JPH08506489A - Ｐｌｒｖ感染に耐性の植物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子をコードする単離ＤＮＡ配列が本文中に開示されている。また、植物中でレプリカーゼ遺伝子を発現させることによってウイルス感染に対する耐性を与える方法、並びに、レプリカーゼ遺伝子を含むトランスジェニックなジャガイモ植物及び塊茎も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ＰＬＲＶ感染に耐性の植物 発明の分野 本発明は植物の遺伝子工学に関する。特に本発明は遺伝的に改変されたウイル ス耐性植物に関する。発明の背景 農業的に重要な多くの作物は植物ウイルスの感染に感受性である。これらのウ イルスは作物を激甚に損傷し、栽培業者にとって作物の経済価値を顕著に下落さ せる。これは最終的に消費者価格の高騰を招く。作物の植物ウイルス感染を防御 または阻止する試みはこれまでにもなされてきたが、未だにウイルス病原体は農 業における重要な問題であり続けている。 最近になって科学者たちは遺伝子工学技術を用いるウイルス耐性植物の生産手 段を開発した。この種の方法は、保護を与える手段が植物自体に取込まれ後代に 継承されるという利点がある。宿主植物が、感染防止能力、ウイルス増殖の阻止 または遅延能力、及び、病状進行の阻止または遅延能力、を有しているとき、宿 主植物は耐性である。「耐性」とは「罹病性」の対語であり、その定義はＣｏｏ ｐｅｒ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ，１９８３に記載されている。宿主のウ イルス耐性には異なるいくつかのタイプが認識されている。即ち、宿主は、（１ ）感染の確立、（２）ウイルスの増殖、または、（３）ウイルスの移動、に対し て耐性を有し得る。 ウイルス病害を防御するためには、ウイルスの複製及び/または感染の過程を 妨害する遺伝子をトランスジェニック植物中で発現させるとよい。コートタンパ ク質（ＣＰ）と呼ばれる植物ウイルスのキャプシドタンパク質が植物中で発現す るとき、この発現が相同ウイルス及び近縁ウイルスに対する耐性を与え得ること は既に証明されている（Ａｂｅｌら、１９８６；Ｔｕｍｅｒら、１９８７；Ｃｕ ｏｚｚｏら、１９８８；Ｈｅｍｅｎｗａｙら、１９８８；Ｓｔａｒｋら、１９８ ９；Ｌａｗｓｏｎら、１９９０；Ｋａｎｉｅｗｓｋｉら、１９９０）。これらの 研究において、ウイルス病害に対する耐性は、感染発生率の減少、症状進行の遅 延、ウイルス複製もしくはウイルス抗原レベルの低下、または全身的ウイルス移 動の遅延もしくは不在、として定義される。これらのトランスジェニック植物中 のウイルスコートタンパク質の発現は、観察はされたがいまだ未確定のメカニズ ムによるウイルス病害の減少効果の原因であろう（Ａｂｅｌら、１９８６；ｖａ ｎ Ｄｕｎら、１９８８- Ａ）。ウイルス感染に対するこの種の防御はコートタンパク質媒介耐性と呼ばれ る。 コートタンパク質媒介ウイルス耐性が多様な状況において有用であることは立 証されたが、ウイルス耐性を与えるための必ずしも最も効果的な手段ではない。 このような場合においては植物にウイルス耐性を与えるための別の方法も有用で あろう。ウイルスまたは病害の発生を阻むような別の技術も公表または提案され ている。これらの例としては、アンチセンスコートタンパク質（Ｃｕｚｚｏら、 １９８８）、サテライトＲＮＡ（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９８７）、リボザイム （Ｗａｌｂｏｔら、１９８８）、欠陥干渉分子（Ｍｏｒｃｈ、１９８７）、ウイ ルス非構造遺伝子（Ｇｏｌｅｍｂｏｓｋｉら、１９９０；Ｂｒａｕｎら、１９９ ２）、抗体（Ｈｉａｔｔ、１９９０）、ＰＲタンパク質（Ｂｏｌら、１９９０） 及び抗ウイルスタンパク質（Ｉｒｖｉｎら、１９８０）がある。 ウイルス非構造遺伝子の１つであるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の推定 レプリカーゼ遺伝子のフラグメントが、タバコ植物中で発現されたときにＴＭＶ 耐性を与えることが最近になって知見された（Ｇｏｌｅｍｂｏｓｋｉら、１ ９９０）。ＴＭＶ中では１８３キロダルトン（ｋＤａ）及び１２６ｋＤａの２つ のタンパク質がレプリカーゼ成分であると推測されており、その理由はタバコ植 物中で正常に増殖するために双方のタンパク質の発現が必要なためである（Ｉｓ ｈｉｋａｗａら、１９８６）。更に、これらの２つのタンパク質は、他の公知の ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼまたはレプリカーゼ遺伝子中でしばしば観察さ れるＮＴＰ結合モチーフ及びＧＤＤドメインのような進化的に保存されたモチー フを含む（Ｋｏｏｎｉｎ、１９９１）。ＮＴＰ結合モチーフはアミノ酸配列Ｇ- Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｘ-Ｇ-Ｋ-Ｘ’であり、Ｇはグリシン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｘ’は通 常はセリン（Ｓ）またはトレオニン（Ｔ）を示す（Ｇｏｒｂａｌｅｎｙａら、１ ９８８）。ＧＤＤモチーフは大きいほうのドメインであり、このドメインの特徴 は、順次に結合したグリシン（Ｇ）残基と２つのアスパラギン酸（Ｄ）残基とか ら成る３つの不変残基が存在することである。ＧＤＤドメインはしばしばレプリ カーゼタンパク質中に見出され、触媒機能に関与すると考えられている（Ｈｏｄ ｇｍａｎ、１９８８）。１８３ｋＤａのタンパク質は、１２６ｋＤａの終止コド ン（ＴＡＧ）の翻訳読み過し（ｒｅａｄ-ｔｈｒｏｕｇ ｈ）によって産生される。１２６ｋＤａタンパク質はＮＴＰ結合モチーフを含む 。１８３ｋＤａタンパク質はＮＴＰ及びＧＤＤの双方のモチーフを含む。耐性を 与えたＴＭＶゲノムの領域は、１８３ｋＤａの推定レプリカーゼ遺伝子の読み過 し部分であった。この読み過し部分は５４ｋＤａのタンパク質をコードする容量 を有している。ＧＤＤドメインは５４ｋＤａ及び１８３ｋＤａのタンパク質配列 内部に位置している。多年の間、５４ｋＤａタンパク質は別の遺伝子産物として 産生されると考えられていた。Ｇｏｌｅｍｂｏｓｋｉら（１９９０）は、この推 定遺伝子の機能を決定するためにこの配列によってタバコを形質転換し、トラン スジェニック植物がＴＭＶに耐性であるという予想外の知見を得た。１２６ｋＤ ａタンパク質をコードする遺伝子によって形質転換された植物は保護されていな かった。１８３ｋＤａの読み過しタンパク質に関しては報告データが全く存在し なかった。 頭部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）形態のレプリカーゼ（ＧＤＤドメイン）を発 現させることによって観察される耐性のメカニズムは不明である。最近になって 、ＴＭＶの場合には、観察される耐性を得るために５４ｋＤａの読み過 しタンパク質（ＧＤＤドメイン）を発現させる必要があることが証明された（Ｃ ａｒｒら、１９９２）。 他の研究者らは、非構造ウイルスタンパク質の成分を発現するトランスジェニ ック植物について保護実験を行った。例えば、ｖａｎ Ｄｕｎら（１９８８）は 、アルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）の複製に関与するタンパク質を コードする２つの遺伝子のいずれかを発現するタバコ植物中の保護を分析した。 タンパク質Ｐ１及びＰ２を夫々コードするＡｌＭＶのＲＮＡ１またはＲＮＡ２に 対するｃＤＮＡによってこれらの植物を形質転換した。これらのＲＮＡによって コードされているポリペプチドＰ１及びＰ２は、他のウイルスレプリカーゼに対 してアミノ酸類似性を有しており、双方の存在が複製に必須であることが知られ ている。ＡｌＭＶに対するＮＴＰ及びＧＤＤモチーフは異なるＲＮＡ上に存在し 、従って異なるタンパク質である。より詳細には、Ｐ１はＮＴＰ結合モチーフを 含み、Ｐ２はＧＤＤモチーフを含む。ＲＮＡ１またはＲＮＡ２を発現する植物は ＡｌＭＶ感染に対して保護されていなかった。また、ＲＮＡ１及び２の双方を発 現する植物もＡｌＭＶ感染に対して保護されていなかった（Ｔａｓｃｈｎｅｒら 、１９９ １）。 Ｂｕｃｋら（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２/０３５３９）は、植物にウイルス耐性 を与える目的でキュウリのウイルスレプリカーゼの発現または機能を阻止する種 々の技術の使用について記載した。該国際公開に使用または開示された耐性獲得 技術としては、（１）アンチセンス方法（全長レプリカーゼをコードするＲＮＡ に相補性のＲＮＡを発現させ得る）；（２）レプリカーゼの３つのウイルスコー ド成分（ウイルスコードポリペプチドＰ１ａ及びＰ２ａとタバコのポリペプチド Ｐ５０）の１つに特異的な抗体の産生をコードする遺伝子の発現；及び、（３） レプリカーゼの成分の１つをコードするＲＮＡに特異的なリボザイムの発現、な どがある。 ジャガイモ葉巻病ウイルス（ＰＬＲＶ）は、ルテオウイルス（ｌｕｔｅｏｖｉ ｒｕｓ）グループの植物ウイルスの成員である。ＰＬＲＶは正のセンスの一本鎖 ＲＮＡウイルスである。ウイルス粒子を形成するために、ウイルスＲＮＡはコー トタンパク質によってキャプシド封入され、ルテオウイルスグループのウイルス の典型的な特徴である等尺性形態を与える。本発明を適用し得るルテオウイルス グループ の他の成員としては、オオムギ黄化ウイルス、インゲンマメ葉巻病ウイルス、ビ ート西部萎黄病ウイルス、ニンジン赤葉病ウイルス、落花生ロゼット病アシスタ 、インドネシア大豆矮化ウイルス、大豆矮化ウイルス及びタバコネクローシス矮 化ウイルスがある。可能なその他の成員としては、ビート黄化網目ウイルス、セ ロリ黄化斑点ウイルス、綿青化症ウイルス、ｆｉｌａｒｅｅ赤葉病ウイルス、キ ビ赤葉病ウイルス、ホオズキマイルド緑化症ウイルス、ホオズキ葉脈発疹症ウイ ルス、キイチゴ葉巻病ウイルス、タバコ葉脈奇形ウイルス、タバコ黄化網目ウイ ルス及びタバコ黄化葉脈アシスタなどがある。 ＰＬＲＶ ＲＮＡは５’端にゲノム結合タンパク質様ユニットを有し、３’端 はポリＡ尾部を含まない（Ｍａｙｏら、１９８２）。ＰＬＲＶゲノムＲＮＡはＲ ＮＡ中間体を介してＤＮＡ依存的に複製される。ＰＬＲＶ ＲＮＡは６個の読み 取り枠（ＯＲＦ）を含む（図１）。ＰＬＲＶゲノムの編制はＭａｒｔｉｎら（１ ９９０）によって研究されている。ゲノムＲＮＡの５’側半鎖中では、２８ｋＤ ａのタンパク質をコードする小ＯＲＦ（ＯＲＦ１）の後に２つの大ＯＲＦ（ＯＲ Ｆ２ａ及びＯＲＦ２ｂ）が続いており、これらは夫々７ ０ｋＤａ及び６７ｋＤａのタンパク質をコードしているであろう。ＯＲＦ２ａ及 びＯＲＦ２ｂは、他の既知のレプリカーゼ遺伝子との配列類似性に基づいて、推 定レプリカーゼタンパク質をコードすると提唱されている。特に、ＯＲＦ２ａ及 びＯＲＦ２ｂはＮＴＰドメイン（Ｈａｂｉｌｉら、１９８９）及びＲＮＡポリメ ラーゼ（Ｋａｍｅｒら、１９８４）の特徴的モチーフを含む。ＯＲＦ２ｂは、レ プリカーゼタンパク質中にしばしば見出されるＧＤＤモチーフを含み、触媒機能 に関与すると考えられている。以後の記載では、ＰＬＲＶ読み取り枠２ａ及び２ ｂを推定レプリカーゼまたはレプリカーゼと呼ぶ。ＰＬＲＶ単離物ＬＲ-７ Ｗ ａｓｈｉｎｇｔｏｎ中で、ＯＲＦ２ａとＯＲＦ２ｂとは５７９ヌクレオチドだけ オーバーラップしている。ＯＲＦ２ｂにはこの領域のＡＵＧ翻訳開始コドンが欠 如しているので、ＯＲＦ２ｂはＯＲＦ２ａのリボソームフレームシフトによって 発現されると推測される（Ｍａｙｏら、１９８９）。 正常感染サイクルの一部であるマイナス鎖メッセージから転写された２．３ｋ ｂのサブゲノムＲＮＡは、ＯＲＦ３（コートタンパク質（ＣＰ）遺伝子）、ＯＲ Ｆ４（１７ｋＤａの推定核酸結合タンパク質（Ｔａｃｋｅら、１９９１）及び ＯＲＦ５（５６ｋＤａの読み過しタンパク質、Ｂａｈｎｅｒら、１９９０）の翻 訳を担当する。ＣＰ遺伝子は、アンバー終止コドン（ＴＡＧ）によって５６ｋＤ ａのＯＲＦから隔てられている。５６ｋＤａのタンパク質が、ＣＰ遺伝子のアン バー終止コドンの抑制によって翻訳されることは判明している（Ｂａｈｎｅｒら 、１９９０）。従って、５６ｋＤａのＯＲＦはＴＭＶの１８３ｋＤａのタンパク 質と同様の読み過し産物として発現される。 ＰＬＲＶの宿主域は、ジャガイモ、タバコ、トマト及びコショウを重要成員と するナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）の植物に限定される。本発明を適用し得る 商業的に重要なジャガイモの栽培品種の非限定例としては、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕ ｒｂａｎｋ、Ｓｈｅｐｏｄｙ、Ａｔｌａｎｔｉｃ、Ｎｏｒｃｈｉｐ及びＳｕｐｅ ｒｉｏｒがある。他のルテオウイルスの宿主域はもっと広汎であろう。例えば、 ビート西部萎黄病ウイルスの宿主域は２３の双子葉科を含み、以下の作物、即ち 、テンサイ、テーブルビート、ホウレン草、レタス、大豆、ブロッコリー、カリ フラワー、ラディッシュ、カブ、エンドウ豆、ソラマメ、ヒヨコマメ、アマ、ヒ マワリ、カラシナ、クローバー、キャベツ、カブハボタン、 セイヨウアブラナ、ハマナ、コショウ、カボチャ、スイカ、キュウリ、トマトな どを冒す。更に、オオムギ黄化ウイルスの宿主域は、オオムギ、エンバク、コム ギ、イネ、ライムギのようなイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）に限定される。 ＰＬＲＶはアブラムシによって持続的に伝搬される。ジャガイモ産業における 最も深刻なウイルスの問題は、ジャガイモ作物のジャガイモ葉巻病ウイルス（ｐ ｏｔａｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ；ＰＬＲＶ）感染である。ジャガイ モのＰＬＲＶ感染は、ジャガイモ作物の品質及び収量を低下させ、かなりの経済 的損失を生む。Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ品種のジャガイモでは、塊茎のＰ ＬＲＶ感染症状は「網状壊死（ｎｅｔ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）」と呼ばれる篩部壊 死である。ウイルスは主病変として篩部壊死を誘発する（Ｓｈｅｐａｒｄｓｏｎ ら、１９８０）。この壊死は、ジャガイモの加工品質に影響を与え、作物の価値 を下落させ、ジャガイモ栽培業者に経済的な打撃を与える。ＰＬＲＶ感染の結果 として生じた経済的な損失は、全世界のジャガイモ収穫高の約５％にのぼると算 定されている。作物のＰＬＲＶ感染に対する現行の対策では、ウイルスを伝搬す るアブラムシを防除するために殺虫剤を使用してい るが、この防除方法は、費用が高い、環境汚染の危険がある、完全防除はできな い、などの欠点がある。 上記から理解されるように、種々の植物のジャガイモ葉巻病ウイルス感染は、 今日の農業でぶつかる重要な問題である。従って、現行の方法に代わって使用で き植物にウイルス耐性を与えるために有効な方法の開発は業界に多大な貢献とな るであろう。発明の概要 本発明の１つの目的は、 （ａ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモーター領域と 、 （ｂ）上記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （ｃ）上記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列の ３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞中 で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子を提供することである。 本発明の別の目的は、感受性ナス科植物にジャガイモ葉巻病ウイルス感染耐性 を与える方法を提供することであり、方法は、 （ａ）（ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモーター 領域と、 （ii）上記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （iii）上記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列 の３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞 中で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子によって植物細胞を形質転換し 、 （ｂ）分化植物を与えるように上記植物細胞を再生し、 （ｃ）上記ジャガイモ葉巻病ウイルスの感染に対して植物を耐性にすべく十分な レベルでジャガイモ葉巻病ウイルスレプリカーゼ遺伝子を発現する形質転換植物 を選択する段階を含む。 本発明の更に別の目的は、感受性ナス科植物中のジャガイモ葉巻病ウイルス感 染に由来する網状壊死を抑制する方法を提供することであり、方法は、 （ａ）（ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモーター 領域と、 （ii）上記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイ モ葉巻病ウイルスレプリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （iii）上記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列 の３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞 中で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子によって植物細胞を形質転換し 、 （ｂ）分化植物を与えるように上記植物細胞を再生し、 （ｃ）上記植物葉巻病ウイルスの感染に対して植物を耐性にすべく十分なレベル でジャガイモ葉巻病ウイルスレプリカーゼ遺伝子を発現する形質転換植物を選択 する段階を含む。 本発明の更に別の目的は、 （ａ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモーター領域と 、 （ｂ）上記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （ｃ）上記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列の ３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞中 で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子をゲノムに含むウイルス耐性の形 質転換ナス科植物を提供することである。 本発明のまた別の目的は、 （ａ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモーター領域と 、 （ｂ）上記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （ｃ）上記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列の ３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞中 で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子をゲノムに含むウイルス耐性の形 質転換ナス科植物細胞を提供することである。 本発明のその他の目的、特徴及び利点は、以下の記載、実施例及び請求の範囲 より当業者に明らかであろう。図面の簡単な説明 図１は、ＰＬＲＶのゲノム編制を示す。 図２は、プラスミドｐＭＯＮ１８６０８の物理的地図を示す。 図３は、プラスミドｐＭＯＮ８５７４の物理的地図を示す。 図４は、プラスミドｐＭＯＮ１８６４３の物理的地図を示す。 図５は、プラスミドｐＭＯＮ１８６４４の物理的地図を示す。 図６は、プラスミドｐＭＯＮ１８６８５の物理的地図を示す。 図７は、プラスミドｐＭＯＮ１８６５８の物理的地図を示す。 図８は、プラスミドｐＭＯＮ１８６７９の物理的地図を示す。 図９は、試験地＃１における対照及びトランスジェニック系統のＰＬＲＶ症状 に対する目視評価を示す。 図１０は、試験地＃２における対照及びトランスジェニック系統のＰＬＲＶ症 状に対する目視評価を示す。 図１１は、試験地＃１におけるＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ ＷＴ対照系統 並びにｐＭＯＮ１８６５８及びｐＭＯＮ１８６８５のトランスジェニック系統に ついてＥＬＩＳＡによって測定したＰＬＲＶ感染の発生率を示す。 図１２は、試験地＃２におけるＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ ＷＴ対照系統 並びにｐＭＯＮ１８６５８及びｐＭＯＮ１８６８５のトランスジェニック系統に ついてＥＬＩＳＡによって測定したＰＬＲＶ感染の発生率を示す。発明の詳細な説明 本発明によれば、植物のウイルス耐性は、ジャガイモ葉巻病ウイルスの推定レ プリカーゼをコードするヌクレオチドから成る単離ＤＮＡ配列を植物中で発現さ せることによって得られる。ＰＬＲＶゲノムのＯＲＦ２ａ及びＯＲＦ２ｂ並びに ＯＲＦ２ｂの終止コドン（ＴＧＡ）までの３’の６６６個のヌクレオチド（ｎｔ ｓ）をコードするｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を調製した。この配 列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１のＲＮＡ及び恐らくは１種または複数のコードタンパ ク質を十分なレベルで発現する植物中でＰＬＲＶ感染に対する耐性を与える。Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の改変を含む植物発現ベク ター即ちｐＭＯＮベクターが実施例に記載されている。ＰＬＲＶゲノムのＯＲＦ ２ａ/２ｂは、ＰＬＲＶ感染植物中のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリ カーゼ）遺伝子として機能すると考えられている（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｌｋら 、１９８９）。 ジャガイモ葉巻病ウイルスレプリカーゼ遺伝子は、実施例に記載したような精 製ジャガイモ葉巻病ビリオンから回収したＲＮＡから作成されたｃＤＮＡライブ ラリーから単 離し得る。ｃＤＮＡライブラリーは当業者に公知の多くの方法で構築され得る。 代表的なジャガイモ葉巻病ウイルス単離物に由来の代表的なレプリカーゼ遺伝子 のｃＤＮＡ配列は３，１８４ヌクレオチドの長さであり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １のヌクレオチド４１-３，２２５に対応する。 種々のＰＬＲＶ株または単離物のいずれかから単離されたＰＬＲＶレプリカー ゼ遺伝子即ちＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を本発明で使用し得る。任意のＰＬＲＶ株 に由来の対応レプリカーゼ遺伝子は、オーバーラップする２つのＯＦＲから成り 、これらは、推定２８ｋＤａのタンパク質をコードするウイルスゲノムの最も５ ’側のＯＲＦ（ＯＲＦ１）の下流に存在する。報告されたＰＬＲＶレプリカーゼ ＯＲＦのアミノ酸配列は、地理的に遠方の場所のＰＬＲＶ単離物に由来の別のレ プリカーゼ遺伝子に比較すると高度の類似性を示す（Ｈａｂｉｌｉら、１９８９ ）。 全長の推定レプリカーゼタンパク質（ＯＲＦ２ａ及びＯＲＦ２ｂ）は、−１の フレームシフトによってコードされている。フレームシフト部位はヘプタヌクレ オチド配列ＵＵＵＡＡＡＵとして同定された。この−１のフレームシフトは、Ｎ ＴＰドメイン及びＧＤＤドメインの双方を含む１ １０ｋＤａのフレームシフトタンパク質を生成するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１中の ヌクレオチド（ｎｔ）１，５０１を起点とする。フレームシフトがほぼ１％の頻 度で発生することが実験的に証明された（Ｐｒｕｆｅｒら、１９９２）。例えば 、感染細胞中の１００個の翻訳された２ａタンパク質（７０ｋＤａ）毎に１つの 翻訳されたフレームシフト（２ａ/２ｂ）（１１０ｋＤａ）タンパク質が存在す るであろう。植物中で発現された推定レプリカーゼクローン（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ．１）はその天然メカニズムによってフレームシフトし、従って全長１１０ｋ Ｄａの２ａ/２ｂ推定レプリカーゼタンパク質をコードしていると予想される。 レプリカーゼ媒介耐性のメカニズムは判っていないので、複数の植物遺伝子発 現ベクターをＰＬＲＶ耐性を生じるように設計した。これらの方法としては、全 長レプリカーゼ遺伝子（ＯＲＦ２ａ/２ｂ）の発現、頭部切除形態のレプリカー ゼドメイン（ＧＤＤドメイン）の発現、及び、ＰＬＲＶレプリカーゼに対するア ンチセンスｍＲＮＡがある。 Ｂｒａｕｎら（１９９２）は、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）に対するアミ ノ末端の６７４個のアミノ酸または全長ウイルスレプリカーゼの発現が、ＰＶＸ 感染に対して高 度に耐性の植物を産生することを証明した。Ｂｒａｕｎら（１９９２）はまた、 ＮＴＰドメインまたはＧＤＤドメインを個別に発現させるベクターがＰＶＸ耐性 植物を産生しないことを証明した。実施例に記載のようにしてＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ．１を含む植物発現ベクターを設計した。これは全長推定レプリカーゼ遺伝子 （ＯＲＦ２ａ/２ｂ）を含む。 Ｇｏｌｅｍｂｏｓｋｉら（１９９０）は、ＴＭＶレプリカーゼ遺伝子の頭部切 除形態であるＧＤＤモチーフを含む５４ｋＤａの読み過しタンパク質の発現が、 相同ＴＭＶ株に対する耐性を生じさせるに十分であることを証明した。Ｂｒａｕ ｎら（１９９２）は、ＰＶＸの場合にＧＤＤドメインがＰＶＸ感染に対する耐性 を生じさせるに十分でないと報告したが、ＧＤＤ媒介耐性のこの現象はウイルス 特異的であろう。従って、Ｇｏｌｅｍｂｏｓｋｉら（１９９０）の知見に基づい て、ＧＤＤドメインを含む構築物を（実施例に記載のように）設計した。 レプリカーゼはＰＬＲＶ感染サイクル中の重要な構成要素でありＰＬＲＶゲノ ム中の最大ＯＲＦであるから、推定レプリカーゼ遺伝子（ＯＲＦ２ａ/２ｂ）に 対しては実施例に記載のようにアンチセンスｍＲＮＡを発現させる方法を 採用した。トランスジーンとしてアンチセンスまたはマイナス鎖メッセージを過 発現させる理由は、これらが侵入性ＰＬＲＶゲノムの正のＲＮＡ鎖に競合的に結 合し、ＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子の翻訳をブロックし、ＰＬＲＶに対する耐性 メカニズムを与えるからである。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１は、本発明で使用したヌクレオチド配列のソースであ るＰＬＲＶレプリカーゼｃＤＮＡを含む。クローニングを容易にするために、レ プリカーゼ遺伝子のヌクレオチド配列の例えば５’端及び３’端を改変してもよ い。前述のような全長１１０ｋＤａレプリカーゼタンパク質が１％を上回る頻度 で産生するように、いくつかのヌクレオチドの挿入、除去または変異によって天 然のフレームシフトメカニズムを除去するような改変を追加してもよい。このた めに、当業者に公知の方法を用いて部位特異的突然変異を誘発してもよく、また 必要に応じて種々の制限部位を与えてもよい。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の前後 により好ましい関係が含まれるように、種々のオリゴヌクレオチドプライマーを 使用して５’端を改変してもよい。植物中でＡＴＧの前後の最適な関係は、−５ のグアニンまたはシトシン、２つのアデニン、任意の２つのヌクレオチド、 翻訳開始コドン（ＡＴＧ）、＋４のグアニンが順次に続く配列であることは判っ ている〔（Ｇ/ＣＡＡＮＮＡＴＧＧ）（Ｌｕｔｃｋｅら、１９８７）〕。また、 植物に好適な終止コドン（ＴＡＡ）を得るように遺伝子の３’端を改変してもよ い（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９）。あるいは、操作された遺伝子が該遺伝子を発 現させる標的生物に対して好ましいアミノ酸コドン使用を含むように遺伝子を構 築してもよい（Ｐｅｒｌａｋら、１９９１）。 レプリカーゼ遺伝子の配列決定は、米国生化学指針（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔ ｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ’ｓ ｒｅｃｏｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）に従って 、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）ポリメラーゼを用いＳａｎｇｅｒら（１９７ ７）の方法によって行った。遺伝子産物のアミノ酸配列を予測するためにヌクレ オチド配列を使用した。この及び本文中のすべての予測アミノ酸配列中では標準 １文字命名法を使用する。本文中に示したすべてのペプチド配列は、Ｎ末端が左 側、Ｃ末端が右側の慣用のフォーマットで示す。 図面に開示した特定のヌクレオチド及び/またはアミノ酸配列は例示的なもの であり、等価の遺伝子またはその部 分が本発明の開示に従って取得及び/または生成され得ることを理解されたい。 等価なる用語は、該遺伝子またはその部分が、本発明で開示されたレプリカーゼ 遺伝子と実質的に同様にして機能し、また実質的に同様にして植物にウイルス耐 性を与えることを意味する。 ＰＬＲＶレプリカーゼｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を植物中で発 現され得る遺伝子として、ｐＭＯＮ１８６０８（図２）のような植物発現ベクタ ーに挿入し得る。植物発現ベクターは、植物中で発現させ後代に継承させるべき 遺伝子を安定に取込むために必要な要素を含む。遺伝子は、単独でまたは他の要 素と組み合わせて細胞中で発現され得る１つの要素または組み合わせ要素である と定義できる。一般に遺伝子は（５’から３’端に向かう方向で）、（１）植物 細胞中で機能し得る５’非翻訳リーダー配列と、（２）所望のタンパク質をコー ドする遺伝子即ちＤＮＡ配列と、（３）典型的には転写の終了及びＲＮＡ配列の ３’領域のポリアデニル化を惹起する３’非翻訳領域とを含む。これらの要素の 各々は隣接要素に対する順次結合によって作動可能に結合されている。上記要素 を含む遺伝子を標準組換えＤＮＡ方法によって植物発現ベクターに挿入し得る。 遺伝 子の要素のいくつかまたは全部が存在してもよく、必要な場合には追加または残 りの要素をベクターに付加してもよい。本発明の別の態様は、レプリカーゼ遺伝 子の多数コピーを植物ゲノムに導入することである。更に、植物発現ベクターを 遺伝子以外の全部の要素が存在するように構築してもよく、その一例がｐＭＯＮ １８６０８（図２）である。次いで、適当な時期に当業者に公知の方法によって 遺伝子を付加し得る。 プロモーターと呼ばれるＤＮＡのセグメントは、ＤＮＡをｍＲＮＡに転写する ときの調節機能を担当する。植物細胞中で機能する多数のプロモーターが当業界 で公知であり、本発明の実施に使用し得る。これらのプロモーターは、植物また は植物ウイルスのような種々のソースから得ることができ、その非限定例として は、カウリモウイルス（ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）グループから単離されたプ ロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭ Ｖ３５Ｓ）、増強カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ｅｎｈＣ ａＭＶ３５Ｓ）、ゴマノハグサヒナノウスツボ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイ ルス全長転写プロモーター（ＦＭＶ３５Ｓ）及びクロロフィルａ /ｂ結合タンパク質から単離されたプロモーターがある。他の有用なプロモータ ーとしては、感染が生じることが判っているある種の細胞型中で誘導的にまたは 組織特異的にレプリカーゼ遺伝子を転写し得るプロモーターがある。例えば、以 下の誘導タンパク質、即ち、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、カルコンシ ンターゼ、ヒドロキシプロリンに富む糖タンパク質、エクステンシン、発病関連 タンパク質（例えばＰＲ-１ａ）、ジャガイモの創傷誘導プロテアーゼインヒビ ター、のいずれかの遺伝子に由来のプロモーターがある。 篩部細胞のようなある種の細胞型中でタンパク質を発現させるためにはグルタ ミンシンテターゼプロモーターのような代替プロモーターの使用も可能である。 ジャガイモ塊茎中でタンパク質を発現させるためにはパタチン（ｐａｔａｔｉｎ ）プロモーターを使用し得る。選択された特定プロモーターは好ましくは、作動 可能に結合されたレプリカーゼ遺伝子の十分な発現を惹起でき、ウイルス耐性を 与えるために有効な量のレプリカーゼタンパク質を産生するが、発現母体となる 植物細胞の損傷または致死を生じさせるほど多量には産生しない。選択されたプ ロモーターを機能さ せ得る組織の非限定例としては、表皮、維管及び巣因組轍がある。実際に選択さ れるプロモーターは、レプリカーゼ遺伝子の発現を達成し、従ってウイルス耐性 を植物に与えるべく十分な転写活性を与えなければならない。 非翻訳リーダー配列は適当な任意のソースに由来するものでよく、ｍＲＮＡの 翻訳を増進するように特異的に改変され得る。５’非翻訳領域は、遺伝子を発現 させるように選択されたプロモーター、発現させるべき遺伝子またはコーディン グ領域の天然型リーダー配列、ウイルスＲＮＡ、適当な真核細胞遺伝子または合 成遺伝子配列から得ることができる。本発明は後出の実施例に示す構築物に限定 されない。 終結領域即ち３’非翻訳領域は、転写を終結させるため、及び、転写されたｍ ＲＮＡ配列の３’端にポリアデニル化リボヌクレオチドを付加するために使用さ れる。終結領域は、プロモーター領域に由来してもよく、遺伝子に由来してもよ く、または別のソースに由来してもよく、好ましくはターミネーターとポリアデ ニル化をコードする配列とを含む。キメラ植物遺伝子の適当な３’非翻訳領域の 非限定例は、（１）ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子のようなＡ ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍誘発（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化 シグナルを含む３’転写非翻訳領域、（２）ダイズ７Ｓ貯蔵タンパク質遺伝子及 びエンドウ豆のリブロース１，５-ビスホスフェートカルボキシラーゼ-オキシゲ ナーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子）のような植物遺伝子であ る。後者を本文中では以後Ｅ９と呼ぶ。 発現構築物を得るためには、標準的な方法で発現構築物の種々の構成要素また はそのフラグメントを大腸菌のような細菌性宿主中で複製され得る適当なクロー ニングベクターに挿入する。文献に記載された多数のベクターが存在する。各ク ローニング後に、ベクターを単離し、特定の要求を充たすベクターを与えるため に、制限エンドヌクレアーゼ消化、新フラグメントの挿入、結合、欠失、挿入、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発、ポリリンカーフラグメントの付加などの操作を 更に行う。構築物が完成すると、適当なベクターに移入し、植物細胞の形質転換 及び植物細胞中での外来遺伝子の発現の方法に従って更に操作する。 植物細胞ゲノム中への遺伝子物質の導入または植物細胞の形質転換のために種 々の技術を利用し得る。しかしなが ら、本発明の実施では宿主内への植物ベクターの導入が特定の方法に限定されな い。有効な形質転換を与えるいかなる方法も使用し得る。本発明のＤＮＡ構築物 を植物細胞に挿入するために、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの腫瘍誘導（Ｔｉ） または根誘導（Ｒｉ）プラスミドに由来の植物発現ベクターを用いる形質転換、 及びそれ以外の代替的な方法を使用することが可能であった。このような方法と して例えば、リポソームの使用、エレクトロポレーション、ＤＮΛの自由取込み を増加させる化学物質、微小粒子（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）の撃込み によるＤＮＡデリバリー、微量注入、ウイルスまたは花粉を使用した形質転換、 などがある。 植物発現ベクターは好ましくは、植物細胞の形質転換に必要なすべての要素を 含んでいる。代表的な植物クローニングベクターは、選択可能マーカー遺伝子、 審査可能（ｓｃｏｒｅａｂｌｅ）マーカー遺伝子、Ｔ-ＤＮＡ境界配列、クロー ニング部位、形質転換体の同定及び広域宿主の複製及び移動機能を容易にする適 当な細菌性遺伝子、並びに、所望に応じたその他の要素から成る。レプリカーゼ 遺伝子は、所望の植物種を形質転換させる適当な任意の植物発現 ベクター中に挿入され得る。適当な植物発現ベクターとしては、例えばＨｅｒｒ ｅｒａ-Ｅｓｔｒｅｌｌａら（１９８３）、Ｂｅｖａｎら（１９８４）、Ｋｌｅ ｅら（１９８５）及びＦｒａｌｅｙ（１９８３）によって開示されたベクターに 加えて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミ ド由来のベクターがある。 形質転換された植物細胞を選択するために選択可能マーカー遺伝子を使用し得 る。使用されるマーカー遺伝子が、カナマイシン、Ｇ４１８、ヒグロマイシン、 ストレプトマイシンなどの抗生物質に対する耐性をコードするのが有利である。 付加的または代替的に、グリホセート、スルホニルウレア、ホスフィノトリシン またはブロモキシニルに対する耐薬性のような除草剤耐薬性をコードする他のマ ーカーも使用し得る。また、追加の選択手段も使用し得る。使用される特定マー カーは、形質転換細胞を非形質転換細胞と対比させて選択し得るマーカーである 。異なる宿主種の数次第で、異なる宿主を選択するために異なる選択条件が使用 される場合には、当業界で公知のマーカーを１種またはそれ以上使用してもよい 。 ジャガイモ葉巻病ウイルスレプリカーゼ遺伝子を含む植 物発現ベクターは、ナス科の植物を形質転換するために使用され得る。特に、ジ ャガイモ葉巻病ウイルス感染はジャガイモに持続的に付随する問題であり、この ウイルスはトマト、コショウ及びタバコにも感染し得る。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ媒介形質転換プロトコルがナス科の成員を形質転換するために有効である ことは公知である。Ａｇｒｏｂａｃａｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を使用するとき は、所望の発現ベクターを適当なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株中に移動させ る。代表例としてＡｇｒｏｂａｃａｔｅｒｉｕｍ菌ＡＢＩ株の場合を説明する。 所望の発現ベクタ−を、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａら、１ ９８０）を用いる三親交配系によってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌ＡＢＩ株中 に移動させる。バイナリーＡＢＩ株は、欠損（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔｉプラスミ ドｐＴｉＣ５８（Ｋｏｎｃｚら、１９８６）を保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ａ２０８のクロラムフェニコール耐性誘導体で ある。このＴｉプラスミドは、Ｔ-ＤＮＡ植物ホルモン遺伝子を保有せず（欠損 ）、従って菌株はクラウンゴールを発症できない。欠損ＴｉプラスミドはＡＢＩ 菌株に結合後のベクターの自律複製に必要なｔ ｒｆＡ遺伝子機能を与える。植物組織をＡＢＩと発現ベクターとのコンジュゲー トと共にインキュベートすると、ベクターは欠損ｐＴｉＣ５８プラスミドによっ てコードされたｖｉｒ機能によって植物細胞に移入する。ＴｉプラスミドｐＴｉ Ｃ５８は植物細胞に移入せず、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に残留する。１つ または２つの境界配列を含む形質転換ベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに よって植物にデリバリーし得る。１つの境界配列を含むベクターは右側のＴ-Ｄ ＮＡ境界領域がオープンであり、全ベクター配列を宿主植物染色体中に挿入する 。右側境界配列は移入及び組込み中に消滅する。２つの境界配列を含むベクター 中では、右側境界配列と左側境界配列との間のＤＮＡが植物染色体中に挿入され 、これにより必要なキメラ遺伝子だけが染色体にデリバリーされる。ベクターの 残部及び境界配列は移入及び組込み中に消滅する。 ナス科の成員の形質転換及び再生のプロトコルは公知である。特に、ジャガイ モ及びトマトに関しては種々の形質転換及び再生のプロトコルが確立されている 。ジャガイモの代表的プロトコルを実施例に示している。ジャガイモ植物を形質 転換し、形質転換したカルスを同定した後で、形 質転換したカルス組織を完全植物として再生させる。公知の任意のジャガイモ植 物の再生方法を本発明に使用し得る。 所望のレプリカーゼ遺伝子を含む本発明の植物を当業者に公知の方法で栽培す る。従って、本発明の形質転換植物は、レプリカーゼ遺伝子を発現でき、これに よりウイルス耐性を示す。形質転換植物中のレプリカーゼ遺伝子または遺伝子産 物の存在は、当業者に公知の任意の適当な方法によって決定し得る。これらの方 法として、サザン、ノーザン及びウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ及びバイオ アッセイがある。次いでレプリカーゼを発現し得る形質転換植物を耐性効果測定 アッセイで処理し得る。このための代表的なアッセイを実施例に示している。 以下の実施例は、本発明の実施をより十分に説明するために与えたものであり 、本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。本発明の思想及び範囲を逸脱 することなく本文中に記載の方法及び遺伝子の多様な変更が可能であることは当 業者に明らかであろう。明瞭及び簡潔な説明を与えるために、特定実施態様に関 する以下の記載では、ジャガイモ葉巻病ウイルス（ＰＬＲＶ）レプリカーゼ遺伝 子及びトランスジェニックＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋジャガ イモ植物中の耐性の使用を例示する。実施例 実施例に関連する総合的情報菌株及びプラスミド 大腸菌ＭＶ１１９０株（ＢｉｏＲａｄ提供） Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌ＡＢＩ株 ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３ ｐＭＯＮ１８６０８（図２） ｐＭＯＮ８５７４（図３） ｐＭＯＮ１８６４３（図４） ｐＭＯＮ１８６４４（図５） ｐＭＯＮ１８６８５（図６） ｐＭＯＮ１８６５８（図７） ｐＭＯＮ１８６７９（図８）酵素及びキット ＤＮＡ配列決定キット： Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌのＳｅｑｕｅｎａｓｅ ｖ２．０配列決定キット＃７０７７０ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キット ＢｉｏＲａｄ Ｍｕｔ-ａ-ｇｅｎｅのｉｎ ｖｉｔｒｏ突然 変異誘発キット＃１７０-３５７８改変酵素 仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）： Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＃７１３０２３制限酵素 ５’から３’の方向に指定された認識配列をもつ以下の制限酵素をＮｅｗ Ｅ ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの指示に従って使用する： ＥｃｏＲＩ（Ｇ↓ＡＡＴＴＣ）：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃ ＡＴ＃１０１ ＫｐｎＩ（ＧＧＴＡＣ↓Ｃ）：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＣＡ Ｔ＃１４２ ＳｔｕＩ（ＡＧＧ↓ＣＣＴ）：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＣＡ Ｔ＃１８７ ＢｓａＡＩ（ＹＡＣ↓ＧＴＲ）：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｃ ＡＴ＃５３１ ＢｇｌII（Ａ↓ＧＡＴＣＴ）：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ＣＡ Ｔ＃１４４培地及び溶液 ＬＢＳＣＫ：１０ｇのＮａＣｌ、５ｇの酵母エキス、１０ ｇのＢａｃｔｏ-トリプトン、５０ｍｇのスペクチノマイシン、２５ｍｇのクロ ラムフェニコール及び５０ｍｇのカナマイシンを１リットル容量中に含有、ｐＨ ７．０。 ＭＳＯ：４．４ｇのＭＸ塩（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌ ｏｕｉｓ，ＭＯ）、３０ｇのショ糖及び２ｍｌのＢ５ビタミン（５００Ｘ）を１ リットル容量中に含有、ｐＨ５．７。 ＰＭ培地：１リットル容量、ｐＨ６．０中の４．４ｇのＭＳ塩（Ｓｉｇｍａ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、３０ｇのショ糖、０．１ ７ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄．Ｈ₂Ｏ）１ｍｌのチアミンＨＣｌ及び０．１ｇのイノシト ールと０．２％のＧｅｌｒｉｔｅ寒天とを含有。 カルス誘導培地：５．０ｍｇ/リットルのＺｅａｔｉｎ Ｒｉｂｏｓｉｄｅ、１ ０ｍｇ/リットルのＡｇＮＯ₃及び０．１ｍｇ/リットルのＮＡＡ含有。 苗条誘導培地：ＭＳＯに加えて５．０ｍｇ/リットルのＺｅａｔｉｎ Ｒｉｂｏ ｓｉｄｅ、１０ｍｇ/リットルのＡｇＮＯ₃及び０．３ｍｇ/リットルのＧＡ₃（ジ ベレリン酸）及び１００ｍｇ/リットルのカナマイシン含有。 ＮＡＡはナフタレン酢酸。 ＬＢ培地：１リットルあたり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス及び５ｇの ＮａＣｌを含有、ｐＨ７．０。 ＰＢＳ-Ｔ-Ｏ：８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、２．９ｇのＮａ₂ＨＰ Ｏ₄．１２Ｈ₂Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．２％ のオボアルブミン含有。 ＰＢＳ-Ｔ：上記のリン酸塩緩衝生理食塩水及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０含 有。 特に注釈がなければ、上記溶液を基本（１×）濃度で使用した。実施例全体を 通じて、異なる濃度レベルで使用した場合には、溶液に関して基本（１×）濃度 の倍数を示した。ジャガイモ葉巻病ウイルスｃＤＮＡライブラリーの構築 ジャガイモ葉巻病ウイルスビリオンを精製するために、Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒ ａｍｏｎｉｕｍ ｃｖ．ｔａｔｕｌａの新しい感染葉を、Ｗａｒｉｎｇブレンダ ー内で、２倍量（ｗ/ｖ）の０．１Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ６、０．０１ＭのＥ ＤＴＡ、０．３％（ｗ/ｖ）のＤＩＥＣＡ（ジエチルチオカルバミン酸、ナトリ ウム塩、Ｓｉｇｍａ Ｄ-３５０６）、０．５％（ｖ/ｖ）の２-メルカプトエタ ノール及び１．５％（重量/組織重量）のＲｏｈａｍｅｎｔ（登録商標）で磨砕 し た。この混合物を室温で少なくとも２．５時間撹拌し、ここで１％のＴｒｉｔｏ ｎ Ｘ-１００（ｖ/ｖ）を添加し、次いで一夜撹拌した。この溶液に次に２０％ （ｖ/ｖ）のブタノール：クロロホルム（１：１）を添加し、ブレンダー内で３ ０秒間混合し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ-１０ロータ内で１５℃、６０００ｒｐｍ で１０分間遠心した。上部の水相を採取した。８％（ｗ/ｖ）の固体ＰＥＧ８０ ００及び１％（ｗ/ｖ）のＮａＣｌを添加し、次いで３０分間撹拌した。これを 室温で１時間インキュベートし、次いでＪＡ-１０ロータ内で１５℃、５０００ ｒｐｍで２０分間遠心した。ペレットを採取し、０．０１ＭのＥＤＴＡを含有し 初期組織重量の１/４の容量の０．１Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ６．４に再懸濁さ せ、室温で一夜撹拌し、次いでＪＡ-２１ロータ内で８０００ｒｐｍで１０分間 遠心することによって清澄化した。上清を採取し、４５Ｔｉ Ｂｅｃｋｍａｎロ ータ内で１５℃、３０Ｋｒｐｍで２時間遠心した。ペレットを初期組織重量の１ /１００の容量の５０ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ６．４及び５ｍＭのＥＤＴＡに 再懸濁させた。これを２時間撹拌し、次に１５℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠 心した。上清を採取した。これを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓ Ｗ−２８ロータ内で１５℃、２５Ｋｒｐｍで２時間遠心することによってショ糖 濃度勾配（１０-４０％ｗ/ｖ）上で精製した。注射器、皮下注射針または勾配分 別によってウイルスバンドを回収した。 約５５μｇのウイルスを、２．１ｍｌの０．０５Ｍのクエン酸緩衝液ｐＨ６． ４中で、２００μｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．５、２００μｌの１０％ ＳＤＳ及び４００μｌの１ｍｇ/ｍｌのプロテアーゼＫと共に３７℃で３０分間 インキュベートし、フェノール及びフェノールクロロホルム（１：１ｖ/ｖ）を 夫々用いて２回抽出することによってＰＬＲＶ ＲＮＡを抽出した。次に、ラン ダムプライマーとラムダｇｔ１１（λｇｔ１１）キットをＡｍｅｒｓｈａｍの指 示通りに用いてＰＬＲＶ ｃＤＮＡを合成した。 ＡｍｅｒｓｈａｍのｃＤＮＡクローニング系から提供されたアダプターを用い てλｇｔ１１中で構築したｃＤＮＡライブラリーから、全長ＰＬＲＶレプリカー ゼクローンを単離した。ＡｍｅｒｓｈａｍのＥｃｏＲＩアダプターは以下の構成 を有していた。 このアダプターは５’から３’の方向でＥｃｏＲＩ適合性オーバーハング、Ｂ ａｍＨＩ、ＫｐｎＩ及びＮｃｏＩ部位を有している。ＯＲＦ２ａの５’端に相補 性のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してこのライブラリーをスクリーニン グした。 推定レプリカーゼ成分のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプ ライマーは以下の配列を有していた。 5’GGAGGTGCCTCGGAAGTTGAAGGCCGG3’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２） このプライマーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド１２２-１４８にハ イブリダイズする。ｃＤＮＡクローンの記述 ３，９０１ヌクレオチドのＫｐｎＩ ｃＤＮＡクローン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ．１）をλｇｔ１１から単離した。推定レプリカーゼ遺伝子の全長ｃＤＮＡ（Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド４１-３，２２５）の存在を確認するため に、このｃＤＮＡクローンのマッピング及び配列決定を行った。３，９０１ヌク レオチドのｃＤＮＡの内部には、推定レプリカーゼ遺伝子の翻訳起点（ＡＴＧ） までの５’の４０個のヌクレオチド（ｎｔｓ）も存在している。４０個のヌクレ オ チドは、ＥｃｏＲＩアダプター由来のＫｐｎＩ及びＮｃｏＩ制限部位と真正ＰＬ ＲＶ ｃＤＮＡの３０個のヌクレオチドとを含む。レプリカーゼ終止コドン（Ｔ ＧＡ）の後に推定レプリカーゼ遺伝子までの３’の６６６個のヌクレオチドが存 在する。この領域の内部には、ＯＲＦ２ｂとＯＲＦ３との間の１６６個のヌクレ オチドから成る遺伝子間領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド３，２２ ６-３，４２２）と、コートタンパク質ＯＲＦ３のコーディング領域に由来の４ ６８個のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド３，４２３-３ ，８９０）と、１７ｋＤａの推定核酸結合タンパク質をコードするＯＲＦ４のコ ーディング領域の４４４個のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオ チド３，４４８-３，８９１）とが存在する。しかしながら、コートタンパク質 及び１７ｋＤａタンパク質の読み取り枠は不完全である。コートタンパク質のＯ ＲＦでは遺伝子の３’端から５２コドン（１５６ヌクレオチド）が欠失し、１７ ｋＤａのＯＲＦでは遺伝子の３’端から８コドン（２４ヌクレオチド）が欠失し ている。コートタンパク質のＯＲＦ及び１７ｋＤａタンパク質のＯＲＦは頭部が 欠失しているので、コートタンパク質及び１７ｋＤａタンパク質のＯ ＲＦは隣接ポリリンカーに続いており、ベクターの下流配列にオープンに維持さ れている。ｐＭＯＮ８５７４の構築 推定レプリカーゼ遺伝子及び下流配列を含むｃＤＮＡ配列をＫｐｎＩによって 消化した。３，９０１個のヌクレオチドから成るＫｐｎＩフラグメントを、Ｋｐ ｎＩ消化し製造業者の指示通りに仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で 消化した予処理ｐＧＥＭ３Ｚｆ（−）（提供：Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍ ａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローニングした。クローンを同定し、ｐＭＯＮ８５７ ４（図３）と命名した。このクローンは、レプリカーゼＲＮＡ（センス鎖）がＴ ７バクテリオファージ転写プロモーターを用いて転写されるように配向されてい た。ｐＭＯＮ１８６Ｏ８植物形質転換ベクターの説明 実施例で植物発現ベクターの１つとして使用したプラスミドｐＭＯＮ１８６０ ８（図２）は、多数クローニング部位をもつように設計されたベクターであり、 本文中に記載のＰＬＲＶ耐性を与え得るＤＮＡフラグメントまたは遺伝子をクロ ーニングするために使用された。ベクターｐＭＯＮ１８６０８はＰＬＲＶ耐性を 与え得る遺伝子をその内部に 全く含まない。 プラスミドｐＭＯＮ１８６０８は以下のＤＮＡセグメントを含む。図２の下部 近傍の出発点は、大腸菌中に維持するための細菌性複製起点（ｏｒｉ-３２２） であり、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞に接合的に 移入するためのｂｏｍ部位を含んでいる。反時計回り方向でｏｒｉ-３２２の次 に、プライマー抑制用コーディング配列であるｒｏｍとも呼ばれるｒｏｐが存在 する。反時計回り方向で更にその次に、複製成長起点であるｏｒｉ-Ｖ（Ｓｔａ ｌｋｅｒら、１９８１）、及び、植物ゲノム中へのＴ-ＤＮＡ挿入を終結させる 左側境界配列が順次存在する。その次に、選択可能マーカーとして使用されるキ メラ遺伝子が存在する。キメラは、０．３５キロ塩基（ｋｂ）のカリフラワーモ ザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ｐ-３５Ｓ）（Ｏｄｅｌｌら、１９８５） 、０．８３ｋｂのネオマイシンホスホトランスフェラーゼII型遺伝子（ＫＡＮ） 及びノパリンシンターゼ遺伝子に由来の０．２５ｋｂの３’非翻訳領域（ＮＯＳ ３’）（Ｆｒａｌｅｙら、１９８３）を含む。 選択可能マーカーとして使用される遺伝子の次に、エンドウ豆ＲＵＢＩＳＣＯ 遺伝子の小サブユニット（Ｃｏｒｕ ｚｚｉら、１９８４）に由来の０．６５ｋｇのＥ９ ３’領域が存在する。その 次に、ＢｇｌII、ＳｔｕＩ及びＫｐｎＩ制限部位を特徴とするポリリンカー領域 が存在する。ＰＬＲＶ耐性を与え得るＤＮＡ配列はこの場所でＦＭＶプロモータ ー及びＥ９ ３’領域に融合し得る。ＦＭＶプロモーターを含むＤＮＡ配列は、 ポリリンカー部位にクローニングされたＤＮＡ配列の転写プロモーターとして機 能する。ＦＭＶプロモーターの次に右側境界配列が存在し、挿入Ｔ-ＤＮＡの植 物染色体内取込みがここで開始される。その次に、細菌性スペクチノマイシン/ ストレプトマイシン耐性をコードするトランスポゾンＴｎ７から単離された０． ９３ｋｂのフラグメント（Ｓｐｃ/Ｓｔｒ）が存在する。このフラグメントは、 大腸菌及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の選択決定 基である（Ｆｌｉｎｇら、１９８５）。 ベクターの諸要素に関する以下の記載は、ＤＮＡ配列が多数クローニング部位 に挿入されること以外は、ｐＭＯＮ１８６４３（図４）、ｐＭＯＮ１８６４４（ 図５）、ｐＭＯＮ１８６８５（図６）及びｐＭＯＮ１８６５８（図７）について も同じである。ｐＭＯＮ１８６４３及びｐＭＯＮ１８６４４の構築 ｐＭＯＮ８５７４のＫｐｎＩフラグメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）は本発 明の推定レプリカーゼＤＮＡ配列を産生するために使用したｃＤＮＡのソースで あった。ＫｐｎＩフラグメント、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１を、ＫｐｎＩ消化しＣ ＩＰ処理したｐＭＯＮ１８６０８に、センス方向でクローニングしてｐＭＯＮ１ ８６４３（図４）を作成し、アンチセンス方向でクローニングしてｐＭＯＮ１８ ６４４（図５）を作成した。ｐＭＯＮ１８６４３中のＰＬＲＶレプリカーゼの５ ’非翻訳領域の配列及び翻訳起点（ＡＴＧ）を以下に示す。 真正ＰＬＲＶ ｃＤＮＡを太字体で示す。（上の図の塩基７はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の塩基７に対応する）。ｐＭＯＮ８５７４のｃＤＮＡクローンの５’配 列内部に、ヌクレオチド７を起点とする翻訳開始（ＡＴＧ）コドンを含むＮｃｏ Ｉ部位が存在する。ＮｃｏＩ部位内部のこのＡＴＧは、推定ＰＬＲＶレプリカー ゼのヌクレオチド４１の真正翻訳起 点に対してアウトオブフレームの翻訳を惹起する。この第一の翻訳開始（ＡＴＧ ）はＯＲＦ１とインフレームに維持されている。ｐＭＯＮ１８６４３にクローニ ングされたＫｐｎＩフラグメントはまた、推定レプリカーゼ２ａ/２ｂタンパク 質のＯＲＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド４１−３，２２５）、遺伝 子間領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド３，２２６-３，４２２）、 コートタンパク質ＯＲＦの一部分（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド３， ４２３-３，８９０）、推定１７ｋＤａの核酸結合タンパク質をコードするＯＲ Ｆの一部分（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド３，４４８-３，８９１） を含む。コートタンパク質及び１７ｋＤａの核酸結合タンパク質のＯＲＦは３’ 端で頭部が欠失しており、終止コドンを含まない。従って、タンパク質合成はｐ ＭＯＮ１８６４３のＥ９に続くであろう。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４は、コートタ ンパク質及び１７ｋＤａのＯＲＦの最初のインフレーム終止コドンが見つかるま での３’のＫｐｎＩ部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド３，８９６- ３，９０１）の配列を含む。最初のインフレームストップは、１７ｋＤａタンパ ク質ではＳＥＱ ＩＤＮＯ．４のヌクレオチド１５４に存在し、コートタンパク 質のＯＲＦではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド１９５に存在する。ｐＭ ＯＮ１８６４３でＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ品種のジャガイモを形質転換し 、そのＰＬＲＶ耐性付与能力を試験した。 アンチセンスＲＮＡの発現をドライブするｐＭＯＮ１８６４４は１１０アミノ 酸よりも大きいＯＲＦを全く含まない。アンチセンス構築物を作成する理由は、 侵入性ＰＬＲＶの正センスメッセージに結合し従ってＰＬＲＶ感染の初期事象中 にＰＬＲＶゲノムの翻訳をブロックするマイナス鎖ＲＮＡを作成するためであっ た。ｐＭＯＮ１８６４４についても、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋジャガイモ を形質転換し、そのＰＬＲＶ耐性付与能力を試験した。ｐＭＯＮ１８６７９の構築 推定レプリカーゼ遺伝子（ＯＲＦ２ａ/２ｂ）の発現を改良し得るベクターを 作成するために、第一のＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド７）と 、ＯＲＦ２ａ/２ｂをコードする第二のＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌク レオチド４１）との間の部位特異的突然変異誘発によってＢｇｌII（Ａ↓ＧＡＴ ＣＴ）制限部位を挿入した。以下のオリゴヌクレオチドを使用し、Ｂｉｏ-Ｒａ ｄによって記載さ れたＭｕｔ-ａ-Ｇｅｎｅ（登録商標）手順に従って突然変異誘発を実施した。 5’-TCTGTTCATGATAGATCTCGTAAATTAAGCTC-3’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３） 得られた突然変異を、ＰＬＲＶレプリカーゼの翻訳開始点（ＡＵＧ）の上流９ ヌクレオチドのＢｇｌII部位に挿入し、ｐＭＯＮ１８６７９と命名した。このベ クターはｐＭＯＮ８５７４の誘導体である。 ｐＭＯＮ１８６８５の構築 ＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子がレプリカーゼＲＮＡ及び１種または複数のタン パク質を発現するＲｕｓｓｅｔ ＢｕｒｂａｎｋにＰＬＲＶ耐性を与える能力を 試験するために、ＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子をコードするｐＭＯＮ１８６７９ 由来のＢｇｌII-ＫｐｎＩフラグメントから成るＤＮＡコーディング配列をｐＭ ＯＮ１８６０８（図２）に組込み操作した。得られたベクターｐＭＯＮ１８６８ ５（図６）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド３８-３，９０１ を含む。配列内部には、ＢｇｌII挿入体の５ヌクレオチド、５’非翻訳真正ＰＬ ＲＶ ｃＤＮＡの３ヌクレオチド、ＯＲＦ２ａ及びＯＲＦ２ｂのコーディング配 列、並びに、３’真正ＰＬＲＶ ｃＤＮＡの６６６ヌクレオチドが存在する。３ ’配列の６６６ヌクレオチド内部には、遺伝子間領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ のヌクレオチド３，２２６-３，４２２）、コートタンパク質ＯＲＦの一部分（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド３，４２３−３，８９０）及び１７ｋＤ ａの推定核酸結合タンパク質ＯＲＦの一部分（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ヌクレオ チド３，４４８-３，８９１）が存在する。コートタンパク質及び１７ｋＤａの 核酸結合タンパク質のＯＲＦは３’端の頭部が欠失しているので、終止コドンを 含まない。これらの遺伝子から産生されたｍＲＮＡによるタンパク質合成は、ｐ ＭＯＮ１８６８５のＥ９ ３’領域に続くであろう。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４は 、コートタンパク質及び１７ｋＤａのＯＲＦの最初のインフレーム終止コドンが 見つかるまでの３’ＫｐｎＩ部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ヌクレオチド３，８ ９６-３，９０１）由来の配列を含む。最初のインフレームストップは、１７ｋ Ｄａタンパク質に対してはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド１５４に存在 し、 コートタンパク質ＯＲＦに対してはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４のヌクレオチド１９ ５に存在する。ｐＭＯＮ１８６８５のＰＬＲＶ耐性付与能力を試験するために、 Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ品種のジャガイモをｐＭＯＮ１８６８５で形質転 換した。ｐＭＯＮ１８６５８の構築 ＧＤＤモチーフを含む頭部切除レプリカーゼ構築物をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ から構築した。ＰＬＲＶ ＯＲＦ２ｂの５１％（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌク レオチド２，２７５-３，２２２）をコードする植物発現ベクターを、５’オー バーハングを除去するためにクレノウ及びｄＮＴＰで埋め戻したＨｉｎｄIII部 位（Ａ↓ＡＧＣＴＴ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ヌクレオチド２，２２７-２， ２３２）と、非反復ＢｓａＡＩ部位（ＣＡＣ↓ＧＴＧ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １のヌクレオチド３，４０４-３，４０９）とを用いて作成した。１，１７８ヌ クレオチドのフラグメントは、５’非翻訳配列の４７ヌクレオチド（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ．１のヌクレオチド２，２２８-２，２７４）、ＧＤＤドメインのコー ディング配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド２，２７５-３，２２２ ）及び３’非翻訳配列の１８１ヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ のヌクレオチド３，２２６−３，４０６）を含む。ＧＤＤドメインを含む３１６ コドンの部分的ＯＲＦ２ｂ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド２，２７５ -３，２２２）を作成した。記載のフラグメントを、ＳｔｕＩ及びＣＩＰによっ て消化したｐＭＯＮ１８６０８にセンス方向でクローニングした。 得られたプラスミドをｐＭＯＮ１８６５８と命名し、耐性評価のためにＲｕｓ ｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ品種のジャガイモをこのプラスミドで形質転換した。ＰＬＲＶ耐性を付与するその他のベクターの構築 ＰＬＲＶ耐性を付与するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の発現構築物の設計を変更し 得ることは当業者に理解されよう。これらのベクターを２ａＯＲＦだけもしくは ２ｂＯＲＦだけ優先的に発現させてもよく、または、同じまたは異なるプロモー ターを用い同じベクター内で双方のＯＲＦを互いに別々に発現させてもよい。Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のヌクレオチド２，２２７のＨｉｎｄIII部位を利用でき るように部分消化中にｐＭＯＮ１８６８５をＨｉｎｄIIIで切断することによっ てベクターを構築し得る。５’オーバーハングを除去して平滑末端をもつクロー ニング部位を作成するために、ベクターをクレノウ及びｄＮＴＰで埋め戻す必要 があ る。次に、ベクターをＢｇｌIIで切断し、２ａドメインを含むフラグメントを単 離する。このフラグメントはＢｇｌII及びＳｔｕＩで切断したｐＭＯＮ１１７８ １にクローニング可能であった。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のコーディング能力の別の変種では、レプリカーゼ構 築物ｐＭＯＮ１８６８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ヌクレオチドの３，２２６- ３，８９１）の終止コドン（ＴＧＡ）までの構造遺伝子の３’のコーディング領 域が除去される。この発現ベクターの構築方法では、ＢｇｌII及びＢｓａＡＩに よってｐＭＯＮ１８６８５を消化し、ＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子を含むフラグ メントを、ＢｇｌII及びＳｔｕＩで消化したｐＭＯＮ１１７８１にクローニング した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１８８２１と命名した。 更に、部位特異的突然変異誘発または当業者に公知のその他の技術によって、 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のフレームシフト領域（ヌクレオチド１，５０１-１， ５０７）の内部にいくつかのヌクレオチドを挿入、除去または変異させることに よって天然フレームシフト部位を除去するように構築物を設計できた。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１内部のヌクレオチド １，５０７の後にＴヌクレオチドを挿入する突然変異誘発プライマーを使用でき 、また、フレームシフト部位の内部のヌクレオチドを変異させ、フレームシフト がもはや発生しないようにした。この挿入及び変異は、天然のフレームシフト部 位を変異させ、従って全長（２ａ/２ｂ）１１０ｋＤａの推定レプリカーゼ遺伝 子を発現する。フレームシフト部位を変異させる突然変異誘発プライマーを以下 に示す。 5’-CGGTGCCGCTTGCCCAATTCAAGGGCTTGTTTGTTG-3’ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５ 上記の突然変異誘発プライマーによって突然変異したフレームシフト部位の翻 訳を以下に示す。下線を付けたアミノ酸配列は真正ＯＲＦ２ｂアミノ酸配列を示 す。元の配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１中の変異ヌクレオチドを太字体及び下線に よって強調する。 本文中に記載のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１のＰＬＲＶコーディング配列を、ＰＬ ＲＶ感染に対する耐性が更に強化されるように改変してもよい。本文中の改変な る用語は、ＰＬＲＶコーディング配列の任意の意図的な変異を意味しており、 その非限定例としては、付加、欠失、置換及びそれらの組み合わせがある。構築 物はまた、ＯＲＦ２ａのＮＴＰドメイン及び/またはＯＲＦ２ｂのＧＤＤドメイ ンが改変されるように特異的に設計され得る。 ＰＬＲＶレプリカーゼまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ．１の部分的変異がＰＬＲＶの非相同または異種菌株に対して発現する耐性ス ペクトルは未知である。可能な耐性拡大メカニズムは、ＰＬＲＶレプリカーゼま たはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の部分的変異と、コ ートタンパク質の構造遺伝子（ＯＲＦ３）またはコートタンパク質の遺伝子の何 らかの変異またはコートタンパク質遺伝子のコーディング能力とを組み合わせる ことによって得られる。コートタンパク質構造要素と非構造レプリカーゼ遺伝子 とのこの組み合わせは広い耐性スペクトルを与えることに成功した。 ウイルス耐性スペクトルの拡大はまた、複数のレプリカーゼ遺伝子または非近 縁ウイルス由来の複数の別の遺伝子を組み合わせ双方のウイルスに耐性を与える ことによって得られた。例えば、発現ベクター中のＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子 とＰＶＹレプリカーゼ遺伝子またはＰＶＹコート タンパク質遺伝子とを組み合わせると、ＰＬＲＶ及びＰＶＹの双方に対する耐性 が得られた。これは、任意のウイルスに耐性を与えることが判っている任意の構 造遺伝子を互いにまたは非構造遺伝子と任意に組み合わせることによって使用し 得ることを示す応用例である。 広い耐性スペクトルはまた、レプリカーゼ遺伝子と、他のＰＬＲＶレプリカー ゼ遺伝子のような他の遺伝子との融合によって拡大し得る。このような耐性スペ クトルの拡大は、ＰＬＲＶ単離物の２ａドメインと異なる単離物の２ｂドメイン との翻訳的融合によるキメラレプリカーゼ遺伝子の作成によって得られる。この キメラレプリカーゼ遺伝子は、非キメラレプリカーゼ遺伝子の発現では得られな かったような、双方の単離物に対する保護を与えるであろう。耐性を与えるよう な別の融合体も構築し得る。 ＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）及び他の形質を与え る遺伝子の別の組み合わせを更に含む発現ベクターを構築することも可能であっ た。これらの例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに由 来のタンパク質のような殺虫性タンパク質をコードする遺伝子、または多量の固 体（ｈｉｇｈ ｓｏｌｉｄｓ）の 産生に関連する遺伝子のような改良された品質形質を与える遺伝子がある。三親交配手順 形質転換に先立って、ｐＭＯＮベクターを内包する大腸菌を、ヘルパープラス ミドｐＲＫ２０１３（Ｄｉｔｔａら、１９８０）との三親交配によってＡｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩに交配した。ＡＢＩは、欠損ｐＴｉＣ５８プラスミ ドｐＭＰ９０ＲＫ（Ｋｏｎｃｚ ＆ Ｓｃｈｅｌｌ、１９８６）を保有するＡｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌Ａ２０８株である。欠損Ｔ ｉプラスミドは、ＡＢＩ菌株に接合した後にｐＭＯＮベクターの自律複製に必要 なｔｒｆＡ遺伝子機能を与える。植物組織をＡＢＩ：：ｐＭＯＮコンジュゲート と共にインキュベートしたとき、ベクターは欠損ｐＭＰ９０ＲＫＴｉプラスミド によってコードされたｖｉｒ機能によって植物細胞に移入される。ＬＢ培地（１ リットルあたり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス及び５ｇのＮａＣｌ）中 で２５μｇ/ｍｌのクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ ｏ．）及び５０μｇ/ｍｌのカナマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ ｏ．）と共にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａを３０℃で３０時間増殖させた。ｐＲＫ ２０１３を内包する大腸菌をカナマイシン（５０μｇ/ｍｌ）中で一夜増殖 させた。ｐＭＯＮベクターを内包する大腸菌を７５μｇ/ｍｌのスペクチノマイ シン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を含むＬＢ培地中で増殖させた 。培養物の増殖後、各１００μｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩ、大腸 菌ｐＲＫ２０１３及び大腸菌ｐＭＯＮベクターを収容した管に４ｍｌのＬＢを添 加した。この混合物を５０００×ｇで５分間遠心した。遠心後に、上清分画を傾 瀉し、ペレット分画を１００μｌのＬＢに再懸濁させた。２５μｌの再懸濁細菌 をＬＢプレートの表面中央にピペットで点滴した。３００Ｃで一夜増殖後、この プレートから採集した細胞の接種ループを、７５μｇ/ｍｌのスペクチノマイシ ンと５０μｇ/ｍｌのカナマイシンと２５μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールとを 補充したＬＢプレートで画線培養した。 ３０℃で２４〜４８時間維持した後、大腸菌ｐＭＯＮベクター、大腸菌ｐＲＫ ２０１３及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＡＢＩの三親交配プレートは細菌コ ロニーを含んでいた。三親交配プレートから４つのコロニーを選択し、７５μｇ /ｍｌのスペクチノマイシンと５０μｇ/ｍｌのカナマイシンと２５μｇ/ｍｌの クロラムフェニコールとを補充したＬＢ液体培地に接種し、３０℃で増殖させた 。ｐ ＭＯＮベクターの存在をサザン分析によって証明した。ｐＭＯＮベクターを含む ことが確認された培養物の１つを使用してＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋジャガ イモ品種を形質転換した。ジャガイモの形質転換 異なる４つのレプリカーゼ構築物ｐＭＯＮ１８６８５、ｐＭＯＮ１８６４３、 ｐＭＯＮ１８６４４及びｐＭＯＮ１８６５８を用いてＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａ ｎｋジャガイモを形質転換した。選択可能物質としてカナマイシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いてジャガイモを形質転換するために、Ａｇ ｒｏｂａｃｔａｅｒｉｕｍを２ｍｌのＬＢＳＣＫ中で一夜増殖させた。翌日、細 菌をＭＳＯで１：１０に希釈するかまたは０．２〜０．３３の光学密度読み取り が成立するまで希釈した。２５ｍｇ/ｍｌのアスコルビン酸を補充したＰＭ培地 中で無菌条件下に３週間増殖させたジャガイモ植物の茎から葉を摘み取り、茎を ３〜５ｍｍの切片に切断し、上記のような希釈細菌を接種した。 準備した共生培養皿に移植片を配置した。共生培養皿は１．５ｍｌのＴｘＤ細 胞と共に１/１０のＭＯＳを収容し、 湿潤濾紙で被覆されていた。皿あたり約５０の移植片を配置した。２日間の共生 培養期間後、５．０ｍｇ/リットルのＺｅａｔｉｎ Ｒｉｂｏｓｉｄｅ、１０ｍ ｇ/リットルのＡｇＮＯ₃、０．１ｍｇ/リットルのＮＡＡ及び１００ｍｇ/リット ルのカナマイシンを加えたＭＳＯを含むカルス誘導培地に移植片を配置し４週間 維持した。４週間後、カナマイシンの存在下に増殖を示した移植片を更に選択す るために、５．０ｍｇ/リットルのＺｅａｔｉｎ Ｒｉｂｏｓｉｄｅ＋１０ｍｇ/ リットルのＡｇＮＯ₃及び０．３ｍｇ/リットルのＧＡ₃を加えたＭＳＯを１００ ｍｇ/リットルのカナマイシンと共に含む苗条誘導培地に配置した。８週目に苗 条が出現し始めた。次に、植物をＰＭ培地と共にガラスカップに配置し、約２週 間増殖させた。植物を土に植え、寒気に曝して丈夫にし、形質転換を確認するた めにカルスを再形成させ、抗生物質カナマイシン耐性を植物に与えるＮｐｔIIの 存在をアッセイによって分析した。植物がＮｐｔIIの発現に有利な陽性のカルス 再形成を示したとき、この植物を更に試験するために選出し組織培養物中に維持 した。ジャガイモＰＬＲＶ耐性実験 Ａ．トランスジェニックＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋの生 育室分析 ＰＬＲＶ感染に対するトランスジェニックジャガイモの耐性の評価を先ず生育 室で行った。ＰＬＲＶ感染力アッセイのために各トランスジェニック系統から１ ０本の根付き挿し木を作成した。適度な強さの光を当てて２４℃に維持する１６ 時間の昼と２０℃に維持する８時間の夜とを与える条件の生育室でジャガイモ植 物を生育した。移植の２週間後、トランスジェニック植物及び対照Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋの根付き挿し木に、アブラムシを用いてＰＬＲＶを接種した。 アブラムシをＰＬＲＶ感染ホオズキ（Ｐｈｙｓａｌｉｓ ｆｌｏｒｉｄａｎａ） 上に維持した。約１５匹の保毒アブラムシをホオズキから各ジャガイモ植物に移 した。アブラムシを１週間だけ放置し、次いでアブラムシ駆除用殺虫剤を散布し た。接種の１カ月後、各植物の葉及び根のサンプルを採取し、ＥＬＩＳＡによっ て分析した。感染植物の葉または根でＰＬＲＶ抗原（ウイルス）が検出されたと きに植物が感染されていると判定した。この分析の結果を以下の表１に示す。縦 の欄は構築物の番号、アッセイに用いた各構築物の系統の番号及び３段階の感染 範囲に分類された系統の数を示す。高度に耐性の系統は０−２０ ％のＰＬＲＶ感染を示し、中程度に耐性の系統は２１−６０％の感染を示し、耐 性のない系統は＞６０％の感染を示す。結果は、ｐＭＯＮ１８６４３（アウトオ ブフレームのレプリカーゼ）においてはＰＬＲＶ感染に高度に耐性の系統は存在 せず、ｐＭＯＮ１８６４４（アンチセンス）においては２１の試験系統中の１系 統が高レベルの耐性を示し、ｐＭＯＮ１８６５８（レプリカーゼ遺伝子の３’部 分）においては１７の試験系統中の１系統が高レベルの耐性を示し、ｐＭＯＮ１ ８６８５においては３系統中の１系統が高レベルの耐性を示し、ＲＢ-ｗｔ対照 においては１２の試験系統全部が＞６０％の感染を示した。ＰＬＲＶレプリカー ゼｃＤＮＡを含むアンチセンス（ｐＭＯＮ１８６４４）、３’部分（ｐＭＯＮ１ ８６５８）及びセンス（ｐＭＯＮ１８６８５）構築物は、ＰＬＲＶ感染に高度に 耐性のＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋジャガイモ系統を作成する可能性を有して いるという結論が得られた。 Ｂ．トランスジェニックＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋの圃場検定 １０系統のＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ（ＲＢ）野生型（独立の非トランス ジェニック組織培養再生物）、１４系統のベクター対照（ＶＣ）（ＰＬＲＶ ｃ ＤＮＡ非含有のトランスジェニックＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ）、及び試験 構築物ｐＭＯＮ１８６４３（１７系統）、ｐＭＯＮ１８６４４（２２系統）、ｐ ＭＯＮ１８６５８（１９系統）及びｐＭＯＮ１８６８５（２４系統）の挿し木か らジャガイモの苗を生育した。苗を鉢に移植し、圃場栽培まで温室に維持した。 圃場試験法としては任意反復実験を用い、各系統の植物を１ 畝あたり２０本として重複試験した。この設計を米国ノースウエストの２つの試 験地で繰り返した。試験地を夫々試験地＃１及び試験地＃２と呼ぶ。 圃場栽培の２週間後、ＰＬＲＶ ＬＲ-７感染したホオズキ（Ｐｈｙｓａｌｉ ｓ ｆｌｏｒｉｄａｎａ）から摘取したアブラムシ寄生葉を各ジャガイモ植物に 移すことによって、各植物に１０〜２０匹のＰＬＲＶ ＬＲ-７保毒グリーンピ ーチアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）を接種した。保毒アブラムシ はホオズキの葉から這い出してジャガイモ植物を食べ、これによってジャガイモ 植物にＰＬＲＶ感染の機会を与えた。接種５日後にジャガイモ植物に殺虫剤を噴 霧した。栽培後１６週以内の植物が自然老化を始めるまで季節中は殺虫剤の散布 を定期的に継続した。 Ｃ．葉面症状の目視評価 接種６週後に双方の試験地の各反復試験区のＰＬＲＶ症状を評点した。各試験 地で、評点はブラインドで実施したが、協力者の主観的評価に傾き易かった。結 果を、記録するか、または、認識可能なＰＬＲＶ葉面症状を示した各反復試験区 の植物のパーセンテージに変換した。各系統毎に１つの評価を与えるように評点 を平均化し、得られた値を 図９及び図１０のデータグラフの点として示す。双方の反復試験区でデータが得 られないかまたはデータが不完全であったジャガイモ系統はこのグラフに示さな かった。これらのグラフのＸ軸は、ＰＬＲＶ様症状を示す植物のパーセンテージ として測定したＰＬＲＶの平均感染率を示す。Ｙ軸（図示せず）は系統の数を示 す。試験地＃１の結果を図９に示し、試験地＃２の結果を図１０に示す。 図９は、圃場試験地＃１における全部のレプリカーゼｃＤＮＡ系統と対照との 目視評価の比較を示す。図９から判るように、ｐＭＯＮ１８６８５（全長ＰＬＲ Ｖレプリカーゼコーディング配列）では２４のトランスジェニック系統中の１１ 系統がＰＬＲＶ症状に対して高レベル（＜２０％の症状、ｐ＝０．０５）の耐性 を示した。ｐＭＯＮ１８６５８（ＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子の３’部分）では ６つのトランスジェニック系統が圃場試験地＃１でＰＬＲＶ症状に対して有意な （＜２０％の症状、ｐ＝０．０５）耐性を示した。ｐＭＯＮ１８６４３（ＰＬＲ Ｖレプリカーゼのアウトオブフレームコーディング配列）ではＰＬＲＶ症状の有 意な減少を示した系統はなかった。ｐＭＯＮ１８６４４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １のアンチセンス）ではＰＬＲＶ症状の有 意な減少を示した系統はなかった。 圃場試験地＃２の目視観察の結果を図１０に示す。ｐＭＯＮ１８６８５（＜２ ５％症状）の４つのトランスジェニック系統及びｐＭＯＮ１８６５８（＜２５％ 感染）の３つの系統は、ＰＬＲＶ症状に対する耐性を示した。ｐＭＯＮ１８６４ ３で形質転換した系統またはｐＭＯＮ１８６４４で形質転換した植物中では、耐 性が観察されなかった。２つの試験地における目視評点の差は、各試験地の症状 に関する協力者の主観的評価に起因する。双方の試験地の結果によれば、ｐＭＯ Ｎ１８６５８（３’ＰＬＲＶレプリカーゼコーディング配列）及びｐＭＯＮ１８ ６８５（全長ＰＬＲＶレプリカーゼコーディング配列）のトランスジェニックジ ャガイモ系統がＰＬＲＶ症状に対して高レベルの耐性を示した。 Ｄ．ＰＬＲＶ（７）ＥＬＩＳＡ分析 保毒アブラムシ接種の６週後に、ＰＬＲＶ抗原（ウイルス）をアッセイするた めに、１０系統のＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋジャガイモ対照、５系統のｐＭ ＯＮ１８６５８及び１０系統のｐＭＯＮ１８６８５のトランスジェニックＲｕｓ ｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋジャガイモから葉サンプルを採取した。サンプルに選ん だ各植物の別々の葉から＃６ のコルク穿孔器で３つの打ち抜き葉サンプルを採取し、合わせて１つの分析用サ ンプルとした。サンプルを凍結状態で２つの圃場試験地からＥＬＩＳＡ用試験所 に輸送した。サンプルを７５０μｌのＰＢＳ-Ｔ-Ｏ中でテフロン乳棒で均質化し 、ヒツジ抗ＰＬＲＶ ＩｇＧを予めコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレ ートに充填した。プレートを一夜インキュベートし、ＰＢＳ-Ｔで洗浄し、アル カリホスファターゼにコンジュゲートしたヒツジ抗ＰＬＲＶ ＩｇＧと共にイン キュベートした。プレートを４時間インキュベートし、ＰＢＳ-Ｔで洗浄し、ア ルカリホスファターゼ基質を添加することによって増殖させた。 図１１は、試験地＃１のｐＭＯＮ１８６８５系統、ｐＭＯＮ１８６５８系統及 びＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ野生型（ＲＢｗｔ）対照から採取したサンプル のＥＬＩＳＡによって測定した平均感染率（％）の比較を示す。図１２は同様に 、試験地＃２のｐＭＯＮ１８６８５系統、ｐＭＯＮ１８６５８系統及びＲｕｓｓ ｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ野生型（ＲＢｗｔ）対照から採取したサンプルのＥＬＩＳ Ａによって測定した平均感染率（％）の比較を示す。各点は、アッセイに用いた 各系統の２つの反復試験地における感染を逆変換 平方根平均（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｑｕａｒｅ−ｒｏｏｔ ｍ ｅａｎｓ）として計算した平均パーセント感染値（４０個のデータ点の平均）で ある。統計分析は、垂直方向の点線で示す信頼レベル（０．１％、１．０％及び ５％）をもつ片側検定である。このＥＬＩＳＡデータは目視評価よりも客観的で ある。双方の試験地におけるＰＬＲＶ感染のＥＬＩＳＡ値とＰＬＲＶ症状の目視 観察との間には十分な相関関係が存在した。ｐＭＯＮ１８６８５については８系 統が双方の試験地でｐ＝０．０１を有している。ｐＭＯＮ１８６５８については ２系統が双方の試験地でｐ＝０．０１を有している。この分析によれば、６つの ｐＭＯＮ１８６８５系統が双方の試験地でＰＬＲＶの非存在を示した。 Ｅ．圃場試験地の塊茎の網状壊死の分析 ＰＬＲＶ構築物の圃場試験で得られたジャガイモの収穫時の網状壊死の存在を 検定した。Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋジャガイモの網状壊死症状の原因は、 塊茎中の篩部組織が枯れて暗色に変わるためであり、この変色は網状構造として 塊茎全体に現れるが、通常は塊茎の切断された茎端に極めて顕著に現れる。この 分析では、各系統の塊茎の 茎端を切断し、網状壊死症状を検査した。網状壊死をはっきりと示した塊茎だけ を網状壊死の範囲にカウントした。このアッセイ時点で塊茎の別の変色または欠 陥も存在していた。これらの原因としては、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ ．及びＦｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．のような維管の植物病原体の存在、または熱 応力、冷害、つるの早枯れのような生理的要因、及び茎端の褐変反応を生じる他 の要因などが考えられる。ＰＬＲＶが誘発した網状壊死の初期症状と後者の塊茎 変色との識別は不可能であろう。従って、この範囲に入れた値の幾つかが、塊茎 の貯蔵後に明白に識別できる網状壊死に発展し得る。収穫時の識別可能な網状壊 死及びその他の塊茎変色の減少は、ＰＬＲＶ耐性ジャガイモ系統を評価するため 及び市場品質の植物材料を選択するための重要な基準である。 Ｆ．網状壊死アッセイの手順 全試験区を畝毎に収穫し、塊茎を地面に置いた。全試験区の塊茎の型を評点し た。型外れの塊茎については網状壊死を評点しなかった。各試験地の選択系統か ら選んだ８０の大塊茎（１試験区あたり４０、１系統あたりの総数１６０）を切 断して網状壊死の存在及び発病度を検定した。各 塊茎の茎端を長軸に垂直に切断し、次に各塊茎を半分に分割した。網状壊死のな い塊茎を「０」と評価し、網状壊死のある塊茎を「１」と評価し、網状壊死が塊 茎の中央まで広がっている塊茎を「２」と評価した。網状壊死以外の内的欠陥ま たは病害の存在を「＋」と評価した。（１）草性及び塊茎の品質に基づいて適正 な型である、（２）２５％以下の葉症状または症状の有意な減少（ｐ＝０．０５ ）を示す、及び、（３）網状壊死を示す塊茎が１系統あたり２個以下であるかま たは対照に比べて網状体が９５％減少している、という３つの品質基準のすべて を満たしていた系統の残りの塊茎全部を、試験区毎に袋詰めし、６０日間貯蔵し 、６０日目にこれらの残りの塊茎を上記手順で検定した。野生型（ＲＢ）の残り の塊茎もすべて袋詰めして貯蔵し、後日になって網状壊死を分析した。 収穫時に行った網状壊死分析の結果を表２に示す。この表は双方の試験地のデ ータを合わせたものである。アッセイに用いた各系統毎に、１６０の塊茎を切断 し網状壊死の発生率を審査した。アッセイに用いた１０系統のＲｕｓｓｅｔ Ｂ ｕｒｂａｎｋ野生型ジャガイモの１６００の塊茎では、７．５〜１９．４％の範 囲にわたる合計１３．３％（２ １３塊茎）が網状壊死の発生を示し、３６．７％（５８７塊茎）が網状壊死と多 少の塊茎変色とを併せて示した。ｐＭＯＮ１８６８５（全長レプリカーゼコーデ ィング配列）では、網状壊死アッセイに用いた２４系統中の１２系統がＲｕｓｓ ｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ ｗｔよりも少ない症状を示し、２．５〜７．５％の範囲 にわたる合計５．５％（１０６/１９２０）が網状壊死を示し、合計２０．１％ （３８６/１９２０）が変色を示した。ｐＭＯＮ１８６５８（３’レプリカーゼ フラグメント、ＧＤＤ）では、アッセイに用いた１９系統中の７系統で、１．３ 〜６．８％の範囲の合計３．９％（４４/１１２０）の塊茎が網状壊死の発生を 示し、１８．４％の塊茎（２２２/１１２０）が何らかの欠陥を示した。ｐＭＯ Ｎ１８６４３（アウトオブフレームレプリカーゼ配列）では、１０系統中の２系 統が６．９％（２２/３２０）の網状壊死を示し、２４．７％（７９/３２０）が 何らかの欠陥を示した。ｐＭＯＮ１８６４４（アンチセンス）では、１０系統中 の１系統が３．８％（６/１６０）の網状壊死を示し、２５％（４０/１６０）が 何らかの欠陥を示した。このアッセイによれば、ｐＭＯＮ１８６８５では２４系 統中の１２系統、ｐＭＯＮ１８６５８では１９系統中の７系統において収穫時の 網状 壊死の発生数が減少し、その他の塊茎変色の発生率も低下していることが判明し た。ｐＭＯＮ１８６４３及びｐＭＯＮ１８６４４では、夫々１０系統中の２系統 及び１０系統中の１系統で網状壊死の発生率の減少が観察された。アッセイに用 いた系統の総数に対するパーセンテージで判断すると、センス構築物、即ち、ｐ ＭＯＮ１８６８５及びｐＭＯＮ１８６５８では、ｐＭＯＮ１８６４３及びｐＭＯ Ｎ１８６４４よりも多くの系統で網状壊死が減少していた。 貯蔵後の塊茎の網状壊死アッセイの結果を表３に示す。 塊茎を華氏５０〜５５度で２カ月間貯蔵し、次いで、網状壊死症状の発生率及び 発病度を判定するために、試験地毎 に１系統あたり約１２０個の塊茎を前述のごとく切断した。表３のデータは試験 地＃２から得られたものである。Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ野生型（ＲＢｗ ｔ）の１０系統は、１系統あたり２．６−３１％の範囲の平均１１．４％の網状 壊死を示した。ｐＭＯＮ１８６８５の５系統は貯蔵後網状壊死の発生率が０−１ ．４％の範囲にわたる合計０．８％であり、対照よりも良好な結果を示した。ｐ ＭＯＮ１８６５８の３系統は貯蔵後の網状壊死の発生率が、０−２．５％の範囲 にわたる合計１．１％であり、対照よりも良好な結果を示した。構築物ｐＭＯＮ １８６４３及びｐＭＯＮ１８６４４の各々では、１つの系統が、夫々０．８％及 び３．０％に減少した貯蔵後の網状壊死の発生率を示した。（注：標本採取手順 の性質によって、貯蔵後の網状壊死アッセイから得られたデータは軽度の網状壊 死の検出に有利になるように歪んでいると考えられる。典型的には、最大塊茎を 収穫時アッセイ用に選択し、より少数の大塊茎を貯蔵後アッセイ用に残しておく 。網状壊死は、小さい塊茎サンプルよりも大きい塊茎サンプル中で発生する機会 が多い。従って、本文中に示すデータはこの要因を反映し得る。） Ｇ．発芽した塊茎の葉組織のＥＬＩＳＡ 発芽した塊茎から得られた葉組織の耐性レベルをＥＬＩＳＡによって測定し得 る。塊茎の萌芽中のＰＬＲＶの発生率は、塊茎中のＰＬＲＶを測定するための信 頼できる方法である（Ｆｌａｎｄｅｒｓら、１９９０）。萌芽中のＰＬＲＶ感染 の低発生率及び塊茎中の低ウイルス価は、網状壊死症状の発生率及び発病度に有 意な衝撃を与える。更に、塊茎中のＰＬＲＶの感染及び蓄積に高度に耐性のジャ ガイモ植物は、市場用栽植の種子材料としてより有用である。 葉の網状壊死症状が減少していたジャガイモ系統及びＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂ ａｎｋ野生型（ＲＢｗｔ）及びベクター対照系統（ＲＢｖｃ）の各々の約４０個 の塊茎のバラ末端 （ｒｏｓｅ ｅｎｄ）を切断することによって塊茎の発芽を惹起した。各ジャガ イモ片は少なくとも３つの芽を有しており、これを発芽剤（ジベレリン酸）で処 理し、次いで温室内で鉢土に植付けた。植付けの６週後に、各塊茎の芽が発芽し 、１塊茎あたり３つの萌芽の各々から１枚の葉サンプルを採取し、１サンプルと してプールした。サンプルを７５０μｌのＰＢＳ−Ｔ抽出緩衝液中で均質化し、 ２５０μｌをＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに充填し、前述の試薬によっ てＰＬＲＶの存在を検定した。 貯蔵後に発芽した塊茎のアッセイ結果を表４に示す。Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂ ａｎｋ ｗｔ及びｖｃの萌芽はＰＬＲＶによって高度に感染されていた。アッセ イに用いた塊茎の平均８０％がウイルスを含んでいた。これは、Ｆｌａｎｄｅｒ ｓら（１９９０）がＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ中で観察した感染率と同様で ある。ｐＭＯＮ１８６８５（全長レプリカーゼ）の５系統は、萌芽中の極めて低 いＰＬＲＶ発生率によって示されるように塊茎のＰＬＲＶ感染に高度に耐性であ った。５系統中の４系統が検出可能なＰＬＲＶを含んでいなかった。ｐＭＯＮ１ ８６５８（ＧＤＤフラグメント）では３系統をアッセイに使用したが、ＰＬＲＶ の発生率（１７％）が減少していた。１系統は検出可能なＰＬＲＶを含んでいな かった。ｐＭＯＮ１８６４３では１系統が中程度のＰＬＲＶ発生率（５５％）を 示し、ｐＭＯＮ１８６４４の１系統は高レベルのＰＬＲＶ（８９％）を示した。 このデータから、ｐＭＯＮ１８６８５中の全長ＰＬＲＶレプリカーゼ遺伝子は高 頻度のＰＬＲＶ感染に対してほぼ免疫を与え、ＧＤＤフラグメントをもつｐＭＯ Ｎ１８６５８はより低い頻度でほぼ免疫を与えるという結論に達した。 アンチセンス構築物ｐＭＯＮ１８６４４はウイルス耐性に対してあまり有効でな く、ｐＭＯＮ１８６４３中のアウトオブフレーム翻訳開始コドンはレプリカーゼ 遺伝子産物の産生に不利な影響を与え、ＰＬＲＶ感染に対する耐性を与える構築 物の効力を減少させる。 Ｈ．圃場の接種レプリカーゼ系統からのアブラムシによるＰＬＲＶ伝搬アッセイ ＰＬＲＶは機械的に伝搬されない。感染植物から非感染植物へＰＬＲＶを伝搬 することができるのはアブラムシだけである。病害を防除するために現行のよう な殺虫剤の散布が必要とされる理由はここにある。ウイルス耐性ジャガイモには アブラムシ防除のための殺虫剤がもはや不要である。ＰＬＲＶ耐性のジャガイモ 栽培品種はしばしばＰＬＲＶ価を全く示さないかまたは極めて僅かにしか示さず 、これらの植物から他の植物へのアブラムシによるウイルス伝搬も容易には生じ ない。この特徴は、圃場のウイルス蔓延の可能性を抑制するので営利面から極め て重要である。 表５は、ＰＬＲＶを接種した圃場のレプリカーゼ系統の葉から指標宿主ホオズ キ（Ｐｈｙｓａｌｉｓ ｆｌｏｒｉｄａｎａ）へのアブラムシによるＰＬＲＶ伝 搬の結果を示す。実験的にこれを逆伝搬（ｂａｃｋ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ）と呼ぶ。使用した方法では、表５に示す各レプリカーゼ系統の１０植物の各々 から１枚の若い小葉を収穫した。 湿潤濾紙に載せたシャーレ中で各小葉に５匹のアブラムシを置いた。２４時間後 、アブラムシを置いた各小葉をホオズキ幼若植物に置き、ケージで覆った。４８ 時間後、硫酸ニコチンを燻蒸することによってアブラムシを駆除した。接種４週 後にＰＬＲＶ感染の徴候を審査した。葉症状が全くまたは殆どなく、塊茎の網状 壊死も全くまたは殆どなく、塊茎の萌芽中にウイルスが全くまたは殆ど存在しな かったｐＭＯＮ１８６８５の５系統は、表５に示すようにアブラムシによって伝 搬可能なウイルスも含んでいなかった。ｐＭＯＮ１８６５８の３系統は、葉症状 、塊茎の網状壊死及び塊茎の萌芽中のウイルスがいずれも少なく、アブラムシに よって伝搬可能なウイルスをある程度含んでいた。 アッセイに用いた系統のうち、アンチセンス構築物ｐＭＯＮ１８６４４は有効 なウイルス耐性を与えず、ｐＭＯＮ１８６４３中のアウトオブフレーム翻訳開始 コドンはレプリカーゼ遺伝子産物の産生に不利な影響を与え、ＰＬＲＶに対する 耐性を与える構築物の効力を減少させた。 注：ＰＬＲＶ感染したＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋからの逆伝搬は常に９０− １００％の感染ホオズキを生じる（Ｈａｓｓａｎら、１９８５；Ｔｈｏｍａｓ、 １９８３）。 本明細書で言及したすべての刊行物及び特許出願は、本発明が属する分野にお ける当業者の技術レベルを示す。 上記より、本発明は提示したすべての目的を本発明に固有の明白な利点を伴っ て適切に達成し得ることが理解されよう。いくつかの特徴及びサブコンビネーシ ョンは有益であり他の特徴及びサブコンビネーションに無関係に使用できること も理解されよう。これらは本発明の範囲に基づいて予測可能であり、本発明の範 囲内に包含される。本発明の範囲を逸脱することなく多くの実施態様が可能であ るが、本文中に記載または添付図面に図示したすべての事項は例示的に解釈され るべきであって制限的に解釈されてはならないことを理解されたい。 下記の文献は明細書中に引用されたものである： 【配列表】 配列番号（SEQ ID NO）：１ 配列の長さ：3901 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic cDNA 配列 配列番号（SEQ ID NO）：２ 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号（SEQ ID NO）：３ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号（SEQ ID NO）：４ 配列の長さ：197 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号（SEQ ID NO）：５ 配列の長さ：36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 チユーマー，ニルガン・エレケン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08550、プリンストン・ジヤンクシヨン、 ツー・サラ・ドライブ（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモーター領 域と、 （ｂ）前記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （ｃ）前記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列の ３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞中 で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子。 ２．前記プロモーター領域が、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター領域、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーター領域及び増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域から成るグループか ら選択されることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ３．前記プロモーター領域がＦＭＶ３５Ｓプロモーター領域であることを特徴と する請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ４．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド３８〜３，９０１から成ること を特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ５．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド２，２７５〜３，２２２から成 ることを特徴とする請求項１に記載 のＤＮＡ分子。 ６．前記３’非翻訳領域が、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子の３’非翻訳 領域、大豆７Ｓ貯蔵タンパク質遺伝子、及びエンドウ豆のリブロース１，５-ビ スホスフェートカルボキシラーゼ-オキシゲナーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）Ｅ９ 遺伝子の小サブユニットから成るグループから選択されることを特徴とする請求 項１に記載のＤＮＡ分子。 ７．前記３’非翻訳領域が、エンドウ豆のリブロース１，５-ビスホスフェート カルボキシラーゼ-オキシゲナーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）Ｅ ９遺伝子から得られることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ分子。 ８．（ａ）（ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモー ター領域と、 （ii）前記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （iii）前記プロモーター領域と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮ Ａ配列の３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植 物細胞中で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子によって植物細胞を形質 転換し、 （ｂ）分化植物を与えるように前記植物細胞を再生し、 （ｃ）前記ジャガイモ葉巻病ウイルスによる感染に対して植物を耐性にすべく十 分なレベルでジャガイモ葉巻病ウイルスレプリカーゼ遺伝子を発現する形質転換 植物を選択する段階を含む感受性ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）植物中のジャ ガイモ葉巻病ウイルス感染に耐性を与える方法。 ９．前記植物が、ジャガイモ、トマト及びタバコから成るグループから選択され ることを特徴とする請求項８に記載の方法。 １０．前記ジャガイモが、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｓｈｅｐｏｄｙ、Ａ ｔｌａｎｔｉｃ、Ｎｏｒｃｈｉｐ及びＳｕｐｅｒｉｏｒから成るグループから選 択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。 １１．前記ジャガイモがＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋであることを特徴とする 請求項１０に記載の方法。 １２．前記プロモーターが、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター領域、ＣａＭＶ３５Ｓプ ロモーター領域及び増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域から成るグループから 選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。 １３．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド３８〜 ３，９０１から成ることを特徴とする請求項８に記載の方法。 １４．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド２，２７５〜３，２２２から 成ることを特徴とする請求項８に記載の方法。 １５．前記３’非翻訳領域が、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子の３’非翻 訳領域、大豆７Ｓ貯蔵タンパク質遺伝子、及びエンドウ豆のリブロース１，５- ビスホスフェートカルボキシラーゼ-オキシゲナーゼの小サブユニット（ｓｓＲ ＵＢＩＳＣＯ）Ｅ９遺伝子から成るグループから選択されることを特徴とする請 求項８に記載の方法。 １６．（ａ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモーター 領域と、 （ｂ）前記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （ｃ）前記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列の ３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞中 で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子をゲノムに含むウイルス耐性の形 質転換ナス科植物。 １７．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド３８〜２，９０１から成るこ とを特徴とする請求項１６に記載のウイルス耐性の形質転換ナス科植物。 １８．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド２，２７５〜３，２２２から 成ることを特徴とする請求項１７に記載のウイルス耐性の形質転換ナス科植物。 １９．前記植物が、ジャガイモ、トマト及びタバコから成るグループから選択さ れることを特徴とする請求項１６に記載のウイルス耐性の形質転換ナス科植物。 ２０．前記植物がジャガイモであることを特徴とする請求項１９に記載のウイル ス耐性の形質転換ナス科植物。 ２１．前記ジャガイモが、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｓｈｅｐｏｄｙ、Ａ ｔｌａｎｔｉｃ、Ｎｏｒｃｈｉｐ及びＳｕｐｅｒｉｏｒから成るグループから選 択されることを特徴とする請求項２０に記載のウイルス耐性の形質転換ナス科植 物。 ２２．（ａ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起すべく機能するプロモーター 領域と、 （ｂ）前記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （ｃ）前記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列の ３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞中 で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子をゲノムに含むウイルス耐性の形 質転換ナス科植物細胞。 ２３．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド３８〜２，９０１から成るこ とを特徴とする請求項２２に記載のウイルス耐性の形質転換ナス科植物細胞。 ２４．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド２，２７５〜３，２２２から 成ることを特徴とする請求項２２に記載のウイルス耐性の形質転換ナス科植物細 胞。 ２５．（ａ）（ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列の産生を惹起べく機能するプロモー ター領域と、 （ii）前記プロモーター領域と作動可能に結合し、ジャガイモ葉巻病ウイルスレ プリカーゼをコードする構造遺伝子と、 （iii）前記構造遺伝子と作動可能に結合し、転写の終了及び転写ｍＲＮＡ配列 の３’端へのポリアデニル化リボヌクレオチドの付加を惹起するように植物細胞 中で機能する３’非翻訳領域とを含むＤＮＡ分子によって植物細胞を形質転換し 、 （ｂ）分化植物を与えるように前記植物細胞を再生し、 （ｃ）前記ジャガイモ葉巻病ウイルスによる感染に対して植物を耐性にすべく十 分なレベルでジャガイモ葉巻病ウイルスレプリカーゼ遺伝子を発現する形質転換 植物を選択する段階を含む感受性ナス科植物中のジャガイモ葉巻病ウイルス感染 に由来する網状壊死の抑制方法。 ２６．前記植物が、ジャガイモ、トマト及びタバコから成るグループから選択さ れることを特徴とする請求項２５に記載の方法。 ２７．前記ジヤガイモが、Ｒｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋ、Ｓｈｅｐｏｄｙ、Ａ ｔｌａｎｔｉｃ、Ｎｏｒｃｈｉｐ及びＳｕｐｅｒｉｏｒから成るグループから選 択されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ２８．前記ジャガイモがＲｕｓｓｅｔ Ｂｕｒｂａｎｋであることを特徴とする 請求項２６に記載の方法。 ２９．前記プロモーターが、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター領域、ＣａＭＶ３５Ｓプ ロモーター領域及び増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター領域から成るグループから 選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。 ３０．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド３８〜 ３，９０１から成ることを特徴とする請求項２５に記載の方法。 ３１．前記構造遺伝子が配列番号１のヌクレオチド２，２７５〜３，２２２から 成ることを特徴とする請求項２５に記載の方法。 ３２．前記３’非翻訳領域が、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子の３’非翻 訳領域、大豆７Ｓ貯蔵タンパク質遺伝子、及びエンドウ豆のリブロース１，５- ビスホスフェートカルボキシラーゼ-オキシゲナーゼの小サブユニット（ｓｓＲ ＵＢＩＳＣＯ）Ｅ９遺伝子から成るグループから選択されることを特徴とする請 求項２５に記載の方法。