CN108347894B - 马铃薯栽培品种y9 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种命名为Y9的马铃薯栽培品种。本发明涉及马铃薯栽培品种Y9的块茎、马铃薯栽培品种Y9的种子、马铃薯栽培品种Y9的植物、马铃薯栽培品种Y9的植物部分、由马铃薯栽培品种Y9生产的食品以及用于产生通过将马铃薯栽培品种Y9与其自身或与另一马铃薯变种杂交而产生的马铃薯植物的方法。本发明也涉及用于产生遗传物质中含有一或多个转基因的马铃薯植物的方法，以及由那些方法产生的转基因马铃薯植物和植物部分。本发明还涉及来源于马铃薯变种Y9的马铃薯栽培品种或育种栽培品种和植物部分；用于产生来源于马铃薯栽培品种Y9的其它马铃薯栽培品种、品系或植物部分的方法；以及由使用那些方法得到的马铃薯植物、变种及其部分。
Description
相关申请案的交叉引用
本申请案要求2015年10月08日提交的美国临时申请案第62/239,068号和2015年11月18日提交的美国临时申请案第62/256,940号的优先权，所述申请案中的每一者的全部内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及命名为Y9的新颖马铃薯栽培品种和由这种马铃薯变种产生的块茎、植物、植物部分、组织培养物及种子。本发明进一步涉及由马铃薯栽培品种Y9产生的食品，例如法式炸薯条、炸马铃薯片、脱水马铃薯材料、马铃薯雪片及马铃薯颗粒。
背景技术
马铃薯为全球第四最重要的粮食作物且迄今为止为最重要的蔬菜。目前，几乎美国的每个州都商业地种植马铃薯。美国马铃薯年产量超过1800万吨且全球马铃薯年产量超过3亿吨。马铃薯的风行主要源于其多功能性及营养价值。马铃薯可以新鲜、冻结或干燥使用，或可加工成面粉、淀粉或醇。其含有复杂的碳水化合物且富含钙、烟酸和维生素C。
食品行业中的马铃薯的质量受两个关键因素影响：(1)马铃薯含有大量天冬酰胺，一种在油炸或烘烤后快速氧化形成丙烯酰胺(一种致癌产物)的非必需游离氨基酸；及(2)马铃薯非常容易酶促褐变及变色，此为当多酚氧化酶从经擦伤的马铃薯的受损质粒渗漏出时发生的非所要事件。在细胞质中，酶使酚类氧化，所述酚类接着快速聚合产生深色色素。块茎含有大量磷酸化淀粉，一些磷酸化淀粉在存储期间降解产生葡萄糖及果糖。当在高于120℃的温度下被加热时，这些还原糖与氨基酸反应形成包括丙烯酰胺的梅纳(Maillard)产物。淀粉磷酸化涉及的两种酶为水二激酶R1和磷酸化酶-L(R1和PhL)。由于淀粉部分降解成葡萄糖及果糖，因此亦非酶促地触发褐变。
许多马铃薯栽培品种容易患晚疫病，一种由类真菌卵菌病原体致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的破坏性疾病。马铃薯的晚疫病通过在叶及茎干上可快速扩散且变得坏死的黑色/褐色病变来鉴别。当致病疫霉在宿主作物上快速生长且繁殖时，出现严重晚疫病传染。
因此，需要研发有毒化合物含量减少且对疾病的抗性增加但没有使用未知或外源核酸的马铃薯变种。本发明满足此需要。
相关技术及其相关限制之前述实例打算为说明性的且非排他性的。在阅读说明书之后，对熟习所属领域者而言，相关技术的其它限制将变得显而易见。
发明内容
因此，在所属领域中需要产生丙烯酰胺含量低、黑斑擦伤耐受增加、还原糖减少且对晚疫病的抗性增加的块茎的马铃薯植物变种。
结合在范围中意谓为示范性、非限制性的系统、工具及方法，描述以下实施例及其方面。在各种实施例中，已减少或消除上述问题中的一或多者，而其它实施例是针对其它改进的。
为此目的，本发明提供用核酸序列转化的新颖马铃薯变种Y9，所述核酸序列为马铃薯植物基因组原生的且不含有外源DNA、农杆菌(Agrobacterium)DNA、病毒标记或载体主链序列。确切而言，插入到马铃薯变种Y9的基因组中的DNA为马铃薯原生或野生型马铃薯(马铃薯性亲和植物)原生的非编码多核苷酸，所述非编码多核苷酸使与表达黑斑擦伤、天冬酰胺累积及老化甜化有关的基因沉默。
由此，在一个实施例中，本发明提供一种被称作pSIM1278的植物载体，其包括：第一沉默盒，其含有在反义方向上包括天冬酰胺合成酶-1基因(fAsn1)片段和多酚氧化酶-5基因的3'端非翻译序列的DNA段的两个复本；及第二沉默盒，其含有在反义方向上包括马铃薯磷酸化酶-L(pPhL)基因片段和马铃薯R1基因片段的DNA段的两个复本。pSIM1278载体包括9,512bp主链区和10,148bp DNA插入区，所述主链区在植物转化之前支撑维护植物DNA且在植物细胞的转化后不转移到植物细胞中，所述插入区包括在转化后稳定整合到植物细胞的基因组中的原生DNA。
在另一实施例中，本发明提供一种被称作pSIM1678的第二植物载体，其包括Rpi-vnt1表达盒和植物液泡转化酶基因VInv的沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白质编码区构成，所述编码区通过其原生启动子和终止子序列调节以赋予对晚疫病的广泛抗性；而沉默盒由来自侧接相反植物启动子pGbss和pAgp的马铃薯VInv基因序列的反向重复序列构成。pSIM1678载体包括9,512bp主链区和9,090bp DNA插入区，所述主链区在植物转化之前支撑维护植物DNA且在植物细胞的转化后不转移到植物细胞中，所述插入区包括在转化后稳定整合到植物细胞的基因组中的原生DNA。
在一不同实施例中，本发明提供一种用本发明的植物载体中的一者或两者转化的植物细胞。在又一实施例中，本发明提供一种马铃薯植物变种，其包括用本发明的载体转化的一或多个细胞。在本发明的一个方面中，马铃薯植物变种表达载体pSIM1278的两个沉默盒中的至少一个且表达载体pSIM1678的沉默盒，且沉默盒的表达引起天冬酰胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因和液泡转化酶基因在植物块茎中的下调。在本发明的优选方面中，表达至少一个沉默盒的马铃薯植物变种的块茎呈现在相同变种的未转化植物块茎中不存在的两个或多于两个所需性状。在本发明的最优选方面中，所述两个或多于两个所需性状系选自由以下组成的群组：天冬酰胺累积少、黑斑擦伤减少、热诱导的丙烯酰胺形成减少及存储期间还原糖的累积减少。
在本发明的不同方面中，马铃薯植物变种表达植物DNA载体pSIM1278的两个沉默盒且表达载体pSIM1678的沉默盒，且沉默盒的表达引起马铃薯植物品种的块茎中天冬酰胺合成酶-1基因、多酚氧化酶-5基因、磷酸化酶-L基因、二激酶R1基因和液泡转化酶基因的下调。在本发明的优选方面中，表达植物DNA载体pSIM1278的两个沉默盒且表达载体pSIM1678的沉默盒的马铃薯植物变种的块茎呈现在相同变种的未转化植物块茎中不存在的两个或多于两个所需性状。在一优选实施例中，所述两个或多于两个所需性状是选自由以下组成的群组：较少天冬酰胺累积、黑斑擦伤减少、存储期间还原糖的累积减少及热诱导的丙烯酰胺形成减少。在本发明的一个方面中，表达植物DNA载体pSIM1278的两个沉默盒和植物DNA载体pSIM1678的沉默盒的马铃薯植物变种为Atlantic Y9变种。
在本发明的另一方面中，本发明的马铃薯植物变种Y9表达植物DNA载体pSIM1678的晚疫病抗性基因(Rpi-vnt1)。在本发明的又一方面中，本发明的马铃薯植物变种Y9对晚疫病感染的抗性增加。
由此，根据本发明，提供一种马铃薯(Solanum tuberosum L.)属种的新型马铃薯栽培品种，命名为Y9。由此，本发明涉及：马铃薯栽培品种Y9、马铃薯栽培品种Y9的块茎、马铃薯栽培品种Y9的植物、马铃薯栽培品种Y9的种子、由马铃薯栽培品种Y9生产的食品，以及用于产生马铃薯植物的方法，所述马铃薯植物是通过使马铃薯栽培品种Y9自交或使马铃薯栽培品种Y9与另一马铃薯栽培品种杂交，及通过突变诱发或转化马铃薯栽培品种Y9产生变体而产生。
因此，使用栽培品种Y9的任何此类方法皆为本发明的实施例：自交、回交、产生杂种、群体杂交及其类似方法。使用马铃薯栽培品种Y9作为至少一个亲本所产生的所有植物皆在本发明的范围内。有利地，马铃薯栽培品种可用于与其它不同的马铃薯植物杂交以产生具有优良特征的第一代(F1)马铃薯杂种块茎、种子及植物。
在另一实施例中，本发明提供马铃薯栽培品种Y9的单基因或多基因转换植物。在一个实施例中，一或多个转移基因可为一或多个显性或隐性对偶基因。在一些实施例中，所述转移基因将赋予例如以下性状：除草剂抗性；昆虫抗性；对细菌性、真菌性或病毒性疾病的抗性；雄性可育性；雄性不育；营养质量增强；均一性；及淀粉和其它碳水化合物的浓度增加；擦伤倾向降低；以及淀粉转化为糖的速率降低。所述基因可以是天然存在的马铃薯基因或通过遗传工程技术、回交或突变引入的转基因。
在另一实施例中，本发明提供供马铃薯栽培品种Y9的组织培养物中使用的可再生细胞。在一个实施例中，组织培养物将能够使具有前述马铃薯植物的所有生理学和形态学特征的植物再生，且能够使大体上与前述马铃薯植物具有相同基因型的植物再生。在一些实施例中，这类组织培养物中的可再生细胞将为：胚芽、原生质粒、分生组织细胞、愈合组织(callus)、花粉、叶、花药、雌蕊、子叶、下胚轴、根、根尖、花、种子、叶柄、块茎、芽眼或茎干。再者，本发明提供由本发明的组织培养物再生的马铃薯植物。
在另一实施例中，本发明提供由马铃薯植物变种Atlantic Y9的块茎制成的食品。优选地，所述食品为热处理产品。甚到更优选地，所述食品为新鲜完整马铃薯、法式炸薯条、炸马铃薯片、脱水马铃薯材料、马铃薯雪片或马铃薯颗粒。
除上文所描述的示范性方面和实施例以外，通过以下描述的研究，其它方面和实施例将变得显而易见。
附图说明
图1描绘pSIM1278转化载体。左侧的载体主链区长9,512bp，如其在位置10,149bp处开始且在位置19,660bp处结束。主链DNA主要由细菌DNA构成，所述细菌DNA在植物转化之前提供对DNA插入序列的支撑维护。包含侧接边缘序列的DNA插入区(右侧)长10,148bp(从1bp到10,148bp)。DNA插入序列在转化后稳定地整合到马铃薯基因组中。
图2提供插入于pSIM1278转化载体中的DNA插入序列中的沉默盒的示意性表示。每一沉默盒含有由间隔区分隔的两种基因片段的两个复本。包括四个靶向基因片段(即Asn-1、Ppo-5、Phl和R1)的DNA段的两个复本以反向重复序列的形式插入于在块茎中具有显著活性的两个汇集启动子(表示为Pro)之间。含有所得沉默盒的植物在块茎中产生多样化且未聚腺苷酸化的RNA分子数组，所述RNA分子数组动态地且剧烈地使所欲靶基因沉默。RNA分子的大小一般小于两个所采用启动子之间的距离，这是因为汇集转录引起碰撞转录。
图3描绘本发明的pSIM1678转化载体。左侧的载体主链区长9,512bp，如其在位置9,091bp处开始且在位置18,602bp处结束。主链DNA主要由细菌DNA构成，所述细菌DNA在植物转化之前提供对DNA插入序列的支撑维护。包含侧接边缘序列的DNA插入区(右侧)长9,090bp(从1bp到9,090bp)。DNA插入序列仅由原生DNA构成且在转化后稳定地整合到马铃薯基因组中。
图4提供插入于pSIM1278转化载体(上游结构)中的DNA插入序列中的沉默盒及插入于pSIM1678转化载体(下游结构)中的DNA插入序列中的沉默盒的示意性表示。
图5说明用于利用如表1及表2中所描述的DNA序列来构建质粒pSIM1278的方法。起始载体pCAMBIA1301含有最终pSIM1278主链中的复制起点。
图6说明pSIM1278中的T-DNA表达盒的结构。使用融合PCR来扩增元件1A(pAgp第一复本)、元件1B(pAgp第二复本)、元件2(Asn1、Ppo5)、元件3(Ppo5、Asn1)、元件4(pGbss第一复本)及元件7(间隔区1、Ppo5、Asn1)。基于来自马铃薯基因组的序列通过蓝鹰生物技术有限公司(Blue Heron Biotechnology,Inc.)(博塞尔，华盛顿(Bothell,WA))合成元件5(PhL、R1)及元件6(间隔区2、R1、PhL、pGbss)。通过接合图式中展示的构建嵌段而产生元件8、9及10。最后，形成三个片段(10、11及6)以涵括所需表达盒。接合这些三个片段且将其插入到图5中展示的KpnI-SacI限制位点中以产生pSIM1278。
图7说明用于利用如表3及表4中所描述的DNA序列来构建质粒pSIM1678的方法。起始载体pSIM1278含有最终pSIM1678主链。
具体实施方式
定义
在以下描述和表中，使用若干术语。为提供对本说明书和权利要求书(包括欲给出此类术语的范围)的清楚且一致的理解，提供以下定义。
术语“一(a或an)”是指实体中的一或多者；举例来说，“一引物”是指一或多个引物或至少一个引物。因此，术语“一(a或an)”、“一或多个”及“至少一个”在本文中可互换使用。另外，通过不定冠词“一(a或an)”提及“一元件”并不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅存在一个元件。
对偶基因。对偶基因为与一个性状或特征相关的基因的一或多种替代形式中的任一者。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个对偶基因在一对同源染色体上占据对应基因座。
氨基酸序列。如本文所使用，包含从植物中分离的原生或天然存在或合成制得但包括内源性对应物的核酸序列的寡肽、肽、多肽或蛋白质及其片段。
人工操纵的。如本文所使用，“人工操纵的”意谓通过手工或通过机械方式或重组方式(例如，通过遗传工程技术)移动、排列、操作或控制植物或植物细胞，以便产生与未经操纵、天然存在的对应物相比具有不同生物学、生物化学、形态学或生理学表达型及/或基因型的植物或植物细胞。
无性繁殖。通过从叶插、茎干插、根插、块茎芽眼、匍匐茎、单个植物细胞原生质粒、愈合组织及其类似者生成整个植物来产生子代，所述过程不涉及配子的融合。
主链。除去打算用于转移的DNA插入序列以外的二元载体的核酸序列。
回交。回交为育种者让杂种子代反复地与亲本中的一者杂交(例如，让第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型的一者杂交)的过程。
细菌性环腐病。细菌性环腐病为由细菌马铃薯棒状环腐菌(Clavibactermichiganense)亚种引起的疾病。细菌性环腐病的名称源自于块茎内的维管环的分解特征。此环通常呈乳黄色到淡褐色，干酪样腐病。在马铃薯的外表面上，严重患病的块茎可展现轻微凹陷、干瘪及裂开的区域。受感染块茎的维管组织中的细菌性环腐病症状可没有上文所描述的症状那么明显，仅表达为零碎的、零星出现的深色线或连续的淡黄色变色。
黑斑擦伤。擦伤的块茎组织中发现的黑斑由被称为黑色素的色素造成，黑色素在细胞损伤之后产生且使组织呈褐色、灰色或黑色外观。当酚底物与适当的酶由于细胞损伤而开始彼此接触时，形成黑色素。损伤不需要破损细胞。然而，通常当组织受到冲击时，一定会出现底物与酶的混合。黑斑主要出现在恰好在维管环下方的环髓组织中，但可能足够大而包含皮层组织中的一部分。
边缘样序列。“边缘样”序列系分离自待修饰的所选植物物种，或分离自与待修饰的植物物种性亲和的植物，且功能类似于农杆菌的边缘序列。即，本发明的边缘样序列促进且有助于其连接到的多核苷酸的整合。本发明的DNA插入序列优选地含有边缘样序列。DNA插入序列的边缘样序列的长度在以下长度范围之间：5到100bp、10到80bp、15到75bp、15到60bp、15到50bp、15到40bp、15到30bp、16到30bp、20到30bp、21到30bp、22到30bp、23到30bp、24到30bp、25到30bp或26到30bp。DNA插入序列的左侧及右侧边缘序列是分离自及/或原生于待修饰的植物的基因组。DNA插入序列的边缘样序列与任何已知农杆菌衍生的T-DNA边缘序列就核苷酸序列而言为不相同的。因此，DNA插入序列的边缘样序列可具有与来自农杆菌种(例如，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes))的T-DNA边缘序列不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。即，本发明的DNA插入序列的边缘序列或边缘样序列与来自农杆菌种(例如，根癌农杆菌或发根农杆菌)的T-DNA边缘序列具有至少95％、至少90％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％或至少50％序列一致性，但并不为100％序列一致性。如本文中所使用，描述性术语“DNA插入序列边缘”及“DNA插入序列边缘样”可互换。边缘样序列可从植物基因组分离且经修饰或突变以改变功效，从而能够将一个核苷酸序列整合到另一核苷酸序列中。其它多核苷酸序列可添加到或并入在本发明的边缘样序列内。因此，DNA插入序列左侧边缘或DNA插入序列右侧边缘可经修饰以具有5'端及3'端多个克隆位点或额外限制位点。DNA插入序列边缘序列可经修饰以增加来自随附载体的主链DNA不整合到植物基因组中的可能性。
基本上由……构成。“基本上由”某些元件“构成”的组合物受限于包括那些元件以及不大体上影响本发明组合物的基本特征和新颖特征的那些元件。因此，只要组合物不影响本发明的基本特征和新颖特征，即不含有外源DNA(并非来自所选植物物种或与所选植物物种性亲和的植物)，那么可认为彼组合物为本发明组合物的由“基本上由……构成”措辞表征的组分。
子叶(Cotyledon)。子叶为种子叶(seed leaf)的一种类型。子叶含有种子的食物贮藏组织。
简并引物。“简并引物”为寡核苷酸，其含有充足的核苷酸变异，当杂交到相似但不完全同源的序列时，所述核苷酸变异可适应碱基错配。
双子叶植物(Dicotyledon/dicot)。胚芽具有两个种子叶或子叶的开花植物。双子叶植物的实例包含(但不限于)：烟草、西红柿、马铃薯、甘薯、木薯、豆科植物(包括苜蓿及大豆)、胡萝卜、草莓、莴苣、橡树、枫树、胡桃、玫瑰、薄荷、南瓜、菊及仙人掌。
DNA插入序列。根据本发明，待插入到植物的基因组中的DNA插入序列包括原生于彼植物或具有彼植物的原生遗传元件的多核苷酸序列。举例来说，在一个实例中，来自本发明的马铃薯变种Y9的pSIM1278的DNA插入序列为原生于马铃薯或野生型马铃薯(一种马铃薯性亲和植物)的非编码多核苷酸，所述非编码多核苷酸在转化后稳定地整合到植物细胞的基因组中，且使与表达黑斑擦伤、天冬酰胺累积及老化甜化有关的基因沉默。DNA插入序列优选地包括两个表达盒，且插入到被称作pSIM1278转化载体的转化载体中。第一盒包括天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)两者的片段，所述片段以反向重复序列的形式排列在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp启动子与颗粒结合合成酶基因(Gbss)的Gbss启动子之间。这些启动子在块茎中具有显著活性。第二盒的功能为使淀粉相关基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子沉默。此盒由淀粉相关基因二激酶-R1(R1)及磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子的片段构成，所述片段可操作地连接到与第一盒相同的Agp及Gbss启动子。第二DNA插入序列来自被称作pSIM1678的转化载体，其包括Rpi-vnt1表达盒和植物液泡转化酶基因VInv的沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白质编码区构成，所述编码区通过其原生启动子和终止子序列调节以赋予对晚疫病的广泛抗性；而沉默盒由来自侧接相反植物启动子pGbss和pAgp的马铃薯VInv基因序列的反向重复序列构成。这些表达盒不含有外源DNA，且仅由来自所选植物物种或来自与所选植物物种性亲和的植物的DNA构成。
胚芽。胚芽为包括于成熟种子内的未成熟植物。
外源。就核酸而言的“外源”意谓所述核酸来源于非植物生物体，或来源于物种与待转化的植物不同的植物，或并非来源于不可与待转化的植物杂交的植物，不属于目标植物的物种。根据本发明，外源DNA或RNA表示真菌、细菌、病毒、哺乳动物、鱼或鸟类的遗传构成中天然存在，但不在待转化的植物中天然存在的核酸。因此，外源核酸为编码(例如)并非由经转化植物天然产生的多肽的核酸。外源核酸不一定必须编码蛋白质产物。根据本发明，所需基因内植物为不含有整合到其基因组中的任何外源核酸的植物。
基因。如本文中所使用，“基因”是指编码区且不包含5'端或3'端到所述区的核苷酸序列。功能性基因为可操作地连接到启动子或终止子的编码区。可使用转化或各种育种方法将一基因引入到一物种的基因组中，无论其来自不同物种抑或相同物种。
基因转换(Converted或Conversion)。基因转换植物是指通过被称为回交的植物育种技术研发的植物，其中除通过回交技术、通过遗传工程或通过突变转移到变种中的一或多个基因外，基本上复原所述变种的所有所需形态学及生理学特征。也可以转移一或多个基因座。
基因重排。是指可在活体内以及活体外自发地发生的遗传元件的重新组合，其引入遗传物质的新组构。举例来说，不同染色体基因座处的多核苷酸的彼此拼接可在活体内在植物发育及有性重组两者期间自发地发生。因此，在活体外通过非天然基因修饰技术进行的遗传元件重组类似于亦可通过活体内有性重组发生的重组事件。
金线虫。马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)(通常被称为金线虫)为影响马铃薯植物的根及块茎的植物寄生线虫。症状包含不良植物生长、枯萎、水分胁迫和养分缺乏。
下胚轴。下胚轴为胚芽或幼苗的在子叶与根之间的部分。因此，其可被视为嫩芽与根之间的过渡区。
框架内。核苷酸三联体(密码子)翻译成植物细胞中的所需重组蛋白质的初生氨基酸序列。具体来说，本发明涵盖以阅读框架连接到第二核酸的第一核酸，其中第一核苷酸序列为基因且第二核苷酸为启动子或相似调节元件。
整合。是指将来自所选植物物种、或来自与所选植物相同物种的植物或与所选植物物种性亲和的植物的核酸序列插入到所选植物物种的细胞的基因组中。“整合”是指仅将原生遗传元件并入到植物细胞基因组中。为通过(例如)同源重组来整合原生遗传元件，本发明可“使用”非原生DNA作为此类方法中的一步骤。因此，本发明将“使用”特定DNA分子与“整合”特定DNA分子到植物细胞基因组中区别开。
引入。如本文中所使用，是指通过包括感染、转染、转化或转导的方法将核酸序列插入到细胞中。
分离。“分离”是指在物理上与其正常、原生环境分离的任何核酸或化合物。经分离物质可维持在含有(例如)溶剂、缓冲液、离子或其它组分的适合溶液中且可呈纯化形式或未纯化形式。
晚疫病。一种由卵菌致病疫霉引起的马铃薯疾病，且亦被称为‘马铃薯疫病’，所述疾病可感染且破坏马铃薯植物的叶、茎干、果实及块茎。
前导序列。基因之前(或5'端)的经转录但不经翻译的序列。
基因座。基因座赋予一或多个性状，例如雄性不育、除草剂抗性、昆虫抗性、疾病抗性、蜡质淀粉、经改进的脂肪酸代谢、经改进的植酸代谢、经改进的碳水化合物代谢及经改进的蛋白质代谢。举例来说，性状可由通过回交、自然突变或诱发突变引入到变种的基因组中的天然存在基因或通过遗传转化技术引入的转基因来赋予。基因座可包括整合在单一染色体位置处的一或多个对偶基因。
可销售产量。可销售产量为收获的直径在2英寸与4英寸之间的所有块茎的重量。可销售产量按cwt(英担)计量，其中cwt＝100磅。
单子叶植物(Monocotyledon或monocot)。胚芽具有一个子叶或种子叶的开花植物。单子叶植物的实例包含(但不限于)草皮草、玉米、水稻、燕麦、小麦、大麦、高梁、兰花、鸢尾、百合、洋葱及棕榈。
原生。“原生”遗传元件是指天然存在于、来源于或属于待转化的植物的基因组的核酸。因此，从待转化的植物或植物物种的基因组分离或从与待转化的植物物种性亲和或可杂交的植物或物种分离的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子为该植物物种“原生”的，即原产的。换言的，原生遗传元件表示植物育种者可获得以用于通过传统植物育种改进植物的全部遗传物质。根据本发明，原生核酸的任何变体亦被视为“原生”的。就此而言，“原生”核酸亦可从植物或其性亲和物种分离且经修饰或突变，使得所得变体与从植物分离的未经修饰的原生核酸的核苷酸序列相似度大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％。原生核酸变体的核苷酸序列相似度亦可小于约60％、小于约55％或小于约50％。从植物分离的“原生”核酸亦可编码从所述核酸转录及翻译的天然存在蛋白质产物的变体。因此，原生核酸可编码与自其分离所述核酸的植物中表达的未经修饰的原生蛋白质具有以下氨基酸序列相似度的蛋白质：大于或等于99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％或60％。
原生遗传元件。根据本发明，“原生遗传元件”可并入且整合到所选植物物种基因组中。原生遗传元件是从属于所选植物物种的植物分离或从与所选植物物种性亲和的植物分离。举例来说，并入到所栽培马铃薯(马铃薯(Solanum tuberosum))中的原生DNA可来源于任何基因型的马铃薯(S.tuberosum)或与马铃薯性亲和的任何基因型的野生型马铃薯物种(例如，S.demissum)。
天然存在核酸。天然存在核酸存在于所选植物物种的基因组内，且可为DNA分子或RNA分子。正常存在于植物物种的基因组中的限制位点的序列可经工程改造为外源性DNA分子(例如，载体或寡核苷酸)，即使彼限制位点并未物理地从彼基因组分离。因此，本发明准许合成生成核苷酸序列(例如，限制酶识别序列)，只要彼序列为所选植物物种的基因组中天然存在的或与待转化的所选植物物种性亲和的植物中天然存在的。
可操作地连接。以使得两个或更多个分子在组合时在植物细胞中适当地起作用的方式来组合所述分子。举例来说，当启动子控制结构基因的转录时，启动子可操作地连接到结构基因。
植物。如本文中所使用，术语“植物”包含(但不限于)被子植物和裸子植物，例如马铃薯、西红柿、烟草、苜蓿、莴苣、胡萝卜、草莓、甜菜、木薯、甘薯、大豆、玉米、草皮草、小麦、水稻、大麦、高梁、燕麦、橡树、桉树、胡桃及棕榈。因此，植物可为单子叶植物或双子叶植物。如本文中所使用，词“植物”亦涵盖植物细胞、种子、植物子代、有性产生抑或无性产生的繁殖体，及这些繁殖体中任一者的后代，例如插条或种子。植物细胞包含悬浮培养物、愈合组织(callus)、胚芽、分生组织区、愈合组织(callustissue)、叶、根、嫩芽、配子体、孢子体、花粉、种子及小孢子。植物可处于成熟期的各阶段，且可在液体或固体培养物中生长，或在盆、温室或田间中的土壤或适合培养基中生长。所引入前导序列、尾部序列或基因序列在植物中的表达可为暂时性或永久性的。“所选植物物种”可为(但不限于)这些“植物”中的任一者的物种。
植物部分。如本文中所使用，术语“植物部分”(或马铃薯植物或其部分)包含(但不限于)原生质粒、叶、茎干、根、根尖、花药、雌蕊、种子、胚芽、花粉、胚珠、子叶、下胚轴、花、块茎、芽眼、组织、叶柄、细胞、分生组织细胞及其类似者。
植物物种。属于至少呈现某些性亲和性的各种正式命名的植物物种的植物组。
植物转化及细胞培养。广义是指遗传修饰植物细胞且将其转移到适当的植物培养基中以维持、进一步生长及/或进一步发育的方法。
精确育种。是指通过将核酸，例如从所选植物物种、或从与所选植物物种相同的另一植物或从与所选植物物种性亲和的物种中分离的原生基因和调节元件，稳定地引入到个别植物细胞中，且随后将这些遗传修饰的植物细胞再生成整个植物以改进植物。由于没有未知的或外源核酸永久地并入到植物基因组中，因此本发明的技术利用通过常规植物育种亦可获得的相同遗传物质。
子代。如本文中所使用，其包含通过使两种马铃薯植物(其中至少一种植物包含马铃薯栽培品种Y9)杂交而产生的F1马铃薯植物，且子代进一步包含(但不限于)与轮回亲本系的F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8、F9及Y9代杂种。
数量性状基因座(QTL)。数量性状基因座(QTL)是指在一定程度上控制可用数值表示的性状的遗传基因座，所述性状通常为连续分布的。
重组。如本文中所使用，其广义上描述藉以可克隆基因、可定序DNA以及可产生蛋白质产物的各种技术。如本文中所使用，所述术语还描述在将基因转移到植物宿主系统的细胞中之后所产生的蛋白质。
再生。再生是指由组织培养物培育植物。
调节序列。是指对熟习所属领域者而言为标准且已知的那些序列，所述序列可包含于表达载体中以在植物系统中增加及/或最大化相关基因的转录或所得RNA的翻译。这些序列包含(但不限于)启动子、肽输出信号序列、内含子、聚腺苷酸化及转录终止位点。修饰核酸结构以增加在植物中的表达水平的方法一般来说亦为所属领域中已知的(例如参见罗杰斯(Rogers)等人，260《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》3731-38，1985；科尔内霍(Cornejo)等人，23《植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)》567:81，1993)。在工程改造植物系统以影响蛋白质的转录速率中，所属领域中已知的各种因素可产生影响，所述因素包含例如正面作用序列或负面作用序列(强化子和沉默子)的调节序列和染色体结构。本发明规定，这些因素中的至少一者可用于工程改造植物以表达相关蛋白质。本发明的调节序列为原生遗传元件，即是从待修饰的所选植物物种中分离的。
选择性标记。“选择性标记”通常为编码赋予对抗生素、除草剂或有毒化合物的某种抗性的蛋白质且用于鉴定转化事件的基因。选择性标记的实例包含：编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(spt)基因、将甘露糖-6-磷酸转化为果糖-6磷酸的磷酸甘露糖异构酶(pmi)、编码卡那霉素(kanamycin)抗性及遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因、编码对潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶(hpt或aphiv)基因、编码对磺酰脲型除草剂的抗性的乙酰乳酸合成酶(als)基因、编码对用于抑制谷氨酰胺合成酶的作用的除草剂(例如草丁膦(phosphinothricin)或巴斯特(basta))的抗性的基因(例如，bar基因)或所属领域中已知的其它类似基因。
有义抑制。通过在转基因植物中表达内源性基因的全部或部分基因的一或多个额外复本来减少所述基因的表达。
比重。如本文中所使用，“比重”为密度的表示且为马铃薯质量的测量值。块茎同淀粉含量的比重与干物质或总固体的百分比之间存在高相关性。更高比重有助于加工产品的更高回收率和更优选质量。
T-DNA样(T-DNA-Like)。“T-DNA样”序列为从所选植物物种、或从与所选植物物种性相容的植物中分离的核酸，且其与农杆菌种T-DNA具有至少75％、80％、85％、90％或95％但非100％的序列一致性。T-DNA样序列可含有分别能够将核苷酸序列整合到另一多核苷酸中的一或多个边缘或边缘样序列。
总产量。总产量是指所有所收获块茎的总重量。
尾部序列。基因之后(或3'端)的经转录但不经翻译的序列。
转录的DNA。包括基因以及与所述基因相关联的未经翻译的前导序列和尾部序列两者的DNA，其通过前面的启动子的作用转录为单个mRNA。
植物细胞的转化。将DNA稳定地整合到植物细胞的基因组中的方法。“稳定地”是指多核苷酸在细胞基因组中及通过细胞基因组的永久性或非暂时性的保留及/或表达。因此，经稳定地整合的多核苷酸为在经转化细胞基因组内为固定物的多核苷酸，且可通过细胞或所得经转化植物的连续子代来加以复制及繁殖。转化可在天然或人工条件下使用所属领域中各种熟知方法发生。转化可依赖于用于将核酸序列插入到原核或真核宿主细胞中的任何已知方法，包含农杆菌介导的转化方案、病毒感染、晶须(whisker)、电穿孔、热休克、脂质粒转染、聚乙二醇处理、微注射及粒子轰击。
转基因。将被插入到宿主基因组中的包括蛋白质编码区的基因。在本发明的上下文中，从宿主基因组中分离包括转基因的元件。
转基因植物。含有至少一个转基因的经遗传修饰的植物。
变体。如本文中所使用，“变体”应被理解为意谓偏离特定基因或蛋白质的标准或给定核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。术语“同功异型”、“同型”及“类似物”也是指核苷酸或氨基酸序列的“变体”形式。通过添加、去除或取代一或多个氨基酸或改变核苷酸序列而变化的氨基酸序列可被视为“变体”序列。变体可具有“保守”改变，其中经取代的氨基酸具有类似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。变体可具有“非保守”改变，例如用色氨酸替代甘氨酸。类似的微小变化也可包括氨基酸的缺失或插入或两者都有。确定哪些氨基酸残基可经取代、插入或缺失的指导可使用所属领域中熟知的计算机程序(例如Vector NTI Suite(马里兰州因弗马斯公司(InforMax，MD))软件)获得。
蔓藤成熟度(Vine Maturity)。蔓藤成熟度是指植物持续利用碳水化合物及光合作用的能力。蔓藤成熟度按1到5的等级评分，其中1＝死蔓藤且5＝绿色、仍开花的蔓藤。
由于马铃薯为四倍体植物、高度异型接合且对近交衰退敏感，因此将所需性状插入到马铃薯植物的基因组中特别困难。因此，有效研发在使用常规育种处理期间产生较少丙烯酰胺和较少有害梅纳反应(Maillard reaction)产物的转基因马铃薯植物是极其困难的，所述梅纳反应产物包含N-亚硝基-N-(3-酮-1,2-丁二醇)-3'-硝基酪胺酸(王(Wang)等人，《毒理学档案(Arch Toxicol)》70:10-5，1995)、5-羟基甲基-2-糠醛(扬科夫斯基(Janzowski)等人，《食品及化学毒理学(Food Chem Toxicol)》38:801-9，2000)及具有诱发突变特性的其它梅纳反应产物(柴本(Shibamoto),《临床及生物研究进展(Prog Clin BiolRes)》304:359-76，1989)。
已试验若干方法且正进行研究以通过过程改变、减少右旋糖及例如天冬酰胺酶、柠檬酸盐以及竞争性氨基酸的添加剂来减少丙烯酰胺。贯穿马铃薯产业实施过程改变的所需资金费用将花费数百万美元。除费用以外，这些过程改变具有相当多的缺点，包含与例如天冬酰胺酶或柠檬酸盐的添加剂相关联的潜在不良风味。通常，炸薯条制造商在法式炸薯条的加工期间添加右旋糖以产生所需金褐色颜色，但右旋糖亦增加通过梅纳反应的丙烯酰胺的形成。仅通过从所述过程中省略右旋糖，即出现丙烯酰胺的显著减少；然而，必须用某种其它方式产生特征标志性的金褐色(例如，通过添加类似胭脂树红的色素)。替代色素的使用引起通过那些褐变反应产生的典型风味的缺失。使用添加剂来减少类似天冬酰胺的反应物的另一挑战为，冻结存储期间发生的水分迁移使得天冬酰胺返回到表面且丙烯酰胺增加。最后，在马铃薯被擦伤后发生的变黑影响加工法式炸薯条及炸薯片的质量及回收率。在加工之前必须修减或丢弃被破坏及擦伤的马铃薯，从而导致质量挑战或经济损失。
本发明的“原生技术”策略通过以下方法解决马铃薯产业改进马铃薯的农艺特征及营养价值的需要：减少造成黑斑擦伤的多酚氧化酶-5(PPO-5)的表达；减少造成天冬酰胺累积的天冬酰胺合成酶-1(Asn-1)的表达，天冬酰胺为丙烯酰胺形成之前体；减少将蔗糖转化为葡萄糖及果糖的酶液泡转化酶的表达；及/或减少磷酸化酶-L及激酶-R1的表达，所述酶为与还原糖的累积相关联的酶，所述还原糖与例如天冬酰胺的氨基酸正常反应且形成包含丙烯酰胺的有毒梅纳产物。块茎中的这些基因的部分或完全沉默降低产生丙烯酰胺的可能性。使用本发明的原生技术允许在不将任何外源遗传物质整合到植物的基因组中的情况下，仅通过用仅含有非编码调节区的“原生”遗传物质(即，从马铃薯植物或与马铃薯植物性亲和的植物获得的遗传物质)转化马铃薯而将所需性状并入到有商业价值的马铃薯植物变种的基因组中。所需性状包括对碰撞诱发的黑斑擦伤的高抗性、对晚疫病感染的抗性增加、丙烯酰胺前体天冬酰胺的形成减少及还原糖的累积减少，其结果为有毒梅纳产物(包括丙烯酰胺)的堆积减少、经改进质量及食品颜色控制。由于马铃薯为四倍体植物、高度异型接合且对近交衰退敏感，因此通过传统育种将这些所需性状并入到现有马铃薯变种中是不可能达成的。
本发明中使用的非编码马铃薯植物DNA插入序列为马铃薯植物基因组原生的且不含有任何农杆菌DNA。DNA插入序列中的一者优选地不可两个表达盒，且经插入到被称作pSIM1278转化载体的转化载体中。第一盒包括天冬酰胺合成酶-1基因(Asn1)和多酚氧化酶-5基因(Ppo5)两者的片段，所述片段以反向重复序列的形式排列在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp启动子与颗粒结合合成酶基因(Gbss)的Gbss启动子之间。这些启动子在块茎中具有显著活性。第二盒的功能为使淀粉相关基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子沉默。此盒由淀粉相关基因二激酶-R1(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子的片段构成，所述片段可操作地连接到与第一盒相同的Agp及Gbss启动子。这些表达盒不含有外源DNA，且仅由来自所选植物物种或来自与所选植物物种性亲和的植物的DNA构成。第二DNA插入序列来自被称作pSIM1678的转化载体，其包括Rpi-vnt1表达盒和植物液泡转化酶基因VInv的沉默盒。Rpi-vnt1基因盒由VNT1蛋白质编码区构成，所述编码区通过其原生启动子和终止子序列调节以赋予对晚疫病的广泛抗性；而沉默盒由来自侧接相反植物启动子pGbss和pAgp的马铃薯VInv基因序列的反向重复序列构成。第一盒的功能为赋予对晚疫病的抗性，而第二盒的功能为使液泡转化酶基因沉默从而减少葡萄糖和果糖。
本发明中使用的具有商业价值的马铃薯植物变种为Atlantic。Atlantic为Y9的亲本变种。植物中等大小，具有厚实竖直的茎干及略微隆起、具有稀疏柔毛的结节。叶鲜明、中等绿色、平滑且具有适当柔毛，具有明显的翼瓣、较大的不对称初级小叶和许多二级及三级小叶。花朵较多，具有绿色锥形的有柔毛的萼裂片、浅淡紫色花冠、橙色花药和大量可育花粉。所述栽培品种对疮痂病和轮枝菌(Verticillium)萎蔫病耐受，对红眼病(pinkeye)具有抗性，对种类A金线虫、病毒X、块茎网状坏死具有高度抗性，且对黑斑擦伤展现一定抗性。块茎易患内部热坏死，特别在温热干季的砂质土壤中。在一些种植区域中，较大直径块茎(直径>4英寸)的空心可能很严重。块茎为卵形到圆形，具有浅色到深色的鳞片状网状皮、中等浅度芽眼和白色果肉。块茎休眠期中等时长。由于高产量潜能、高比重及均一块茎大小及形状，因此Atlantic为用于从田间或从极短期存储的切成薄片的标准变种(韦伯(Webb)等人，1978年)。所述变种为可育的且主要在东北及东南部种植，尤其用于生产薯片。
本发明提供一种具有重要市场价值的马铃薯变种(即，Atlantic)，其通过转化载体pSIM1278转化之后通过第二转化载体pSIM1678转化，使用聚合酶链式反应而非标记来进行鉴别且成功地被繁殖。还提供由本发明的马铃薯植物变种Y9的块茎制成的食品制品。根据经济合作及发展组织(OECD)，马铃薯栽培品种Y9具有以下独特植物变种标识符：
用原生DNA沉默目标基因减少马铃薯植物变种Y9的块茎中目标基因的RNA转录物含量。马铃薯栽培品种Y9含有通过多种机制减少块茎中还原糖含量的表达盒。通过用pSIM1278转化，引入用于淀粉相关基因(R1)和磷酸化酶-L基因(PhL)的启动子的沉默盒，而用pSIM1678的转化引入用于转化酶基因(VInv；叶(Ye)等人，2010)的沉默盒。总地来说，这些性状通过推迟将淀粉和蔗糖转化为还原糖(葡萄糖和果糖)而起作用。
因此，本发明的马铃薯植物变种Y9的块茎并有高度合乎需要的性状，包含游离酰胺氨基酸天冬酰胺及谷氨酰胺的比例降低，此与油炸或烘焙后丙烯酰胺形成减少相关联。具体来说，本发明的马铃薯变种Y9的特征在于：游离天冬酰胺含量减少两倍到大于四倍、与黑斑擦伤相关联的变色减少及对晚疫病的抗性增加。此外，本发明的马铃薯变种Y9展现在存储期间延迟淀粉降解为还原糖葡萄糖和果糖。淀粉到糖转化的障碍进一步减少老化甜化和丙烯酰胺形成且限制热诱发的褐变。
由于本发明的马铃薯变种Y9的块茎在热处理后产生显著较少的丙烯酰胺且不带有任何潜在有害的外源基因，因此其在马铃薯行业及食品市场中是极其有价值的。
实例
本发明使用原生技术将原生非编码DNA整合到所选马铃薯植物变种的基因组中，以研发新型基因内的马铃薯植物变种。所述方法包含：性状鉴定、载体设计、将载体并入到农杆菌中、选择受体马铃薯变种、植物转化、证明开放阅读框的缺失及确认新型马铃薯植物变种仅含有原生DNA。本发明的马铃薯栽培品种Y9相比于其未经转化的对应物，具有形成丙烯酰胺的降低的可能性、较少量的蔗糖，且对黑斑擦伤更具有抗性。此外，本发明的马铃薯栽培品种Y9对晚疫病的抗性增加。
实例1：pSIM1278转化载体主链
质粒pSIM1278为用于转化马铃薯的19.7kb二元转化载体。此实例展示遗传元件的来源、主链的克隆步骤及T-DNA序列，以及元件在质粒中的次序。
质粒主链(图1和表1)含有两种明确表征的细菌性复制起点。pVS1(pVS1Sta及Rep)使得能够将质粒维持于农杆菌中，且pBR322(pBR322bom及ori)使得能够将质粒维持于大肠杆菌(Escherichia coli)中。农杆菌DNA超驱动区序列促进RB处的裂解，且大肠杆菌nptII基因为细菌性卡那霉素选择性标记。主链含有包括农杆菌异戊烯基转移酶(ipt)基因的表达盒，所述异戊烯基转移酶基因侧接有Ranger Russet马铃薯多聚泛素(Ubi7)启动子和Ranger Russet马铃薯多聚泛素(Ubi3)终止子。ipt盒为用于选择宿主植物中的质粒主链DNA整合的可筛选表达型。当ipt存在于经转化植物组织中时，其过度表达引起植物激素细胞分裂素的过度产生，从而导致植物具有发育不良的表达型，叶子异常且不能生根。
主链部分并未转移到植物细胞中。主链的各种元件描述于表1中。
表1.pSIM1278主链的遗传元件
1http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html-(pCAMBIA载体的通式结构图谱)
实例2：pSIM1278转化载体T-DNA
用于pSIM1278的包含侧接边缘序列的pSIM1278DNA插入区长10,148bp，从1bp到10,148bp。pSIM1278DNA插入序列仅由原生DNA构成且稳定地整合到马铃薯基因组中。pSIM1278DNA插入序列或其功能性部分为本发明的马铃薯植物变种中整合的载体pSIM1278的唯一遗传物质。
pSIM1278DNA插入序列描述于下文图1(连同载体主链区)、图2及表2中。LB和RB序列(各自25bp)经合成设计成类似于根癌农杆菌的T-DNA边缘且与其功能类似。修订GenBank寄存号AY566555以阐明边缘区域的DNA来源。描述为遗传元件5及10的ASN1被称为StAst1(乔拉(Chawla)等人，2012年)。
质粒pSIM1278T-DNA含有两个表达盒：
第一盒(元件4到12，表2)引起Asn1及Ppo5在经转化马铃薯变种中的下调。其由Asn1的两个相同405bp片段及Ppo5的两个相同144bp片段构成。Asn1及Ppo5的片段经排列为由非编码157bp Ranger Russet马铃薯核苷酸间隔元件分离的反向重复序列。Asn1及Ppo5片段排列在两个汇集马铃薯启动子之间，排列在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp启动子与颗粒结合淀粉合成酶基因(Gbss)的Gbss启动子之间，所述启动子在块茎中具有主要活性。这些启动子驱动反向重复序列的表达以产生双链RNA且下调Asn1及Ppo5。
第二盒(元件14到21，表2)引起PhL及R1在经转化马铃薯变种中的下调。其由PhL启动子区(pPhL)的两个相同509bp片段及R1启动子区(pR1)的两个相同532bp片段构成。pPhL及pR1片段经排列为由Ranger Russet马铃薯多聚泛素基因的非编码258bp片段分离的反向重复序列。类似于第一盒，pPhL及pR1片段排列在马铃薯Agp启动子与Gbss启动子之间，且通过所述启动子转录。
表2.pSIM1278T-DNA的遗传元件，从左侧边缘位点到右侧边缘
由此，如可从表1及表2看出，pSIM1278质粒为经设计用于马铃薯植物转化的二元载体。载体主链含有在大肠杆菌及农杆菌两者中用于复制的序列以及用于筛选以消除带有载体主链DNA的植物的ipt标记。T-DNA区由侧接有LB及RB序列的两个表达盒构成。在用含有pSIM1278载体的农杆菌接种宿主植物组织时，pSIM1278的T-DNA区转移到宿主基因组中。
描述于表2中用于产生本发明的马铃薯栽培品种Y9的DNA插入序列并不激活邻近基因且不会不利地影响马铃薯植物变种的表达型。
实例3：pSIM1678转化载体主链
质粒pSIM1678为用于转化马铃薯的18.6kb二元转化载体。此实例展示遗传元件的来源、主链的克隆步骤及T-DNA序列，以及元件在质粒中的次序。
质粒主链(图3；表3)含有两种明确表征的细菌性复制起点。pVS1(pVS1Sta及Rep)使得能够将质粒维持于农杆菌中，且pBR322(pBR322bom及ori)使得能够将质粒维持于大肠杆菌中。农杆菌DNA超驱动区序列促进RB处的裂解，且大肠杆菌nptII基因为细菌性卡那霉素选择性标记。主链含有包括农杆菌异戊烯基转移酶(ipt)基因的表达盒，所述农杆菌异戊烯基转移酶基因侧接有Ranger Russet马铃薯多聚泛素(Ubi7)启动子和Ranger Russet马铃薯多聚泛素(Ubi3)终止子(加巴里诺(Garbarino)及贝尔纳普(Belknap)，1994年)。ipt盒为用于选择宿主植物中的质粒主链DNA整合的可筛选表达型。当ipt存在于经转化植物组织中时，其过度表达引起植物激素细胞分裂素的过度产生，从而导致植物具有发育不良的表达型，叶子异常且不能生根。
主链部分并未转移到植物细胞中。主链的各种元件描述于表3中。
表3.pSIM1678主链的遗传元件
实例4：pSIM1678转化载体T-DNA
用于pSIM1678的包括侧接边缘序列的pSIM1678DNA插入区长9,090bp，从1bp到9,090bp。pSIM1678DNA插入序列仅由原生DNA构成且稳定地整合到马铃薯基因组中。pSIM1678DNA插入序列或其功能性部分为本发明的马铃薯植物变种中整合的载体pSIM1678的唯一遗传物质。
pSIM1678DNA插入序列描述于下文图3(连同载体主链区)及表4中。在表4中，LB及RB序列(各自25bp)经合成设计成类似于根癌农杆菌的T-DNA边缘且与其功能类似。修订GenBank寄存号AY566555以阐明边缘区域的DNA来源。
质粒pSIM1678T-DNA为1-bp到9,090-bp且含有两个表达盒(图3)：
第一盒(元件4到6，表4)含有来源于马铃薯(Solanum venturii)的2,626bp Rpi-vnt1(Vnt1)基因。基因产物VNT1为与保护马铃薯免受致病疫霉引起的晚疫病感染的植物免疫反应有关的R型蛋白质。基因在原生Vnt1启动子pVnt1及终止子tVnt1下表达。
第二盒(元件8到14，表4)引起液泡转化酶(VInv)在经转化马铃薯变种中的下调。其由两个VInv片段(元件10及12，表4)构成，所述片段经排列为分离开的反向重复序列。VInv片段排列在两个汇集马铃薯启动子之间，排列在ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因(Agp)的Agp启动子与颗粒结合淀粉合成酶基因(Gbss)的Gbss启动子之间，所述启动子在块茎中具有显著活性。这些启动子驱动反向重复序列的表达以产生双链RNA且下调VInv。
表4.pSIM1678T-DNA的遗传元件，从左侧边缘位点到右侧边缘
由此，如可从表3及表4看出，pSIM1678质粒为经设计用于马铃薯植物转化的二元载体。载体主链含有在大肠杆菌及农杆菌两者中用于复制的序列以及用于筛选以消除带有载体主链DNA的植物的ipt标记。T-DNA区由侧接有LB及RB序列的两个表达盒构成。在用含有pSIM1678载体的农杆菌接种宿主植物组织后，pSIM1678的T-DNA区转移到宿主基因组中。
实例5：农杆菌菌株及转染
通过精确地使高毒力质粒pTiBo542的转移DNA缺失来研发C58源性农杆菌菌株AGL1(拉佐(Lazo)等人，1991年)。将转座子插入一般性重组基因(recA)中使例如pSIM1278的重组质粒载体稳定(图1)。AGL1呈现对羧苄青霉素(carbenicillin)和立复霉素(rifampicin)的抗性，且使用特美汀(timentin)从经转化马铃薯组织消除。在选择之后，通过插入到植物基因组中的源于马铃薯的表达盒，植物不含有抗生素和农杆菌两者。
将母株植物维持于具有40ml半强度(half-strength)M516(Phytotechnology)培养基的品红色箱(magenta box)中，所述培养基含有3％蔗糖和2g/l结冷胶(繁殖介质)。从四周龄植物切下四到六毫米的马铃薯节间段，用携载pSIM1278的农杆菌AGL1菌株感染，且转移到含有3％蔗糖和6g/l琼脂(共栽培介质)的组织培养基中。在两天之后，将经感染外植体转移到含有3％蔗糖、6g/l琼脂和150mg/l特美汀的M404(Phytotechnology)培养基中以消除农杆菌(无激素培养基)。所述方法的细节描述于瑞秋(Richael)等人(2008年)中。
在一个月之后，将经感染外植体转移到缺乏任何合成激素的新鲜培养基中，且珀西瓦尔生长箱(Percival growth chamber)中在24℃下于16小时光周期下进行培育，所述经感染外植体在生长箱中开始形成嫩芽。许多嫩芽表达ipt基因且呈现细胞分裂素过度产生的表达型；不考虑将这些嫩芽用于进一步分析。PCR基因分型表明，其余嫩芽中有约0.3％到1.5％在缺乏ipt基因的同时，还含有至少部分P-DNA。因此，未使用标记来选择经转化植物。关于不含基于ipt的标记的植物转化的细节由瑞秋(Richael)等人公开(2008年)。
在外植体感染两天后，开始进行消除农杆菌的程序。出于此目的，使组织经受抗生素特美汀(150mg/L)处理，直到证实其不含活的农杆菌为止。通过在28℃下，在营养培养液酵母提取物(NBY培养基)上培育具有转化事件的茎干片段2周而获得证据。(重复两次)。根据97CFR第340部分，仅当不含活的农杆菌时才运输经转化植物且将其种植在田间。
Atlantic Y9项目含有由用具有不同质粒进行的两个独立转化得到的插入序列。第一插入序列，即质粒pSIM1278，含有由经设计以使块茎中多达四个马铃薯基因，即Asn1、Ppo5、R1及PhL沉默的反向重复序列构成的两个盒。类似地，第二质粒pSIM1678含有由使块茎中的VInv基因沉默的反向重复序列构成的盒，所述盒同时还含有在原生马铃薯启动子下的Rpi-vnt1基因的复本。
通过DNA凝胶印迹分析来分析马铃薯植物变种，以测定所整合的DNA插入序列的结构及复本数且确认不存在载体主链序列。
实例6：证明不存在载体主链DNA
不同于许多商业转基因作物，本发明的马铃薯栽培品种通过以下两种不同方法来确认不含用于转化的源于农杆菌的DNA序列(例如，载体主链DNA)：1)首先，确定载体主链中负选择性异戊烯基异构酶(ipt)标记基因的存在或缺失，如将包含ipt基因表达盒的主链DNA从农杆菌无意转移到植物细胞将触发ipt基因表达，且因此形成细胞分裂素类型激素异戊烯基腺苷，如果植物具有与所述质粒主链中的负选择性异戊烯基异构酶(ipt)标记基因相关联的表达型，那么弃去所述植物；及2)接着对已经过第一轮筛选方法的经转化马铃薯植物使用南方墨点(southern blot)杂交以确认不存在主链DNA。
由此，以上两个分析已展示，Atlantic Y9项目不含有来从用于转化的任一质粒的主链。
实例7：所插入DNA的稳定性
细菌性T-DNA在插入到植物中之后并非总是稳定的。所估计不稳定率(0.5-5.9×10-4)与减数分裂相关联(缪勒(Müller)等人，1987年；科勒(Conner)等人，1998年)，这与马铃薯不相关，因为马铃薯系以无性繁殖再产生的。因此，预期DNA插入序列为稳定的。由于块茎为商业种植的，故使用块茎而非种子来定义后续代。
使用分子及表达型分析来评定遗传稳定性。对三代Y9马铃薯(G0到G3)内分离的基因组DNA使用南方墨点分析展示，插入序列的结构是稳定的，而通过测量第二代田间种植块茎中的多酚氧化酶活性来评定表达型稳定性。此方法展示在向马铃薯的切割表面施加儿茶酚之后PPO沉默的可视证据。进行这些研究以确保Y9中的所需遗传变化在维持性状的同时在多个纯系循环内保持稳定。
通过使用南方墨点法比较三个连续纯系代(G1、G2及G3)与初始转化体(G0)来评估DNA插入序列的稳定性。预期稳定的DNA插入序列维持相同结构且因此在植物的多个代内产生相同酶切剪切模式。为测试Y9项目中的插入序列的稳定性，使用杂合到pSIM1278及pSIM1678两者的插入序列的区域的两个探针(GBS1及AGP)及对pSIM1678插入序列具有特异性的两个探针(INV及VNT1)来比较其剪切模式。由于与这些探针杂合的DNA序列包含于马铃薯基因组中以及在一或多个DNA插入序列内，因此预期内源性及插入序列特异性条带两者皆在南方墨点中。
所有基因组DNA样品皆用限制酶EcoRV来进行酶切，且与对AGP或GBS1中任一者具有特异性的探针杂交。选择EcoRV用于这些研究，这是由于EcoRV在两个插入序列内剪切以提供独特条带模式，在pSIM1278插入序列中具有预测大小(例如，2.3kb)的固有条带。在所有Y9样品之间的条带模式对于两个探针彼此相同。存在于Atlantic对照组中的多个条带亦在Y9中发现，但Y9也含有对应于pSIM1278及pSIM1678插入序列的条带。在所有已分析的Y9的世代之间这些条带类似地为一致的，从而指示两个插入序列的遗传稳定性。
使用对pSIM1678插入序列具有特异性的两个探针进行第二分析。对于此分析，用限制酶(XbaI)剪切基因组DNA样品，并与VNT1及INV探针杂交。选择XbaI作为限制酶用于这些研究，这是由于XbaI内部地剪切pSIM1678并产生已知大小(例如，用于针对INV探针为4.6kb)的一条带。再者，内源性及特异性插入序列条带两者皆检测具有与三个所分析世代之间一致的条带模式。遗传及表达型分析指示，从pSIM1278及pSIM1678两者的转化产生的插入序列在三代内是稳定的。鉴于三代内所表明的稳定性，有可能在后续无性繁殖的循环期间将维持稳定性。
实例8：基因沉默的效果及组织特异性
通过引入含有来源于基因的序列的反向重复序列及靶向用于沉默的启动子，来达成沉默。尽管存在与双链RNA介导的沉默有关的若干平行路径，但认为这些反向重复序列的转录为经与病毒防卫有关的细胞机制加工(富萨罗(Fusaro)等人，2006年)。Y9马铃薯含有三个独特盒，所述盒含有来自总共五个不同马铃薯基因的序列。pSIM1278结构由两个基因沉默盒构成(参见图4，上游结构)。一个盒含有来自两个基因(天冬酰胺合成酶-1(Asn1)及多酚氧化酶-5(Ppo5))的序列的反向重复序列。第二个盒包含来自淀粉相关基因(R1(531-bp)及磷酸化酶-L(PhL)(508-bp))的启动子的序列。通过pSIM1678结构引入最后一个盒，该盒包含含有来自液泡转化酶(VInv)基因的序列的反向重复序列(参见图4，下游结构)。
所有三个沉默盒受自马铃薯的Agp及Gbss基因的同一组明确表征及组织特异性激活子调控，相比于光合活性组织和根，所述激活子在块茎中具有高度活性((中田(Nakata)等人，1994年；维瑟(Visser)等人，1991年)。因此，预期表达及基因沉默在块茎中最有效且很大程度上受限于块茎。
所有五个靶标基因的表达以北方墨点(northern blot)分析来表征，以测定每一盒的基因沉默效果。且如下文表5所展示，所有五个基因在块茎中皆展示为下调。
表5.RNAi靶基因在Y9组织中表达的汇总
| 基因 | 块茎 | 叶 | 茎干 | 根 | 花 |
| Asn1 | √<sup>1</sup> | √ | - | - | √ |
| Ppo5 | √ | - | - | - | - |
| PhL | √ | - | - | - | - |
| R1 | √ | - | - | - | - |
| VInv | √ | - | - | - | √ |
1√＝下调，-＝不下调，n/o＝未观测到。
在Y9项目中观测到Asn1、Ppo5、PhL、R1及VInv基因的块茎特异性下调。除叶中的Asn1以及花中的Asn1及VInv部分下调以外，其它组织中的表达水平不受影响。
实例9：马铃薯栽培品种Y9特征概述
通过提高对晚疫病的抗性、减少造成黑斑擦伤的酶的表达及通过降低反应物(即天冬酰胺及还原糖)的浓度而减少丙烯酰胺，马铃薯变种Y9解决马铃薯产业改进质量的需要。用原生于马铃薯植物基因组且不含有外源DNA、农杆菌DNA、病毒标记或载体主链序列的核酸序列来转化马铃薯变种Y9。另外，进行农艺研究以确保除与性状相关联的特征外，项目与常规对照组相同生长。
在2014年期间在七个美国地点进行田间试验。此研究的目的是评估Y9马铃薯相比于未转化对照组(亲本变种Atlantic)的表达型性能、块茎及生态交互作用。
表达型、块茎及生态交互作用研究并未指示，Y9与Atlantic对照组之间存在任何有意义的差异。
针对表达型特征中的任一者的检测不存在统计学差异，从而指示就表达型而言Y9与Atlantic相当。
对于块茎评定，Y9的比重高于对照组，但在可见于常规马铃薯的值的范围内。此改变不会更改Y9的环境影响，所述环境影响与常规马铃薯系相同的。
对于昆虫、疾病、及非生物应激源以及节肢动物丰度无差异支持Y9的生态交互作用与常规马铃薯相同的结论。
表6.表达型、产量及定级特征
表达型性能、块茎评估及生态交互作用研究未指示Y9与Atlantic对照组之间存在任何有意义的差异。对于表达型特征中的任一者的检测不存在统计学差异。对于块茎评估，Y9的比重高于对照组，但在可见于常规马铃薯中的值的范围内。此改变不会更改Y9的环境影响，所述环境影响与常规马铃薯是相同的。对于昆虫、疾病、及非生物应激源以及节肢动物丰度无差异支持Y9的生态交互作用与常规马铃薯相同的结论。
实例10A：2013年实验，马铃薯栽培品种Y9晚疫病效果
此研究的目的是评估马铃薯项目Y9对叶面晚疫病(致病疫霉)的田间效果。
在2013年期间在三个地点进行田间试验。用US-8、US-22及/或US-23晚疫病菌株来接种样地。在整个季节中对叶面感染的程度进行定级。
相比于Y9的非转化亲本对照组，在Y9中观测到晚疫病叶面感染显著减少，从而表明晚疫病抗性性状对所测试致病疫霉菌株的效果。
实例10B：2014年实验，马铃薯栽培品种Y9晚疫病效果
此研究的目的是评估马铃薯项目Y9对叶面晚疫病(致病疫霉)的田间效果。
在2014年期间在两个地点进行田间试验。用US-23晚疫病菌株来接种样地。在整个季节中对叶面感染的程度进行定级。
相比于Y9的非转化亲本对照组，在Y9中观测到晚疫病叶面感染显著减少，从而表明晚疫病抗性性状对所测试致病疫霉菌株的效果。
以引用的方式并入
本文中所引用的所有参考文献、论文、公开案、专利、专利公开案以及专利申请案皆出于所有目的以全文引用的方式并入。然而，提及本文引用的任何参考文献、论文、公开案、专利、专利公开案以及专利申请案，不视为且不应认为是承认或以任何形式暗示其构成有效现有技术或形成世界上任何国家的公共常识的部分。
应理解，上文描述仅为说明性实施例和实例的表示。出于读者的便利性，上文描述聚焦于教示本发明的原理的所有可能实施例、实例的受限数量的代表性实例。描述不试图穷尽列举所有可能变化或甚至所有那些所描述变化的组合。可能本发明的特定部分未提出替代实施例，或对部分而言可能可获得的其它未描述替代实施例，但不应认为不承认那些替代实施例。一般技术者应了解，许多那些未描述实施例包含在技术及材料上的差异而非在本发明的原理的应用上差异。因此，本发明并不打算受限于小于以下权利要求书中所阐述的范围及等效物。
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寄存信息
辛普劳公司(J.R.Simplot Company)专用马铃薯栽培品种Y9(上文所公开且在所附权利要求书中叙述)的块茎已寄存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801丹佛大学(University Boulevard)，马纳萨斯，弗吉尼亚(Manassas,Va.)20110。寄存日期为2015年6月17日。从本申请案的申请日之前，50小瓶微管的寄存是从由辛普劳公司维持的同一寄存取出。所有限制将在专利授予后不可撤销地去除，且所述寄存打算满足37C.F.R.§§1.801-1.809的所有需求。ATCC寄存编号为PTA-122247。寄存将在储藏所中维持三十年时间、或在最后一次请求之后五年或专利的有效期，视较长时间而定，且在彼时期间将视需要进行替换。
Claims (17)
1.一种不能生长为完整马铃薯植物的马铃薯食物产品，其包括马铃薯栽培种Y9的重组马铃薯细胞，
所述细胞包括存在于所述细胞的代表性样品中的pSIM1278的插入区，所述代表性样品以ATCC登录号PTA-122247保藏，其中所述插入区包含能有效抑制内源性天冬酰胺合成酶-1基因和内源性多酚氧化酶-5基因的表达的马铃薯DNA反向重复序列以及磷酸化酶-L和二激酶R1基因的内源性马铃薯启动子的反向重复序列，且
所述细胞进一步包括存在于栽培种Y9中的pSIM1678插入区，所述pSIM1678插入区含有马铃薯晚疫病抗性基因Rpi-vnt1和有效抑制内源性液泡转化酶基因VInv的表达的马铃薯DNA的反向重复序列。
2.根据权利要求1所述的马铃薯食物产品，其中所述马铃薯食物产品是热处理的马铃薯食物产品。
3.根据权利要求1所述的马铃薯食物产品，其中所述马铃薯食物产品是脱水马铃薯材料。
4.根据权利要求1所述的马铃薯食物产品，其中所述马铃薯食物产品是新鲜的马铃薯。
5.根据权利要求1所述的马铃薯食物产品，其中所述马铃薯食物产品是冷冻的马铃薯。
6.根据权利要求1所述的马铃薯食物产品，其中所述马铃薯食物产品是干燥的马铃薯。
7.根据权利要求1所述的马铃薯食物产品，其中所述马铃薯食物产品加工成面粉、淀粉或酒精。
8.一种马铃薯栽培种Y9的重组马铃薯细胞，其分离自权利要求1所述的不能生长为完整马铃薯植物的马铃薯食物产品。
9.一种产生马铃薯种子的方法，所述方法包括使两株马铃薯植物杂交并收获所得的马铃薯种子，其中至少一株马铃薯植物为通过培育马铃薯栽培种Y9的块茎或所述块茎的部分而产生的马铃薯植物，其中所述块茎的代表性样品以ATCC登录号PTA-122247保藏。
10.一种产生马铃薯种子的方法，所述方法包括使两株马铃薯植物杂交并收获所得的马铃薯种子，其中至少一株马铃薯植物为根据以下步骤生产的马铃薯植物：
通过培育马铃薯栽培种Y9的块茎或所述块茎的部分而产生种子，其中所述块茎的代表性样品以ATCC登录号PTA-122247保藏，
其中所述种子包含存在于栽培种Y9中的pSIM1278的插入区，所述插入区包含能有效抑制内源性天冬酰胺合成酶-1基因和内源性多酚氧化酶-5基因的表达的马铃薯DNA反向重复序列以及磷酸化酶-L和二激酶R1基因的内源性马铃薯启动子的反向重复序列；且
所述种子进一步包括存在于栽培种Y9中的pSIM1678插入区，所述pSIM1678插入区含有马铃薯晚疫病抗性基因Rpi-vnt1和有效抑制内源性液泡转化酶基因VInv的表达的马铃薯DNA的反向重复序列；以及
通过培养所述种子而产生所述马铃薯植物。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述马铃薯植物中的一株为马铃薯栽培种Y9，而另一株马铃薯植物是转基因的。
12.一种用于将所需性状引入马铃薯栽培种Y9的方法，其中所述方法包括：
(a)使Y9植株与具有所需性状的另一种马铃薯栽培种植株杂交以产生子代植物，其中所述Y9植株的块茎的代表性样品以ATCC登录号PTA-122247保藏，其中所述所需性状选自雄性不育性、除草剂抗性、昆虫抗性、改良的脂肪酸代谢、改良的碳水化合物代谢以及对细菌性病害、真菌性病害或病毒性病害的抗性；
(b)选择具有所述所需性状的一株或多株子代植物；
(c)使所述所选子代植物与Y9植物回交以产生回交子代植物；
(d)选择具有所述所需性状的回交子代植物；并且
(e)依次重复步骤(c)和步骤(d)两次或更多次以产生选择的包含所述所需性状的第三轮或更高轮次的回交子代植物。
13.一种制备马铃薯食物产品的方法，所述方法包括：
通过培育马铃薯栽培种Y9的块茎或所述块茎的部分而获得马铃薯或其部分，其中所述块茎的代表性样品以ATCC登录号PTA-122247保藏，并且
从所述马铃薯或其部分制备所述马铃薯食物产品，其中所述马铃薯食物产品是脱水马铃薯材料。
14.根据权利要求13所述的制备马铃薯食物产品的方法，其中所述脱水马铃薯材料是马铃薯雪片或马铃薯颗粒。
15.根据权利要求3所述的马铃薯食物产品，其中所述脱水马铃薯材料是马铃薯雪片或马铃薯颗粒。
16.根据权利要求1所述的马铃薯食物产品，其选自由法式炸薯条和炸马铃薯片组成的群组。
17.一种制备马铃薯食物产品的方法，所述方法包括：
通过培育马铃薯栽培种Y9的块茎或所述块茎的部分而获得马铃薯或其部分，其中所述块茎的代表性样品以ATCC登录号PTA-122247保藏，并且
从所述马铃薯或其部分制备所述马铃薯食物产品，其中所述马铃薯食物产品选自由法式炸薯条和炸马铃薯片组成的群组。
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