WO2001057196A1 - Adpglucosa pirofosfatasa vegetal, procedimiento de obtencion, uso en la fabricacion de dispositivos de ensayo y en la obtencion de plantas transgenicas - Google Patents

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Edurne Baroja Fernandez
Aitor Zandueta Criado
Milagros Rodriguez Lopez
Francisco José MUÑOZ PEREZ
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Universidad Publica De Navarra
Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd.
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Definitions

  • ADPglucose plant pyrophosphatase method of obtaining, use in the manufacture of test devices and in obtaining transgenic plants.
  • the invention relates to the sector of obtaining, purifying and characterizing isoforms of the enzyme ADPglucose pyrophosphatase (AGPPase), also called ADPglucose phosphodiesterase, and to the applications of this enzyme in the determination of sugar-nucleoside levels, and of sulfonucleotides and the obtaining of transgenic plants in which the AGPPase gene is overexpressed giving rise to plants with reduced starch content and high salinity resistance.
  • ADPglucose pyrophosphatase also called ADPglucose phosphodiesterase
  • Starch is the main form of carbohydrate storage in vegetables. It accumulates in large quantities in organs such as seeds (wheat, barley, corn, pea, etc.) and tubers (potato and sweet potato among others), and is a fundamental constituent of the human being's diet.
  • starch is a polymer frequently used in the paper, cosmetic, pharmaceutical and food industries, and is also used as a fundamental component for the manufacture of biodegradable plastics and low environmental impact paints.
  • Another polysaccharide, cellulose is a fundamental component of the cell wall of plants, which constitutes the fundamental raw material in industrial processes as important as that of paper production. Consequently, the study of the processes involved in the synthesis of these glucose polymers is a priority issue in various fields of industrial production.
  • UDPglucose is the fundamental precursor of cellulose biosynthesis and cell wall polysaccharides.
  • ADPglucose is the universal precursor of the biosynthesis of starch in reserve tissues of the plant. Its concentration in the cell is decisive for the quantity and quality of the starch produced by the plant. Reflections on the factors that govern the endogenous levels of ADPG in the plant cell have revolved primarily around their synthesizing enzymes, such as ADPG pyrophospholase (AGPase) and Sucrose smtase (Preiss,
  • YSA1H a human adenosme 5 "-diphosphosugar pyrophosphatase possessmg a MutT motif". Biochem J. 331-337).
  • this type of activity has been poorly described in the literature (Rodr ⁇ guez-López, M., Baro] a-Fernández, E., Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) "Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis ". Proc. Nati. Acad.
  • HvGLPl HvGLPl
  • starch constitutes a viscosifying and gelling agent of first necessity.
  • the biosynthesis of starch in the plant cell from ADPG takes place in the subcellular compartment called plastid. Both synthesis and degradation of ADPG occur in this compartment and therefore the control of starch levels can take place by controlling the regulatory processes of ADPG levels.
  • the different applications of starch produced in a plant are based on the balance of amylose and amylopectin, which determines the structure of the starch granule, as well as its viscosity in aqueous suspensions. Such a proportion of amylose and amylopectin depends on the concentration of ADPG in the plant cell. No method to regulate the characteristics of starch produced in a plant by controlling the degradation of ADPG, which the enzyme described in the present invention, can provide, is known to date.
  • starch In addition to acting as a reserve substance for the plant, starch accumulates in the plant cell in circumstances in which the plant is not subjected to water stress conditions. Under conditions in which the plant is subjected to high temperatures or high concentrations of salts in the medium, the plant stops accumulating starch, producing large amounts of soluble sugars that accumulate in the vacuole (Keeling, PL, Bacon, PJ, Holt, DC (1993) "Elevated temperature reduces starch deposition in wheat endosperm by reducing the activity of soluble starch synthase" Plant 191, 342-348; Geigenberger, P., Geiger, M., Stitt, M.
  • the Arabidopsis HAL2-like gene family includes a novel sodium-sensitive phosphatase "Plant J. 17, 373-383). From these observations, it is possible that enzymatic reactions responsible for the hydrolysis of ADPG, APS and
  • PAPS are responsible for adaptive processes of the plant to the conditions of water stress.
  • Chromatographic and radiological techniques constitute a powerful tool for determining nucleotide levels such as sulfonucleotides (APS and PAPS among others; Yoshida, H., Fukui, S., Yamashina, I., Tanaka, T., Sakano, T., Usui, T., Shimotsuji, T., Yabuuchi, H., Owada, M., Kitagawa, T. (1982) "Elevation of nucleotide pyrophosphatase activity in skin fibroblasts from patients with Lowe's syndrome". Biochem. Biophys. Res.
  • sugar-nucleoside diphosphate such as those derived from glucose, ribose, mannose, galactose, glucuronic acid, fructose and galacturonic acid
  • sugar-nucleoside diphosphate such as those derived from glucose, ribose, mannose, galactose, glucuronic acid, fructose and galacturonic acid
  • sugar-nucleoside diphosphate such as those derived from glucose, ribose, mannose, galactose, glucuronic acid, fructose and galacturonic acid
  • the plant enzyme object of the invention has various isoforms in the plant tissues from which it can be obtained (Baroja-Fernández, E., Zandueta-Criado, A., Rodr ⁇ guez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2000) "Distinct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and
  • ADPglucose pyrophosphorylase occur in the suspension-cultured cells of sycamore (Acer pseudopla.tan.us L.). FEBS Lett. 480, 277-282).
  • the simplest extraction isoform is what is called soluble, while other isoforms, which we can call particulate, are intimately adhered to the starch granules, so that to obtain them it is necessary to destroy the granule by hydrolyzing the starch.
  • two isoforms of AGPPase were partially sequenced; one soluble and another associated with the starch granule of plants.
  • An object of the invention is, first of all, to obtain a soluble isoform of AGPPase in substantially pure form, from plant tissues, and its characterization. Another object is to obtain the amino acid sequence of the soluble barley AGPPase (Hordeu vulgare, cv.
  • Another object of the invention is the procedure followed for the preparation of devices or kits for determining sugar-nucleoside diphosphates and sulfonucleotides based on the use of the enzymatic product with AGPPase activity.
  • UDPglucose is the precursor of glycogen in animals, so that its levels in various tissues and organs (blood, muscle, liver) are related to the various situations, pathological or not, of glycidic metabolism.
  • the kits available for simple, quick and inexpensive determination of Azu ⁇ nucleoside presents considerable interest cares for the industry of biomedical products, both diagnostic and research in physiology.
  • AGPPase object of the invention can be made from any plant tissue of any species, such as any Monocotyledonous or Dicotyledonous, such as barley (Hordeum vulgare), wheat (Tri ticum aestivum ), pepper ⁇ Capsicum annuum), tomato ⁇ Lycopersicon sculentum), potato ⁇ Solanum tuberosum), Arabidopsis ⁇ Arabidopsi s thaliana), or maple (Acer pseudoplatanus L.), to name just a few of the countless representative examples of different families and genera .
  • any Monocotyledonous or Dicotyledonous such as barley (Hordeum vulgare), wheat (Tri ticum aestivum ), pepper ⁇ Capsicum annuum), tomato ⁇ Lycopersicon sculentum), potato ⁇ Solanum tuberosum), Arabidopsis ⁇ Arabidopsi s thaliana), or maple (Acer pseudopla
  • the general method of obtaining and purifying the soluble plant AGPPase described in the invention includes the following steps, in which small variations can be admitted that do not substantially modify the general scheme of the extraction and purification process, from any plant tissue: 1. Homogenization of plant tissue with an extraction buffer.
  • AGPPase can be easily determined in any of the following ways: a) Protein elution and subsequent detection of G1P production in the presence of ADPG. b) Incubation of the gel in a solution with bis-PNPP and developed in a basic solution.
  • the general method of obtaining and purifying AGPPase vegetable particulate includes the following steps, in which small variations can be admitted that do not substantially modify the general scheme of the extraction and purification procedure, from any plant tissue:
  • AGPPase in samples incubated with ADPG. 8: Isoelectric focusing.
  • the position of AGPPase can be easily determined in any of the following ways: a) Protein elution and subsequent detection of G1P production in the presence of ADPG. b) Incubation of the gel in a solution with bis-para-nitrophenyl phosphate (bis-PNPP) and developed in a basic solution as described by Nishimura and Beevers
  • AGPPase can be easily determined in any of the following ways: a) Protein elution and subsequent detection of G1P production in the presence of ADPG. b) Incubation of the gel in a solution with bis-PNPP and developed in a basic solution.
  • the enzyme product obtained by the procedures described above, or other equivalents, is identified by the following functional standards: • It is a pyrophosphatase / phosphodiesterase (EC 3.1.4) that catalyzes the hydrolysis of ADPG in equimolar amounts of G1P and AMP (Rodr ⁇ guez-López, M., Baroja-Fernández, E.,
  • ADPG In addition to ADPG, it recognizes small molecules that have phosphodiester and phosphosulfate bonds, such as UDP-glucose, GDP-glucose, GDP-mannose, ADP-mannose, bis-PNPP,
  • PAPS and APS and others of similar structure does not hydrolyse molecules with phosphomonoester bonds such as G1P, G6P, AMP, 3-phosphoglycerate, and the like. Nor does it hydrolyze cyclic AMP or long-chain nucleic acids such as DNA or RNA, which are substrates of other phosphodiesterases described in the literature. ⁇ Unlike pyrophosphatases of ADP-sugars (EC 3.6.1.13, EC 3.6.1.21) described in bacteria and animals and unlike other phosphodiesterases (EC 3.1.4), their ionic requirements are reduced, so it can work in the absence of Magnesium, Manganese, Cobalt, and other divalent cations.
  • AGPPase hydrolyzes bis-PNPP.
  • phosphorylated molecules such as AMP, ADP, ATP, 3-phosphoglycerate, orthophosphate, inorganic pyrophosphate, and others of similar characteristics.
  • Coli XLl Blue Strains of said transformed bacteria were deposited on 23.06.00 in the Spanish Type Culture Collection, located in the Research Building of the University of Valencia, Burj Asot Campus, Burjasot 46100 (Valencia, Spain) with CECT deposit number 5338.
  • pVT'BSP-GL was digested sequentially with the enzymes HindIII, T4 DNA polymerase and Xbal and was cloned into the binary plasmid pCGN1548 (McBride, KE, Summerfelt, KR
  • kits designed for the determination of nucleotides such as sugar-nucleoside diphosphates and sulfonucleotides are based on the action of the product with AGPPase activity on phosphodiester bonds and phosphosulfate of small molecules that, after being hydrolyzed, give rise to other easily detectable molecules and quantification.
  • kits The two most convenient strategies for the preparation of these kits are based on the hydrolysis of the sugar-nucleoside diphosphate by means of the enzyme object of the present invention, that is, AGPPase, producing equal amounts of sugar-1-phosphate and the corresponding mono nucleoside. - phosphate.
  • the determination of the amount of nucleotide initially existing in the sample can be considered from the determination of the amount of sugar-1-phosphate and nucleoside monophosphate produced, as specified below: ⁇
  • the sugar-1-phosphate is glucose-1-P (G1P)
  • said compound is subjected to the action of the phosphoglucomutase enzyme yielding glucose-6-phosphate, which in turn can be reacted coupled with NAD + by the action of the glucose enzyme -6-phosphate dehydrogenase, obtaining 6-phosphogluconate and NADH, easily determinable.
  • sugar-1-phosphate is not G1P
  • the determination of sugar-1-phosphate and nucleoside mono-phosphate is carried out by colorimetric determination of orthophosphate (Pi) produced after the hydrolysis of these compounds with alkaline phosphatase .
  • the 5 'nucleus can be used as a coupling enzyme tidase which will hydrolyze the nucleoside mono-phosphate in equimolar amounts of the corresponding nucleoside and
  • the Pi released in either case is easily quantifiable by known colorimetric methods.
  • the strategy for determining sulpho-nucleotide levels is based on the hydrolysis of these nucleotides and consequent production of equimolar amounts of sulfate, which can be determined turbidimetrically or nephelometrically (Sorbo, B.
  • Examples are described below in which the procedure for obtaining and purifying AGPPase, in its soluble and particulate isoforms, from barley leaves is shown in detail. The same procedure, with minimal variations appropriate to each case, can be applied to any other plant tissue, to obtain the corresponding soluble isoforms with the enzymatic activity described.
  • Other examples show the use of AGPPase for the production of kits (test devices) for the determination of sugar-nucleotides and sulfonucleotides.
  • Another example shows obtaining a complete cDNA encoding soluble AGPPase.
  • Another example shows the obtaining of transgenic plants.
  • Example 1 Extraction and purification of soluble AGPPase obtained from barley leaves All steps were developed at 4 ° C, unless otherwise indicated.
  • the plant tissue 200 g was homogenized with 600 mL of extraction buffer (50 mM Month pH 6, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) using an Aring Blender. The homogenate was filtered through four layers of Miracloth, centrifuged at 100,000 g for 30 minutes and the supernatant was adjusted to 50% ammonium sulfate.
  • the precipitate obtained after 30 minutes of centrifugation at 30,000 g (20 ° C) was resuspended in 560 mL of 50 mM Month pH 4.2, then heated in a water bath at 62 ° C for 20 minutes, cooled in ice, and centrifuged at 30,000 g for 20 minutes. Supernatant proteins were precipitated by 50% ammonium sulfate, and resuspended in 5.7 mL of 50 mM Month pH 6. The sample was then subjected to Superdex 200 column gel filtration (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) pre-equilibrated with Month pH 6 and NaCl 150 rnM. Elution was performed with the same buffer.
  • the optional improvement consists of a subsequent purification in cation exchange column type Mono S HR 5/5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and affinity column type A A Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). The fractions with AGPPase activity were pooled and concentrated. The proteins were electrophoretically separated in a 4-12% Bis-Tris NuPAGE gels system (Novex, San Diego, California).
  • Example 2 Extraction and purification of AGPPase particulate obtained from pericarp of tomato fruits
  • the plant tissue (30 Kg) was homogenized with 30 L of extraction buffer (50 mM HEPES pH 7, EDTA 1 mM, DTT 2 mM) using an aring Blender. The homogenate was filtered through four layers of Miracloth, is cen ⁇ trifugó at 20,000 g for 30 min. The precipitate was resuspended in 1.5 L of extraction buffer with 3% Triton X-100.
  • extraction buffer 50 mM HEPES pH 7, EDTA 1 mM, DTT 2 mM
  • the suspension was centrifuged at 20,000 g for 30 min after which the sediment was resuspended in 0.54 L of extraction buffer with MgCl 2 (200 M) or with ⁇ -amylase (100 units / mL), ⁇ -amylase (100 units / mL) and amyloglucosidase (15 units / mL). After one hour of stirring, the suspension was centrifuged for half an hour at 20,000 g and the supernatant dialyzed against 10 mM HEPES pH 7, and 10 mM MgCl 2 . The dialyzed sample was lyophilized and resuspended with water to a final volume of 60 mL.
  • the sample was then subjected to Superdex 200 column gel filtration (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) pre-prepared with HEPES pH 7 and 150 mM NaCl. Elution was performed with the same buffer. The fractions that showed AGPPase activity were subjected to a subsequent purification step in anion exchange column type Mono Q (Pharmacia, Uppsala, Sweden). The fractions with AGPPase activity were collected and contracted. The proteins were electrophoretically separated in a 4- 12% Bis-Tris NuPAGE gels system (Novex, San Diego, California).
  • G1P was determined spectrophotometrically in 300 microliters of mixture containing Hepes 50 mM pH 7, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, KCl 15 mM, NAD + 0.6 mM, a unit of phosphoglucomutase and another of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides, and 30 microliters of the supernatant resulting from step one. After 20 minutes of incubation, NADH production was monitored at 340 nm using a Multiskan EX (Labsystems) spectrophotometer. The amount of NADH produced by any protein extract in the absence of ADPG in step one was negligible.
  • the native molecular mass of AGPPase was determined by gel filtration by means of a representation of the partition coefficient (Kav) against the logarithm of the molecular mass of the following standard proteins: bovine thyroglobuilin (670 kDa), bovine gamma globulin ( 158 kDa), ovalbumin (45 kDa), myoglobin (17 kDa) and vitamin B-12 (1.3 kDa). Protein content was determined by the Bradford method using the reagent prepared by Bio-Rad and gamma globulin as a standard.
  • Tables 1 and 2 presented below reflect the purification of soluble AGPPase from barley leaves and AGPpase particulate from tomato pericarp, respectively.
  • Unit (U) is defined as the amount of enzyme that catalyzes the production of 1 ⁇ mol of product per minute.
  • AGPPase activity thus obtained meets the following characteristics: 1
  • Both soluble and particulate AGPPase are phosphodiesterases that catalyze the hydrolysis of ADPG producing equimolar amounts of G1P and AMP.
  • both isoenzymes recognize other small molecules that have phosphodiester bonds, such as UDP-glucose, GDP-glucose, bis-PNPP and others of similar structure. They also catalyze the hydrolysis of small molecules with phosphosulfate bonds, such as PAPS and APS, releasing equimolar amounts of sulfate and the corresponding nucleotide.
  • K for ADP-glucose 0.5 mMolar, which is about four to five times lower to K-, corresponding to other sugar-nucleotide substrates such as ADP-ribose, UDP-glucose or the like.
  • the affinity for APS is similar to the affinity for ADP-glucose.
  • Soluble AGPPase is resistant to a temperature of
  • SEQ ID NO: 1 Internal sequences (obtained after partial hydrolysis of AGPPase with trypsin): SEQ ID NO: 2 and 3
  • the AGPPase enzyme shows a very wide diffusion among vegetables, so that the enzyme product with activity
  • AGPPase can be obtained from any vegetable.
  • Example 7 Preparation of enzymatic kits to determine glucose-nucleoside diphosphates
  • a kit is prepared containing the following elements: a. AGPPase b. NAD c. Phosphoglucomutase (PGM) d. G6P dehydrogenase (G6PDH) e. Tampon
  • the determination of the amount of glucose-nucleoside diphosphate present in the test sample is based on the spectrophotometric determination of the NADH produced according to the following coupled reaction: (shows problem) NAD + NADH
  • Example 8 Preparation of enzymatic kits for the determination of nucleoside diphosphates of sugars other than glucose
  • Ribose-nucleoside diphosphates ADP-ribose, GDP-ribose, UDP-ribose, CDP-ribose or TDP-ribose
  • mannose-nucleoside diphosphates ADP-mannose, GDP-mannose, TDP-mannose, UDP-mannose or CDP-mannose
  • B galactose nucleoside diphosphates ADP-galactose, GDP-galactose, UDP-galactose or CDP-galactose
  • B glucuronic-nucleoside diphosphates (GDP-glucuronic, UDP-glucuronic, ADP-glucuronic, CDP-glucuronic or TDP-glucuronic) ⁇ fructose-nucleoside diphosphates (GDP-fructose, ADP-fructose, CDP-fructose, UDP-fructose, TDP-fructose)
  • AGPPase b. 5'-nucleotidase (or, alternatively, alkaline phosphatase)
  • the determination of the amount of sugar-nucleoside diphosphate present in the test sample is based on the colorimetric determination of the orthophosphate released according to the following coupled enzymatic reaction:
  • Example 9 Development of enzymatic kits for the determination of PAPS and APS
  • Example 10 Obtaining transgenic tobacco, potato and tomato plants that overexpress AGPPase
  • High in soluble sugars such as sucrose, glucose-6-phosphate, glucose and fructose.

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Abstract

La invención describe la enzima AGPPasa, ADPglucosa pirofosfatasa/fosfodiesterasa vegetal, su procedimiento de obtención, purificación y caracterización. Asimismo se decribe el uso de la AGPPasa en la fabricación de dispositivos de ensayo para determinar niveles de azucares-nucleosido-difosfato y en la obtención de plantas transgénicas con reducido contenido de almidón y resistencia a la sanidad.

Description

TITULO DE LA INVENCIÓN
ADPglucosa pirofosfatasa vegetal, procedimiento de obtención, uso en la fabricación de dispositivos de ensayo y en la obtención de plantas transgénicas .
SECTOR DE LA TÉCNICA AL QUE SE REFIERE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al sector de la obtención, purifi- cación y caracterización de isoformas del enzima ADPglucosa pirofosfatasa (AGPPasa) , también llamada ADPglucosa fosfo- diesterasa, y a las aplicaciones de este enzima en la determinación de niveles de azúcares-nucleósidos , y de sulfonucleótidos y la obtención de plantas transgénicas en las que se sobreexpresa el gen de la AGPPasa dando lugar a plantas con reducido contenido en almidón y alta resistencia a salinidad.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El almidón constituye la forma principal de almacenamiento de carbohidratos en los vegetales . Se acumula en grandes cantidades en órganos tales como semillas (trigo, cebada, maíz, guisante, etc.) y tubérculos (patata y batata entre otros) , y es un constituyente fundamental de la dieta del ser humano. Por otro lado, el almidón es un polímero utilizado frecuentemente en las industrias papelera, cosmética, farmacéutica y alimentaria, y también se utiliza como componente fundamental para la fabricación de plásticos biodegradables y pinturas de bajo impacto medioambiental. Otro polisacárido, la celulosa, es un componente fundamental de la pared celular de las plantas, la cual constituye la materia prima fundamental en procesos industriales tan importantes como el de la producción de papel. Consecuentemente, el estudio de los procesos implicados en la síntesis de estos polímeros de glucosa constituye un tema prioritario en diversos ámbitos de la producción índus- trial.
El UDPglucosa (UDPG) es el precursor fundamental de la biosíntesis de la celulosa y de polisacáridos de pared celular. Por otro lado, el ADPglucosa (ADPG) es el precursor universal de la biosíntesis del almidón en te idos de reserva de la planta. Su concentración en la célula resulta determinante para la cantidad y calidad del almidón producido por la planta. Las reflexiones acerca de los factores que gobiernan los niveles endógenos de ADPG en la célula vegetal han girado fundamentalmente en torno a sus enzimas smtetizadores , tales como la ADPG pirofosfoπlasa (AGPasa) y la Sacarosa smtasa (Preiss,
(1988) ,ΛBιosynthesιs of starch and íts regulation" . The
Biochemistry of Plants . Vol . 14, Academic Press, New York, pp.182-249; Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999) Λ Sucrose-starch conversión m heterotrophic tissues" . Cπt. Rev.Plant. Sci . 18, 489-525). Sin embargo, poco se ha investigado en relación con la maquinaria responsable de la degradación de este azúcar-nucleótido
(Femgold, D.S., Avigad, G. (1980) "Sugar trasnformation m plants". The Biochemistry of Plants. Vol. 3, Stumpf, P.K. and Conn, E.E. eds . Academic Press, New York, pp . 101-170). Existen indicios de que tanto bacterias como mamíferos disponen de una maquinaria enzimática capaz de hidrolizar azúcares-nucleótidos tales como el ADPG y el UDPG (Meló, A., Glaser, L. (1966) "Nucleotide diphosphate hexose pyrophosphatases" . Biochem. Biophys . Res. Commun. 22, 524- 531; Bessman, M.J., Frick, D.N., O'Handley, S.F. (1996) "The MutT protems or Nudix hydrolases, a family of versatile, widely distributed housecleanmg enzymes". J.
Biol. Chem. 271, 25059-25062; Rodríguez, P., Bass, S.T.,
Hansen, R.G. (1968) "A pyrophosphatase from mammalian tissues specific for derivates of ADP". Biochim. Biophys . Acta. 167, 199-201; Gasmi , L., Cartwπght , J.L., McLennan,
A.G. (1999) "Clonmg, expression and characterization of
YSA1H, a human adenosme 5 " -diphosphosugar pyrophosphatase possessmg a MutT motif " . Biochem. J. 331-337) . En plantas, tal tipo de actividad ha sido escasamente descrito en la literatura (Rodríguez-López, M., Baro] a-Fernández, E., Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) " Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis " . Proc . Nati. Acad. Sci . , 97, 8705-8710; Baro] a-Fernández , E., Zandueta-Cπado, A., Rodríguez-López, M., Akazawa, T. , Pozueta-Romero, J. (2000) " Distmct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylase occur ín the suspension-cultured cells of sycamore {Acer pseudopla tanus L.). FEBS Lett . 480, 277-282; Rodríguez- López, M., Baro] a-Fernández, E., Zandueta-Criado, A.,
Moreno-Bruna, B., Muñoz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero,
J. (2001) "Two isoforms of a nucleotide-sugar pyrophosphatase/phosphodiesterase from barley leaves
(Hordeum vulgare L.) are distmct oligomers of HvGLPl, a germm-like protem" . FEBS Lett. (en prensa) .
En diversas industrias, el almidón constituye un agente viscosizante y gelificante de primera necesidad. La biosín- tesis del almidón en la célula vegetal a partir del ADPG tiene lugar en el compartimento subcelular denominado plástido. Tanto la síntesis como la degradación del ADPG se producen en este compartimento y por tanto el control de los niveles de almidón puede tener lugar mediante el control de los procesos reguladores de los niveles de ADPG. Las diferentes aplicaciones del almidón producido en una planta están basadas en el balance de amilosa y amilopectina, el cual determina la estructura del granulo de almidón, así como su viscosidad en suspensiones acuosas. Tal proporción de amilosa y amilopectina depende de la concentración de ADPG en la célula vegetal . No se conoce hasta el momento ningún procedimiento para regular las características del almidón producido en una planta mediante el control de la degradación de ADPG, que el enzima descrito en la presente invención, puede proporcionar.
Además de actuar como sustancia de reserva para la planta, el almidón se acumula en la célula vegetal en circunstancias en las que la planta no está sometida a condiciones de stress hídrico. En condiciones en las que la planta se ve sometida a altas temperaturas o altas concentraciones de sales en el medio, la planta deja de acumular almidón, produciendo grandes cantidades de azúcares solubles que se acumulan en la vacuola (Keeling, P.L., Bacon, P.J., Holt, D.C (1993) "Elevated temperature reduces starch deposition in wheat endosperm by reducing the activity of soluble starch synthase" Planta 191, 342-348; Geigenberger, P., Geiger, M. , Stitt, M. (1998) v 'High-temperature perturbation of starch synthesis is attributable to inhibition of ADP- glucose pyrophosphorylase by decreased levéis of glycerate- 3-phosphate in growing potato tubers" Plant Physiol . 117, 1307-1316) . Además de estas alteraciones adaptativas del metabolismo de carbohidratos al stress hídrico, la planta experimenta alteraciones de su metabolismo del azufre, evitando la acumulación del adenosine-5 '-phosphate (PAP) procedente de la transformación de adenosina 5'phosphosulfate (APS) y 3 ' -phosphoadenosine 5'- phosphosulfate (PAPS) (Gil-Mascarell , R., López-Coronado, J.M., Bellés, J.M., Serrano, R., Rodríguez, P.L. (1999)
,vThe Arabidopsis HAL2-like gene family includes a novel sodium-sensitive phosphatase" Plant J. 17, 373-383). A partir de estas observaciones, es posible que reacciones enzimáticas responsables de la hidrólisis del ADPG, APS y
PAPS sean responsables de procesos adaptativos de la planta a las condiciones de stress hídrico.
Las técnicas cromatográficas y radiológicas constituyen una poderosa herramienta de determinación de niveles de nucleótidos tales como sulfonucleótidos (APS y PAPS entre otros; Yoshida, H., Fukui , S., Yamashina, I., Tanaka, T. , Sakano, T., Usui, T., Shimotsuji, T., Yabuuchi , H., Owada, M., Kitagawa, T. (1982) "Elevation of nucleotide pyrophosphatase activity in skin fibroblasts from patients with Lowe's syndrome" . Biochem. Biophys. Res. Commun. 107, 1144-1150) y azúcares-nucleósido difosfato (tales como los derivados de glucosa, ribosa, mañosa, galactosa, ácido glucurónico, fructosa y ácido galacturónico) en extractos crudos de origen animal, vegetal o microbiano. Aunque de uso muy generalizado, requieren una inversión importante en equipamientos y en la preparación de las muestras problema. Lamentablemente, se hace escaso uso de posibles métodos alternativos que permitan la detección y cuantificación de azúcares-nucleótidos y sulfonucleótidos de una manera simple y eficaz. El análisis de los niveles en sangre, músculo, riñon o hígado de algunos de los azúcares-nucleótidos mencionados son importantes en clínica (Cortes, P., Dumler, F., Sastry, K.S., Verghese, C.P., Levin, N. . (1982) "Effects of early diabetes on uridine diphosphosugar synthesis in the rat renal cortex" . Kidney Int. 21, 676- 682; Spiro, M.J. (1984) "Effect of diabetes on the sugar nucleotides m several tissues of the rat" Diabetologia 26, 70-75; Sochor, M., Kunjara, S., Baquer, N.Z., McLean, P. (1991) "Regulation of glucose metabolism in livers and kidneys of NOD mice" . Diabetes 40, 1467-1471) . Así por ejemplo, dado que el UDPglucosa es el precursor del glucógeno en animales, el análisis de los niveles de esta molé- cula puede ser importante en el estudio y el diagnóstico de enfermedades relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos como por ejemplo distintos tipos de diabetes. Por otro lado, la determinación de los niveles de PAPS en orina es fundamental para el diagnóstico de enfermedades graves tales como el síndrome de Lowe o el síndrome antifos- folípido (Yoshida, H., Fuk i , S., Yamashina, I., Tanaka, T. , Sakano, T., Usui , T., Shimotsuji, T., Yabuuchi , H. , Owada, M. , Kitagawa, T. (1982) "Elevation of nucleotide pyrophosphatase activity in skin fibroblasts from patients with Lowe's syndrome" . Biochem. Biophys . Res. Commun. 107, 1144-1150; Amigo, M.C., García-Torres, T. (2000) "Morphology of vascular, renal, and heart lesions in the antiphospholipid syndrome: relationship to pathogenesis" Curr. Rheumatol . Rep. 2000, 2, 262-270). Evidentemente, la posibilidad de analizar de manera simple y poco costosa los niveles de estas sus-tancias en una muestra constituye una alternativa ventajosa respecto a las técnicas cromato- gráficas . La invención describe la purificación y aplicaciones de un producto enzimático de origen vegetal que denominamos
AGPPasa que cataliza la hidrólisis de pequeñas moléculas con enlaces fosfodiéster o fosfosulfato entre las que destacan el ADPG, el APS, y el UDPG por ser los substratos preferentes . El enzima vegetal objeto de la invención presenta diversas isoformas en los tejidos vegetales de los que puede obtenerse (Baroja-Fernández, E., Zandueta-Criado, A., Rodríguez-López, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2000) "Distinct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and
ADPglucose pyrophosphorylase occur in the suspension- cultured cells of sycamore (Acer pseudopla.tan.us L.) . FEBS Lett. 480, 277-282) . La isoforma de extracción más sencilla es la que denominados soluble, mientras que otras isoformas, que podemos denominar particuladas, se encuentran íntimamente adheridas a los granulos de almidón, de tal modo que para obtenerlas es preciso destruir el granulo hidrolizando el almidón. En la presente invención se consiguió secuenciar parcialmente dos isoformas de AGPPasa; una soluble y otra asociada al granulo de almidón de las plantas. Tras comparar los fragmentos secuenciados de la isoforma soluble con las secuencias disponibles en los bancos de datos, se concluye que es una proteína perteneciente al grupo de las germin- like cuya función se desconocía hasta el momento (Vallelian-Bindschedler, L., Mósinger, E., Métraux, J-P. , Schweizer, P. (1998) "Structure, expression and locali- zation of a germin-like protein in barley that is insolubilized in stressed leaves". Plant Mol. Biol . 37, 297-308; Hurkman, .J., Tao H.P., Tanaka, C.K. (1991) "Germin-like polypeptides increase in barley roots during salt stress". Plant Physiol . 97, 366-37; Rodríguez-López, M., Baroj a-Fernández, E., Zandueta-Criado, A., Moreno- Bruna, B., Muñoz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J.
(2001) "Two isoforms of a nucleotide- sugar pyrophosphatase/phosphodiesterase from barley leaves
(Hordeum vulgare L.) are distinct oligomers of HvGLPl, a germin-like protein" . FEBS Lett. (en prensa) . El número de acceso de la proteína germin-like de cebada disponible en el banco de dato de la EMBL es: Y15962. La amplia distribución de la AGPPasa en el reino vegetal queda demostrada tras la constatación de la existencia de secuencias nucleotídicas similares a las del gen de la
AGPPasa de cebada en especies tales como arroz (número de accesión AB010876) y Arabidopsis thaliana (número de acceso U95034) (Cárter, C, Graham, R.A. , Thornburg, R.W. (1998) "Arabidopsis thaliana contains a large family of germin- like proteins: characterization of cDNA and genomic sequences encoding 12 unique family members" Plant Mol. Biol. 38, 929-943) . Un objeto de la invención es, en primer lugar, la obtención de una isoforma soluble de AGPPasa en forma sustan- cialmente pura, a partir de tejidos vegetales, y su caracterización. Otro objeto es la obtención de la secuencia aminoacídica de la AGPPasa soluble de cebada (Hordeu vulgare, cv. Scarlett) y su contraste con las secuencias disponibles en bases de datos, identificándose el gen que la codifica y sintetizándose un cDNA completo que codifica para la misma. Identificado el gen, se detalla el diseño de construcciones derivadas del mismo destinadas a la obtención de plantas transgénicas con alta actividad AGPPasa cuyo contenido y calidad del almidón, así como el de polisacáridos de pared celular, estén modificados respecto a las plantas control . Tales plantas no acumulan el marcador de toxicidad osmótica PAP, de modo que son más resistentes a altas concentraciones de sales que las plantas control. Otro objeto de la invención es la purificación y caracterización de una isoforma de AGPPasa asociada al granulo de almidón de tomate (Lycopersicon scul entum) , que también se denomina AGPPasa particulada. Otro objeto de la invención es el procedimiento seguido para la elaboración de dispositivos o kits de determinación de azúcares-nucleósido difosfatos y sulfonucleótidos basados en el empleo del producto enzimático con actividad AGPPasa. Tal y como se ha explicado en el Estado de la Técnica Anterior, el UDPglucosa es el precursor del glucógeno en animales, de modo que sus niveles en diversos tejidos y órganos (sangre, músculo, hígado) están relacionados con las diversas situaciones, patológicas o no, del metabolismo glucídico. Por este motivo, el disponer de kits para la determinación sencilla, rápida y económica de azú¬ cares nucléosidos presenta un notable interés para la industria de productos biomédicos, tanto de diagnóstico como de investigación en fisiología.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La obtención y purificación del producto vegetal con actividad enzimática AGPPasa objeto de la invención puede hacerse a partir de cualquier tejido vegetal de cualquier especie, como puede ser cualquier Monocotiledónea o Dicotiledónea, como por ejemplo, cebada (Hordeum vulgare) , trigo ( Tri ticum aestivum) , pimiento { Capsicum annuum) , tomate {Lycopersicon sculentum) , patata { Solanum tuberosum) , Arabidopsis {Arabidopsi s thaliana) , o arce (Acer pseudoplatanus L.), por citar sólo algunos de los innumerables ejemplos representativos de diferentes familias y géneros.
Obtención y purificación de una isoforma soluble de
AGPPasa:
El método general de obtención y purificación de la AGPPasa soluble vegetal descrito en la invención incluye los siguientes pasos, en los que pueden admitirse pequeñas variaciones que no modifiquen sustancialmente el esquema general del procedimiento de extracción y purificación, a partir de cualquier tejido vegetal: 1. Homogeneización del tejido vegetal con un tampón de extracción.
2. Filtración a través de cuatro capas de Miracloth® (tela filtrante para suero lácteo empleada en industrias queseras) .
3. Ultracentrifugación del homogeneizado filtrado.
4. Precipitación en sulfato amónico de las proteínas del sobrenadante . 5. Resuspensión del precipitado en tampón de pH 4,2.
6. Calentamiento durante al menos 15 minutos a una temperatura entre 60 y 65°C.
7. Centrifugación.
8. Concentración del sobrenadante y purificación de la pro- teína por cromatografía de filtración en gel . La actividad enzimática de la AGPPasa se detecta mediante la detección de la producción de G1P y AMP en muestras incubadas con ADPG. Opcionalmente, una de las mejoras introducidas en el método descrito anteriormente en la invención consiste en la utilización adicional, en la etapa de purificación de la enzima, de una cromatografía de intercambio catiónico. Asimismo otra de las mejoras opcionales consiste en la introducción de una nueva etapa de cromatografía en columnas de afinidad del tipo Concanavalina A. 9. Isoelectroenfoque . La posición de la AGPPasa puede determinarse fácilmente de alguna de las siguientes maneras: a) Elución de la proteína y posterior detección de la producción de G1P en presencia de ADPG. b) Incubación del gel en una solución con bis-paranitro- fenilfosfato (bis-PNPP) y revelado en una solución básica según se describió por Nishimura y Beevers (Nishimura, M. , Beevers, H (1978) Plant Physiol . 62, 44-48) . 10. Separación por electroforesis de la proteína en gel desnaturalizante en un sistema de tampones neutros o ligeramente ácidos tales como el NuPAGE 4-12% Bis-Tris
(Novex, San Diego, California) . La posición de la AGPPasa puede determinarse fácilmente de alguna de las siguientes maneras : a) Elución de la proteína y posterior detección de la producción de G1P en presencia de ADPG. b) Incubación del gel en una solución con bis-PNPP y revelado en una solución básica.
Obtención y purificación de una isoforma de AGPPasa adherida al granulo de almidón (isoforma particulada) .
El método general de obtención y purificación de la AGPPasa particulada vegetal incluye los siguientes pasos, en los que pueden admitirse pequeñas variaciones que no modifiquen sustancialmente el esquema general del procedimiento de extracción y purificación, a partir de cualquier tejido vegetal :
1: Homogeneización del tejido vegetal con un tampón de extracción.
2: Filtración a través de cuatro capas de Miracloth®. 3: Centrifugación del homogeneizado filtrado a 20000 g.
4: Resuspensión del precipitado en un tampón con 3% Tritón
X-100.
5: Centrifugación a 20.000 g.
6 : Resuspensión del precipitado en un tampón con MgCl2 200 mM o bien con enzimas hidrolíticos del almidón tales como la α-amilasa, β-amilasa y amiloglucosidasa .
7: Concentración del sobrenadante obtenido tras centrifugación a 20000 g y purificación de la proteína por cromatografía de filtración en gel y por cromatografía de intercambio iónico. La actividad enzimática de la AGPPasa se detecta mediante la detección de la producción de G1P y
AMP en muestras incubadas con ADPG. 8: Isoelectroenfoque . La posición de la AGPPasa puede determinarse fácilmente de alguna de las siguientes maneras : a) Elución de la proteína y posterior detección de la producción de G1P en presencia de ADPG. b) Incubación del gel en una solución con bis-para- nitrofenilfosfato (bis-PNPP) y revelado en una solución básica según se describió por Nishimura y Beevers
(Nishimura, M. , Beevers, H (1978) Plant Physiol . 62, 44-
48) . 9 : Separación por electroforesis de la proteína en gel desnaturalizante en un sistema de tampones neutros o ligeramente ácidos tales como el NuPAGE 4-12% Bis-Tris
(Novex, San Diego, California) . La posición de la AGPPasa puede determinarse fácilmente de alguna de las siguientes maneras: a) Elución de la proteína y posterior detección de la producción de G1P en presencia de ADPG. b) Incubación del gel en una solución con bis-PNPP y revelado en una solución básica.
Identificación del producto con actividad enzimática AGPPasa
El producto enzimático obtenido por los procedimientos arriba descritos, u otros equivalentes, se identifica mediante los siguientes patrones funcionales : • Es una pirofosfatasa/fosfodiesterasa (EC 3.1.4) que cataliza la hidrólisis del ADPG en cantidades equimolares de G1P y AMP (Rodríguez-López, M., Baroja-Fernández, E.,
Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) " Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase : a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis " . Proc. Nati. Acad. Sci . , 97, 8705-8710)
B Además del ADPG, reconoce pequeñas moléculas que poseen enlaces fosfodiéster y fosfosulfato, tales como el UDP- glucosa, GDP-glucosa, GDP-manosa, ADP-manosa, bis-PNPP,
PAPS y APS y otros de estructura similar. No hidroliza moléculas con enlaces fosfomonoéster tales como la G1P, G6P, AMP, 3 -fosfoglicerato , y otras similares. Tampoco hidroliza AMP cíclico ni ácidos nucleicos de larga cadena tales como ADN o ARN, que son substratos de otras fosfodiesterasas descritas en la literatura. β A diferencia de pirofosfatasas de ADP-azúcares (EC 3.6.1.13, EC 3.6.1.21) descritos en bacterias y animales y a diferencia de otras fosfodiesterasas (EC 3.1.4), sus requerimientos iónicos son reducidos, por lo que puede trabajar en ausencia de iones de Magnesio, Manganeso, Cobalto, y otros cationes divalentes .
• A diferencia de las pirofosfatasas de azúcar-nucleósidos difosfatos de bacterias y animales, la AGPPasa hidroliza bis-PNPP.
• Se inhibe por moléculas fosforiladas tales como el AMP, ADP, ATP, 3-fosfoglicerato, ortofosfato, pirofosfato inorgánico, y otras de características semejantes.
• Se inhibe fuertemente por molibdato y arsenato.
• Es resistente a detergentes iónicos tales como el SDS (dodecilsulfato sódico) (Rodríguez-López, M. , Baroja- Fernández, E., Zandueta-Criado, A., Moreno-Bruna, B., Muñoz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) " Two isoforms of a nucleotide-sugar pyrophosphatase/phospho- diesterase from barley leaves (Hordeu vulgare L.) are distinct oligomers of HvGLPl, a germin-like protein" .
FEBS Lett. (en prensa)) . B Es resistente a la acción de una amplia gama de proteasas, como Proteinasa K y Pronasa (Boehringer) . 1 Su actividad no se ve afectada por la acción de inhibidores típicos de fosfodiesterasas tales como el β-mer- captoetanol, EDTA, cisteína reducida, ascorbato, y otros agentes reductores y quelantes. • Es sensible a pH ligeramente básico y es muy estable a pH entre 4 y 7,5.
Obtención de un cDNA completo que codifica para la AGPPasa soluble.
Conocida la secuencia aminoacídica de la AGPPasa se contrastó con otras existentes en los bancos de datos . Ello permitió identificar el gen que codifica para la AGPPasa . El conocimiento de la secuencia nucleotídica del gen que codifica para la AGPPasa permitió la creación de dos cebadores específicos del gen de la AGPPasa. Haciendo uso de estos cebadores se amplificó por métodos convencionales de RT-PCR un cDNA completo que se introdujo en el sitio de restricción EcoRV del plásmido pSK Bluescript (Stratagene) dando lugar a la construcción AGPPase-cDNApsK" la cual fue amplificada en la bacteria hospedadora E. Coli XLl Blue. Cepas de dicha bacteria transformada fueron depositadas el 23.06.00 en la Colección Española de Cultivos Tipo, sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus de Burj asot , Burjasot 46100 (Valencia, España) con el número de depósito CECT 5338.
Obtención de plantas transgénicas que sobreexpresan el cDNA de la AGPPasa soluble AGPPase-cDNApsK" fue digerido secuencialmente con los enzimas HindIII, T4 DNA polimerasa y Xbal . El fragmento liberado (que contiene el cDNA de AGPPsa) fue clonado en el plásmido pVT'BSP tras haber sido digerido secuencialmente por los enzimas Ncol , T4 DNA polimerasa y Xbal. De este modo se obtiene un plásmido denominado pVT'BSP-GL el cual posee el promotor constitutivo 35S, el cDNA de la AGPPasa y el terminador Nos. Para poder transferir esta construcción al genoma de las plantas via Agrobacterium tumefaciens, es preciso que previamente sea clonada en un plásmido binario. Para ello, pVT'BSP-GL fue digerido secuencialmente con los enzimas HindIII, T4 DNA polimerasa y Xbal y se clonó dentro del plásmido binario pCGN1548 (McBride, K.E., Summerfelt, K.R.
(1990) " Improved binary vectors for Agrobacteriu/n-mediated plant transformation" . Plant Mol. Biol . 14, 269-276) que previamente había sido digerido secuencialmente con los enzimas HindIII, T4 DNA polimerasa y Xbal. El plásmido así obtenido se designó con el nombre de pCGN154835SGL . Tras amplificarse en E. coli (XLl Blue), pCGN154835SGL se introdujo en Agrobacterium tumefaciens (CECT 5387) el cual fue utilizado para transformar especies tales como tomate, tabaco, patata, etc. (Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., Fraley, R.T. (1985) "A simple and general method for transferring genes into plants" Science 277, 1229-1231. Cepas de Agrobacterium tumefaciens fueron depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo, sita en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia, Campus de Burjasot, Burjasot 46100 (Valencia, España), con el n° de depósito CECT5387, el 10.01.01. Elaboración de dispositivos (kits) de ensayo para determinación de azúcares -nucleósido difosfatos y sulfonucleótidos.
Los kits diseñados para la determinación de nucleótidos tales como azúcares-nucleósido difosfatos y sulfonucleó- tidos están basados en la acción del producto con actividad AGPPasa sobre enlaces fosfodiéster y fosfosulfato de pequeñas moléculas que, tras ser hidrolizadas , dan lugar a otras moléculas de fácil detección y cuantificación.
Las dos estrategias más convenientes para la elaboración de estos kits parten de la hidrólisis del azúcar-nucleósido difosfafo mediante el enzima objeto de la presente invención, esto es, AGPPasa, produciendo cantidades equi- molares de azúcar-1-fosfato y del correspondiente nucleósido mono- fosfato . A partir de aquí puede plantearse la determinación de la cantidad de nucleótido inicialmente existente en la muestra a partir de la determinación de la cantidad de azúcar-1-fosfato y nucleósido monofosfato pro- ducidos, según se especifica a continuación: β En el caso de que el azúcar-1-fosfato sea glucosa-1-P (G1P) , se somete dicho compuesto a la acción del enzima fosfoglucomutasa rindiendo glucosa-6-fosfato, que a su vez puede hacerse reaccionar acopladamente con NAD+ por acción del enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, obteniéndose 6-fosfogluconato y NADH, fácilmente determi- nable. > En el caso de que el azúcar-1-fosfato no sea G1P, la determinación del azúcar-1-fosfato y del nucleósido mono- fosfato tiene lugar mediante determinación colorimétrica del ortofosfato (Pi) producido tras la hidrólisis de estos compuestos con fosfatasa alcalina. Alternativamente, se puede utilizar como enzima acoplador la 5 'núcleo- tidasa la cual hidrolizará el nucleósido mono-fosfato en cantidades equimolares del nucleósido correspondiente y
Pi . El Pi liberado en cualquiera de los dos casos resulta fácilmente cuantificable por métodos colorimétricos conocidos .
La estrategia de determinación de niveles de sulfo- nucleótidos tales como el APS, se basa en la hidrólisis de estos nucleótidos y consiguiente producción de cantidades equimolares de sulfato, el cual puede ser determinado turbidimétricamente o bien nefelométricamente (Sorbo, B.
(1987) "Sulfate: turbidimetric and nephelometric methods"
Methods Enzy ol . 143, 3-6).
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Se describen a continuación ejemplos en los que se muestra detalladamente el procedimiento de obtención y purificación de la AGPPasa, en sus isoformas soluble y particulada, a partir de hojas de cebada. El mismo procedimiento, con mínimas variaciones adecuadas a cada caso, puede aplicarse a cualquier otro tejido vegetal, para obtener las correspondientes isoformas solubles con la actividad enzimática descrita. Otros ejemplos muestran la utilización de la AGPPasa para la producción de kits (dispositivos de ensayo) de determinación de azúcares-nucleótidos y de sulfonucleó- tidos. Otro ejemplo muestra la obtención de un cDNA completo que codifica para la AGPPasa soluble. Por último otro ejemplo muestra la obtención de plantas transgénicas.
Ejemplo 1: Extracción y purificación de la AGPPasa soluble obtenida a partir de hojas de cebada Todos los pasos se desarrollaron a 4°C, a no ser que se indique otra cosa. El tejido vegetal (200 g) se homogeneizó con 600 mL de tampón de extracción (Mes 50 mM pH 6, EDTA 1 mM, DTT 2 mM) empleando un aring Blender. El homogeneizado se filtró a través de cuatro capas de Miracloth, se centrifugó a 100.000 g durante 30 minutos y el sobrenadante se ajustó al 50% de sulfato amónico. El precipitado obtenido tras 30 minutos de centrifugación a 30.000 g (20°C) fue resuspendido en 560 mL de Mes 50 mM pH 4,2, luego calentado en baño de agua a 62 °C durante 20 minutos, enfriado en hielo, y centrifugado a 30.000 g durante 20 minutos. Las proteínas del sobrenadante se precipitaron mediante sulfato amónico 50%, y se resuspendieron en 5,7 mL de Mes 50 mM pH 6. La muestra se sometió a continuación a filtración en gel en columna Superdex 200 (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia) preequilibrada con Mes pH 6 y NaCl 150 rnM. La elución se efectuó con el mismo tampón. La mejora opcional consiste en una purificación posterior en columna de intercambio catiónico tipo Mono S HR 5/5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y columna de afinidad tipo Con A Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) . Las fracciones con actividad AGPPasa se juntaron y concentraron. Las proteínas se separaron electroforéticamente en un sistema de geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Novex, San Diego, California) .
Ejemplo 2: Extracción y purificación de la AGPPasa particulada obtenida a partir de pericarpo de frutos de tomate
Todos los pasos se desarrollaron a 4°C, a no ser que se indique otra cosa. El tejido vegetal (30 Kg) se homogeneizó con 30 L de tampón de extracción (HEPES 50 mM pH 7, EDTA 1 mM, DTT 2 mM) empleando un aring Blender. El homogeneizado se filtró a través de cuatro capas de Miracloth, se cen¬ trifugó a 20.000 g durante 30 min. El precipitado se resus- pendió en 1.5 L de tampón de extracción con 3% de Tritón X- 100. La suspensión se centrifugó a 20.000 g durante 30 min tras lo cual el sedimento se resuspendió en 0,54 L de tampón de extracción con MgCl2 (200 M) o bien con α-amilasa (100 unidades/mL) , β-amilasa (100 unidades/mL) y amiloglu- cosidasa (15 unidades/mL) . Tras una hora de agitación, la suspensión se centrifugó durante media hora a 20.000 g y el sobrenadante se dializó frente a HEPES 10 mM pH 7, y MgCl2 10 mM. La muestra dializada se liofilizó y se resuspendió con agua a un volumen final de 60 mL . La muestra se sometió a continuación a filtración en gel en columna Superdex 200 (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia) preequi- librada con HEPES pH 7 y NaCl 150 mM. La elución se efectuó con el mismo tampón. Las fracciones que mostraban actividad AGPPasa fueron sometidas a un posterior paso de purificación en columna de intercambio aniónico tipo Mono Q (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . Las fracciones con actividad AGPPasa se juntaron y concetraron. Las proteínas se separaron electroforéticamente en un sistema de geles NuPAGE 4- 12% Bis-Tris (Novex, San Diego, California) .
Ejemplo 3: Ensayos enzimáticos
A no ser que se indique otra cosa, todas las reacciones enzimáticas se desarrollaron a 37°C. Las determinaciones de actividades AGPPasa se realizaron utilizando la determi- nación espectrofotométrica de G1P en dos pasos descrita por Sowokinos (1981) (Sowokinos, 1981, Plant Physiol . 68, 924- 929) . La mezcla de reacción contenía Hepes 50 mM pH 7, la cantidad especificada de ADPG y el extracto proteico en un volumen total de 50 microlitros. Todos los ensayos se realizaron frente a blanco de ADPG. Tras 20 minutos de incubación, la reacción se detenía mediante ebullición en baño seco durante 2 minutos. La mezcla se centrifugaba a 20.000 g durante 5 minutos y se recuperaba el sobrenadante. En el segundo paso, se determinaba G1P espectrofoto- métricamente en 300 microlitros de mezcla conteniendo Hepes 50 mM pH 7, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, KCl 15 mM, NAD+ 0,6 mM, una unidad de fosfoglucomutasa y otra de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa de Leuconostoc mesenteroides, y 30 microlitros del sobrenadante resultante del paso uno. Tras 20 minutos de incubación, la producción de NADH se monitorizó a 340 nm utilizando un espectrofotómetro Multiskan EX (Labsystems) . Fue despreciable la cantidad de NADH produ- cida por cualquier extracto proteico en ausencia de ADPG en el paso uno.
La masa molecular nativa de la AGPPasa se determinó mediante filtración en gel por medio de una representación del coeficiente de partición (Kav) frente al logaritmo de la masa molecular de las siguientes proteínas patrones: tiroglobuilina bovina (670 kDa) , gamma-globulina bovina (158 kDa) , ovoalbúmina (45 kDa) , mioglobina (17 kDa) y vitamina B-12 (1,3 kDa) . El contenido en proteína se determinó por el método de Bradford utilizando el reactivo preparado por Bio-Rad y gamma-globulina como patrón.
Las tablas 1 y 2 presentadas a continuación reflejan la purificación de la AGPPasa soluble a partir de hojas de cebada y la AGPpasa particulada a partir de pericarpo de tomate, respectivamente. La unidad (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 μmol de producto por minuto. Tabla 1
Figure imgf000022_0001
Tabl a 2
Figure imgf000023_0001
Ejemplo 4; Identificación del producto con actividad enzimática obtenido
El producto con actividad AGPPasa así obtenido cumple las siguientes características: 1 Tanto la AGPPasa soluble como la particulada son fosfo- diesterasas que catalizan la hidrólisis del ADPG produciendo cantidades equimolares de G1P y AMP. • Además del ADPG, ambas isoenzimas reconocen otras moléculas de pequeño tamaño que poseen enlaces fosfodiéster , tales como el UDP-glucosa, GDP-glucosa, bis-PNPP y otros de estructura similar. También catalizan la hidrólisis de pequeñas moléculas con enlaces fosfosulfato, tales como el PAPS y el APS, liberando cantidades equimolares de sulfato y el correspondiente nucleótido. β No hidrolizan moléculas con enlaces fosfomonoéster tales como la G1P, G6P, AMP, 3 -fosfoglicerato, y otras similares. Tampoco hidrolizan AMP cíclico ni ácidos nucleicos tales como ADN y ARN, que son substratos de otras fosfo- diesterasas descritas en la literatura.
• Sus requerimientos iónicos son reducidos, por lo que pueden trabajar en ausencia de iones de Magnesio, Manganeso, Cobalto, y otros cationes divalentes, que son efec- tores fundamentales para el funcionamiento de otras fosfodiesterasas descritas en la literatura. β A diferencia de las pirofosfatasas de azúcar-nucleósidos difosfatos de bacterias y animales, ambas isoformas de AGPPasa hidrolizan bis-PNPP.
• Se inhiben por moléculas fosforiladas tales como el AMP, ADP, ATP, 3-fosfoglicerato, ortofosfato, pirofosfato inorgánico, y otras de características semejantes. β Se inhiben fuertemente por molibdato y arsenato.
> Son resistentes a detergentes iónicos tales como el SDS (dodecilsulfato sódico) . B Son resistentes a la acción de una amplia gama de proteasas, como Proteinasa K y Pronasa (Boehringer) . β Su actividad no se ve afectada por la acción de inhibidores típicos de fosfodiesterasas tales como el β-mer- captoetanol , EDTA, cisteína reducida, ascorbato, y otros agentes reductores y quelantes.
• Son sensibles a pH ligeramente básico y son muy estables a pH entre 4 y 7,5. Esta característica es una de las que convierten a ambas isoformas de AGPPasa en enzimas totalmente diferentes a la mayoría de las fosfodiesterasas descritas en la literatura, dado que éstas últimas son estables y activas en pHs ligeramente básicos.
> Constante de Michaelis-Menten (K para ADP-glucosa, de 0,5 mMolar, la cual es unas cuatro a cinco veces inferior a la K-, correspondiente a otros substratos azúcares-nu- cleótidos como por ejemplo ADP-ribosa, UDP-glucosa o similares. La afinidad por APS es similar a la afinidad por ADP-glucosa.
Algunas de las características particulares de la AGPPasa soluble son: La AGPPasa soluble es resistente a una temperatura de
65 °C durante 30 minutos, y puede ser caracterizada por los siguientes datos: β Peso molecular aparente medido por filtración en gel, en torno a 35-55 kDa.
• Keq' de la reacción de 110.
B Incremento de Energía Libre estándar (ΔG' ) de -2,9 kcal/mol.
• En la presente invención, la caracterización de la secuencia de aminoácidos nos permite conocer otra serie de características, como son:
• Es una glicoproteína. H Peso molecular aparente de la proteína purificada en geles desnaturalizantes, en torno a 20 kDa.
• Las secuencias aminoacídicas obtenidas mediante la degradación de Edman son:
Extremo N-terminal : SEQ ID NO: 1 - Secuencias internas (obtenidas tras la hidrólisis parcial de la AGPPasa con tripsina) : SEQ ID NO : 2 y 3
Algunas de las características particulares de la AGPPasa particulada son:
Peso molecular medido por filtración en gel en torno a 400-500 kDa. • Peso molecular aparente en gel desnaturalizante del péptido que compone la AGPPasa particulada: 45 kDa.
• La secuencia aminoacídica obtenida mediante la degradación de Edman es: - Extremo N-terminal: SEQ ID NO: 4
Ejemplo 5: Obtención de un cDNA completo que codifica para la AGPPasa soluble
El conocimiento de la secuencia nucleotídica del gen que codifica para la AGPPasa de cebada permitió la creación de dos cebadores específicos del gen de la AGPPasa cuyas secuencias son, en sentido 5' - 3', SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Haciendo uso de estos cebadores se amplificó por mé- todos convencionales de RT-PCR un cDNA completo que se introdujo en un plásmido pSK Bluescript (Stratagene) el cual fue amplificado en la bacteria hospedadora XLl Blue. El peso molecular del péptido deducido del cDNA es de 19.5 kDa. La secuencia del cDNA es SEQ ID NO: 7.
Ejemplo 6; Productos con actividad AGPPasa a partir de diversos vegetales
El enzima AGPPasa muestra una muy amplia difusión entre los vegetales, de modo que el producto enzimático con actividad
AGPPasa puede ser obtenido a partir de cualquier vegetal .
Como ejemplo, se presenta la siguiente tabla II con las actividades específicas (mU / mg proteína) obtenidas en varias Monocotiledóneas y Dicotiledóneas. Tabla 3
Figure imgf000027_0001
Ejemplo 7: Elaboración de kits enzimáticos de determinación de glucosa-nucleósido difosfatos
Para la determinación de glucosa-nucleósido difosfatos tales como ADPG, UDP-glucosa, CDP-glucosa, GDP-glucosa y TMP-glucosa, se elabora un kit que contiene los siguientes elementos : a. AGPPasa b. NAD c. Fosfoglucomutasa (PGM) d. G6P deshidrogenasa (G6PDH) e . Tampón
La determinación de la cantidad de glucosa-nucleósido difosfato presente en la muestra problema se basa en la determinación espectrofotométπca del NADH producido según la siguiente reacción acoplada: (muestra problema) NAD+ NADH
NDP-glucosa ^ NMP + G1P - G6P - 6-fosfogluconato
AGPPasa PGM G6PDH
La determinación de la cantidad de NDP-glucosa en una muestra problema tendría lugar mediante la elaboración de un cocktail cuya composición sería (para 1 mi):
U Muestra problema
" 1 U de AGPPasa
" 1 U de PGM
" 1 U de G6PDH
1 0.6 mM NAD U Tampón Mes o Hepes 50 mM pH 7
• Agua (hasta completar 1 mi)
Se incuba a 37 °C durante 20 minutos y se observa la variación de absorbancia de la muestra a 340 nm. Como control negativo se puede utilizar un cocktail en el que falte la AGPPasa.
Ejemplo 8: Elaboración de kits enzimáticos de determinación de nucleósido difosfatos de azúcares distintos a glucosa
Se preparan kits de determinación de los siguientes azúcares-nucleósido difosfatos:
• ribosa-nucleósido difosfatos (ADP-ribosa, GDP-ribosa, UDP-ribosa, CDP- ribosa o TDP-ribosa)
• manosa-nucleósido difosfatos (ADP-manosa, GDP-manosa, TDP-manosa, UDP-manosa o CDP-manosa) B galactosa-nucleósido difosfatos (ADP-galactosa, GDP- galactosa, UDP-galactosa o CDP-galactosa)
B glucurónico-nucleósido difosfatos (GDP-glucurónico, UDP- glucurónico, ADP-glucurónico, CDP-glucurónico o TDP- glucurónico) β fructosa-nucleósido difosfatos (GDP-fructosa, ADP-fruc- tosa, CDP-fructosa, UDP-fructosa, TDP-fructosa)
B galacturónico-nucleósido difosfatos (UDP-galacturónico,
GDP-galacturónico, CDP-galacturónico, TDP-galacturónico o ADP-galacturónico)
En el kit intervienen los siguientes elementos:
a. AGPPasa b. 5 ' -nucleotidasa (o, alternativamente, fosfatasa alcalina) c . tampón
La determinación de la cantidad de azúcar-nucleósido difosfato presente en la muestra problema se basa en la determinación colorimétrica del ortofosfato liberado según la siguiente reacción enzimática acoplada:
(muestra problema) NDP-azúcar ^. azúcar-P + NMP - base + Pi
AGPPasa 5 ' -nucleotidasa
La determinación del Pi tiene lugar según cualquiera de los múltiples métodos colorimétricos disponibles en la biblio- grafía y en el mercado. La detemmación de la cantidad de NDP-azúcar en una muestra problema tendría lugar mediante la elaboración de un cocktail (1 mi) compuesto por:
B Muestra problema
B l u de AGPPasa
B 1 U de 5'-nucleotιdasa (o, alternativamente, 1 U de fos- fatasa alcalina)
B Tampón Mes o Hepes 50 mM pH 7.5
B Agua (hasta completar 1 mi)
Se incuba a 37°C durante 20 minutos y se determina la producción del Pi liberado según técnicas convencionales. Como control negativo se puede utilizar un cocktail en el que falte la AGPPasa.
Ejemplo 9: Elaboración de kits enzimáticos de determinación de PAPS y APS
La estrategia de determinación de niveles de sulfo- nucleótidos tales como el PAPS o el APS, se basa en la determinación turbidimétπca o bien nefelométπca según la siguiente reacción:
AGPPasa PAPS PAP+sulfato
AGPPasa APS AMP+sulfato
La detemmación de la cantidad de sulfonucleótido en una muestra problema tendría lugar mediante la elaboración de un cocktail (1 mi) compuesto por: B Muestra problema B 1 U de AGPPasa
B Tampón Mes o Hepes 50 mM pH 7.0
B Agua (hasta completar 1 mi)
Se incuba a 37 °C durante 20 minutos y se determina la producción del sulfato liberado según técnicas convencionales. Como control negativo se puede utilizar un cocktail en el que falte la AGPPasa.
Ejemplo 10; Obtención de plantas transgénicas de tabaco, patata y tomate gue sobreexpresan AGPPasa
Utilizando la cepa de Agrobacterium tumefaciens CECT 5387 se obtuvieron plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) , patata (Solanum tuberosum) y tomate (Lycopersicon sculentu ) con alta actividad AGPPasa en todos los órganos analizados (raíz, hoja, frutos y tallo). Tales plantas presentaron las siguientes características:
1. Bajo contenido en almidón y carbohidratos de pared celular (según las técnicas de medición basadas en kits comerciales descritas en la literatura (Frehner, M. , Pozueta-Romero, J., Akazawa, T. (1990) ,λEnzyme sets of glycolysis, gluconeogenesis , and oxidative pentose phosphate pathway are not complete in nongreen highly purified amyloplasts of sycamore cell suspensión cultures" Plant Physiol . 94, 538-544)).
2. Alto contenido en azúcares solubles tales como sacarosa, glucosa-6-fosfato, glucosa y fructosa.
3. Reducción de los niveles de PAP acumulados en los tejidos, confiriendo gran resistencia a altas concentraciones de cloruro sódico en el sustrato de crecimiento, respecto a plantas no transformadas. La morfología externa de la planta no era aberrante, tras ser comparada con la de las plantas no transformadas.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Producto enzimático de origen vegetal, demonmado AGPPasa, con actividad enzimática ADP-glucosa fosfo- diesterasa, caracterizado por ser una fosfodiesterasa (EC 3.1.49 que cataliza la hidrólisis del ADPG equimolarmente en G1P y AMP, no hidroliza moléculas con enlaces fosfomono- éster, no requiere de efectores iónicos de fosfodiesterasa, es capaz de hidrolizar bis-PNPP, se inhibe por molibdato, arsenato y moléculas fosfoπladas , su actividad no se ve afectada por agentes reductores y quelantes inhibidores de fosfodiesterasas , es sensible a pH ligeramente básico y es muy estable a pH entre 4 y 7,5, es resistente a detergentes iónicos tipo SDS y a la acción de proteasas, y reconoce además del ADPG otros sustratos que poseen enlaces fosfo- diéster y fosfosulfato, hidrolizándolos con una Km 4 a 5 veces superior a la del propio ADPG.
2.- Producto enzimático según la reivindicación 1, caracterizado por no hidrolizar, entre otros, G1P, G6P, AMP, 3-fosfoglicerato, AMPc, ni ácidos nucleicos.
3.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por no requerir como efectores, entre otros cationes divalentes, al Magnesio, Manganeso o al Cobalto.
4.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por ser inhibido por ortofosfato, pirofosfato inorgánico, y esteres de fosfato tales como, entre otros, AMP, ADP, ATP, o 3 - fosfoglicerato .
5.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque su actividad no es afectada, entre otros, por el β-mercaptoetanol, EDTA, cisteína reducida o ascorbato.
6.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por ser resistente, entre otras, a Proteinasa K o Pronasa.
7.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por reconocer como sustratos, entre otros, a la UDP-glucosa, GDP-glucosa, ADP-manosa, APS, PAPS o bis- PNPP.
8. - Procedimiento de obtención de un producto enzimático de origen vegetal con actividad ADP-glucosa fosfodiesterasa en su isoforma soluble caracterizado por someter a material de origen vegetal a una extracción de la fracción proteica por un tampón, filtración del extracto, seguida de un procedimiento de purificación por sucesivas centrifugaciones y precipitaciones, con ajustes tanto del pH como de la fuerza iónica del medio, incluyendo preferentemente un calentamiento de la proteína por encima de 60°C y enfriamiento en hielo, y purificación por filtración en gel, isoelectroenfoque, electroforesis en gel desnaturalizante, u otros medios equivalentes de purificación de proteínas extraídas a partir de tejidos vegetales.
9. - Procedimiento según la reivindicación 8 que comprende los siguientes pasos: (1) homogeneización del tejido vegetal con un tampón de extracción, por ejemplos, Mes 50 mM pH 6, EDTA 1 Mm, DTT 2 Mm, (2) filtración a través de 4 capas de Miracloth®, (3) ultracentrifugación a 100.000 g,
(4) precipitación en sulfato amónico de las proteínas del sobrenadante, (5) resuspensión del precipitado en tampón de pH 4,2, (6) calentamiento durante al menos 15 minutos a una temperatura entre 60 y 65 °C, seguido de enfriamiento en hielo, (7) centrifugación a 30.000 g, (8) concentración de la proteína del sobrenadante mediante precipitación en sulfato amónico y resuspensión a pH 6, y (9) purificación por cromatografía de filtración en gel, isoelectroenfoque y electroforesis en gel desnaturalizante.
10.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por ser resistente a una temperatura de 65°C durante 30 minutos, y por presentar un peso molecular aparente determinado por filtración en gel en torno a 35-55 kDa, así como por mostrar una Keq de la reacción de 110, siendo su ΔG' de -2,9 Kcal/mol, y su K_, para ADPG de 0,5 mMolar .
11.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por haber sido aislado a partir de cualquier especie vegetal .
12. - El producto enzimático de las reivindicaciones 1 a 7 obtenible por el procedimiento de la reivindicaciones 8 y 9.
13. - Uso del producto enzimático de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de dispositivos y/o composiciones de ensayo de aplicación en la determinación de azúcares- nucleósido difosfatos.
14.- Dispositivo de ensayo para la determinación de azúcares-nucleósido disfosfatos caracterizado porque incluye el producto enzimático de las reivindicaciones 1 a a 12, de tal modo que la determinación se basa en el azúcar-1-fosfato liberado durante la reacción catalizada por la AGPPasa.
15. - Dispositivo de ensayo para la determinación de azúcares-nucleósido difosfatos caracterizado porque incluye el producto enzimático de las reivindicaciones 1 a 12, de tal modo que la determinación se basa en el nucleósido monofosfato producido durante la reacción catalizada por la AGPPasa.
16.- Dispositivo de ensayo según la reivindicación 14, caracterizado porque la determinación se basa en la glucosa-1-fosfato liberada, la cual es sometida al enzima fosfoglucomutasa para producir glucosa-6-fosfato, que a su vez se hace reaccionar acopladamente con NAD+ o NADP+, por acción del enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, obte- niéndose 6-fosfogluconato y NADH o NADPH, determmables uno u otro por métodos espectrofotométπcos , o de otra naturaleza, convencionales.
17.- Dispositivo de ensayo según la reivindicación 15, caracterizado porque la determinación se basa en el nucleósido-monofosfato, el cual es susceptible de liberar ortofosfato, además de la base correspondiente, por acción de un enzima como 5 ' nucleotidasa, siendo el ortofosfato fácilmente determmable por métodos convencionales, por ejemplo coloπmétricos .
18.- Dispositivo de ensayo según las reivindicaciones 14 y 15, caracterizado porque la determinación se basa en que el azúcar-1-fosfato y el nucleósido-monofosfato son susceptibles de liberar ortofosfato por acción de un enzima como fosfatasa alcalina o 5 ' nucleotidasa, siendo el ortofosfato fácilmente determmable por métodos convencionales, por ejemplo coloπmétπcos .
19.- Producto enzimático según la reivindicación 1, caracterizado por comprender dos isoformas del enzima una soluble y otra asociada a los granulos de almidón existentes en vegetales.
20.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 y 19, caracterizado porque la isoforma soluble contiene en su secuencia al menos uno de los fragmentos polipeptídicos representados en SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3
21.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 y 19- 20, caracterizado por obtenerse a partir de un cDNA completo, representado por SEQ ID NO: 7, mediante dos cebadores obtenidos a su vez a partir de las regiones 5' y 3', representados por SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 respectivamente, del gen que codifica para la AGPPasa soluble .
22.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1 y 19, caracterizado porque la isoforma asociada al almidón presenta un peso molecular nativo determinado por filtración en gel de 400-500 kDa, y tiene una K., para ADPG en torno a 0,5 mM.
23.- Producto enzimático según las reivindicaciones 1, 19 y 22, caracterizado porque la isoforma asociada a almidón contiene en su secuencia al menos un fragmento polipeptídico representado en SEQ ID NO 4.
24. - Procedimiento de obtención de la isoforma de AGPPasa asociada a almidón caracterizado por someter al material de origen vegetal a una extracción de la fracción proteica por un tampón, o bien con enzimas hidrolíticas al almidón, seguido de sucesivas centrifugaciones y precipitaciones, con ajustes tanto del pH como de la fuerza iónica del medio, cromatografía de intercambio iónico, isoelec- troenfoque, filtración en gel, y electroforesis en gel desnaturalizante, u otros medios equivalentes de purificación de proteínas extraídas a partir de tejidos vegetales.
25.- Procedimiento según la reivindicación 24 que comprende los siguientes pasos: (1) homogeneización del tejido vegetal con un tampón de extracción, por ejemplo HEPES 50 mM pH 7, EDTA 1 mM, DTT 2 mM, (2) filtración a través de 4 capas de Miracloth, (3) centrifugación a 20.000 g, (4) resuspensión del sedimento en tampón de extracción con 3% Tritón X-100, (5) centrifugación a 20.000 g, (6) tratamiento con 200 mM MgCl2 o con enzimas hidrolíticas de almidón, tipo α-amilasa, β-amilasa y/o amiloglucosidasa,
(7) centrifugación a 20.000 g, (8) concentración de las proteínas, (9) purificación por cromatografía de filtración en gel, intercambio iónico, isoelectroenfoque y electro- foresis en gel desnaturalizante.
26.- Uso de cualquiera de las isoformas de la AGPPasa de la reivindicación 19, o de ambas, en la fabricación de dispositivos y/o composiciones de ensayo para determinar nucleósidos difosfato de azúcares, independientemente que sean o no de glucosa.
27.- Uso de cualquiera de las isoformas de la AGPPasa de la reivindicación 19, o de ambas, para determinar la presencia de 3' -fosfo-adenosina 5 ' fosfosulfato (PAPS).
28.- Uso de cualquiera de las isoformas de la AGPPasa de la reivindicación 19, o de ambas, para determinar adenosma 5' fosfosulfato (APS).
29. -Uso del producto enzimático de las reivindicaciones 1, 12 y 19 a 23, en la obtención de plantas transgénicas que sobre-expresan el enzima AGPPasa isoforma soluble.
30.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas que sobre-expresan la isoforma de AGPPasa soluble caracterizado por utilizar un vector de transformación que contenga un plásmido que incluya el cDNA del gen de dicha AGPPasa.
31.- Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según la reivindicación 30 caracterizado porque el vector de transformación es Agrobacterium tumefaciens .
32. - Procedimiento de obtención de plantas transgénicas según la reivindicación 31 caracterizado porque el vector de transformación son cepas de Agrobacterium tumefaci ens CECT5387.
33. - Procedimiento de obtención de plantas según las reivindicaciones 30 a 33 caracterizado porque la planta transformada es una dicotiledónea y prefentemente tomate, patata o tabaco.
34. - Plantas transgénicas con reducido contenido en almidón y resistentes a salinidad alta caracterizadas por ser obtenidas según el procedimiento de las reivindicaciones 30 a 33.
35.- Plantas transgénicas con reducido contenido en almidón y resistentes a salinidad alta caracterizadas por sobreexpresar el gen de la AGPPasa soluble.
36.- Plantas transgénicas según la reivindicación 35 caracterizadas por ser plantas dicotiledóneas y preferentemente tomate, patata o tabaco.
37.- Procedimiento según la reivindicación 9 que comprende opcionalmente entre las etapas de filtración en gel y la de isoelectroenfoque, una cromatografía de intercambio catiónico seguida de una cromatografía de afinidad con Concanavalina A.
38.- Procedimiento según la reivindicación 10 que comprende opcionalmente entre las etapas de filtración en gel y la de isoelectroenfoque, una cromatografía de intercambio catió- nico seguida de una cromatografía de afinidad con Concanavalina A.
39.- Dispositivo de ensayo para la determinación de sulfonucleósidos , caracterizado porque incluye los productos enzimáticos de las reivindicaciones 1 a 7, 10-12 y 19 a 23 de tal modo que la determinación se basa en el sulfato liberado .
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