CN102304525A - 开花调节基因AcFT及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从菠萝中克隆得到的开花调节基因AcFT，及其在调节拟南芥开花中的应用。所述AcFT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2。利用同源序列法克隆得到AcFT基因，采用花粉管通道法转化拟南芥，结果证实转基因拟南芥植株与野生型拟南芥植株相比，表现出提前开花。本发明有助于进一步了解菠萝开花机理，从而可利用生物技术手段来调节菠萝花期、选育菠萝新品种。

Description

开花调节基因AcFT及其应用

技术领域

本发明涉及一种从菠萝中克隆得到的开花调节基因AcFT及其在拟南芥开花调节中的应用。

背景技术

菠萝(Ananas comosus)是禾本目、凤梨科、凤梨属多年生草本植物，也是热带亚热带名果之一。其果实富含多种糖分、有机酸、矿质元素及人体必需的多种维生素，营养价值高，可鲜食和加工，加工后的皮渣可作饲料和肥料，菠萝叶还可提取高质量纤维。菠萝用途广泛，在国内外有广阔的市场和发展前景。据FAO统计，2009年，我国菠萝产量为145万吨，是世界上继泰国和菲律宾之后的世界第三大菠萝生产国。我国自17世纪初开始引种菠萝，主要分布在广东、广西、海南、云南、福建等省区。

虽然菠萝是我国比较有优势的热带水果，但在栽培过程中存在很多问题，主要问题之一是菠萝早花现象。菠萝早花是指营养器官未发育完全就提早开花的现象，是造成菠萝减产的一个重要原因；菠萝早花导致果小、品质差，大大降低了果实的商品价值和经济价值。但如果开花太迟，则需要分批采收、销售和加工，增加了成本。目前，生产上多采用催花技术，以达到同时收果的目的。但品种间催花难易差别比较大，因此需要了解其开花机理，以调节花期。

Flowering Locus T(简称FT)是一个进化上高度保守的基因，是花发育途径中的汇集点，它可以整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号，在植物花发育中发挥着重要作用。其编码的蛋白产物是可以长距离转运的成花激素，转运到茎端分生组织处，在bZIP转录因子Flowering Locus D(简称FD)的共同作用下，上调SUPPRESSOR OFOVEREXPRESSION OF CONSTANS 1(SOC1)基因和花分生组织特性基因APETALA1(AP1)的表达，促进花分生组织的形成而开花(Abe M et al，2005；Wigge PA et al，2005；Schmid M et al，2003；Seari E I et al，2006)。

Hd3α是水稻中FT的同源基因，主要在短日条件下起开花促进作用。当通过RNA干扰手段将Hd3α的表达水平下调后，导致水稻开花时间延迟30天。其他植物如番茄、南瓜、矮牵牛、杨树和葡萄的FT同源基因在拟南芥中组成型表达后，都能在非诱导型光周期条件下促进拟南芥开花(Hsu et al.，2006；Lifschitz and Eshed，2006a；Carmona et al.，2007；Hayama et al.，2003；Linet al.，2007)。目前在番茄、日中性烟草、短日烟草(Maryland Mannoth)和短日矮牵牛〔Pharbitis nil)中，通过异位表达FT同源基因都能促进其提前开花(Lifschitz et al，2006b；Hayama et al，2003)。在木本植物杨树(Populus spp)中，FT同源基因的组成型表达显著地缩短童期并促进了成花转变(Hsu et al.，2006)。反之，在拟南芥和水稻中，用RNA干扰或小分子RNA手段使FT基因的表达下调后，植株的开花时间延迟(Mathieu et al.，2007；Komiya et al.，2008)。这些结果表明FT及其同源基因是植物开花所必需的，而且其对开花的调控作用在不同物种间是相当保守的。

其编码的蛋白质结构与广泛存在于哺乳动物、酵母和细菌中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphat-dylethanolamine binding proteins，简称PEBP)相似，均具有保守的磷脂酰乙醇胺结合域(Banfield MJ et al，1998；Hengst U，2001；Chautard H，2004)，因此，FT属于PEBP家族。这个结构域因能在体外结合磷脂酰乙醇胺而得名。FT含有PEBP家族的大部分保守序列：如70～74残基间的DPDxP、第86个氨基酸残基His、第116～119残基间的GxHR，这些保守序列均与配体结合位点的形成有关(Banfield et al，2000)。

目前已从多种作物中克隆得到FT同源基因cDNA全长，如水稻的Hd3a，番茄的SFT，柑桔的CiFT等(Sha AH et al.，2006；Chen FF et al.，2009；Yoko H etal.，2008；Endo et al.2005；

et al.2006；Lifschitz et al.2006；Yan et al.2006；Gyllenstrand et al.2007；Hayama et al.2007；Lin et al.2007；Kotoda et al.2010；Yasushi and Weigel，2007；Hemming et al.，2008；Lifschitz and Eshed2006；Kojima et al.2002)。

随着对模式植物拟南芥等花发育方面的研究，了解菠萝开花机理可有效地指导菠萝育种，加快育种进程。这是首次从分子生物学的角度来初步了解菠萝的花发育，为以后通过目的基因在菠萝中的过量表达或抑制其表达来调节开花时间打下基础。因此，本研究对于利用基因工程来选育菠萝新品种有着重要的意义。

发明内容

鉴于上述问题，根据本发明的一个目的，提供一个首次从菠萝顶端分生组织中获得的开花调节基因AcFT，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1。

根据本发明的一个方面，所述AcFT基因大小为915bp，其编码177个氨基酸，含有典型的FT同源基因结构域。

根据本发明的另一个方面，所述AcFT基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO：2。

根据本发明的另一个方面，所述AcFT基因包含PEBP蛋白家族的DPDxP，第85个氨基酸残基Y，第116-119的GxHR及第150-152的LYN结构域。

根据本发明的又一个方面，经实时荧光定量表达分析，所述AcFT基因在果肉、果柄、萼片、雄蕊、苞片、顶端分生组织和花瓣的7个部位中都有表达，且表达量从大到小依次为：果肉＞果柄＞萼片＞雄蕊＞苞片＞顶端分生组织＞花瓣；且所述AcFT基因在叶片不表达。

本发明还提供所述AcFT基因在调节拟南芥开花中的应用，其中所述AcFT基因与载体pBI121正向相连后得到重组质粒pBI121-AcFT，将所述重组质粒pBI121-AcFT转化农杆菌菌株GV3101，经花粉管通道法转化拟南芥后，促使拟南芥平均提前6.8天现蕾。

附图说明

图1表示FT同源基因编码的氨基酸序列比对。

图2表示AcFT基因在8个不同部位的表达。

图3表示植物表达载体pBI121-AcFT的构建图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，这些实施例只用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

本发明所提供的FT同源基因，是从菠萝中克隆得到，命名为AcFT基因，核酸序列如SEQ ID NO：1(序列1)。

AcFT基因编码的蛋白质，命名为AcFT蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2(序列2)。

一、AcFT基因的克隆及其序列分析

上述AcFT基因的克隆方法及其序列分析，包括如下步骤：

1、RNA提取

以菠萝品种“巴厘”的顶端分生组织为材料，用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAout 2.0试剂盒(产品编号为CAT#：90404-50)提取总RNA，具体操作如下：

1)估算组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100～200mg顶端分生组织。

2)先将新鲜顶端分生组织剪切成小块，用液氮研磨成粉末后，加入1ml经65℃预热的溶液A(用前需要混匀)，制得匀浆物。

3)将砚磨后的顶端分生组织或制得的匀浆物转移至干净的1.5ml塑料离心管中(可以不转移非液体的细胞碎片)。有的植物组织(比如果实)含有大量水份，匀浆液会多于1ml，转移时也只取1ml。

4)在离心管中加入0.3ml的溶液B和0.2ml自备氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器振荡时必须使管底溶液震荡起来。

5)室温12000rpm离心3～5分钟，两相间将有约5毫米厚的细胞破碎物。

6)将上清液(约0.6ml)转移到另一干净的1.5ml塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。最好留下100μl上清液不取。

7)加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀，制得混合溶液。

8)将一半上述混合溶液转移到离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。

9)将剩下的一半上述混合溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。

10)将0.7ml通用洗柱液加入到离心吸附柱中，12000rpm室温离心10～30秒，弃穿透液。

11)重复步骤10)一次。

12)12000rpm室温离心上述吸附柱30秒以便去除残留液体。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用。

13)将离心吸附柱转移到无RNA酶的收集管中，加入50μl RNA洗脱液，室温放置1～2分钟。

14)12000rpm室温离心半分钟，离心管中溶液即为含DNA污染的RNA样品。后续步骤主要是去除DNA污染。

15)将上步得到的50ul总RNA溶液与溶液D按1∶1的比例混合，充分震荡半分钟。

16)加入相当于RNA溶液和溶液D混合液总体积9倍体积的溶液E，颠倒数次充分混匀。注意：溶液E在4℃放置后可能会产生沉淀，使用前必须放在65℃水浴使沉淀彻底溶解并充分摇匀后再取用。

17)将步骤16)制得的混合液转移到离心吸附柱中，室温12000rpm离心半分钟，弃穿透液。

18)加0.7ml通用洗柱液到离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。

19)一次洗涤一般足够去除杂质。如果有必要，可以再加0.3ml通用洗柱液到离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟并弃穿透液。一般情况，此步可以省略。

20)室温12000rpm离心步骤19)处理过的离心吸附柱半分钟。此步十分重要，否则残留的乙醇会影响RNA的使用。

21)将离心吸附柱转移到一个新的1.5ml离心管中，加入30～50μl RNA洗脱液，室温放置1～2分钟。

22)将上述离心管在室温12000rpm离心半分钟，离心管中溶液即为去除DNA污染的RNA样品，可以立即使用或存放于-80℃待用。

RNA的质量和浓度用核酸蛋白仪来测定，同时用1.0g/100ml(简称为1.0％)的琼脂糖凝胶电泳来检测。

2、反转录

采用大连宝生物工程公司(TAKARA)第一链反转录试剂盒来进行反转录，得到cDNA第一链，作为随后PCR扩增的模板。

3、引物设计

根据美国生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，简称为NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上其他作物同源基因的序列比对，设计核心片段的引物：正向引物FT-F：5’-TGAGGTCGGAGGAACTGATCATCTGAGA-3’

反向引物FT-R：5’-GACCGGAGACCCGAGGTTGTAGAGC-3’

反应体系为：12.5μl PCR缓冲液，8.4μl灭菌去离子水，0.1μl Taq酶，正向、反向引物各1μl(10μM)，cDNA模板2μl；PCR扩增条件为：94℃变性3min；94℃变性0.5min，52℃退火0.5min，72℃延伸1.5min，32个循环；72℃延伸10min。

4、目的DNA回收

PCR产物电泳后，按照TAKARA的Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0(编号为DV805A)的说明书，从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段。具体步骤如下：

1)使用三羟甲基氨基甲烷-乙酸(简称为TAE)缓冲液制作1.0％的琼脂糖凝胶，对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。

2)在紫外灯下切下含有目的DNA片段的凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。

3)切碎胶块。胶块切碎后可以加快胶块融化时间，提高DNA的回收率。

4)称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时以1g＝1ml进行计算。

5)向胶块中加入胶块融化液DR-I缓冲液，DR-I缓冲液的加量如下：

6)均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热)。此时应间断振荡混合，使胶块充分融化(约6～10min)。

7)向上述胶块融化液中加入DR-I缓冲液的1/2体积量的DR-II缓冲液，均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20％的异丙醇。

8)将试剂盒中的吸附柱安置到收集管上。

9)将上述操作步骤7)的溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液。

10)将500μl的Rinse A加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃滤液。

11)将700μl的Rinse B加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，弃滤液。

12)重复操作步骤11)一次。

13)将操作步骤12)处理过的吸附柱安置于新的1.5ml的离心管上，在吸附柱膜的中央处加入25ul的灭菌水或洗脱液，室温静置1min。

14)12000rpm离心1min，洗脱DNA。

15)立即使用或-20℃保存备用。

回收的目的DNA于16℃与pMD18-T载体连接2～4h，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行菌落PCR检测，挑取检测呈阳性的转化子送公司测序，测序结果证实得到的为AcFT基因的中间片段。

5、根据得到的核心片段设计5’和3’端快速扩增cDNA末端(Rapidamplification of cDNA ends，简称为RACE)的特异引物：

3’FT-OUT：CATCGGATCGTGTTCGTGCTATTTCAA；

3’FT-IN：GGCTGGCGTCAGAACTTCAATACCCG；

5’FT-OUT：GTATTGAAGTTCTGACGCCAGCCCG；

5’FT-IN：TGCCCAAAAGATGCTTCAGTTGTCGC；

按照Clontech RACE试剂盒操作，先用5’FT-OUT和3’FT-OUT分别与试剂盒中配备的通用引物(Universal primer，简称为UPM)进行第一轮扩增，扩增产物稀释100倍后用作第二轮扩增的模板，用5’FT-IN和3’FT-IN分别于试剂盒中配备的巢式通用引物(Nested universal primer，简称为NUP)进行第二轮RACE扩增。PCR总反应体积50μl，操作实验步骤应在冰浴上进行。

PCR产物用TAKARA的凝胶回收试剂盒回收后，16℃与pMD18-T载体连接2～4h，连接产物转化JM109感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR检测，挑取阳性转化子送公司测序，测序结果证实得到的为AcFT基因的5’和3’端片段。

6、根据得到的测序结果设计cDNA全长扩增引物：

FTQC-F：5’-ACTGGTTCTACTTGAGTTCTTTTCACCAG-3’

FTQC-R：5’-ATATGTTTTCTCCATACATTGTAAAT-3’

反应体系为：PCR缓冲液12.5μl，8.4μl灭菌去离子水，0.1μl Taq酶，正向、反向引物各1μl(10μM)，cDNA模板2μl；PCR扩增条件为：94℃变性3min；94℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸2min，32个循环；72℃延伸10min。

7、扩增后得到的目的片段用TAKARA的凝胶回收试剂盒回收后，16℃与pMD18-T载体连接2～4h，连接产物转化JM109感受态细胞，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR检测，挑取阳性转化子送公司测序，测序结果证实得到的为菠萝AcFT cDNA全长基因。

8、序列分析

从NCBI上搜索同源序列进行比对，结果显示AcFT与春兰、文心兰、拟南芥的同源性分别为84％、82％和70％。

AcFT属于PEBP蛋白家族，也含有PEBP蛋白家族典型的结构域如71～75残基间的DPDxP、第86个氨基酸残基His、第116～119残基间的GxHR、第150-152残基xYN和第140个残基Q(图1)。这些结构与其蛋白功能相关。

二、AcFT基因的表达

对AcFT基因在菠萝的8个不同部位(叶片、果肉、果柄、萼片、雄蕊、苞片、顶端分生组织和花瓣)进行实时荧光定量表达分析，以验证其功能。具体实施方案如下：

当花序高为4～5cm时，分别提取8个不同部位的总RNA，用核酸蛋白仪测定其浓度，分别定量取出1μg RNA，使用TAKARA定量反转录试剂盒来进行反转录，得到的cDNA用作定量表达的模板。采用18sRNA作为内参基因。

AcFT定量表达的引物：

FTdl-up：GCTCCAAGTCCCAGTTACCCAA

FTdl-dn：GCTCACAATCTCCTGCCCAAAA

反应体系：95℃30sec，1个循环；95℃5sec，53℃30sec，72℃30sec，40个循环。如果制作标准曲线，最后再添加一个溶解曲线的反应：95℃60sec，56℃30sec，95℃30sec，1个循环。

实时荧光定量表达结果显示，AcFT基因在叶片不表达，在其他7个部位的表达量从大到小依次为：果肉＞果柄＞萼片＞雄蕊＞苞片＞顶端分生组织＞花瓣(图2)，AcFT在果肉的表达量是花瓣的696倍，在雄蕊和苞片微量表达，在顶端分生组织和花瓣几乎不表达。

AcFT基因在果肉和果柄的高表达量说明AcFT基因在果实发育中可能发挥很重要的作用；在叶片不表达，这也再次证实了可能的成花素是FT蛋白而不是FT mRNA。在开花前，FT蛋白经长距离运输到达顶端分生组织，从而促进开花，此时FT蛋白的表达量很高，而开花后，FT蛋白的表达量降低。

三、含AcFT基因植物表达载体的构建

构建含AcFT基因的植物表达载体，经花粉管通道法转入拟南芥，进一步验证AcFT基因的功能。

1、带酶切位点编码区的扩增

设计带酶切位点的引物：

FTmq-F：TGCTCTAGACTAGCTAAGCTAGAGTGTGGTTGGTC

            XbaI

FTmq-R：TCCCCCGGGGTGCTCTTTATTAATTGACCTTGATA

            SmaI

PCR反应体系：25μl总反应体积中含模板第一链cDNA 2μl，上下游引物各1μl(10μmol/L)，Taq DNA聚合酶0.1μl(5U/μl)，2x Mix缓冲液12.5μl，用无菌重蒸馏水补足体积。

PCR反应条件为：94℃3min；94℃30sec，48℃30sec，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。扩增得到的FTmq与pMD18-T连接后，命名为pMD18-AcFT，转化JM109感受态后，采用蓝白斑筛选转化子，取白斑进行PCR检测，挑取阳性转化子送公司测序，测序结果证实得到的为包括编码区的带酶切位点的AcFT基因。

2、植物表达载体的构建

用限制性内切酶XbaI和SmaI从含有目的基因的重组质粒pMD18-AcFT中切下目的片段，同时用XbaI和SmaI双酶切pBI121载体，琼脂糖凝胶电泳分离后，用TAKARA胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和pBI121载体的大片段。利用T4DNA连接酶将AcFT正向插入到pBI121载体中，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经PCR鉴定后，获得植物表达载体pBI121-AcFT(图3)。

3、植物表达载体导入农杆菌

取农杆菌GV3101的感受态细胞冰上解冻以后，加入1μg pBI121-AcFT质粒DNA，混匀，冰浴30min，液氮中放置1min，迅速转入37℃中水浴5min，融化后加入0.8ml新鲜的LB培养基(不含抗生素)，于28℃振荡培养2～4h；取200μl涂布于含卡那霉素(简称为Kan)50mg/L和利福平(简称为Rif)25mg/L的LB培养基上，28℃培养2～3天。并对菌落进行PCR检测。

4、目的基因转化拟南芥

挑取鉴定好的阳性农杆菌单克隆于10ml含有Rif(25mg/l)和Kan(50mg/l)的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养至光学密度(Opticaldensity，简称为OD)为0.5左右。在转化前一天，取1ml转入100ml含Rif(25mg/l)和Kan(50mg/l)的LB培养基中振荡培养过夜，第二天，当菌液OD600在1.0～1.5之间时取出使用。

制备好已转化了pBI121-AcFT重组质粒的农杆菌菌液100ml，室温5000r/m离心15min，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基(1/2MS+5％蔗糖+0.5g 2-吗啉乙磺酸(简称为MES)/L+Silwet-77 200μl/L，pH5.8)中，重悬后的菌液OD600在0.8左右。将农杆菌悬浮液倒在烧杯中，将长有拟南芥的培养杯倒扣其上，保证莲座叶以上部分浸没于农杆菌菌液中，浸泡1分钟，期间不时摇动。取出植株，横放在塑料盘中，用保鲜膜封好以保持高湿，放在恒温室培养。第二天揭开保鲜膜，竖直培养。根据需要一周后可再浸染一次，以提高转化率。培养三至四周，待种子成熟后，收取种子，自然干燥后4℃保存。

5、AcFT基因的应用

以Kan抗性T1代转基因拟南芥植株的叶片为材料，提取基因组DNA，以DNA为模板，以FTmq-F，FTmq-R为引物进行PCR扩增，以未转基因拟南芥叶片的DNA为阴性对照。结果表明AcFT基因已经整合到拟南芥基因组中。转基因拟南芥植株平均在24.6天现蕾，而野生型拟南芥植株平均在28.2天现蕾，转基因植株比非转化株平均提前3.6天现蕾。说明AcFT具有促进拟南芥开花的功能。因FT同源基因在不同物种中的功能相当保守，因此，可应用AcFT基因来调节菠萝开花时间。

以上所述，仅为本发明的较佳实例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种从菠萝中克隆得到的开花调节基因AcFT，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1。

2.根据权利要求1所述的AcFT基因，其编码177个氨基酸，含有典型的Flowering Locus T同源基因结构域。

3.权利要求1所述的AcFT基因，所述AcFT基因编码的氨基酸序列如SEQID NO：2。

4.根据权利要求1所述的AcFT基因，其包含PEBP蛋白家族的DPDxP，第85个氨基酸残基Y，第116-119氨基酸残基GxHR及第150-152氨基酸残基LYN结构域。

5.根据权利要求1所述的AcFT基因，经实时荧光定量表达分析，所述AcFT基因在果肉、果柄、萼片、雄蕊、苞片、顶端分生组织和花瓣7个部位中都有表达，且表达量从大到小依次为：果肉＞果柄＞萼片＞雄蕊＞苞片＞顶端分生组织＞花瓣；且所述AcFT基因在叶片不表达。

6.如权利要求1至5中任意一项所述的AcFT基因在调节拟南芥开花中的应用，其中所述AcFT基因与植物表达载体正向相连后得到重组质粒，将所述重组质粒转化农杆菌，经花粉管通道法转化拟南芥后，促使拟南芥平均提前6.8天现蕾。

7.如权利要求6所述的AcFT基因在调节拟南芥开花中的应用，其中所述植物表达载体为pBI121，所述农杆菌菌株为GV3101。

8.如权利要求1至5中任意一项所述的AcFT基因的载体。

9.如权利要求1至5中任意一项所述的AcFT基因的宿主细胞。

10.如权利要求1至5中任意一项所述的AcFT基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ IDNO：2。

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