地への分泌を促進するため（国際公開第２０１０１４２３０５号パンフレット、同第２０１７０４２３８２号パンフレット）に遺伝子改変することができる。更に、組換え細胞内の目的遺伝子の発現は、例えば、近年、国際公開第２０１９１２３３２４号パンフレットに記載されているような特定のプロモーター配列又は他の遺伝子発現レギュレーターを用いて調節され得る。

ＨＭＯの産生を最適化する１つの方法は、糖輸送を改変することであるが、具体的には、ＨＭＯ前駆体であるラクトースを取り込むことにより、このラクトースがＨＭＯ生合成の出発点としての役割を果たすため、ＨＭＯ産生に好ましい影響を及ぼし得る。これは、最も顕著に特性評価されている溶質輸送体の１つを代表する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のラクトースパーミアーゼＬａｃＹを過剰発現させることにより行われる（Ｇｕａｎ ａｎｄ Ｋａｂａｃｋ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．２００６；３５：６７－９１）。

国際公開第２０１４０１８５９６号パンフレットは、改変されたラクトースの異化作用及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のラクトースパーミアーゼであるＬａｃＹの過剰発現により、２’－ＦＬ、ＬＤＦＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ又はＬＮＤＦＨ－Ｉの産生を増強することを示唆しており、ＬａｃＹの発現は、野生型プロモーターよりも転写レベルがはるかに高い誘導性合成プロモーター、ｌａｃｌｑプロモーターによって誘発される（Ｐｅｎｕｍｅｔｃｈａ，ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＳ，８１（１）：７－１５（２０１０））。これにより、ラクトース及び蛍光体－ヌクレオチドの細胞内プールが増強され、増強されたＨＭＯ産生がもたらされる。

国際公開第２０１７０４２３８２号パンフレットは、１つ以上のＨＭＯを産生するために、内在性β－ガラクトシダーゼ遺伝子を不活化することと、天然又は異種糖排出輸送体を過剰発現させるか又は欠失させることと、機能的なラクトースパーミアーゼタンパク質を有することとを組み合わせている。具体例は、オリゴ糖排出輸送体を欠失させることにより、ＬＮＴの形成を増大させ得ることを示している。

欧州特許第２９２７３１６号明細書は、Ｐｔｅｔプロモーターの制御下の天然のＬａｃＹ遺伝子及びプラスミドから発現されたＹｂｅｒＣ輸送体により、宿主から２’ＦＬを産生することを開示している。それは、ラクトースの存在下でＬａｃＹを過剰発現させると、ラクトースにより誘発されるストレスを細胞に引き起こす可能性があるため、ラクトースを外から添加することなく目的のオリゴ糖を完全に発酵させることができるように、細胞を遺伝子改変したことも開示している。

本明細書では、内在性ラクトースパーミアーゼ遺伝子などのラクトースパーミアーゼ遺伝子の発現の増強を異種非ＬａｃＹ糖輸送体の発現と組み合わせることを含む、１つ以上のＨＭＯを産生する方法が初めて開示され、これにより驚くべきことに最適化された輸送平衡が促進され、１つ以上のＨＭＯの産生の効果的な増強がもたらされる一方、副産物が形成される量も減少する。

［概要］
本開示は、遺伝子改変細胞及び１つ以上のＨＭＯ、特にＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴを産生する方法に関し、本方法は、ラクトース取り込み系が第２の糖輸送体の発現と組み合わせて上方制御されることにより、ＨＭＯ産生を進行させるように遺伝子改変細胞のラクトース及び／又はオリゴ糖の取り込み／排出を促進する適切な遺伝子改変細胞を含む。ＨＭＯの生合成を調節する細胞経路の主要な工程を同定することにより、代謝物及び生成物間の細胞平衡を制御することで、ＨＭＯの細胞産生を増強するように前記経路を改変することが可能となった。特に、好ましいラクトース／ＨＭＯの平衡の維持が実現し、ＭＦＳ輸送体ファミリーとは別の糖輸送体と組み合わせてラクトースパーミアーゼＬａｃＹを過剰発現することにより、細胞により産生される全体的なＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴのレベルだけでなく、発酵培地への特定のＨＭＯの輸送も増強される。一般に、本発明は、発酵時の炭素源からＨＭＯ産生への変換が更に高い全収率で行われるより持続可能な製造プロセスを促進する。

最も広義には、本開示は、従って、遺伝子改変細胞を提供することを含む、１つ以上のＨＭＯ、特にＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴを産生する方法に関し、細胞は、１つ以上のラクトースパーミアーゼを過剰発現し、且つＶａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｂａｄ及びＶａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つのアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される異種ＭＦＳ輸送体を発現し、細胞は、β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ、β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ及びβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼ並びに任意選択によりスクロース利用系からなる群から選択される１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを更に発現する。本方法は、ラクトースを含む適切な培地中で前記細胞を培養することと、産生された１つ以上のＨＭＯを収集することとを含む。

好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、１つ以上の天然のラクトースパーミアーゼを過剰発現する。

１つ以上のラクトースパーミアーゼのアミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６［ＬａｃＹ変異体］及び配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６［ＬａｃＹ変異体］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、且つ機能的相同体であるアミノ酸配列からなる群から選択される。

本明細書で好ましい実施形態では、１つ以上の過剰発現されたラクトースパーミアーゼは、配列番号１［ＬａｃＹ Ｋ－１２］と同一であるか、又は配列番号１［ＬａｃＹ Ｋ－１２］と少なくとも７０％同一である。遺伝子改変細胞は、ラクトースパーミアーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み得るか、又は１つ以上のラクトースパーミアーゼをコードする２つ以上の核酸配列を含み得る。ラクトースパーミアーゼをコードする核酸配列は、遺伝子改変細胞に対して天然の遺伝子であることが好ましく、組換え核酸配列によってコードされ得る。

異種ＭＦＳ輸送体タンパク質は、配列番号６２［Ｖａｇ］、６３［Ｆｒｅｄ］、６４［Ｍａｒｃ］、６５［Ｂａｄ］、６６［Ｎｅｃ］、６７［ＹｂｅｒＣ］及び配列番号６２［Ｖａｇ］、６３［Ｆｒｅｄ］、６４［Ｍａｒｃ］、６５［Ｂａｄ］、６６［Ｎｅｃ］、６７［ＹｂｅｒＣ］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号６２［Ｖａｇ］、６３［Ｆｒｅｄ］、６４［Ｍａｒｃ］、６５［Ｂａｄ］、６６［Ｎｅｃ］、６７［ＹｂｅｒＣ］のいずれか１つの機能的相同体の群から選択される。１つ以上の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送体は、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ及び／又はＶａｇである。遺伝子改変細胞は、本発明に従い、１つ以上の異種ＭＦＳ輸送体をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み得る。遺伝子改変細胞は、１つ以上の異種ＭＦＳ輸送体をコードする２つ以上の核酸配列を含み得る。異種ＭＦＳ輸送体をコードする核酸配列は、合成又は組換え核酸配列によってコードされ得る。

遺伝子改変細胞は、本発明に従い、β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ、β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ及びβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼから選択される１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする１つの核酸配列を含み得る。遺伝子改変細胞は、１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする２つ以上の核酸配列を含み得る。１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、合成又は組換え核酸配列によってコードされ得る。

本開示の１つ以上の例示的な実施形態では、β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ又はβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼは、それぞれＣｖＢ３ｇａｌＴ及びＧａｌＴＫ又はＧａｌＴ並びに配列番号１７［ＣｖＢ３ｇａｌＴ］、１８［ＧａｌＴＫ］及び１９［ＧａｌＴ］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、ＣｖＢ３ｇａｌＴ、ＧａｌＴＫ又はＧａｌＴのいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される。

本開示の１つ以上の更なる例示的な実施形態では、β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼは、ＬｇｔＡ、ＰｍｎａｇＴ、ＨＤ０４６６及び配列番号２０［ＬｇｔＡ］、２１［ＰｍｎａｇＴ］又は２２［ＨＤ０４６６］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、ＬｇｔＡ、ＰｍｎａｇＴ又はＨＤ０４６６のいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、１つ以上の異種ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、これは、発現すると、前記遺伝子改変細胞の唯一の炭素源及びエネルギー源としてのスクロースの利用を可能にするスクロース利用系を構築する。１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、ｓｃｒＹＡオペロン及びｓｃｒＢＲオペロンを更に含むＰＴＳ依存性スクロース利用系を含み、発現する。別の好ましい実施形態では、遺伝子改変細胞は、スクロースをグルコースとフルクトースとに加水分解することができるポリペプチド、好ましくは単一のポリペプチドを発現する。

ＨＭＯ産生を増強する１つの方法は、ＨＭＯの生合成に用いられる活性化糖ヌクレオチドの生合成を改変することでもある。従って、遺伝子改変細胞は、本開示に従い、活性化糖の生合成に関与する１つ以上の異種ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含み得る。１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、活性化糖ヌクレオチドの生合成に関与する１つ以上のポリペプチド、例えばＰｇｍ［配列番号４３又は４４］、ＧａｌＵ［配列番号４５又は４６］、ＧａｌＥ［配列番号４７又は４８］、ＧｌｍＭ［配列番号４９又は５０］、ＧｌｍＵ［配列番号５１又は５２］、ＧｌｍＳ［配列番号３３又は５４］及び配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３又は５４のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドを発現する。

本発明による遺伝子改変細胞におけるタンパク質の遺伝子発現は、調節エレメントによって調節される。従って、本発明によるいずれか１つ以上の核酸配列は、１つ以上の調節エレメントによって調節され得る。１つ以上の例示的な実施形態では、調節エレメントは、表８で特定されるような核酸配列を有する１つ以上のプロモーター配列、好ましくは配列番号７０（ＰｇｌｐＦ）、若しくは配列番号６８（Ｐｌａｃ）、若しくは配列番号６９（ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ）、配列番号８２（ＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０）、若しくは配列番号１００（ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ）、若しくは配列番号１０１（ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ）、若しくはｃｐ６（配列番号８４）、若しくはＰｏｓｍｙ（配列番号８５）又はこれらの変異体からなる群から選択されるプロモーター配列を含む。

本明細書で例示される実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞において、プロモーター配列ＰｇｌｐＦによって１つ以上のラクトースパーミアーゼが調節される。

別の本明細書で例示される実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞において、プロモーター配列Ｐｌａｃ及び／又はＰｇｌｐＦによって１つ以上の異種ＭＦＳ輸送体が調節される。

従って、本明細書で好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞において、１つ以上のラクトースパーミアーゼは、天然であり、プロモーター配列ＰｇｌｐＦによって調節され、１つ以上の異種ＭＦＳ輸送体は、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ及び／又はＶａｇからなる群から選択され、プロモーター配列Ｐｌａｃ及び／又はＰｇｌｐＦによって調製される。

調節エレメントは、内在性、異種、合成及び／又は最適化シャイン・ダルガノ配列を更に含み得る。

本開示のエレメントを含む核酸配列は、遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれ得る。代わりに、１つ以上の核酸配列は、１つ以上の低コピー数、中コピー数及び／又は高コピー数のプラスミドのようなプラスミドから発現され得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞、例えば好ましくは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２由来株などの細菌細胞又は酵母細胞である。

本発明は、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴなどの１つ以上のＨＭＯの産生及び／又は製造における本方法及び／又は遺伝子改変細胞の使用にも関する。

［詳細な説明］
本開示は、遺伝子改変細胞及び１つ以上のＨＭＯを産生する方法に関し、細胞のラクトース取り込み系が第２の糖輸送体の発現と組み合わせて上方制御されることにより、遺伝子改変細胞のオリゴ糖の取り込み／排出が促進され、特にＬＮＴ及びＬＮｎＴのＨＭＯ産生が進行する。

本開示では、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴの細胞産生は、代謝物及び生成物間の細胞均衡を調節することによって増強される。特に、好ましいラクトース／ＨＭＯの平衡の維持が実現し、特にＶａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ及びＢａｄからなる群から選択される、ＭＦＳ輸送体ファミリーとは別の糖輸送体と組み合わせて、ラクトースパーミアーゼであるＬａｃＹを過剰発現することにより、細胞によって産生される全体的なＨＭＯのレベルだけでなく、発酵培地に輸送されるＨＭＯのレベルも増強され、改変細胞によって産生されるＨＭＯ、特にＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴの更に高い全収率がもたらされる。

ＨＭＯの生合成を調節することにより、代謝物及び生成物間の細胞平衡を制御することによってＨＭＯの細胞産生を増強し得る細胞経路を改変することが可能となった。「生合成」という用語は、遺伝子改変細胞により且つ／又は遺伝子改変細胞内で行われる１つ以上のＨＭＯの合成を意味する。代謝物及び生成物間の細胞平衡は、細胞の生存率を維持するために必須の特徴であり、リン酸塩などの代謝物及び／又は産物前駆体、例えばラクトースのいずれかが蓄積した場合、ＨＭＯ産生の効率を低下させる細胞ストレスがもたらされる可能性がある。他方で、１つ以上のＨＭＯのような産物の細胞内蓄積により、細胞ストレス応答がもたらされる可能性もあり、これによりＨＭＯ産生の効率も阻害される可能性がある。従って、細胞経路を改変し、調整された取り込み／排出システムと組み合わせてそれぞれの点のＨＭＯの生合成を調整した結果として、産生されたＨＭＯの排出を増強しながら、代謝物及び／又はＨＭＯの細胞内蓄積を減少させることは、ＨＭＯの大規模生産に極めて有利である。

本開示では、代謝物と産物間の好ましい細胞平衡の維持は、別の糖輸送体、例えば、限定されるものではないが、ＭＦＳ輸送体ＹｂｅｒＣ、Ｎｅｃ又はＶａｇと組み合わせてラクトースパーミアーゼＬａｃＹを過剰発現させることによって実現されており、これは、実施例１～３に記載されているように、産生されたＬＮＴ又はＬＮｎＴの全体的なレベルを増強し、場合によりバイオマスの形成に影響を及ぼす。

具体的には、本開示は、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｂａｄ及びＶａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つのアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択され、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質と組み合わせて１つ以上のラクトースパーミアーゼを過剰発現する遺伝子改変細胞に関する。好ましい実施形態では、遺伝子改変細胞は、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現し、グリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ及びβ－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ、又はβ－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ及びβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼ、又はβ－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ、及びβ－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ、及びβ－１，４－Ｇａｌ－トランスフェラーゼである。

好ましい実施形態では、本開示は、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｂａｄ及びＶａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つのアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択され、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質と組み合わせて１つ以上の天然ラクトースパーミアーゼを過剰発現する遺伝子改変細胞に関する。好ましい実施形態では、遺伝子改変細胞は、２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現し、グリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ及びβ－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ、又はβ－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ及びβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼ、又はβ－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ、及びβ－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ、及びβ－１，４－Ｇａｌ－トランスフェラーゼである。

［１つ以上のヒトミルクオリゴ糖を産生する方法］
本開示は、ラクトースパーミアーゼ遺伝子の発現の増強を異種非ＬａｃＹ糖輸送体の発現と組み合わせることを含む、１つ以上のヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、特にＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴを産生する方法を提供し、これにより、驚くべきことに、１つ以上のＨＭＯの産生の増強が促進されながら、形成される副産物の量も減少する。好ましくは、前記ラクトースパーミアーゼ遺伝子は、宿主細胞に内在するものである。

これは、例えば、異種輸送体ＹｂｅｒＣ又はＮｅｃ又はＶａｇをすでに発現している株にＬａｃＹの更なるコピーが挿入されている実施例１及び２に示されており、実施例１ではＬＮＴ、実施例２ではＬＮｎＴ及びｐＬＮｎＨの産生が増強され、同時に副産物の形成が減少し、例えばＬＮＴ－ＩＩ及びｐＬＮＨ２の産生が減少する。実施例３からも明らかとなるように、ＬａｃＹが過剰発現すると、発酵中のＨＭＯ力価は、ＬａｃＹの通常の発現レベルと比較してより高いレベルに到達する。より少ない副産物の形成とより高い力価は、大規模生産設定に必須となる特徴であり、副産物の形成が少なければ少ないほど、結果として発酵後の精製がより簡便となり得、力価が高いほど、生産収率がより高くなり、従ってＨＭＯの生産コストが削減される結果となり得る。

［ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）］
本開示に関連して、「オリゴ糖」という用語は、いくつかの単糖単位を含有する糖ポリマーを意味する。いくつかの実施形態では、好ましいオリゴ糖は、３、４、５又は６個の単糖単位、すなわち三糖、四糖、五糖又六糖からなる糖ポリマーである。本開示の好ましいオリゴ糖は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）である。

本明細書に関連して、「ヒトミルクオリゴ糖」又は「ＨＭＯ」という用語は、ヒト母乳中に見出される複合糖質を意味する。ＨＭＯは、１つ以上のβ－Ｎ－アセチル－ラクトサミニル単位及び／又は１つ以上のβ－ラクト－Ｎ－ビオシル単位によって伸長され得る還元末端にラクトース単位を含むコア構造を有し、このコア構造は、アルファ－Ｌ－フコピラノシル部分及び／又はアルファ－Ｎ－アセチル－ノイラミニル（シアリル）部分で置換することができる。

本開示に関連して、ラクトースは、ＨＭＯ種と見なされない。

非酸性（又は中性）ＨＭＯは、シアリル残基を欠いており、酸性ＨＭＯは、それらの構造内に少なくとも１つのシアリル残基を有する。本開示の方法は、特に中性及び酸性ＨＭＯの両方の産生及び全収率を向上させるように設計されている。

非酸性（又は中性）ＨＭＯは、フコシル化又は非フコシル化され得る。このような中性非フコシル化ＨＭＯの例としては、ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ（ＬＮＴ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ｐＬＮｎＨ）、パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ｐＬＮＨ）及びラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＬＮＨ）が挙げられる。中性フコシル化ＨＭＯの例としては、２’－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ－Ｉ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ（ＬＮＤＦＨ－Ｉ）、３－フコシルラクトース（３－ＦＬ）、ジフコシルラクトース（ＤＦＬ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ－ＩＩＩ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩＩ（ＦＬＮＨ－ＩＩ）、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ－Ｖ）、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ（ＬＮＤＦＨ－ＩＩ）、フコシル－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ヘキサオースＩ（ＦｐＬＮＨ－Ｉ）、フコシル－パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（Ｆ－ｐＬＮｎＨ ＩＩ）及びフコシル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（ＦＬＮｎＨ）が挙げられる。酸性ＨＭＯの例としては、３’－シアリルラクトース（３’－ＳＬ）、６’－シアリルラクトース（６’－ＳＬ）、３－フコシル－３’－シアリルラクトース（ＦＳＬ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースａ（ＬＳＴ ａ）、フコシル－ＬＳＴ ａ（ＦＬＳＴ ａ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－テトラオースｂ（ＬＳＴ ｂ）、フコシル－ＬＳＴ ｂ（ＦＬＳＴ ｂ）、６’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｃ）、フコシル－ＬＳＴ ｃ（ＦＬＳＴ ｃ）、３’－Ｏ－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＳＴ ｄ）、フコシル－ＬＳＴ ｄ（ＦＬＳＴ ｄ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ヘキサオース（ＳＬＮＨ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ（ＳＬＮＨ－Ｉ）、シアリル－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ（ＳＬＮＨ－ＩＩ）及びジシアリル－ラクト－Ｎ－テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が挙げられる。

１つ以上の好ましい実施形態では、１つ以上の産生されるＨＭＯは、ＬＮＴ－ＩＩ、ｐＬＮｎＨ、ＬＮＴ及びＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ＬＮＦＰ－ＩＩＩ、ＬＮＦＰ－Ｖ、ＬＮＦＰ－ＶＩ、ＬＮＤＦＨ－Ｉ、ＬＮＤＦＨ－ＩＩ、ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ、２’－ＦＬ、ＤＦＬ、３－ＦＬ、ＬＳＴ－ａ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＬＳＴ－ｂ、ＬＳＴ－ｃ、ＦＳＬ、ＦＬＳＴ－ａ、ＤＳＬＮＴ、ＬＮｎＨ及びＬＮＨからなる群から選択される。

好ましくは、本明細書に開示される方法及び／又は遺伝子改変細胞によって産生されるＨＭＯは、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴ、ｐＬＮｎＨ及び／又はＬＮＦＰ－ＩなどのＬＮＴ－ＩＩコアを含むＨＭＯである。

更により好ましくは、産生されるＨＭＯは、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴである。

１つ以上の例示的な実施形態では、産生されるＨＭＯは、ＬＮＴである。１つ以上の更なる例示的な実施形態では、産生されるＨＭＯは、ＬＮｎＴである。

ＬＮＴ、ＬＮｎＴ及びＬＮＦＰ－Ｉは、ＬＮＴ－ＩＩコアから構成され、ラクトース主鎖にガラクトース（Ｇａｌ）又はＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）などの特定の糖を結合させる能力を有する一連のグリコシルトランスフェラーゼを選択することにより、適切な遺伝子改変細胞内で合成することができる。

［遺伝子改変細胞］
本開示の遺伝子改変細胞は、ＨＭＯを産生するように遺伝子改変されている宿主細胞である。

特に、本開示は、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｂａｄ及びＶａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つのアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択され、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質と組み合わせて１つ以上のラクトースパーミアーゼを過剰発現する改変細胞に関する。１つ以上のラクトースパーミアーゼは、宿主細胞に天然のものであり得る。

遺伝子改変細胞は、一般的に、細胞由来の天然（遺伝子改変されていない）形態には存在しない１つ以上の遺伝子を含有し得る。細胞の遺伝情報のヌクレオチド配列を挿入、欠失又は改変するために、細胞の遺伝情報に外来性核酸分子／配列を導入し且つ／又は外来性核酸分子／配列（組換え、異種）を挿入する技術は、当業者に公知である。

本開示による遺伝子改変細胞は、細胞の天然形態に存在する１つ以上の遺伝子を含むことができ、前記遺伝子は、人工的手段によって改変され、微生物細胞に再導入される。

「遺伝子改変細胞」という用語は、細胞に内在する核酸分子を含有し、細胞から核酸分子を除去することなく改変されている細胞も包含する。このような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異及び関連技術によって得られるものが含まれる。

本発明の遺伝子改変細胞は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｗａｌｋｅｒ，“Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．による要覧に記載されたものなど、当技術分野の標準的な方法を使用して提供され得る。

遺伝子改変細胞は、哺乳動物細胞株を含む、ＨＭＯの産生に有用なあらゆる細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、真核生物又は原核生物由来の単細胞微生物である。宿主細胞として機能し得る適切な微生物細胞としては、酵母細胞、細菌細胞、古細菌細胞、藻類細胞及び真菌細胞が挙げられる。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、原核細胞である。１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞である。

本開示の遺伝子改変細胞は、目的遺伝子を挿入するための遺伝的操作が可能である限り、真正細菌（グラム陽性若しくはグラム陰性）又は古細菌であり得、製造スケールで培養することができる。好ましくは、宿主細胞は、高細胞密度での培養を可能にする特性を有する。

本発明の実施形態では、遺伝子改変細胞は、細菌細胞又は酵母細胞である。１つの好ましい実施形態では、遺伝子改変細胞は、好ましくは細菌細胞などの原核細胞である。

本開示で使用するのに好適な細菌細胞の非限定的な例は、前述のＭＦＳ輸送体Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ及びＢａｄのいずれかを天然に含まないレシピエント生物から選択される。これらには、限定されるものではないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であるＡＴＣＣ ８７３９（大腸菌Ｃ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ））、ＡＴＣＣ １１３０３（大腸菌Ｂ（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ））、ＢＬ２１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇ，２００７－２００８を参照されたい）において実施された大半の遺伝子工学的研究の株背景である、大腸菌Ｋ－１２株（ＥＭＧ２、ＭＧ１６５５、Ｗ３１１０、Ｗ３３５０、Ｃ６００及びＤＨ５αなど）並びにこれらの株の派生株が含まれる。

本明細書で好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞である。特に好ましい実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２株又はＤＥ３株に由来する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｃ．グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｓ．リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。

ＨＭＯ産物の産業的組換え産生に好適な真菌宿主細胞の非限定的な例としては、酵母細胞、例えばコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ ｐｈａｆｆｉｉ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は糸状菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属種若しくはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属種があり、例示的な種としては、クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、Ｆ．ソラニイ（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）、赤かび病（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）及びＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）がある。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。

［遺伝子改変細胞における発現］
本発明に関して、「発現」という用語は、タンパク質の産生をもたらす遺伝子若しくは核酸配列の発現を指し得るか、又はタンパク質の発現に関係し得、すなわちタンパク質の産生に直接関係し得る。具体的には、「発現」という用語は、ラクトースパーミアーゼタンパク質の発現をもたらすラクトースパーミアーゼ遺伝子の発現又はラクトースパーミアーゼタンパク質の発現、同様にＭＦＳ輸送体タンパク質遺伝子若しくはＭＦＳ輸送体タンパク質の発現をそれぞれ指し得る。

「増強発現」という用語の使用は、本明細書に関連して、例えばラクトースパーミアーゼタンパク質の「過剰発現」という用語と互換的に使用され、前記細胞における天然タンパク質の通常のタンパク質発現レベルと比較して、発現されるタンパク質のレベルが上昇することを指す。タンパク質又は遺伝子の発現増強は、複数の方法で実現することができ、例えば天然プロモーターを強力なプロモーターに置き換えるか、遺伝子の発現を抑制する調節エレメントを欠失させるか、又は目的遺伝子のコード配列を保有して発現するプラスミドなどのエピソームエレメントを導入することによる、遺伝子コピー数の改変、転写又は翻訳レベルでの任意のコピーの遺伝子の発現を制御することを含み得る。

本明細書に記載され、実施例１～３に例示されるように、ＨＭＯの生合成経路に直接的又は間接的に関与する酵素及び／又は輸送体タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の遺伝子コピー数及び／又は発現を増大させることが有利となり得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、発現は、目的のタンパク質をコードする遺伝子又は核酸配列のコピー数を増加させることにより制御される。

１つ以上の例示的な実施形態では、発現は、目的のタンパク質をコードする遺伝子又は核酸配列の発現を増強させるために強力なプロモーター配列を使用することにより制御される。

［１つ以上のラクトースパーミアーゼの過剰発現］
本開示は、１つ以上のラクトースパーミアーゼを過剰発現する遺伝子改変細胞及び前記遺伝子改変細胞を含む方法に関する。

好ましい実施形態では、本開示は、１つ以上の天然のラクトースパーミアーゼを過剰発現する遺伝子改変細胞及び前記遺伝子改変細胞を含む方法に関する。

本開示による１つ以上のラクトースパーミアーゼの過剰発現は、実施例１～３に記載されるように、１つ以上のＨＭＯ、特にＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴの増強された産生をもたらしながら、いくつかの場合に産生時の副産物の量も減少する。

本明細書に関連して、「過剰発現」とは、タンパク質の発現レベルが本発明の細胞により天然に得られるものよりも高いことを意味する。従って、異種遺伝子の導入及び発現は、本発明に関して「過剰発現」と見なされない。過剰発現は、例えば、定量ＰＣＲ又は質量分析などであるが、これらに限定されない、当業者に公知のいずれかの方法のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルの定量的決定の転写又は翻訳分析によって決定され得る。本開示では、過剰発現は、好ましくは、実施例１～３及び図１～５に提供される実験データのような、１つ以上のラクトースパーミアーゼの増強発現に関連し得る効果を実験的に観察することによって決定される。

［ラクトースパーミアーゼ遺伝子］
本発明の１つ以上の実施形態では、遺伝子改変細胞は、過剰発現した１つ以上のラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む。ラクトースパーミアーゼ遺伝子は、ｌａｃＹ遺伝子であり得る。

本発明による遺伝子改変細胞は、ラクトースパーミアーゼをコードする少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は１０の核酸配列を含み得る。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、１つ以上のラクトースパーミアーゼをコードする２つ以上の核酸配列を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、１つ以上の追加のラクトースパーミアーゼ、例えば１つ以上の異種ラクトースパーミアーゼを含む。

１つ以上の更なる例示的な実施形態では、１つ以上のラクトースパーミアーゼは、異種核酸配列及び／又は組換え核酸配列によってコードされる。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、１つ以上のラクトースパーミアーゼをコードする核酸配列は、遺伝子改変細胞に対して天然の遺伝子である。

［天然のラクトースパーミアーゼ遺伝子］
１つ以上の例示的な実施形態では、本開示の遺伝子操作細胞は、過剰発現された宿主細胞に対して天然のラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む。

本開示の天然のラクトースパーミアーゼは、本発明の宿主細胞で内在的に見られる遺伝子である。例えば、天然のラクトースパーミアーゼ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来株において、配列番号１のラクトースパーミアーゼＬａｃＹをコードする、配列番号２の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１６５５のｌａｃＹ遺伝子から選択することができる。従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ－２１（ＤＥ３）のＬａｃＹをコードする遺伝子が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１６５５のＬａｃＹをコードする遺伝子と非同一であることを考慮すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来株で過剰発現した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ－２１（ＤＥ３）に対して天然のｌａｃＹ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＭＧ１６５５由来株に対して天然ではないということになる。

［ＬａｃＹ］
一実施形態では、１つ以上のラクトースパーミアーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６［ＬａｃＹ変異体］及び配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６［ＬａｃＹ変異体］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つ以上であり得る。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、１つ以上のラクトースパーミアーゼは、配列番号１と同一である。

１つ以上の実施形態では、ラクトースパーミアーゼは、天然のラクトースパーミアーゼである。

［ＭＦＳ輸送体タンパク質］
本開示の遺伝子改変細胞は、１つ以上の異種ＭＦＳ輸送体タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。本開示の遺伝子改変細胞は、従って、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）の輸送体は、細胞膜を横断する、オリゴ糖などであるが、これらに限定されない分子の輸送を促進する。

「主要促進剤スーパーファミリー（ＭＦＳ）」という用語は、二次能動輸送体クラスの多数の極めて多様なファミリーを意味し、そのメンバーは、糖、薬物、疎水性分子、ペプチド、有機イオンなどを含む様々な異なる基質の輸送に関与する。

本明細書に関連して、「ＭＦＳ輸送体」という用語は、細胞膜を通過又は横断するオリゴ糖、好ましくはＨＭＯの輸送、好ましくは本明細書に記載されるような遺伝子改変細胞によって合成されたＨＭＯ／オリゴ糖の細胞サイトゾルから細胞培地への輸送を促進するタンパク質を意味する。加えて又は代わりに、ＭＦＳ輸送体は、ラクトース、グルコース、細胞代謝物及び／又は毒素などのＨＭＯ又はオリゴ糖と見なされない分子の排出も促進し得る。好ましい実施形態では、ＭＦＳ輸送体は、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴを細胞サイトゾルから細胞培地に排出させることができる。

本発明に関連して、ラクトースパーミアーゼは、異種ＭＦＳ輸送体と見なされない。

実施例１～３では、ＬａｃＹ発現株又はＬａｃＹ過剰発現株の遺伝的背景で糖排出輸送体タンパク質をコードする選択された異種遺伝子を導入することにより、細胞のＨＭＯ産生のＨＭＯ前駆体及び／又は副産物の存在量のオーダーを逆転することができ、従って遺伝子改変細胞によるＨＭＯの改善された産生を促進することができる方法が示されている。

１つ以上の例示的な実施形態では、ＭＦＳ輸送体は、Ｂａｄ、Ｎｅｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｆｒｅｄ、Ｖａｇ及びＭａｒｃからなる群から選択される。

本開示の遺伝子改変細胞は、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ、Ｂａｄ及び配列番号６２［Ｖａｇ］、６３［Ｆｒｅｄ］、６４［Ｍａｒｃ］、６５［Ｂａｄ］、６６［Ｎｅｃ］又は６７［ＹｂｅｒＣ］のいずれか１つのアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

［Ｂａｄ］
互換的に「Ｂａｄタンパク質」又は「Ｂａｄ輸送体」又は「Ｂａｄ」として本明細書で定義されるＭＦＳ輸送体タンパク質は、配列番号６５のアミノ酸配列を有し、この配列番号６５として本明細書で定義されるアミノ酸配列は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０１７４８９９１４．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示に従って発現されるＭＦＳ輸送体は、Ｂａｄである。本開示の遺伝子改変細胞は、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、Ｂａｄである異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

本発明の１つ以上の実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質ｂａｄ又はｂａｄ［配列番号６５］のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を発現する。

１つ以上の実施形態では、ｂａｄの発現は、配列番号６８のＰｌａｃプロモーターエレメントを含む調節エレメントによって調節される。

本発明の一実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質である配列番号６５のＢａｄ又は配列番号６５のアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体と組み合わせて、１つ以上の天然のラクトースパーミアーゼを過剰発現し、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する。

［Ｎｅｃ］
互換的に「Ｎｅｃタンパク質」又は「Ｎｅｃ輸送体」又は「Ｎｅｃ」として本明細書で定義されるＭＦＳ輸送体タンパク質は、配列番号６６のアミノ酸配列を有し、この配列番号６６として本明細書で定義されるアミノ酸配列は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０９２６７２０８１．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示に従って発現されるＭＦＳ輸送体は、Ｎｅｃである。本開示の遺伝子改変細胞は、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、Ｎｅｃである異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

本発明の１つ以上の実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質Ｎｅｃ又はＮｅｃ［配列番号６６］のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を発現する。

１つ以上の実施形態では、Ｎｅｃの発現は、配列番号６８のＰｌａｃプロモーターエレメントを含む調節エレメントによって調節される。

本発明の一実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質である配列番号６６のｎｅｃ又は配列番号６６のアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体と組み合わせて、１つ以上の天然のラクトースパーミアーゼを過剰発現し、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する。

［ＹｂｅｒＣ］
互換的に「ＹｂｅｒＣタンパク質」又は「ＹｂｅｒＣ輸送体」又は「ＹｂｅｒＣ」として本明細書で定義されるＭＦＳ輸送体タンパク質は、配列番号６７のアミノ酸配列を有し、この配列番号６７として本明細書で定義されるアミノ酸配列は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＩＤ ＥＥＱ０８２９８．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示に従って発現されるＭＦＳ輸送体は、ＹｂｅｒＣである。本開示の遺伝子改変細胞は、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、ＹｂｅｒＣである異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

本発明の１つ以上の実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質ＹｂｅｒＣ又はＹｂｅｒＣ［配列番号６７］のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を発現する。

１つ以上の実施形態では、ＹｂｅｒＣの発現は、配列番号６８のＰｌａｃプロモーターエレメントを含む調節エレメントによって調節される。

本発明の一実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質である配列番号６７のＹｂｅｒＣ又は配列番号６７のアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体と組み合わせて、１つ以上の天然のラクトースパーミアーゼを過剰発現し、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する。

［Ｆｒｅｄ］
互換的に「Ｆｒｅｄタンパク質」又は「Ｆｒｅｄ輸送体」又は「Ｆｒｅｄ」として本明細書で定義されるＭＦＳ輸送体タンパク質は、配列番号６３のアミノ酸配列を有し、この配列番号６３として本明細書で定義されるアミノ酸配列は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０８７８１７５５６．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示に従って発現されるＭＦＳ輸送体は、Ｆｒｅｄである。本開示の遺伝子改変細胞は、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、Ｆｒｅｄである異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

本発明の１つ以上の実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質ｆｒｅｄ又はｆｒｅｄ［配列番号６３］のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を発現する。

１つ以上の実施形態では、ｆｒｅｄの発現は、配列番号６８のＰｌａｃプロモーターエレメントを含む調節エレメントによって調節される。

本発明の一実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質である配列番号６３のＦｒｅｄ又は配列番号６３のアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体と組み合わせて、１つ以上の天然のラクトースパーミアーゼを過剰発現し、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する。

［Ｖａｇ］
互換的に「Ｖａｇタンパク質」又は「Ｖａｇ輸送体」又は「Ｖａｇ」として本明細書で定義されるＭＦＳ輸送体タンパク質は、配列番号６２のアミノ酸配列を有し、この配列番号６２として本明細書で定義されるアミノ酸配列は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０４８７８５１３９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示に従って発現されるＭＦＳ輸送体は、Ｖａｇである。本開示の遺伝子改変細胞は、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、Ｖａｇである異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

本発明の１つ以上の実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質ｖａｇ又はｖａｇ［配列番号６２］のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を発現する。

１つ以上の実施形態では、ｖａｇの発現は、配列番号６８のＰｌａｃプロモーターエレメントを含む調節エレメントによって調節される。

本発明の一実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質である配列番号６２のｖａｇ又は配列番号６２のアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体と組み合わせて、１つ以上の天然のラクトースパーミアーゼを過剰発現し、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する。

［Ｍａｒｃ］
互換的に「Ｍａｒｃタンパク質」又は「Ｍａｒｃ輸送体」又は「Ｍａｒｃ」として本明細書で定義されるＭＦＳ輸送体タンパク質は、配列番号６４のアミノ酸配列を有し、この配列番号６４として本明細書で定義されるアミノ酸配列は、ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＩＤ ＷＰ＿０６０４４８１６９．１を有するアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列である。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示に従って発現されるＭＦＳ輸送体は、Ｍａｒｃである。本開示の遺伝子改変細胞は、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、Ｍａｒｃである異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

本発明の１つ以上の実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質ｍａｒｃ又はｍａｒｃ［配列番号６４］のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体を発現する。

１つ以上の実施形態では、ｍａｒｃの発現は、配列番号６８のＰｌａｃプロモーターエレメントを含む調節エレメントによって調節される。

本発明の一実施形態では、遺伝子改変細胞は、異種ＭＦＳ輸送体タンパク質である配列番号６４のｍａｒｃ又は配列番号６４のアミノ酸配列と７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体と組み合わせて、１つ以上の天然のラクトースパーミアーゼを過剰発現し、更に１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する。

本開示の遺伝子改変細胞は、従って、１つ以上の例示的な実施形態では、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ又はＢａｄのいずれかの異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。１つ以上の更なる例示的な実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞は、配列番号６２［Ｖａｇ］、６３［Ｆｒｅｄ］、６４［Ｍａｒｃ］、６５［Ｂａｄ］、６６［Ｎｅｃ］及び６７［ＹｂｅｒＣ］からなる群から選択される２つ以上の異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現する。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞は、配列番号６２、６３、６４、６５、６６又は６７のいずれか１つと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、Ｖａｇ、Ｎｅｃ、Ｆｒｅｄ、Ｍａｒｃ、ＹｂｅｒＣ及び／又はＢａｄの機能的相同体を発現する。

本明細書で好ましい実施形態では、発現するＭＦＳ輸送体は、Ｎｅｃ、Ｖａｇ及び／又はＹｂｅｒＣである。

特に好ましい実施形態では、発現するＭＦＳ輸送体は、ＹｂｅｒＣである。

特に好ましい実施形態では、発現するＭＦＳ輸送体は、Ｎｅｃである。

特に好ましい実施形態では、発現するＭＦＳ輸送体は、Ｖａｇである。

［異種発現］
本開示において、異種という用語は、タンパク質が通常そのタンパク質を生成しない（すなわち発現しない）細胞に実験的に導入されることを意味する。従って、異種とは、導入されたタンパク質が、多くの場合レシピエントと異なる細胞型又は異なる種から最初にクローニングされたか又はそれらに由来するという事実を指す。タンパク質自体が必ずしも導入され得るものではないが、代わりにタンパク質をコードする「正しく編集された」遺伝物質（相補的ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）をレシピエント細胞に加えることができる。導入される遺伝物質は、通常、レシピエント細胞がｃＤＮＡをタンパク質として発現する（すなわち発現ベクターに導入される）ことを促進する形態でなければならない。外来遺伝物質をレシピエント細胞に導入する方法としては、トランスフェクション及び形質導入が挙げられる。レシピエント細胞型の選択は、タンパク質の機能を詳細に調査するために実験的な必要性に基づくものであることが多く、異種発現系として公知の最も一般的なレシピエントは、通常、ＤＮＡの導入が容易であるか、又はタンパク質の機能をより簡単に評価することができるという理由から選択される。

［グリコシルトランスフェラーゼ］
本開示に従って使用される本開示の遺伝子改変細胞は、１つ以上のグルコシルトランスフェラーゼを更に発現する。１つ以上の発現されたグリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸配列は、遺伝子改変細胞のゲノムに（染色体組込みによって）組み込まれ得るか、又は代わりに本開示に記載されるようにプラスミド内に含まれ得、プラスミド性であるものとして発現され得る。

ＨＭＯ、例えばＬＮＴ又はＬＮｎＴの産生に好適となるように、遺伝子改変細胞に２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが必要となる場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する異なる酵素をコードする２つ以上の異種核酸を核酸構築物に組み込み得るか、又は個々の核酸配列として提供し得、これをゲノムに組み込み且つ／若しくはプラスミドから発現させ得る。

１つの例示的な実施形態では、ＬＮＴを産生するために、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の異種核酸配列）が、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の異種核酸配列）と組み合わせて宿主細胞に導入され、第１及び第２の異種核酸は、互いに独立して染色体に組み込まれるか若しくはプラスミドから発現され得るか、又は核酸構築物と組み合わされ得、任意選択により本開示の更なる特徴を含む核酸構築物にも含まれ得る。従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、１つ以上の異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。

別の例示的な実施形態では、ＬＮｎＴを産生するために、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（第１のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１の異種核酸配列）が、β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ（第２のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第２の異種核酸配列）と組み合わせて宿主細胞に導入され、第１及び第２の異種核酸は、互いに独立して染色体に組み込まれるか若しくはプラスミドから発現され得るか、又は核酸構築物に組み合わされ得、任意選択により本開示の更なる特徴を含む核酸構築物にも含まれ得る。従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本発明の遺伝子改変細胞は、１つ以上の異種グリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１及び第２の異種核酸のいずれも遺伝子改変細胞の染色体に安定的に組み込まれる。別の好ましい実施形態では、１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１及び第２の異種核酸は、本発明による天然のラクトースパーミアーゼ及び／又はＭＦＳ輸送体をコードする核酸配列と独立して組み込まれる。１つ以上の更なる例示的な実施形態では、１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする第１及び第２の異種核酸は、核酸構築物に組み込まれる。１つ以上の更なる例示的な実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼをコードする異種核酸配列の少なくとも１つは、プラスミド性である。

本開示のグリコシルトランスフェラーゼは、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，３／４－フコシルトランスフェラーゼ、α－１，４－フコシルトランスフェラーゼ、α－２，３－シアリルトランスフェラーゼ、α－２，６－シアリルトランスフェラーゼ、β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ及びβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの活性を有する酵素の群から選択される。

好ましい実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ、β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ及びβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼからなる群から選択される。

表１は、産生細胞内に含まれる異種遺伝子によってコードされ得るグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質のいくつかの非限定的な実施形態を示す。

上述の酵素は、ＨＭＯコア構造だけでなく、フコシル化ＨＭＯ及び／又はシアリル化ＨＭＯ並びにそれらのグリコシド誘導体の生合成産生を可能にするものである。

改変細菌における天然のＮ－アセチルグルコサミンを含有するＨＭＯの産生は、当技術分野において公知である（例えば、Ｇｅｂｕｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６３ ８３－９０を参照されたい）。

１つ以上の例示的な実施形態では、β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ又はβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼは、それぞれ、ＣｖＢ３ｇａｌＴ及びＧａｌＴＫ又はＧａｌＴ並びに配列番号１７、１８又は１９のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣｖＢ３ｇａｌＴである。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼは、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＧａｌＴＫである。

別の本明細書の好ましい実施形態では、β－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼは、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＧａｌＴである。

１つ以上の更なる例示的な実施形態では、β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼは、ＬｇｔＡ、ＰｍｎａｇＴ、ＨＤ０４６６及び配列番号２０、２１又は２２のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される。

１つ以上のなお更なる例示的な実施形態では、β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＬｇｔＡである。

別の１つ以上の更なる例示的な開示では、α－１，２－フコシル－トランスフェラーゼは、ＦｕｔＣ、Ｓｍｏｂ、Ｍｔｕｎ及び配列番号２３、２４又は２５のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される。

１つ以上の更なる例示的な開示では、α－１，３－フコシル－トランスフェラーゼは、ＦｕｔＡ、ＦｕｃＴ、ＦｕｃＴＩＩＩ及び配列番号２６、２７又は２８のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される。

１つ以上のなお更なる例示的な開示では、α－２，３－シアリル－トランスフェラーゼは、Ｐｄ２及び／若しくはＮｓｔ並びに／又は配列番号２９又は３０のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．９％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体である。

［スクロースの発酵］
１つ以上のＨＭＯの産生において、出発材料は、品質、純度及び産物の量の点から、生産される産物に大きい影響を与え得る。炭素源及びエネルギー源としてグルコースを利用することは、いくつかの場合、グルコースの取り扱い及び殺菌が難しく、多くの場合にグルコースの分解、誘導体の形成及びカラメル化が生じるために問題となる可能性がある。従って、スクロースなどであるが、これらに限定されない別の糖を、より簡単な取り扱い上のパラメーターで利用する能力は、１つ以上のＨＭＯを産生するのに極めて有利である。

大規模製造において、出発材料の原価及び純度は、生産の実行可能性にとって圧倒的に重要なものである。従って、グルコース部分とフルクトース部分から構成される、より弾力性のある糖であるスクロースを利用することは、大規模製造において大いに有益である。しかしながら、多くの製造株及び／又は産生株は、スクロースを加水分解することができる酵素を欠如しているため、スクロースを炭素源として利用することができない。これは、いくつかの場合、スクロースと、スクロース加水分解酵素、例えばインベルターゼとを発酵培地に添加することによって克服されており、これによりスクロースをグルコースとフルクトースとに加水分解することが可能になる。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、スクロース利用系を発現する。このような系は、細胞に内在するものであり得るが、細胞がスクロースを利用することができない場合、異種であり得る。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、１つ以上の異種ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、これにより、スクロースを前記遺伝子改変細胞の唯一の炭素源及びエネルギー源として利用することが可能となる。

１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、スクロースをグルコースとフルクトースとに加水分解することができるポリペプチドを発現する。好ましくは、スクロースをグルコースとフルクトースとに加水分解できるポリペプチドは、単一の異種酵素である。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞によって発現される、スクロースをフルクトースとグルコースに加水分解することができる異種ポリペプチドは、配列番号８６［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ、グリコシドヒドロラーゼファミリー３２タンパク質、ＷＰ＿１０３８５３２１０．１］及び配列番号８７［Ｂｆｆ、β－フルクトフラノシダーゼタンパク質、ＢＡＤ１８１２１．１］並びに配列番号８６又は８７のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、例えば少なくとも７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．９％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号８６又は８７のいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される。

別の手法は、異種スクロース利用系を発現させ、例えば、限定されるものではないが、ＰＴＳ依存系を発現させるか又はインベルターゼを発現させ、細胞がスクロースを炭素源及びエネルギー源として利用できるようにすることであり、本開示の実施例２及び３に記載されている。

スクロース特異的ポリン、スクロース輸送タンパク質及びスクロース－６－リン酸ヒドロラーゼを含む異種ＰＴＳ依存性スクロース利用輸送系は、例えば、国際公開第２０１５１９７０８２号パンフレットに記載されている。それらのグルコース－６－リン酸及びフルクトースが酸化すると、生物自身の代謝系によって生物学的エネルギー源がもたらされる。また、グルコース－６－リン酸及びフルクトースは、細胞の天然の生合成経路において糖ヌクレオチドを生成するための炭素源として機能する。このようにして産生された糖ヌクレオチドは、炭水化物受容体（例えば、ラクトース）をグリコシル化するためのドナーであり、細胞によって特定のパーミアーゼにより内部移行され、それにより目的のオリゴ糖が製造される。グリコシル化は、異種遺伝子を発現させることによって直接的に産生される１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼにより媒介される。生物では、細胞内で受容体又はオリゴ糖産物のいずれかを分解するあらゆる酵素が欠如している。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本開示の遺伝子改変細胞は、１つ以上の異種ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸配列を含み、これにより、スクロースを前記遺伝子改変細胞の唯一の炭素源及びエネルギー源として利用することが可能となる。１つ以上の好ましい例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、ＰＴＳ依存性スクロース利用系を含み、更にｓｃｒＹＡオペロン及びｓｃｒＢＲオペロンを含む。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本開示による遺伝子改変細胞は、ＰＴＳ依存性スクロース利用輸送系及び／又はスクロースをフルクトースとグルコースに加水分解することができる異種ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、ｓｃｒＹＡオペロンによってコードされるポリペプチドは、配列番号８８及び８９［ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］によるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号８８及び８９［ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］のいずれか１つと少なくとも８０％同一であり、例えば少なくとも９０％同一であり、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号８８及び８９［ｓｃｒＹ及びｓｃｒＡ］のいずれか１つの機能的相同体である。

１つ以上の例示的な実施形態では、ｓｃｒＢＲオペロンによってコードされるポリペプチドは、配列番号９０及び９１［ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］によるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は配列番号９０及び９１［ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］のいずれか１つと少なくとも８０％同一であり、例えば少なくとも９０％同一であり、例えば少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号９０及び９１［ｓｃｒＢ及びｓｃｒＲ］のいずれか１つの機能的相同体である。

上記に記載されるようなこのような細胞は、スクロースを炭素源及びエネルギー源として利用することができる。

更に、本明細書に開示される方法の培養工程は、第１の供給段階で連続的に添加される量よりも少ないスクロースを培養物に連続的に添加する第２の供給段階を含む２工程のスクロース供給から構成され得、そのようにして高細胞密度培養における細胞増殖を遅らせ、産生される産物の含有量を増加させる。

第２の供給段階中に細胞培養物に連続的に添加されるスクロースの供給速度は、第１の供給段階中に連続的に添加されるスクロースの供給速度よりも約３０～４０％低くてもよい。

両方の供給段階中、ラクトースを連続的に、好ましくは同一の供給溶液中でスクロースと共に添加することができるか又は順次添加することができる。

任意選択により、培養は、第２の段階後に細胞外分画中に相当量の未使用の受容体が残存している場合、第３の供給段階を更に含む。

次いで、スクロースの添加を、好ましくは受容体が消費されるまで第２の供給段階で設定されたものとほぼ同じ供給速度で受容体を添加することなく継続する。

［糖ヌクレオチドの合成］
活性化糖ヌクレオチドの生合成は、１つ以上のＨＭＯの産生にいくつかの方法で影響を与える可能性があり、第一に、ＨＭＯの合成の際に基質として作用する特定の糖ヌクレオチドの産生を増強することにより、全体的なＨＭＯ産生を増強するか、又は副産物の形成を減少することができ、第二に、特定の糖ヌクレオチドを減少させることにより、産生される標的となるＨＭＯのレベルを維持しながら、産生される副産物の量を減少させることができる。従って、本開示の１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、活性化糖の生合成に関与する１つ以上の異種ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。

「活性化糖」又は「活性化糖ヌクレオチド」又は「糖ヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、本明細書に関連して、ヌクレオチド糖（例えば、ＵＤＰ－ガラクトース）など、ＨＭＯ合成における前駆体として作用する修飾糖に関する。一般に、ヌクレオチドとのコンジュゲート又はリン酸化によって単糖を活性化し、これをグリコシルトランスフェラーゼに媒介される反応に利用してＨＭＯを合成する。従って、糖ヌクレオチド合成を改変することは、１つ以上のＨＭＯを産生するのに極めて有利である。

活性化糖ヌクレオチドは、一般に、ヌクレオシドに結合された、リン酸化されたグリコシル残基を有する。特異的なグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、特異的な活性化糖ヌクレオチドのみを受け入れる。従って、好ましくは、以下の活性化糖ヌクレオチド：グルコース－ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧｌｃＮＡｃ）及びＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸が、グリコシル転移に関与する。本開示による遺伝子改変細胞は、グルコース－ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＧＤＰ－フコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン、ＵＤＰ－Ｎ－アセチルガラクトサミン及びＣＭＰ－Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）からなる群から選択されるヌクレオチド活性化糖を産生するための１つ以上の経路を含み得る。下記の表７は、グリコシルドナー及びそれらを用いて産生することができるＨＭＯ産物の非限定的な例であり、この一覧は網羅的でない可能性がある。

本開示の１つ以上の例示的な実施形態は、修飾糖ヌクレオチド合成を有する遺伝子改変細胞に関する。特に、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ及び／又はＵＤＰ－Ｇａｌの糖ヌクレオチド合成の増加した合成は、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴの産生において有利であり得る。

１つ以上の例示的な開示では、遺伝子改変細胞は、活性化糖ヌクレオチドの生合成に関与する１つ以上のポリペプチドを発現する。活性化糖ヌクレオチドの生合成に関与する１つ以上のポリペプチドは、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ、ＷｃａＨ、ＷｃａＩ、ＭａｎＣ、ＭａｎＢ、Ｐｇｍ、ＧａｌＵ、ＧａｌＥ、ＧｌｍＭ、ＧｌｍＵ、ＧｌｍＳ、ＮｅｕＡ、ＮｅｕＢ、ＮｅｕＣ並びに配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４及び４５のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択することができる。

本開示の１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞は、活性化糖ヌクレオチドの生合成に関与する１つ以上のポリペプチドを発現し、活性化糖ヌクレオチドの生合成に関与する１つ以上のポリペプチドは、Ｐｇｍ［配列番号４３又は４４］、ＧａｌＵ［配列番号４５又は４６］、ＧａｌＥ［配列番号４７又は４８］、ＧｌｍＭ［配列番号４９又は５０］、ＧｌｍＵ［配列番号５１又は５２］、ＧｌｍＳ［配列番号３３又は５４］及び配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３又は５４のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される。

［コラン酸遺伝子クラスター］
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２のコラン酸遺伝子クラスターは、細菌細胞壁の主要なオリゴ糖である細胞外多糖類、コラン酸の産生に関与する。

コラン酸遺伝子クラスターは、通常、実施例に記載されるような遺伝子改変細胞にＰｇｌｐＦ誘導発現カセットの形態で導入されるため、（ＤＮＡ結合転写リプレッサーＧｌｐＲをコードする）ｇｌｐＲ遺伝子を欠失させると、細胞内の全てのＰｇｌｐＦプロモーターからのＧｌｐＲにより強制された転写の抑制が排除され、このようにコラン酸遺伝子クラスターを含む全てのＰｇｌｐＦをベースとしたカセットによる遺伝子発現が増強される。

１つ以上の例示的な開示では、コラン酸遺伝子クラスターは、その天然のゲノム遺伝子座から発現され得る。この発現は、能動的に調節することができる。天然プロモーターを目的のプロモーターと交換し、且つ／又は遺伝子クラスターを、天然のものとは別のゲノム遺伝子座から発現させることにより、前記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させるか、又はコラン酸遺伝子クラスター若しくはその特異遺伝子をエピソーマルに発現させることによって発現を調節することができる。

従って、１つ以上の例示的な開示では、コラン酸遺伝子クラスターの発現は、天然プロモーターを目的のプロモーターと交換し、且つ／又は遺伝子クラスターを、天然のものとは別のゲノム遺伝子座から発現させることにより、前記タンパク質をコードするコラン酸遺伝子のコピー数を増加させるか、又はコラン酸遺伝子クラスターをエピソーマルに発現させることによって調節される。

本開示に関して、コラン酸遺伝子クラスターに関する「天然のゲノム遺伝子座」という用語は、遺伝子クラスターが遺伝子改変細胞のゲノムの本来の自然な位置にあることに関する。

［Ｇｍｄ］
ｇｍｄ遺伝子は、ＧＤＰ－Ｄ－マンノースからＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－マンノースへの変換を触媒するタンパク質、ＧＤＰ－マンノース－４，６－デヒドラターゼをコードする。このタンパク質は、ＧＤＰ－α－Ｄ－マンノースからＧＤＰ－Ｌ－フコースを合成する反応に関与する。１つ以上の例示的な開示では、ｇｍｄ遺伝子は過剰発現される。

［ｗｃａＧ］
ｆｃｌとしても公知のｗｃａＧ遺伝子は、ＧＤＰ－Ｌ－フコースシンターゼ（ＥＣ１．１．１．２７１）というタンパク質をコードしており、ＧＤＰ－４－デヒドロ－６－デオキシ－Ｄ－マンノースからＧＤＰ－フコースへの２段階のＮＡＤＰ依存的変換を触媒し、エピメラーゼ及びレダクターゼ反応に関与する。１つ以上の例示的な開示では、ｗｃａＧ遺伝子は過剰発現される。

［ｗｃａＨ］
ｗｃａＨ遺伝子は、ＧＤＰ－マンノース及びＧＤＰ－グルコースの両方を加水分解するタンパク質、ＧＤＰ－マンノースマンノシルヒドロラーゼ（ＥＣ３．６．１．－）をコードする。１つ以上の例示的な開示では、ｗｃａＨ遺伝子は過剰発現される。

［ｗｃａＩ］
ｗｃａＩ遺伝子は、コラン酸生合成グリコシルトランスフェラーゼであるＷｃａＩをコードし、ＵＰＰ－Ｇｌｃ（α－Ｄ－グルコピラノシル－ジホスホウンデカプレノール－グルコース）への未修飾のフコースの転移を触媒する。１つ以上の例示的な開示では、ｗｃａｌ遺伝子は過剰発現される。

［ｍａｎＢ］
ｍａｎＢ遺伝子は、ホスホマンノムターゼ（ＥＣ５．４．２．８）というタンパク質をコードし、α－Ｄ－マンノース－１－リン酸からＤ－マンノース－６－リン酸への変換を触媒することにより、ＧＤＰ－マンノースの生合成に関与する。従って、ｍａｎＢの発現レベルにより、ＧＤＰ－マンノースの形成が調節される。１つ以上の例示的な開示では、ｍａｎＢ遺伝子は、過剰発現される。

［ｍａｎＣ］
ｍａｎＣ遺伝子は、マンノース－１－リン酸グアニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．１３）というタンパク質をコードし、ＧＴＰとα－Ｄ－マンノース－１－リン酸からＧＤＰ－マンノースを合成することにより、ＧＤＰ－マンノースの生合成に関与する。１つ以上の例示的な開示では、ｍａｎＣ遺伝子は過剰発現される。

［シアル酸異化経路］
更に、遺伝子改変細胞は、シアル酸合成能力も含み得る。例えば、細胞は、外来性ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ２－エピメラーゼ（例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）のＮｅｕＣ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２７．１）若しくは均等物（例えば、（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＲ０４５６１．１）、Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＮｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２６．１）若しくは均等物（例えば、フラボバクテリウム・リムノセディミニス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｎｏｓｅｄｉｍｉｎｉｓ）のシアル酸シンターゼ、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿０２３５８０５１０．１）及び／又はＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃシンセターゼ（例えば、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＮｅｕＡ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＫ９１７２８．１）若しくは均等物（例えば、ビブリオ・ブラシリエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のＣＭＰ－シアル酸シンターゼ、ＮＣＢＩ参照配列ＷＰ＿００６８８１４５２．１）の提供により、シアル酸合成能力を含む。

１つ以上の例示的な開示では、遺伝子改変細胞は、欠損したシアル酸異化経路を含む。「シアル酸異化経路」は、通常、酵素によって制御及び触媒され、これによりシアル酸の分解が生じる一連の反応を意味する。本明細書に記載される例示的なシアル酸異化経路は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）経路である。この経路では、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ；Ｎ－アセチルノイラミン酸）は、ＮａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）及びＮａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）及びＮａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ）という酵素によって分解され、これらは、全てｎａｎＡＴＥＫ－ｙｈｃＨオペロンによってコードされ、ＮａｎＲによって抑制される（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｏｃｙｃ．ｏｒｇ／ＥＣＯＬＩ）。欠損したシアル酸代謝経路は、内在性ｎａｎＡ（Ｎ－アセチルノイラミン酸リアーゼ）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ０００６７．１（ＧＬ２１６５８８））及び／又はｎａｎＫ（Ｎ－アセチルマンノサミンキナーゼ）遺伝子（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＧｅｎＢａｎｋ参照（アミノ酸）ＢＡＥ７７２６５．１（ＧＬ８５６７６０１５））及び／又はｎａｎＥ（Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸エピメラーゼ、ＧｅｎｅＩＤ：９４７７４５）内に突然変異を導入することにより、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に提供される。任意選択により、ｎａｎＴ（Ｎ－アセチルノイラミン酸輸送体）遺伝子も不活化されるか又は変異される。シアル酸代謝物の他の中間体としては、（ＭａｎＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルマンノサミン－６－リン酸；（ＧｌｃＮＡｃ－６－Ｐ）Ｎ－アセチルグルコサミン－６－リン酸；（ＧｌｃＮ－６－Ｐ）グルコサミン－６－リン酸及び（Ｆｒｕｃ－６－Ｐ）フルクトース－６－リン酸が挙げられる。

１つ以上の好ましい例示的な開示では、ｎａｎＡは変異している。他の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＫは、変異しているが、ｎａｎＥは、機能性を維持している。別の好ましい実施形態では、ｎａｎＡ及びｎａｎＥは、変異しているが、ｎａｎＫは、変異、不活化又は欠失されていない。本明細書に関連して、変異とは、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴの遺伝子産物をコードする核酸配列内の１つ以上の変化を指す。例えば、変異は、核酸配列内の１個、２個、最大５個、最大１０個、最大２５個、最大５０個又は最大１００個の変化であり得る。例えば、ｎａｎＡ、ｎａｎＫ、ｎａｎＥ及び／又はｎａｎＴ遺伝子は、ヌル変異によって変異している。本明細書に記載されるヌル変異は、酵素の機能の消失（すなわち活性の低下若しくは活性がない）又は酵素の消失（すなわち遺伝子産物がない）のいずれかを引き起こすアミノ酸の置換、付加、欠失又は挿入を包含する。「欠失した」は、（機能的）遺伝子産物が産生されないように、コード領域が完全に又は部分的に除去されていることを意味する。不活化されたとは、結果として生じる遺伝子産物が、機能的に不活性であるか、又は天然の自然に存在する内在性遺伝子産物の活性の１００％未満、例えば９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％若しくは２０％の遺伝子産物をコードするようにコード配列が変異されていることを意味する。「非変異」遺伝子又はタンパク質は、天然で自然に存在するか、又は内在性のコード配列と１個、２個、最大５個、最大１０個、最大２０個、最大５０個、最大１００個、最大２００個若しくは最大５００個以上のコドンが異ならないか、又は対応するコードされたアミノ酸配列と異ならない。

［リプレッサー］
１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変細胞は、調節エレメントに通常結合し、前記調節エレメントによって調節される本開示のタンパク質のいずれかの発現を抑制する非機能的又は欠如遺伝子産物を含む。

本明細書に関連して、調節エレメントに通常結合し、調節エレメントによって誘発される発現を抑制する非機能的（又は欠如）遺伝子産物という用語は、目的遺伝子のコード配列の上流、具体的には前記遺伝子のプロモーター領域ＤＮＡ結合部位に関する。

１つ以上の例示的な実施形態では、細胞は、ｌａｃＹ遺伝子及び／若しくは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５若しくは１６のアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかに通常結合し、これらの発現を抑制する非機能的（若しくは欠如）遺伝子産物又はｌａｃＹ遺伝子及び／若しくは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５若しくは１６のアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかの発現を制御するための調節エレメントの上流の領域を有し得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、前記遺伝子産物は、ＤＮＡ結合転写リプレッサーであるＧｌｐＲである。

［ＧｌｐＲ］
ＧｌｐＲは、転写レギュレーターのＤｅｏＲファミリーに属し、異なるオペロン内で構築され、グリセロール－３－リン酸レギュロンのリプレッサーとして作用する。このレギュレーターは、ｇｌｐＥＧＲオペロンの一部でありながら、独立した（ｇｌｐＲ）転写単位として構成的に発現させることもできる。加えて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）をインデューサーであるグリセロール、すなわちグリセロール－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）の存在下且つグルコースの非存在下で培養すると、調節されたオペロンが誘導される。インデューサーの非存在下、このリプレッサーは２０核酸長のＤＮＡ標的部位からなる逆位反復配列にタンデムに結合する。

ｇｌｐＲ遺伝子に関する「非機能性又は欠如」という用語は、細菌ゲノム（例えば、ｇｌｐＦ由来のプロモーターを下方制御することが可能なｇｌｐＲをコードする配列番号９２又はその変異体）に由来する、対応する核酸配列を完全欠失又は部分的欠失させることによるｇｌｐＲ遺伝子の不活化を指す。ｇｌｐＲ遺伝子は、ＤＮＡ結合転写リプレッサーであるＧｌｐＲをコードする。このようにして、ＰｇｌｐＦファミリーのプロモーター配列は、通常、ＰｇｌｐＦプロモーターを下方制御することになるリプレッサー遺伝子を欠失していることにより、遺伝子改変細胞内で上方制御される。

１つ以上の例示的な実施形態では、ｇｌｐＲ遺伝子は欠失されている。

［アクチベーター］
１つ以上の例示的な実施形態では、本明細書に開示される遺伝子改変細胞は、前記調節エレメントによって調節される本開示の遺伝子及び／又はタンパク質のいずれかの発現を増強する、過剰発現された遺伝子産物を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、本開示の細胞は、ラクトースパーミアーゼＬａｃＹ及び／又は配列番号１～１６のアミノ酸配列を有するタンパク質のいずれかをコードする遺伝子の発現を増強する、過剰発現された遺伝子産物を含み得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、前記遺伝子産物は、ｃＡＭＰ ＤＮＡ結合転写二重レギュレーターであるＣＲＰである。

［ＣＲＰ］
ＣＲＰは、転写因子のＣＲＰ－ＦＮＲスーパーファミリーに属する。ＣＲＰは、いくつかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子の発現を調節し、その多くは二次炭素源の異化に関与する。ＣＲＰは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）によって活性化されると、特定のプロモーター配列に直接結合し、この結合により、直接相互作用を介してＲＮＡポリメラーゼを動員し、次にプロモーター配列の後に続く核酸配列の転写を活性化して、目的遺伝子の発現がもたらされる。従って、ＣＲＰが過剰発現することにより、目的遺伝子／核酸配列の増強発現がもたらされ得る。他の機能性の中でも、ＣＲＰはＰｇｌｐＦプロモーター上でその機能を発揮し、リプレッサーのＧｌｐＲとは逆にＰｇｌｐＦファミリーのプロモーター配列を活性化する。このようにして、本開示の遺伝子改変細胞内でＣＲＰを過剰発現させることにより、ＰｇｌｐＦファミリーのプロモーターによって調節される遺伝子の発現が促進される。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、ｃｒｐ遺伝子が過剰発現される。

ＧｌｐＲ及び／又はＣＲＰを遺伝子改変することは、２’－ＦＬ産生株において、本開示で示唆されるように、これらの株による全体的な２’－ＦＬの産生に有益である。

［レギュレーターエレメント］
本開示による遺伝子改変細胞は、内在性、異種及び／又は合成核酸配列の過剰発現を制御することが可能な調節エレメントを含み得る。

「調節エレメント」という用語は、プロモーター配列、シグナル配列及び／又は転写因子結合部位の配列を含み、これらの配列は、調節エレメントに作動可能に連結された核酸配列の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。

調節エレメントは、転写及び転写後レベルで見出され、更にそれらのレベルで分子ネットワークを可能にする。例えば、転写後レベルでは、ｍＲＮＡの安定性、翻訳及び細胞内局在性を制御する生化学的シグナルが調節エレメントによって処理される。ＲＮＡ結合タンパク質は、転写後調節エレメントの別のクラスであり、更に配列エレメント又は構造エレメントとして分類される。調節エレメントとして機能し得る特定の配列モチーフもｍＲＮＡの改変に関連する。様々なＤＮＡ調節エレメントが遺伝子発現の調節に関与しており、ＤＮＡ、クロマチンを構成する細胞タンパク質及び転写因子に関与する生化学的相互作用に依存する。

一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列及び転写停止配列、翻訳開始配列及び翻訳停止配列並びにエンハンサー配列又はアクチベーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。

プロモーター及びエンハンサーは、遺伝子発現の主要なゲノム調節成分である。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から１～２キロベース（ｋｂ）の範囲内のＤＮＡ領域であり、ＲＮＡポリメラーゼ転写機構を組み立てるのに必要となる短い調節エレメント（ＤＮＡモチーフ）を含有する。しかしながら、ＴＳＳよりも遠位に位置するＤＮＡ調節エレメントの寄与がなければ、転写は、最小限となることが多い。このような領域は、多くの場合エンハンサーと称され、細胞型の同一性を確立し、遺伝子発現を調節するために部位特異的転写因子と相互作用する、位置に依存しないＤＮＡ調節エレメントである。エンハンサーは、それらの配列関係とは無関係に、ルーピングとして公知のプロセスを通して、それらの標的遺伝子から数百ｋｂ～それ以上のｋｂの距離で作用することもある。これらの特徴から、ＤＮＡ配列のみを基準として好適なエンハンサーを同定し、それらを標的遺伝子に結合させることは困難である。

プロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）と共に、所与の遺伝子又は遺伝子群（オペロン）を発現するために必要なものである。

特定の目的遺伝子の発現を促進する好適なプロモーター配列を同定することは、時間のかかる作業であり、多くの場合、大変な努力が必要とされる。本開示に関して、レギュレーターエレメントは、翻訳後レギュレーターであっても若しくはなくてもよいか、又は翻訳レギュレーターであっても若しくはなくてもよい。

本発明の１つ以上の例示的な実施形態では、いずれかの１つ以上の核酸配列及び／又は遺伝子の発現は、１つ以上の調節エレメントによって調節される。

１つ以上の例示的な実施形態では、調節エレメントは、発現を増強することができ、すなわち本開示によるいずれかの１つ以上の核酸配列を過剰発現することができる１つ以上のエレメントを含む。

この点に関して、調節エレメントは、内在性又は異種、及び／又は組換え、及び／又は合成核酸配列であり得る。本明細書に関連して、「異種調節エレメント」という用語は、本明細書に記載される本来の遺伝子改変細胞に内在しない調節エレメントであるものと理解すべきである。異種調節エレメントは、組換え調節エレメントでもあり得、２つ以上の動作可能に連結されていない天然の調節エレメントが異種及び／又は合成調節エレメントに組換えられる。異種調節エレメントは、当業者に公知の方法を使用して遺伝子改変細胞に導入され得る。

調節エレメントは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して天然のｌａｃオペロンの発現を促進する、例えばＰｌａｃプロモーターなどの天然の調節エレメントであり得る。

［プロモーター配列］
本開示は、遺伝子改変細胞及び／又は前記遺伝子改変細胞を提供することを含む方法に関し、前記核酸配列のいずれか１つ以上の発現は、１つ以上の調節エレメントによって調節される。前記調節エレメントは、１つ以上のプロモーター配列を含み得る。

調節エレメント、すなわち遺伝子及び／又は核酸配列の発現を調節するエレメントは、１つ以上のプロモーター配列を含み得、プロモーター配列は、目的遺伝子の核酸配列の発現を調節するという意味で目的遺伝子の核酸配列に作動可能に連結される。

一般に、プロモーターは、天然、異種及び／又は合成核酸配列を含み得、上記に記載されるように２つ以上の核酸配列又は同一若しくは異なる起源を組換え、これにより相同、異種若しくは合成核酸プロモーター配列及び／又は相同、異種若しくは合成核調節エレメントが生成される組換え核酸配列であり得る。ＰｇｌｐＦ、ＰｌｇｐＡ、ＰｌｇｐＴ、ＰｇａｔＹ、ＰｍｇｌＢ及びＰｌａｃプロモーター系に由来するプロモーター配列の幅広い選択については、国際公開第２０１９１２３３２４Ａ１号パンフレット及び国際公開第２０２０２５５０５４Ａ１号パンフレットに詳細に記載されている。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列の調節エレメントは、２つ以上の天然又は異種プロモーター配列を含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列の調節エレメントは、同一のプロモーター配列を有する２つ以上の調節エレメントを含む。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞の遺伝子及び／又は異種核酸配列の調節エレメントは、同一ではないプロモーター配列を有する２つ以上の調節エレメントを含む。

調節構造、すなわち転写因子結合部位の遺伝子ごとの分布及びそれらの部位に結合する転写因子の同一性は、複数の異なる増殖条件下で利用することができ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムにわたって調節エレメントとして作用する１００個超の遺伝子が存在する。従って、本明細書に記載されるような１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の異種核酸配列又は天然核酸配列の転写及び／又は転写レベルの調節を可能にする、あらゆるプロモーター配列が好適となり得る。

産物の産生を増大させる１つの方法は、グリコシルトランスフェラーゼ又はＭＦＳ輸送体又はラクトースパーミアーゼなどの産物又は前駆体／基質の取り込みを生じさせるために使用される、所望の酵素活性の生成を調節することであり得る。

所望の酵素の発現を誘発するプロモーター強度を増大させることは、この方法を行う１つの方法であり得る。プロモーターの強度は、以前に記載されているように、β－ガラクトシダーゼ活性がアッセイされるｌａｃＺ酵素アッセイを用いて評価することができる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７２を参照されたい）。簡潔には、細胞をＺバッファ中に希釈し、ドデシル硫酸ナトリウム（０．１％）及びクロロホルムによって透過処理する。ＬａｃＺアッセイは３０℃で実施する。試料を予熱し、２００μｌのオルト－ニトロ－フェニル－β－ガラクトシダーゼ（４ｍｇ／ｍｌ）を添加することによってアッセイを開始し、試料がわずかに黄色になったら、５００μｌの１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３を添加することによって停止する。続いて、オルト－ニトロフェノールの放出を、４２０ｎｍでの光学密度の変化として測定する。比活性は、ミラー単位（ＭＵ）［Ａ４２０／（分＊ｍｌ＊Ａ６００）］で報告する。活性が１０，０００ＭＵを上回る調節エレメントは、強力であると見なし、３，０００ＭＵ未満の調節エレメントは、弱いものと見なし、その間の活性は、中程度の強度を有する。強力な調節エレメントの例は、約１４，０００ＭＵの活性を有するＰｇｌｐＦプロモーターであり、弱いプロモーターの例は、ＩＰＴＧによって誘導された場合に約２３００ＭＵの活性を有するＰｌａｃである。

代わりに、産生を最適化するために１つ以上のタンパク質の発現レベルを均衡させる必要がある場合、所望の強度、例えば中強度又は低強度のプロモーターを使用することが有益であり得る。下記の表８は、ＰｇｌｐＦプロモーターと比較した強度に従い、一連の野生型プロモーター及び組換えプロモーターを列記したものである。

＊プロモーター活性は、下記に記載されるＬａｃＺアッセイで評価され、同アッセイではＰｇｌｐＦプロモーターを陽性参照として実行する。アッセイ間で比較するために、ＰｇｌｐＦプロモーターと比較した活性を算出する。範囲は、複数のアッセイからの結果を示す。

プロモーターは、異種起源のものであるか、遺伝子改変細胞に天然のものであり得るか、又は異種及び／若しくは天然のエレメントを組み合わせた組換えプロモーターであり得る。

１つ以上の例示的な実施形態では、調節エレメントは、ＰＢＡＤ、Ｐｘｙｌ、Ｐｌａｃ、ＰｓａｃＢ、ＰｘｙｌＡ、ＰｒｐＲ、ＰｎｉｔＡ、ＰＴ７、Ｐｔａｃ、ＰＬ、ＰＲ、ＰｎｉｓＡ、Ｐｂ、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＣＰ６、ＰｏｓｍＹ、Ｐｓｐｃ、Ｐｂｌａ、Ｐｒｒｎ１及びＰｒｒｎ２からなる群から選択されるプロモーター配列を含む。

現在の好ましい実施形態では、プロモーター配列は、ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ２、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、Ｐｌａｃ＿１６ＵＴＲ及びＰｌａｃからなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、調節エレメントは、ＰｇｌｐＦ（配列番号７０）、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ（配列番号１０１）、配列番号６９（ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ）、Ｐｌａｃ（配列番号６８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ（配列番号８２）、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ（配列番号１００）、Ｃｐ６（配列番号８４）、Ｐｏｓｍｙ（配列番号８５）又はこれらの変異体及びその変異体からなる群から選択されるプロモーターである。具体的には、表８に開示される変異体が好ましい。

１つ以上の例示的な実施形態では、調節エレメントは、高強度又は中強度のプロモーター、例えば、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、ｐｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２８、ＰｇｌｐＦ＿Ｂ２９、ＰｍｇｌＢ＿１６ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６及びＰｇｌｐＡ＿１６ＵＴＲからなる群から選択されるプロモーター配列である。

１つの好ましい実施形態では、プロモーターは、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ８、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ１０、ＰｍｇｌＢ＿５４ＵＴＲ、Ｐｌａｃ＿７０ＵＴＲ、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ９、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ４、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ＿ＳＤ７、ＰｍｇｌＢ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ、ｐｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ、ＰｇｌｐＦ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１０、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ５、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ８及びＰｍｇｌＢ＿１６ＵＴＲからなる群から選択される強力なプロモーターである。これらのプロモーターは、特に、異種グリコシルトランスフェラーゼ及び又はＭＦＳ輸送体を発現するのに有利であり得る。

別の実施形態では、プロモーターは、中強度のプロモーター、例えばＰｇｌｐＦ＿ＳＤ９、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ６及びＰｇｌｐＡ＿１６ＵＴＲからなる群から選択され、これらのプロモーターは、特に、異種ＭＦＳ輸送体を発現するために、この発現をラクトースパーミアーゼの発現に対して均衡させる必要がある場合に有利であり得る。

別の実施形態では、プロモーターは、低強度のプロモーター、例えばＰｌａｃ、ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ３及びＰｇｌｐＦ＿ＳＤ１からなる群から選択される。これらのプロモーターは、特に、異種ＭＦＳ輸送体を発現するために、この発現をラクトースパーミアーゼの発現に対して均衡させる必要がある場合に有利であり得る。

現在好ましい実施形態では、プロモーター配列は、配列番号７０に示すようなＰｇｌｐＦである。本発明の好ましい実施形態では、中強度又は低強度のプロモーターエレメント、例えばＰｌａｃプロモーター（配列番号６８）が異種ＭＦＳ輸送体を調節する調節エレメントに含まれ、高強度のプロモーター、例えばＰｇｌｐＦ（配列番号７０）がＬａｃＹを調節する調節エレメントに含まれる。

現在好ましい実施形態では、配列番号６８のＰｌａｃプロモーターエレメントがＹｂｅｒＣを調節する調節エレメントに含まれ、配列番号７０に示すようなＰｇｌｐＦがＬａｃＹを調節する調節エレメントに含まれる。

調節エレメントの別のタイプの一例は、細菌及び古細菌のメッセンジャーＲＮＡにあるリボソーム結合部位のシャイン・ダルガノ配列であり、一般に開始コドンＡＵＧの８塩基ほど上流に位置し、リボソームをｍＲＮＡに動員し、タンパク質合成を開始するのを補助する。従って、翻訳領域の核酸配列の上流のシャイン・ダルガノ配列を改変すると、本発明の遺伝子及び／又は核酸配列及び／又はポリペプチドのいずれか１つ以上の発現レベルが改変され得る。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、本開示による遺伝子改変細胞は、１つ以上の内在性、異種、合成及び／又は最適化シャイン・ダルガノ配列を含む。

［配列同一性］
２つ以上の核酸配列又はアミノ酸配列に関連して、「［所定の］％の配列同一性」という用語は、２つ以上の配列を核酸又はアミノ酸の比較ウィンドウ又は指定された配列に対して最も一致するように比較及びアラインメントさせたときに、所与のパーセントで共通する核酸又はアミノ酸残基を有する（すなわち、配列は、少なくとも９０パーセント（％）の同一性を有する）ことを意味する。核酸配列又はアミノ酸配列の同一性パーセントは、デフォルトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２．０配列比較アルゴリズムを使用して又は手動によるアラインメント及び視覚的検査によって測定することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照されたい）。この定義は、試験配列の相補体並びに欠失及び／又は付加を有する配列、同様に置換を有する配列にも適用される。同一性パーセント、配列類似性の決定及びアラインメントに好適なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋アルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５－３３８９（１９９７）に記載されている。本開示の核酸及びタンパク質に対する配列同一性パーセントを決定するために、ＢＬＡＳＴ ２．２．２０＋を使用する。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。一般的に使用されている配列アラインメントアルゴリズムの例は、
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）、
ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）、
ＭＡＦＦＴ（ｈｔｔｐ：／／ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｅｒｖｅｒ／）、又は
ＭＵＳＣＬＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）
である。

本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ／．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定されることが好ましい（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ ｎｅｅｄｌｅ／において利用可能）。使用されるパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（３０ ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長の同一性」と表示されたＮｅｅｄｌｅ出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される：（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。

本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列間の配列同一性は、１０、好ましくはバージョン５．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１ ９７０，前掲）を使用して決定されることが好ましい。使用されるパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ及びＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長の同一性」と表示されたＮｅｅｄｌｅ出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して得られる）が同一性パーセントとして使用され、以下のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）。

［機能的相同体］
本明細書に記載されるようなタンパク質／ヌクレオチドの機能的相同体は、その元々の機能性を保持する、遺伝コード内に変異を有するタンパク質／ヌクレオチドである。機能的相同体は、変異誘発によって得られ得る。機能的相同体は、タンパク質／ヌクレオチドの機能と比較して、少なくとも５０％、例えば６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の残された機能性を有する必要がある。

開示されるアミノ酸配列のいずれか１つの機能的相同体は、より高い機能性も有し得る。本明細書に開示されるポリペプチドのいずれか１つの機能的相同体は、ＨＭＯの収率、純度、バイオマスの形成の低減、遺伝子改変細胞の生存率、本開示による遺伝子改変細胞の頑健性又は消耗品の削減の観点から、理想的にはＨＭＯの産生に関わることが可能となるようにすべきである。

［ゲノムへの組み込み］
本開示による遺伝子改変細胞で発現した核酸配列は、遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれ得る。

場合により、構築物（発現カセット）に含まれる目的の異種核酸をゲノムに組み込むことは、従来法により、例えばａｔｔＴｎ７部位について記載されているような、染色体上の特異的部位に相同な隣接配列を含有する線状カートリッジを使用することにより（Ｗａｄｄｅｌｌ Ｃ．Ｓ．ａｎｄ Ｃｒａｉｇ Ｎ．Ｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９８８）Ｆｅｂ；２（２）：１３７－４９．）；組み換えがファージλのＲｅｄリコンビナーゼ機能又はＲａｃプロファージのＲｅｃＥ／ＲｅｃＴリコンビナーゼ機能によって組み換えが媒介される、核酸配列のゲノムを組み込む方法により（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９８）；１８０（８）：２０６３－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）２０：１２３－１２８ Ｍｕｙｒｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．（２０００）１（３）：２３９－２４３）；Ｒｅｄ／ＥＴ組み換えに基づく方法により（Ｗｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．（２００５），１２（３）：３４９－５６．；Ｖｅｔｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００５）；７１（４）：１８２９－３５）；又は陽性クローン、すなわち例えばマーカー遺伝子若しくは遺伝子機能の損失若しくは獲得によって選択され得る発現カセットを有するクローンにより達成することができる。

天然又は異種遺伝子の発現及び／又は過剰発現は、前記遺伝子のエピソームによる組み込みから得られ、すなわち異種ポリペプチドをコードする核酸を核酸構築物に挿入し、続いてこれをプラスミド中に含めるか、又は別の染色体の独立した発現ベクター中に含める１つ以上の例示的な実施形態であり得、いくつかの場合、発現ベクターを染色体に組み込むことができるが、しかしながら、本発明の異種ポリペプチドをコードする異種核酸の発現を達成するためにそうする必要はない。エピソームの例としては、例えば、トランスポゾン及び挿入配列がある。

開示されるような本発明の範囲において、「ゲノム的に組み込まれた」という用語は、１つ以上の天然又は異種核酸配列が、染色体又は内在性プラスミドに組み込まれ、従って本開示の遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれることを指す。

従って、１つ以上の例示的な好ましい実施形態では、本発明は、例えば、上記に記載されるような１つ以上のラクトースパーミアーゼ及び／又は異種ＭＦＳ輸送体遺伝子及び／又は１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼの１つ以上のエピソーム及び／又はゲノム的に組み込まれたコピーをコードする１つ以上の異種核酸配列を含む、上記に記載されるような遺伝子改変細胞に関する。

１つ以上の例示的な実施形態では、例えば、本発明による１つ以上のラクトースパーミアーゼ及び／又は異種ＭＦＳ輸送体及び／又は１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の天然及び／又は異種核酸配列は、遺伝子改変細胞のゲノムに安定的な方法で組み込まれる。

１つ以上の更なる例示的な実施形態では、例えば、本発明による１つ以上のラクトースパーミアーゼ及び／又は異種ＭＦＳ輸送体及び／又は１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の天然及び／又は異種核酸配列は、遺伝子改変細胞のゲノムに一過性の方法で組み込まれる。

［プラスミドからの発現］
１つ以上の更なる例示的な実施形態では、１つ以上の核酸配列は、プラスミドから発現される。

本開示では、本発明に従い、例えば１つ以上のラクトースパーミアーゼ、及び／又は異種ＭＦＳ輸送体、及び／又は１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の核酸配列は、一過性の方法で遺伝子改変細胞に導入することができる。

従って、１つ以上の例示的な実施形態では、例えば１つ又は１つ以上のラクトースパーミアーゼ及び／又は異種ＭＦＳ輸送体遺伝子及び／又は１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼをコードする１つ以上の異種核酸配列は、プラスミド性であり、例えば、限定されるものではないが、低、中又は高コピー数のプラスミドである。

本開示では、低／中／高コピー数のプラスミドとは、１細菌細胞当たりのプラスミドのコピー数に関する。本開示の１つ以上の例示的な実施形態では、低コピー数プラスミドは、細胞が平均で１～２０コピーの前記プラスミド、例えば１細胞当たり平均で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０コピーの前記プラスミドから構成されるプラスミドである。従って、本開示の１つ以上の例示的な実施形態では、中コピー数のプラスミドは、細胞が平均で２１～１００コピーの前記プラスミド、例えば１細胞当たり平均で２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００コピーの前記プラスミドから構成されるプラスミドである。更に、本開示の１つ以上の例示的な実施形態では、高コピー数のプラスミドは、細胞が少なくとも平均で１０１コピーの前記プラスミド、例えば１細胞当たり平均で少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００コピーの前記プラスミドから構成されるプラスミドである。

［細胞培養培地］
本明細書に関連して、増殖培地又は培養培地は、微生物、細胞又は小さい植物の増殖を支持するように設計された液体又はゲルである。培地は、適切なエネルギー源を含み、細胞周期を調節する化合物を含み得る。培養培地は、半合成、すなわち複合培地化合物（例えば、酵母抽出物、大豆ペプトン、カザミノ酸など）を含有する培地であり得るか、又はいかなる複合化合物も含まずに化学的に合成された培地であり得る。例示的な好適な培地は、実験例に示される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、最少培地である。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地には、グリセロール、スクロース、グルコース及びフルクトースを含む群から選択される１つ以上のエネルギー源及び炭素源が補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地には、グリセロール、スクロース及びグルコースを含む群から選択される１つ以上のエネルギー源及び炭素源が補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地には、グリセロール、スクロース及び／又はグルコースが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地には、グリセロール及び／又はグルコースが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地には、スクロース及び／又はグルコースが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地には、グリセロール及び／又はスクロースが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地には、スクロースのみが補充される。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地は、唯一の炭素源及びエネルギー源としてスクロースを含有する。

１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地には、本発明のグリコシルトランスフェラーゼの好適なアクセプターとしてラクトースが補充される。

［前記細胞の培養］
本開示は、生合成プロセスでＨＭＯを産生する方法であって、本開示による遺伝子改変細胞を適切な培地中で培養し、１つ以上のＨＭＯを収集することを含む方法に関する。好ましくは、培地はラクトースを含む。

本発明によれば、「培養する（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」（若しくは「培養する（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ）」又は「培養」、「発酵」とも称される）という用語は、当業界で公知の方法に従い、制御されたバイオリアクター内で細菌発現細胞を増殖させることに関する。

前記方法によれば、遺伝子改変細胞、好ましくは細菌、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ＨＭＯ産生のような工業的に収益性の高い形質転換のために最適化された株である。このような最適化は、本開示に記載される工程を含み得る。

１つ以上のＨＭＯを産生するために、本明細書に記載されるようなＨＭＯ産生微生物を当技術分野において公知の手法に従って培養し、産生されたＨＭＯを培養培地及び培養プロセス中に形成されたバイオマスから収集する。その後、当技術分野において公知の手順、例えば国際公開第２０１５１８８８３４号パンフレット、同第２０１７１８２９６５号パンフレット又は同第２０１７１５２９１８号パンフレットに記載されるような手順に従ってＨＭＯを精製し、精製されたＨＭＯは、栄養補助食品、医薬品として又は任意の他の目的、例えば研究のために使用される。

本明細書に開示される遺伝子改変細胞の培養中、このオリゴ糖産生細胞に、増殖、繁殖及びその構造を維持するために解糖を介してエネルギーを供給する、スクロースなどであるが、これらに限定されない炭素源及びエネルギー源が供給される。加えて、細胞によって取り込まれたエネルギー源及び炭素源は、上記に記載されるように、細胞内で生じるグリコシル化プロセスに必要とされる活性化糖ヌクレオチドを合成するための前駆体を供給するか又はそのように作用する。加えて、培地にラクトース溶液が添加される。

実施例１に示されるように、ラクトースは、硫酸マグネシウム及びチアミンを補充した基礎最少培地に、２０％ラクトース溶液（０．１ｍｌ）をボーラス注射することによって供給することができる。代わりに又は加えて、ラクトースを、連続的に、好ましくは同一の供給溶液中でスクロースと共に添加することができるか又は順次添加することができる。

［培養中のラクトースのレベル］
１つ以上の例示的な実施形態では、培養培地中のラクトースのレベルが調節される。

１つ以上の例示的な実施形態では、遺伝子改変細胞の培養中のラクトースのレベルは、低レベルから高レベルに調節される。本明細書に関連して、これにより、以下のラクトースの濃度範囲：高ラクトースプロセスで３０～８０ｇ／Ｌ、低ラクトースプロセスで０～１５ｇ／Ｌ、例えば０．５～１５ｇ／Ｌがもたらされる。

１つ以上の例示的な実施形態では、高レベルのラクトースレベルは、３０～８０ｇ／Ｌに関し、例えば、限定されるものではないが、３０～４０ｇ／Ｌ、３０～５０ｇ／Ｌ、３０～６０ｇ／Ｌ、３０～７０ｇ／Ｌ、４０～５０ｇ／Ｌ、４０～６０ｇ／Ｌ、４０～７０ｇ／Ｌ、４０～８０ｇ／Ｌ、５０～６０ｇ／Ｌ、５０～７０ｇ／Ｌ、５０～８０ｇ／Ｌ、６０～７０ｇ／Ｌ、６０～８０ｇ／Ｌ、３５～５０ｇ／Ｌ、３５～６０ｇ／Ｌ、３５～７０ｇ／Ｌ、３５～７５ｇ／Ｌ、３５～８０ｇ／Ｌ、４５～５５ｇ／Ｌ、４５～７５ｇ／Ｌ、５５～６５ｇ／Ｌ、５５～７５ｇ／Ｌ、５５～８０ｇ／Ｌ、６５～７５ｇ／Ｌ又は６５～８０ｇ／Ｌである。

１つ以上の例示的な実施形態では、低レベルのラクトースレベルは、０～１５ｇ／Ｌに関し、例えば、限定されるものではないが、０～５ｇ／Ｌ、０～７．５ｇ／Ｌ、０～１０ｇ／Ｌ、０～１２．５ｇ／Ｌ、０．５～５ｇ／Ｌ、０．５～７．５ｇ／Ｌ、０．５～１０ｇ／Ｌ、０．５～１２．５、０．５～１５ｇ／Ｌ ｇ／Ｌ、２．５～５ｇ／Ｌ、２．５～７．５ｇ／Ｌ、２．５～１０ｇ／Ｌ、２．５～１２．５ｇ／Ｌ、２．５～１５ｇ／Ｌ、５～７．５ｇ／Ｌ、５～１０ｇ／Ｌ、５～１２．５ｇ／Ｌ、５～１５ｇ／Ｌ、７．５～１０ｇ／Ｌ、７．５～１２．５ｇ／Ｌ、７．５～１５ｇ／Ｌ、１０～１２．５ｇ／Ｌ、１０～１５ｇ／Ｌ又は１２．５～１５ｇ／Ｌである。

ラクトースなどの内在化されたＨＭＯ主鎖前駆体は、細胞によって産生された活性化ヌクレオチドドナーのグリコシル残基が転移した結果としてアクセプターがグリコシル化される、グリコシルトランスフェラーゼによって誘導されるグリコシル化反応に関与する。任意選択により、細胞によって２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼが発現される場合、更なるグリコシル化反応が生じ、標的のオリゴ糖及び／又は副産物の形成がもたらされる。細胞は、細胞内で産生されたオリゴ糖誘導体を分解することになる、あらゆる酵素活性を欠いていることが好ましい。

［収集］
本発明に関連して、「収集する」という用語は、発酵が終了した後に産生されたＨＭＯを回収することに関する。異なる実施形態では、これは、バイオマス（すなわち遺伝子改変細胞）及び培養培地の両方に含まれるＨＭＯを回収すること、すなわちバイオマスから発酵ブロスを分離する前／分離せずにＨＭＯを回収することを含み得る。他の実施形態では、産生されたＨＭＯは、バイオマス及び発酵ブロスから別々に、すなわち培養培地（すなわち発酵ブロス）からバイオマスを分離した後／分離に続いて回収され得る。

培地からの細胞の分離は、当業者によく知られる方法のいずれか、例えば任意の好適な種類の遠心分離又は濾過により実行することができる。培地からの細胞の分離は、発酵ブロスの収集直後に続いて実行するか、又は適切な条件で発酵ブロスを貯蔵した後の段階で実行することができる。残留しているバイオマス（又は全発酵物）からの産生されたＨＭＯの回収には、バイオマス（産生細胞）からの抽出が含まれる。

これは、当技術分野の任意の好適な方法、例えば超音波処理、煮沸、均質化、リゾチームを用いる酵素溶解又は凍結及び破砕によって行うことができる。

ＨＭＯは、発酵物から回収した後、更なる加工処理及び精製に利用可能である。

［産生及び／又は製造の方法又は遺伝子組換え細胞の使用］
本開示は、本明細書に記載される方法又は遺伝子改変細胞の任意の商業的使用にも関する。

従って、１つ以上の例示的な開示では、本発明による方法又は遺伝子改変細胞は、１つ以上のＨＭＯを製造するのに使用される。１つ以上のＨＭＯは、ＬＮＴ－ＩＩ、ｐＬＮｎＨ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、ＬＮＦＰ－Ｉ、ＬＮＦＰ－ＩＩ、ＬＮＦＰ－ＩＩＩ、ＬＮＦＰ－Ｖ、ＬＮＦＰ－ＶＩ、ＬＮＤＦＨ－Ｉ、ＬＮＤＦＨ－ＩＩ、ＬＮＤＦＨ－ＩＩＩ、２’－ＦＬ、ＤＦＬ、３－ＦＬ、ＬＳＴ－ａ、３’－ＳＬ、６’－ＳＬ、ＬＳＴ－ｂ、ＬＳＴ－ｃ、ＦＳＬ、ＦＬＳＴ－ａ、ＤＳＬＮＴ、ＬＮｎＨ及びＬＮＨからなる群から選択することができる。本明細書で好ましい実施形態では、１つ以上のＨＭＯはＬＮＴ－ＩＩコアを有し、例えば、１つ以上のＨＭＯは、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ及びＬＮＦＰ－Ｉからなる群から選択される。

１つ以上の例示的な実施形態では、方法及び／又は遺伝子改変細胞は、２つ以上のＨＭＯを製造するのに使用され、１つ以上のＨＭＯは、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ及びＬＮＦＰ－Ｉからなる群から選択される。

１つ以上の更なる例示的な実施形態では、本開示による方法及び／又は遺伝子改変細胞は、２つ以上のＨＭＯを製造するのに使用され、ＨＭＯは、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴである。

［ＨＭＯの製造］
１つ以上のＨＭＯを産生するために、好適な炭素源及びエネルギー源、例えばグルコース、グリセロール又はスクロース及び好適なアクセプター、例えばラクトース又は任意のＨＭＯの存在下において、本明細書に記載されるような遺伝子改変細胞を当技術分野において公知の手順に従って培養し、産生されたＨＭＯブレンドを培養培地及び培養プロセス中に形成された微生物のバイオマスから収集する。その後、当技術分野において公知の手順、例えば、国際公開第２０１６０９５９２４号パンフレット、同第２０１５１８８８３４号パンフレット、同第２０１７１５２９１８号パンフレット、同第２０１７１８２９６５号パンフレット、米国特許出願公開第２０１９０１１９３１４号明細書に記載されるような手順に従ってＨＭＯを精製し、精製されたＨＭＯは、栄養補助食品、医薬品として又は任意の他の目的、例えば研究のために使用される。

ＨＭＯの製造は通常、大量に培養を実施することによって行われる。本発明の意味における「製造する」及び「製造スケール」という用語は、最小体積が５Ｌの培養ブロスを用いた発酵を規定するものである。通常、「製造スケール」プロセスは、目的の産物を含有する大量の調製物を処理することができ、例えば、治療用化合物又は組成物の場合、臨床試験及び市場供給の需要を満たす量の目的のＨＭＯ産物を量産し得ることによって規定される。大量であることに加えて、製造スケールでの方法は、振盪フラスコによる培養のような単純なラボスケールの方法とは対照的に、撹拌、通気、栄養素供給、プロセスパラメーター（ｐＨ、温度、溶存酸素圧、背圧など）のモニタリング及び制御のための機器を装備したバイオリアクター（発酵槽）の技術的なシステムを使用することを特徴とする。大方の場合、本開示の実施例に記載される振盪フラスコ、卓上バイオリアクター又はディープウェルフォーマットなどのラボスケールの方法における発現系の挙動により、バイオリアクターの複雑な環境におけるこの系の挙動を予測することが可能となる。

［製造された産物］
遺伝子改変細胞又は核酸構築物の使用による「製造された産物」という用語は、１つ以上の産物のＨＭＯであることが意図される１つ以上のＨＭＯを指す。様々な産物が上記に記載されている。

有利には、本明細書で開示される方法は、副産物と産物の比率の低下と、産物の全収量（及び／又は総計でのＨＭＯ）の増大との両方を実現する。このように、産物の形成に対して副産物の形成が少ないことにより、産物の産生量の増加が促進され、産生プロセス及び産物回収プロセスの両方の効率が向上し、優れたＨＭＯの製造手順が提供される。

製造される産物は、１つ以上のＨＭＯから構成される粉末、組成物、懸濁剤又はゲルであり得る。

［全般］
ラクト－Ｎ－トリオース、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ ＩＩ、ＬＮＴ２及びＬＮＴ ２という用語は、互換的に使用される。

全試料を分析することで明らかとなった、（ａ）ｙｂｅｒＣ発現株ＭＰ１及びＭＰ２、並びに（ｂ）ｎｅｃ発現株ＭＰ３及びＭＰ４に対する、ＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ｐＬＮＨ２の相対力価及び総ＨＭＯ含有量に及ぼすｌａｃＹ過剰発現の影響。 （ａ）最終的なＨＭＯブレンド中の％におけるＬＮＴ分画、並びに（ｂ）ｙｂｅｒＣ発現株ＭＰ１及びＭＰ２並びにｎｅｃ発現株ＭＰ３及びＭＰ４によって達成された最終的な光学密度に及ぼすｌａｃＹ過剰発現の影響。 上清及び細胞ペレット試料を分析することで明らかとなった、（ａ）ｙｂｅｒＣ発現株ＭＰ１及びＭＰ２、並びに（ｂ）ｎｅｃ発現株ＭＰ３及びＭＰ４の培養液の上清で検出されたＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ及びｐＬＮＨ２分画に及ぼすｌａｃＹ過剰発現の影響。 全試料を分析することで明らかとなった、ｖａｇ発現株ＭＰ５及びＭＰ６に関するＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮＴ、ｐＬＮｎＨの相対力価及び総ＨＭＯ含有量に及ぼすｌａｃＹ過剰発現の影響。 （ａ）最終的なＨＭＯブレンド中の％におけるＬＮｎＴ分画、並びに（ｂ）ｖａｇ発現株ＭＰ５及びＭＰ６によって達成された最終的な光学密度に及ぼすｌａｃＹ過剰発現の影響。 高ラクトースプロセスを用いた、発酵を実行した際のＬＮＴ産生株ＭＰ７及びＭＰ８の能力。（ａ）ラクトース濃度、及び（ｂ）バイオマス濃度を示す。 高ラクトースプロセスを用いた、発酵を実行した際のＬＮＴ産生株ＭＰ７及びＭＰ８の能力。（ｃ）スクロースにおけるＬＮＴの相対蓄積収率、及び（ｄ）ＬＮＴ－ＩＩとＬＮＴの比率を示す。 高ラクトースプロセスを用いた、発酵を実行した際のＬＮＴ産生株ＭＰ７及びＭＰ８の能力。（ｅ）ｐＬＮＨ２とＬＮＴの比率の経時変化プロファイルを示す。 高ラクトースプロセスを用いた、発酵を実行した際のＬＮｎＴ産生株ＭＰ５及びＭＰ６の能力。（ａ）ラクトース濃度を示す。 高ラクトースプロセスを用いた、発酵を実行した際のＬＮｎＴ産生株ＭＰ５及びＭＰ６の能力。（ｂ）バイオマス濃度、及び（ｃ）スクロースにおけるＬＮｎＴの相対蓄積収率を示す。 高ラクトースプロセスを用いた、発酵を実行した際のＬＮｎＴ産生株ＭＰ５及びＭＰ６の能力。（ｄ）ＬＮＴ－ＩＩとＬＮｎＴの比率、及び（ｅ）ｐＬＮｎＨとＬＮｎＴの比率の経時変化プロファイルを示す。 それぞれのＭＦＳ輸送体株の％としての３’ＳＬ産生は、１００％に設定されている。ＭＦＳ輸送体ｎｅｃを含む株は点線のバー、ｙｂｅｒＣ株は交差ストライプで、ｆｒｅｄ株は水平のストライプで示されている。 対照のｎｅｃ株（ＭＰ１８）の％としての２’ＦＬ産生は、１００％に設定されている。ＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７（ＭＰ１９）又はＰｇｌｐＦ（ＭＰ２０）のいずれかから発現させたｌａｃＹの追加のコピーを組み合わせてＭＦＳ輸送体ｎｅｃを含む株の２’ＦＬの力価を、ｎｅｃ輸送体株と比較して示す。

［配列ＩＤ］
本出願は、参照により本明細書に組み込まれるテキストフォーマット及び電子フォーマットの配列表を含有する。表９は、本出願の配列の概要を示す。

［実施例］
［実施例１ － ラクトースパーミアーゼをコードするｌａｃＹ遺伝子の発現を、異種ＭＦＳ輸送体を発現する細胞で増加させることによるＬＮＴ産生系の改善］
［株ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３及びＭＰ４の遺伝子型］
本開示で構築した株（遺伝子改変細胞）は、Ｆ^－、λ^－、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｃＡ１、ｒｅｌＡ１、ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ－１、ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４の遺伝子型を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１をベースとしたものであった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ－１２ ＤＨ１株に更なる改変を行い、以下を改変したプラットフォーム株「ＭＤＯ」を生成した：ｌａｃＺ：１．５ｋｂｐの欠失、ｌａｃＡ：０．５ｋｂｐの欠失、ｎａｎＫＥＴＡ：３．３ｋｂｐの欠失、ｍｅｌＡ：０．９ｋｂｐの欠失、ｗｃａＪ：０．５ｋｂｐの欠失、ｍｄｏＨ：０．５ｋｂｐの欠失及びｇｍｄ遺伝子の上流へのＰｌａｃプロモーターの挿入。

目的遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムに挿入又は欠失させる方法は、当業者によく知られている。遺伝子カセットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体への挿入は、特異的な選択マーカー遺伝子及びスクリーニング方法を用いる遺伝子ゴージング（例えば、Ｈｅｒｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｌａｔｔｎｅｒ ２００４ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６；２６７３－８１及びＷａｒｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ ２００５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３（４）；ｅ３６を参照されたい）を使用して実行することができる。

プラットフォーム株「ＭＤＯ」（例えば、国際公開第２０２０２５５０５４Ａ１号パンフレット又は同第２０１９１２３３２４Ａ１号パンフレットにも報告されている）をベースとして、下記の表に要約される改変を行い、完全染色体株ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３及びＭＰ４を得た。この株は、四糖のＨＭＯであるＬＮＴを産生することができる。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のグリコシルトランスフェラーゼ酵素ＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ）とピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のＧａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）が、４株全てに存在する。更に、ＭＰ１及びＭＰ２は、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）由来の異種輸送体ＹｂｅｒＣを発現する一方、株ＭＰ３及びＭＰ４は、ローゼンベルギエラ・ネクタレア（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｅｌｌａ ｎｅｃｔａｒｅａ）由来の異種輸送体Ｎｅｃを発現する。更に、株ＭＰ２及びＭＰ４は、ＰｇｌｐＦによって誘発された追加のゲノムコピーからｌａｃＹ遺伝子を過剰発現する一方、株ＭＰ１及びＭＰ３は、ｌａｃＹ遺伝子を過剰発現しない。

本実施例では、すでに異種輸送体ＹｂｅｒＣ又はＮｅｃを発現している株において、ラクトースパーミアーゼをコードするｌａｃＹ遺伝子の過剰発現が、ＬＮＴ産生を増強する遺伝的ツールとしてどのように利用されるかが実証される。本発明により、ブロスの総ＨＭＯ含有量を増加させ、同時にＬＮＴ－ＩＩなどの他のＨＭＯの形成を低減し、最終的なＨＭＯブレンド中のＬＮＴ含有量を増加させるために、ｌａｃＹ遺伝子の過剰発現をどのように有利に利用できるかも実証される。表２に示されるように、２つの株の組、すなわちＭＰ１－ＭＰ２及びＭＰ３－ＭＰ４のそれぞれの株の中での唯一の違いは、天然のｌａｃＹ遺伝子座と異なるゲノム遺伝子座に追加のｌａｃＹ発現カセットが存在することである。

［ディープウェルアッセイ］
本実施例に開示される株を、４日間のプロトコルを用いて９６ディープウェルプレート内でスクリーニングした。最初の２４時間中、前培養物を高密度となるまで増殖させ、続いて遺伝子発現を誘導して産物を形成させることが可能な培地に移した。より具体的には、１日目中、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基礎最少培地（ＢＭＭ）を用いて新鮮な前培養物を調製した。前培養物を１０００ｒｐｍで振盪しながら３４℃で２４時間インキュベートし、次いで本培養を開始するために更に新しいＢＭＭ（ｐＨ７．５）に移した。新しいＢＭＭに、硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（１ｍＬ当たり０．５μｌ）及び２０％ラクトース溶液のボーラス（１μＬ当たり０．１μＬ）を補充した。

更に、特定の加水分解酵素を添加しながら、特定の多糖の２０％ストック溶液を炭素源として供給することで、炭素制限増殖に好適であり、且つ典型的な流加発酵プロセスと同様の速度でグルコースを放出した。本培養を１０００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で７２時間インキュベートした。全ブロスを分析するために、９６ウェルプレートを１００℃で煮沸し、その後、遠心分離し、最終的に上清をＨＰＬＣで分析した。

［結果］
株をディープウェルアッセイで特性評価し、全ブロス、上清及び細胞ペレットから試料を回収した。全ての試料のＨＭＯ含有量を、上記に記載された７２時間のプロトコルに従ってＨＰＬＣで分析した。

各試料中に検出されたＨＭＯの濃度（ｇ／Ｌ）を用いて、試験した株のＨＭＯ含有量における％定量差、すなわち生理学的レベルでｌａｃＹを発現するものと比較したｌａｃＹ発現細胞のＨＭＯ濃度の％差を算出した。更に、ＨＰＬＣによって検出されたＨＭＯ濃度、すなわちＬＮＴ－ＩＩ及びＬＮＴの濃度を考慮することで、最終的なＨＭＯブレンド中のＬＮＴの絶対分画（％）を算出した。実験終了時、すなわち産生期の７２時間後の全ての株に対して、６００ｎｍにおける最終的な光学密度も測定した。最終的に、上清及びペレット試料のＨＰＬＣ測定値を用いて、上清分画とペレット分画の合計（合計、Ｔ）に対する上清（Ｓ）分画の絶対的な糖比率（％）を算出した。

ディープウェル培養において全ての試料を分析することで明らかになったように、ｎｅｃ発現細胞及びｙｂｅｒＣ発現細胞の両方でｌａｃＹ遺伝子を過剰発現させることにより、ＬＮＴ及び総ＨＭＯ力価において若干の増加を達成することができる。具体的には、Ｎｅｃ輸送体を発現し、且つｌａｃＹ遺伝子を過剰発現する株であるＭＰ２では、ｌａｃＹ遺伝子の野生型の発現レベルを有するｎｅｃ発現株であるＭＰ１よりもＬＮＴが約１５％多く産生され、約１０％多い総ＨＭＯ含有量がもたらされた（図１ａ）。同様に、ｙｂｅｒＣ発現株ＭＰ３にｌａｃＹ遺伝子を過剰発現させて、ＭＰ４７４８株を生成することにより、ＬＮＴ力価及び総ＨＭＯ含有量の両方で最大１５％の増加を達成することができる（図１ｂ）。更に、ｎｅｃ発現細胞及びｙｂｅｒＣ発現細胞（株ＭＰ２及びＭＰ４）の両方にｌａｃＹを過剰発現させることによって媒介される細胞内のラクトース濃度の増大により、生理学的レベルでｌａｃＹを発現する細胞（ＭＰ１株及びＭＰ３株）と比較して、副産物（ＬＮＴ－ＩＩ）の生成が著しく低下する結果となる（図１ａ～１ｂ）。

上記で言及された事実は、ｌａｃＹ遺伝子を過剰発現するｎｅｃ発現細胞とｙｂｅｒＣ発現細胞の両方の最終的なＨＭＯブレンド中のＬＮＴ含有量（％）に直接反映されている。具体的には、ｌａｃＹ遺伝子とｎｅｃ遺伝子（株ＭＰ３）又はｌａｃＹ遺伝子とｙｂｅｒＣ遺伝子（株ＭＰ２）を過剰発現する細胞によって生成される最終的なＨＭＯブレンドのＬＮＴ分画は、ｎｅｃ遺伝子（株ＭＰ４）又はｙｂｅｒＣ遺伝子（株ＭＰ１）を単独で発現する細胞よりも約１０％高い（図２ａ）。興味深いことに、異種ＭＦＳ発現株のバイオマス形成に及ぼすｌａｃＹ過剰発現の効果は、発現される異種ＭＦＳに応じて変動し得る。詳細には、ｌａｃＹ遺伝子とｎｅｃ遺伝子の両方を過剰発現する株ＭＰ４は、ｌａｃＹ遺伝子を過剰発現しない類似株であるＭＰ３と比較して、培養して７２時間後に極めて低い光学密度値を達成している（図２ｂ）。ｌａｃＹ遺伝子とｙｂｅｒＣ遺伝子との両方を過剰発現する株ＭＰ２の場合、その逆が当てはまり、すなわち、ＭＰ２は、ｙｂｅｒＣ遺伝子のみを発現する株ＭＰ１よりも多くバイオマスを形成する（図２ｂ）。

結論として、輸送体を発現するＬＮＴ産生株でｌａｃＹ遺伝子が過剰発現することにより、これらの株における最終的なＬＮＴ及び総ＨＭＯ力価が、生理学的レベルでｌａｃＹ遺伝子が発現している場合（株ＭＰ１及びＭＰ３）よりも、過剰発現している場合（株ＭＰ２及びＭＰ４）ではるかに高くなるように、細胞膜を横断する糖輸送動態が変化するものと思われる。

ブロスの上清分画及びペレット分画の分析から明らかとなるように、上清中のＬＮＴ及びＬＮＴ－ＩＩの分画％は、ｙｂｅｒＣ発現細胞のｌａｃＹ遺伝子の過剰発現による影響を受けない（図３ａ）。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのＰｌａｃプロモーターから単独でｌａｃＹを発現させた場合（株ＭＰ１）よりも、ｙｂｅｒＣ発現細胞がｌａｃＹを過剰発現させた場合（株ＭＰ２）において、約２５％少ないｐＬＮＨ２が培養培地中で検出されている（図３ａ）。

ｙｂｅｒＣ発現細胞に関して、上清中に検出されたＬＮＴ及びＬＮＴ－ＩＩの分画は、ｎｅｃ発現細胞におけるｌａｃＹ遺伝子の過剰発現による影響を受けない（図３ｂ）。しかしながら、ｙｂｅｒＣ発現細胞（株ＭＰ３）とは逆に、ｎｅｃ発現細胞（株ＭＰ４）におけるｌａｃＹ遺伝子の過剰発現により、培養培地中のｐＬＮＨ２が高くなる結果となる（図３ｂ）。

［実施例２ － ラクトースパーミアーゼをコードするｌａｃＹ遺伝子の発現を、異種ＭＦＳ輸送体を発現する細胞で増加させることによるＬＮｎＴ産生系の改善］
［株ＭＰ５及びＭＰ６の遺伝子型］
プラットフォーム株「ＭＤＯ」（例えば、実施例１を参照されたく、国際公開第２０２０２５５０５４Ａ１号パンフレット又は同第２０１９１２３３２４Ａ１号パンフレットにも報告されている）をベースとして、下記の表に要約される改変を行い、完全染色体株ＭＰ５及びＭＰ６を得た。この株は、四糖のＨＭＯであるＬＮｎＴを産生することができる。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のグリコシルトランスフェラーゼ酵素ＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ）とピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のＧａｌＴ（β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ）とは、いずれの株にも存在する。更に、ＭＰ５及びＭＰ６は、パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）由来の異種輸送体Ｖａｇを発現し、ＭＰ５は、そうではないが、株ＭＰ６は、ＰｇｌｐＦプロモーターの制御下で追加のゲノムコピーからｌａｃＹ遺伝子を過剰発現する。

本実施例では、すでに異種輸送体Ｖａｇを発現している株において、ラクトースパーミアーゼをコードするｌａｃＹ遺伝子の過剰発現が、ＬＮｎＴ産生を増強する遺伝的ツールとしてどのように利用されるかが実証される。本発明により、ブロスのｐＬＮｎＨ及び総ＨＭＯ含有量を増加させるために、ｌａｃＹ遺伝子の過剰発現をどのように有利に利用できるかも実証される。下記の表３に示されるように、ＭＰ５及びＭＰ６の２つのｖａｇ発現株間の唯一の違いは、天然のｌａｃＹ遺伝子座と異なるゲノム遺伝子座に追加のｌａｃＹ発現カセットが存在することである。

［ディープウェルアッセイ］
本実施例に開示される株を、４日間のプロトコルを用いて９６ディープウェルプレート内でスクリーニングした。最初の２４時間中、前培養物を高密度となるまで増殖させ、続いて遺伝子発現を誘導して産物を形成させることが可能な培地に移した。より具体的には、１日目中、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基礎最少培地（ＢＭＭ）を用いて新鮮な前培養物を調製した。前培養物を１０００ｒｐｍで振盪しながら３４℃で２４時間インキュベートし、次いで本培養を開始するために更に新しいＢＭＭ（ｐＨ７．５）に移した。新しいＢＭＭに、硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（１ｍＬ当たり０．５μｌ）及び２０％ラクトース溶液のボーラス（１μＬ当たり０．１μＬ）を補充した。

更に、特定の加水分解酵素を添加しながら、特定の多糖の２０％ストック溶液を炭素源として供給することで、炭素制限増殖に好適であり、且つ典型的な流加発酵プロセスと同様の速度でグルコースを放出した。本培養を１０００ｒｐｍで振盪しながら２８℃で７２時間インキュベートした。全ブロスを分析するために、９６ウェルプレートを１００℃で煮沸し、その後、遠心分離し、最終的に上清をＨＰＬＣで分析した。

［結果］
ディープウェルアッセイで株を特性評価し、全ブロスから試料を回収し、上記に記載された７２時間のプロトコルに従ってＨＭＯ含有量をＨＰＬＣで分析した。各試料中で検出されたＨＭＯの濃度（ｇ／Ｌ）を用いて、試験した株のＨＭＯ含有量における％定量差、すなわち生理学的レベルでｌａｃＹを発現するもの（株ＭＰ５）と比較したｌａｃＹ発現細胞（株ＭＰ６）のＨＭＯ濃度の％差を算出した。更に、ＨＰＬＣによって検出されたＨＭＯ濃度、すなわちＬＮＴ－ＩＩ、ＬＮｎＴ及びｐＬＮｎＨの濃度を考慮することで、最終的なＨＭＯブレンド中のＬＮｎＴの絶対分画（％）を算出した。実験終了時、すなわち産生期の７２時間後の全ての株に対して、６００ｎｍにおける最終的な光学密度も測定した。

ディープウェル培養物中の全ての試料の分析によって明らかになったように、ｖａｇ発現細胞でｌａｃＹ遺伝子を過剰発現させることにより、ＬＮｎＴ、ｐＬＮｎＨ及び総ＨＭＯ力価において顕著な増加を達成することができる。具体的には、Ｖａｇ輸送体を発現し、且つｌａｃＹ遺伝子を過剰発現する株であるＭＰ６では、野生型レベルでｌａｃＹ遺伝子を発現するｖａｇ発現株であるＭＰ５よりもＬＮｎＴが約２０％多く、ｐＬＮｎＨが２０％多く産生され、２０％多い総ＨＭＯ含有量となった（図４）。２つの株間のＬＮＴ－ＩＩ含有量では、有意差を認めることができなかった（図４）。

上記で言及された事実は、ｌａｃＹ遺伝子を過剰発現するｖａｇ発現細胞の最終的なＨＭＯブレンド中のＬＮｎＴ含有量（％）に直接反映されている。具体的には、ｌａｃＹ遺伝子とｖａｇ遺伝子を過剰発現する株ＭＰ６によって生成される最終的なＨＭＯブレンドのＬＮｎＴ分画は、ｖａｇ遺伝子を単独で発現する株ＭＰ５よりも約１０％高い（図５ａ）。実施例１に示されるｌａｃＹの過剰発現がＬＮＴ産生株のバイオマス形成に及ぼす顕著な影響とは逆に、ｌａｃＹの過剰発現が異種ＭＦＳ発現ＬＮｎＴ株ＭＰ６のバイオマス形成に及ぼす影響はごくわずかである。詳細には、ｌａｃＹ遺伝子とｖａｇ遺伝子の両方を過剰発現する細胞（株ＭＰ６）の最終的な光学密度は、ｖａｇ遺伝子を単独で発現する細胞（株ＭＰ５）の光学密度と極めて類似したものとなっている（図５ｂ）。

［実施例３ － ｌａｃＹ遺伝子を過剰発現し、異種糖排出輸送体をコードする遺伝子を発現するＬＮＴ株及びＬＮｎＴ株の発酵性能］
［株ＭＰ７、ＭＰ８、ＭＰ５及びＭＰ６の遺伝子型］
プラットフォーム株「ＭＤＯ」（例えば、実施例１を参照されたく、国際公開第２０２０２５５０５４Ａ１号パンフレット又は同第２０１９１２３３２４Ａ１号パンフレットにも報告されている）をベースとして、表４に要約される改変を行い、完全染色体株ＭＰ７、ＭＰ８、ＭＰ５及びＭＰ６を得た。この株は、四糖のＨＭＯであるＬＮＴ（ＭＰ７及びＭＰ８）又はＬＮｎＴ（ＭＰ５及びＭＰ６）を産生することができる。４株は、全てスクロースで増殖させることができる。髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のグリコシルトランスフェラーゼ酵素ＬｇｔＡ（β－１，３－Ｎ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ）は４株全てに存在する一方、株ＭＰ７－ＭＰ８及びＭＰ５－ＭＰ６のそれぞれにピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のＧａｌＴＫ（β－１，３－ガラクトシルトランスフェラーゼ）又はＧａｌＴ（β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ）が導入されている。更に、株ＭＰ７及びＭＰ８は、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）由来の異種輸送体ＹｂｅｒＣを発現する一方、株ＭＰ５及びＭＰ６は、パントエア・バガンス（Ｐａｎｔｏｅａ ｖａｇａｎｓ）由来の異種輸送体Ｖａｇを発現する。更に、株ＭＰ８及びＭＰ６は、ＰｇｌｐＦによって誘発された追加のゲノムコピーからｌａｃＹ遺伝子を過剰発現する一方、株ＭＰ７及びＭＰ５は、ｌａｃＹ遺伝子を過剰発現しない。

本実施例では、すでに異種輸送体ＹｂｅｒＣ又はＶａｇをそれぞれ発現している株を使用して、ラクトースパーミアーゼをコードするｌａｃＹ遺伝子の過剰発現が、流加発酵におけるＬＮＴ又はＬＮｎＴ産生を増強する株改変ツールとしてどのように利用されるかが実証される。本発明により、発酵ブロス中でより高い総ＨＭＯ含有量を得ると同時に、ＬＮＴ及びＬＮｎＴ、例えば、ＬＮＴ－ＩＩ、ｐＬＮｎＨ及びｐＬＮＨ２以外のＨＭＯの形成を調節するために、ｌａｃＹ遺伝子の過剰発現をどのように有利に利用できるかも実証される。表４に示されるように、ＭＰ７－ＭＰ８及びＭＰ５－ＭＰ６の２組の株間の唯一の違いは、天然のｌａｃＹ遺伝子座と異なるゲノム遺伝子座に追加のｌａｃＹ発現カセットが存在することである。

［発酵プロセス］
適切な濃度の炭素源（スクロース又はグルコース）、ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、微量金属溶液、クエン酸、消泡剤及びチアミンからなる合成ミネラル培養培地１００ｍＬから出発して、２００ｍＬのＤａｓＢｏｘバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で発酵を行った。微量金属溶液（ＴＭＳ）は、硫酸塩としてのＭｎ、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎとクエン酸とを含有するものであった。合成最少培地中で増殖させた２％（ｖ／ｖ）の前培養物を播種することで発酵を開始した。バッチ培地中に存在する炭素源を欠乏させた後、スクロース（又はグルコース）、ＮＨ_４ＳＯ_４及びＴＭＳを含有する滅菌供給溶液を、所定の線形プロファイルを用いて炭素制限方式で連続的に供給した。

ラクトースの添加は、「高」ラクトースプロセス（ＬＮＴの発酵では「ＬＮＴ９８」及び「ＬＮＴ１０８」、ＬＮｎＴの発酵では「Ｌ２３２」）によって行い、ラクトース一水和物溶液を２回のボーラス添加によって添加し、１回目のボーラス添加は供給を開始して約１０時間後、２回目のボーラス添加は約７０時間のＥＦＴの時点であった。ＬＮＴの発酵では、プロセス「ＬＮＴ９８」及び「ＬＮＴ１０８」は、２回目のラクトースパルスがＬＮＴ９８の場合よりもＬＮＴ１０８の場合に約２０時間早く行われたという事実のみが異なる。このようにして、図６ａ及び７ａに示されるように、少なくとも９０時間のＥＦＴまで、ラクトースがＨＭＯを形成する制限因子とならないことが確実となった。プロセスＬ２３２は、ＬＮＴ９８と同じである。

１４％ＮＨ４ＯＨ溶液で滴定することにより、発酵全体を通してｐＨを６．８に制御した。通気は空気を用いて１ｖｖｍに制御し、溶存酸素は撹拌速度によって制御し、空気飽和の２３％以上に維持した。スクロースの供給を開始してから１５分後、発酵温度設定値を３３℃から２８℃に下げた。この温度降下は、勾配を用いずに行った。発酵の全持続時間は、４～５日であった。

発酵全体を通して試料を採取し、ＬＮＴ又はＬＮｎＴ、ＬＮＴ－ＩＩ、ラクトース、ｐＬＮｎＨ又はｐＬＮＨ２及び他の微量な副産物の濃度を、ＨＰＬＣを使用して測定した。全ブロス試料を脱イオン水で３倍に希釈し、２０分間煮沸した。これに続いて、１７０００ｇで３分間遠心分離を行い、その後、得られた上清をＨＰＬＣで分析した。スクロースの産物収率並びに主産物（それぞれＬＮｎＴ又はＬＮＴ）に対するＬＮＴ－ＩＩ及び六糖（ｐＬＮｎＨ又はｐＬＮＨ２）の比率を正確に算出するために、上記の測定値を炭素源利用に関するデータと共に使用した。

［結果］
少なくとも４日間、安定的な方法で全４回の発酵を実行した（図６及び７）。

図６ｃに示されるように、ｌａｃＹ遺伝子の追加のコピーを有するＬＮＴ株（株ＭＰ８）の性能は、生理学的レベルでｌａｃＹを発現する株（株ＭＰ７）で観察されたものよりも優れており、前者は、スクロースにおいてＬＮＴの収量が約５０％高いことを示す（図６ｃ）一方、バイオマスの形成は、同等レベルで維持されている（図６Ｂ）。更に、ＬＮＴに対する副産物の比率の計算から明らかになったように、株ＭＰ８及びＭＰ７は、同様のＬＮＴ－ＩＩレベルを示す（図６ｄ）一方、ＭＰ８株でｌａｃＹ遺伝子を過剰発現させると、ｐＬＮＨ２の形成が増加する結果となる（図６ｅ）。

図７ｃに示されるように、ｌａｃＹ遺伝子の追加のコピーを有するＬＮｎＴ株（株ＭＰ６）の性能は、生理学的レベルでｌａｃＹを発現する株（株ＭＰ５）で観察されたものよりも優れており、前者はスクロースにおいてＬＮｎＴの収量が約２５％高いことを示す（図７ｃ）一方、バイオマスの形成は、同等レベルで維持されている（図７ｂ）。ＬＮＴ株について上記で言及したように、株ＭＰ８及びＭＰ７は、同様のＬＮＴ－ＩＩレベルを示し（図７ｄ）、ＭＰ６株でｌａｃＹ遺伝子を過剰発現させると、株ＭＰ５よりもｐＬＮｎＨの形成が多くなる結果となる（図７ｅ）。

［実施例４ － ＭＦＳ輸送体と組み合わせたｌａｃＹの発現増加は、３’ＳＬ発現を改善しない］
実施例１～３では、特定のＭＦＳ輸送体と組み合わせてＬａｃＹを過剰発現させると、ＬＮＴ及びＬＮｎＴの産生にプラスの効果があることが実証されている。

以下の実施例では、ＭＦＳ輸送体であるｎｅｃ、ｙｂｅｒＣ又はｆｒｅｄ（ゲノム的に組み込まれた１コピー）を、ＬａｃＹを過剰発現しない（ＭＰ９、ＭＰ１２及びＭＰ１５）又は染色体由来（ＭＰ１０、ＭＰ１３若しくはＭＰ１６）若しくは中コピー数プラスミド（ｐＳＵ２７１９－ｌａｃＹ－ｃｈｒ）由来（ＭＰ１１、ＭＰ１４及びＭＰ１７）の追加のコピーとしてＬａｃＹを過剰発現させた３’－ＳＬ産生株で試験した。

全ての株は、プラットフォーム株「ＭＤＯ」（例えば、実施例１を参照されたく、国際公開第２０２０２５５０５４Ａ１号パンフレット又は同第２０１９１２３３２４Ａ１号パンフレットにも報告されている）をベースとし、ＭＯＤ株のゲノム中の異なる遺伝子座に単一コピーで組み込まれた、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のα－２，３－シアリルトランスフェラーゼの切断型バージョン（２９ ａａ ｎ末端欠失）であるｎｓｔ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４４５４１．１）、異種ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡｃシンセターゼであるｎｅｕＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ９１７２８．１）、異種シアル酸シンターゼであるｎｅｕＢ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ９１７２６．１）及び異種ＧｌｃＮＡｃ－６－リン酸２エピメラーゼであるｎｅｕＣ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＫ９１７２７．１）を含有するものであった。試験株の遺伝子型を表５に示す。

［ディープウェルアッセイ］
本実施例に開示される株を３’ＳＬの産生について９６ディープウェルプレートアッセイでスクリーニングした。１株当たり３つの複写物を試験した。より具体的には、１日目中、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基礎最少培地（ＢＭＭ）を用いて新鮮な前培養物を調製した。前培養物を１０００ｒｐｍにおいて３４℃で２４時間インキュベートし、次いで本培養を開始するために新しいＢＭＭ（ｐＨ７．５）に移した。新しいＢＭＭに、硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（０．５μｌ／ｍＬ）及び２０％ラクトース溶液のボーラス（０．１μＬ／μＬ）を補充した。

遺伝子発現及び３’ＳＬの産生が可能な炭素制限増殖に好適な速度でグルコースが放出されるように、本培養物に対して、スクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ０．１ｇ／Ｌ）及び５０ｍｇ／ｍｌのＩＰＴＧを添加しながら、炭素源として５０％スクロース溶液（５２．５μｌ／ｍｌ）を細胞に供給した。プラスミドを維持するのに必要である場合、ウェルに抗生物質（クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。本培養物を１０００ｒｐｍにおいて３４℃で９６時間インキュベートした。全ブロスを分析するために、９６ウェルプレートを１００℃で煮沸し、その後、遠心分離し、最終的に上清をＨＰＬＣで分析した。

［結果］
本実施例の株は、３’ＳＬのみを産生する。ディープウェルアッセイの結果を表８に示す。ＭＦＳ輸送体を発現する株の３’ＳＬ産生量を１００に設定し、染色体上の追加の１コピーのＬａｃＹ又は多コピープラスミドから発現されたＬａｃＹのいずれかを含む対応する株をそれぞれのＭＦＳ輸送体株に正規化した。

図８から、３’ＳＬ産生株では、ＬａｃＹを過剰発現させても３’ＳＬの総産生量が増加しないことがわかる。実際には、中コピー数プラスミドからｌａｃＹを発現する株（それぞれＭＰ１１、ＭＰ１４及びＭＰ１７）で、ＬａｃＹの追加の単一コピーを含む株（それぞれＭＰ１０、ＭＰ１３及びＭＰ１６）と比較して３’ＳＬのレベルが更に減少したことから示されるように、ｌａｃＹの過剰発現が増大すると産生量が減少するものと思われる。

［実施例５ － ＭＦＳ輸送体と組み合わせたｌａｃＹの発現増加は、２’ＦＬ発現を改善しない］
実施例１～３では、特定のＭＦＳ輸送体と組み合わせてＬａｃＹを過剰発現させると、ＬＮＴ及びＬＮｎＴの産生にプラスの効果があることが実証されている。

以下の実施例では、ＭＦＳ輸送体であるＮｅｃ（ゲノム的に組み込まれた１コピー）を、ＬａｃＹを過剰発現した（ＭＰ１９及びＭＰ２０）又は過剰発現しない（ＭＰ１８）２’－ＦＬ産生株で試験した。ｌａｃｙを過剰発現する株において、追加のゲノムコピーを弱いプロモーター（ＭＰ１９）又は強力なプロモーター（ＭＰ２０）の制御下に置き、ｌａｃｙの発現レベルが２’ＦＬの産生に影響するかどうかを評価した。

全ての株は、プラットフォーム株「ＭＤＯ」（例えば、実施例１をされたく、国際公開第２０２０２５５０５４Ａ１号パンフレット又は同第２０１９１２３３２４Ａ１号パンフレットにも報告されている）をベースとし、ＭＤＯ株のゲノム中の２つの異なる遺伝子座に単一コピーで組み込まれた、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のα－１，２－フコシルトランスフェラーゼであるｆｕｔＣ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＰ００３９０４）を含むものであった。試験株の遺伝子型を表６に示す。

［ディープウェルアッセイ］
本実施例に開示される株を２’ＦＬの産生について９６ディープウェルプレートアッセイでスクリーニングした。１株当たり３つの複写物を試験した。より具体的には、１日目中、硫酸マグネシウム、チアミン及びグルコースを補充した基礎最少培地（ＢＭＭ）を用いて新鮮な前培養物を調製した。前培養物を７００ｒｐｍにおいて３４℃で２４時間インキュベートし、次いで本培養を開始するために新しいＢＭＭ（ｐＨ７．５）に移した。新しいＢＭＭに、硫酸マグネシウム、チアミン、２０％グルコース溶液のボーラス（０．５μｌ／ｍＬ）及び１０％ラクトース溶液のボーラス（０．１μＬ／μＬ）を補充した。

遺伝子発現及び２’ＦＬの産生が可能な炭素制限増殖に好適な速度でグルコースが放出されるように、本培養物に対して、スクロースヒドロラーゼ（インベルターゼ０．１ｇ／Ｌ）を添加しながら、５０％（５２．５μｌ／ｍｌ）を細胞に供給した。本培養物を７００ｒｐｍにおいて２８℃で４８時間インキュベートした。全ブロスを分析するために、９６ウェルプレートを１００℃で煮沸し、その後、遠心分離し、最終的に上清をＨＰＬＣで分析した。

［結果］
本実施例の株は、２’ＦＬと、極めて低レベルのＤＦＬとを産生する。ディープウェルアッセイの結果を表９に示す。ＭＦＳ輸送体ｎｅｃを発現する株の２’ＦＬ産生量を１００に設定し、ＰｇｌｐＦプロモーター又はＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７プロモーターのいずれかから発現した染色体上にＬａｃＹの追加の１コピーを含む対応する株をそれぞれのｎｅｃ輸送体株に正規化した。

図９から、２’ＦＬ産生株では、ＬａｃＹを過剰発現させても２’ＦＬの総産生量が増加しないことがわかる。実際に、弱いプロモーター（株ＭＰ１９のＰｇｌｐＦ＿ＳＤ７）及び強力なプロモーター（株ＭＰ２０のＰｇｌｐＦ）からｌａｃＹを発現する株によって示されるように、ｌａｃＹの過剰発現の増大に伴って産生量が減少するように思われる。

Claims (19)

1. １つ以上のＨＭＯを産生する方法であって、
   ａ）遺伝子改変細胞であって、
   ｉ）１つ以上のラクトースパーミアーゼを過剰発現し、
   ｉｉ）異種ＭＦＳ輸送体タンパク質であって、
   （Ｉ）Ｖａｇ及び配列番号６２のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
   （ＩＩ）Ｎｅｃ及び配列番号６６のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
   （ＩＩＩ）Ｆｒｅｄ及び配列番号６３のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
   （ＩＶ）Ｍａｒｃ及び配列番号６４のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
   （Ｖ）ＹｂｅｒＣ及び配列番号６７のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
   （ＶＩ）Ｂａｄ及び配列番号６５のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体
   からなる群から選択される異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現し、及び
   ｉｉｉ）β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ、β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ及びβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼからなる群から選択される１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現する、遺伝子改変細胞を提供することと、
   ｂ）前記細胞を、ラクトースが添加された適切な培地で培養することと、
   ｃ）前記１つ以上のＨＭＯを収集することと
   を含み、前記１つ以上のＨＭＯは、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴである、方法。
2. 前記遺伝子改変細胞は、スクロース利用系を発現する、請求項１に記載の１つ以上のＨＭＯを産生する方法。
3. 前記スクロース利用系は、配列番号８６［ＳａｃＣ＿Ａｇａｌ、グリコシドヒドロラーゼファミリー３２タンパク質、ＷＰ＿１０３８５３２１０．１９、配列番号８７［Ｂｆｆ、β－フルクトフラノシダーゼタンパク質、ＢＡＤ１８１２１．１］又は配列番号１１若しくは１２のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、配列番号１１及び１２のいずれか１つの機能的相同体から選択される、スクロースをグルコースとフルクトースとに加水分解することができるポリペプチドである、請求項２に記載の１つ以上のＨＭＯを産生する方法。
4. 前記１つ以上のラクトースパーミアーゼのアミノ酸配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６［ＬａｃＹ変異体］及び前記配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６［ＬａｃＹ変異体］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であり、且つ機能的相同体であるアミノ酸配列からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記１つ以上のラクトースパーミアーゼのアミノ酸配列は、配列番号１と同一であるか又は少なくとも７０％同一である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ＭＦＳ輸送体は、Ｎｅｃ、Ｖａｇ及び／又はＹｂｅｒＣである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記β－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ又はβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼは、それぞれＣｖＢ３ｇａｌＴ及びＧａｌＴＫ又はＧａｌＴ並びに配列番号１７［ＣｖＢ３ｇａｌＴ］、１８［ＧａｌＴＫ］及び１９［ＧａｌＴ］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、ＣｖＢ３ｇａｌＴ、ＧａｌＴＫ又はＧａｌＴのいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼは、ＬｇｔＡ、ＰｍｎａｇＴ、ＨＤ０４６６及び配列番号２０［ＬｇｔＡ］、２１［ＰｍｎａｇＴ］又は２２［ＨＤ０４６６］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、ＬｇｔＡ、ＰｍｎａｇＴ又はＨＤ０４６６のいずれか１つの機能的相同体からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記遺伝子改変細胞は、活性化糖ヌクレオチドの生合成に関与する１つ以上のポリペプチドを発現する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 活性化糖ヌクレオチドの生合成に関与する前記１つ以上のポリペプチドは、Ｐｇｍ［配列番号４３又は４４］、ＧａｌＵ［配列番号４５又は４６］、ＧａｌＥ［配列番号４７又は４８］、ＧｌｍＭ［配列番号４９又は５０］、ＧｌｍＵ［配列番号５１又は５２］、ＧｌｍＳ［配列番号３３又は５４］及び配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３又は５４のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記遺伝子改変細胞は、請求項４又は５に記載の１つ以上のラクトースパーミアーゼをコードする２つ以上の核酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. ラクトースパーミアーゼ、ＭＦＳ輸送体タンパク質、グリコシルトランスフェラーゼ、スクロース利用系及び活性化糖ヌクレオチドの生合成に関与するポリペプチドのいずれか１つ以上は、前記遺伝子改変宿主細胞内の１つ以上の核酸配列によってコードされ、前記１つ以上の核酸配列は、１つ以上の調節エレメントによって調節される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記１つ以上の調節エレメントは、表８で特定されるような核酸配列を有する１つ以上のプロモーター配列、好ましくは配列番号７０（ＰｇｌｐＦ）、若しくは配列番号６８（Ｐｌａｃ）、若しくは配列番号６９（ＰｇａｔＹ＿７０ＵＴＲ）、配列番号８２（ＰｍｇｌＢ＿ＵＴＲ７０）、若しくは配列番号１００（ＰｇｌｐＡ＿７０ＵＴＲ）、若しくは配列番号１０１（ＰｇｌｐＴ＿７０ＵＴＲ）、若しくはｃｐ６（配列番号８４）、若しくはＰｏｓｍｙ（配列番号８５）又はこれらの変異体からなる群から選択されるプロモーター配列を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記核酸配列は、前記遺伝子改変細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１１又は１２に記載の方法。
15. 前記遺伝子改変細胞は、細菌細胞又は酵母細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記遺伝子改変細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴを産生する遺伝子改変細胞であって、
    ａ）１つ以上のラクトースパーミアーゼ遺伝子を過剰発現し、
    ｂ）異種ＭＦＳ輸送体タンパク質であって、
    ｉ）Ｖａｇ及び配列番号６２のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
    ｉｉ）Ｎｅｃ及び配列番号６６のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
    ｉｉｉ）Ｆｒｅｄ及び配列番号６３のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
    ｉｖ）Ｍａｒｃ及び配列番号６４のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
    ｖ）ＹｂｅｒＣ及び配列番号６７のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体、
    ｖｉ）Ｂａｄ及び配列番号６５のアミノ酸配列と８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体
    からなる群から選択される異種ＭＦＳ輸送体タンパク質を発現し、及び
    ｃ）β－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ及びβ－１，３－Ｇａｌ－トランスフェラーゼ又はβ－１，３－ＧｌｃＮＡｃ－トランスフェラーゼ及びβ－１，４－ｇａｌ－トランスフェラーゼである２つ以上のグリコシルトランスフェラーゼを発現し、並びに任意選択により、
    ｄ）スクロース利用系を発現し、及び／又は
    ｅ）活性化糖の生合成に関与する１つ以上のポリペプチドを発現する、遺伝子改変細胞。
18. ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６［ＬａｃＹ変異体］及び配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６［ＬａｃＹ変異体］のいずれか１つと少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される１つ以上のラクトースパーミアーゼと、
    ｉｉ）ＣｖＢ３ｇａｌＴ、ＧａｌＴＫ、ＧａｌＴ、ＬｇｔＡ、ＰｍｎａｇＴ、ＨＤ０４６６及び配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するその機能的相同体からなる群から選択される１つ以上のグリコシルトランスフェラーゼと、任意選択により、
    ｉｉｉ）Ｐｇｍ［配列番号４３又は４４］、ＧａｌＵ［配列番号４５又は４６］、ＧａｌＥ［配列番号４７又は４８］、ＧｌｍＭ［配列番号４９又は５０］、ＧｌｍＵ［配列番号５１又は５２］及びＧｌｍＳ［配列番号３３又は５４］並びに配列番号４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３及び５４と少なくとも７０％の同一性を有するその機能的相同体からなる群から選択される、活性化糖の生合成に関与する１つ以上のポリペプチドと
    を含む、請求項１７に記載の遺伝子改変細胞。
19. １つ以上のＨＭＯを産生及び／又は製造するための、請求項１７又は１８に記載の細胞の使用であって、前記１つ以上のＨＭＯは、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴである、使用。

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