KR20100051697A

KR20100051697A - 신규 폴리갈락투로나아제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100051697A
Application number: KR1020107004555A
Authority: KR
Inventors: 아드리안 빌렘 반 허스든; 베노와 고르게
Original assignee: 웨스턴 씨드 인터내셔널 비.브이.
Priority date: 2007-07-26
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2010-05-17
Also published as: MA31631B1; JP5719983B2; BRPI0814099A2; EP2173867B1; IL203537A0; JP2010534471A; US20100199374A1; AU2008279868B2; CA2694402A1; AU2008279868A1; WO2009014430A1; MX2010000951A; CN101809149A; EP2173867A1

Abstract

본 발명은 신규 솔라눔 폴리갈락투로나아제의 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 상기 뉴클레오티드 서열은 비-열개 꽃밥에 기인한 위치성 불임 표현형을 갖는 식물 제조를 위한 마커 보조된 재배, TILLING 또는 유전자 변형 식물에 사용될 수 있다.

Description

신규 폴리갈락투로나아제 및 이의 용도{Novel polygalacturonase and their uses}

본 발명은 식물의 재배, 특히 토마토 식물의 재배에 관한 것이다. 본 발명은 고전 및 분자 식물 유전학의 영역까지 확장되며 신규 폴리갈락투로나아제 및 마커 보조된 재배 또는 유전자 변형 식물, 예를 들어 꽃밥의 비-열개(non-dehiscent)에 기인하는 위치성 불임(positional sterile) 표현형을 갖는 식물의 생산에서의 이의 용도에 관한 것이다.

고등 식물에서 성숙한 꽃가루는 열개(dehiscent)에 의해 꽃밥으로부터 방출되며, 이는 포자낭막(tapetum), 격막(septum) 및 궁극적으로 구변세포(stomium)에서 성공적으로 발생하는 세포 파괴의 성공으로 이루어진다. 포자낭막의 퇴보(degeneration) 후, 내피 세포가 확장하고 리그닌화된 섬유성 밴드가 축적되어 세포벽을 두껍게 한다. 후속적으로, 내피 및 포실(loculus) 주변 연결(connective) 세포의 탈수 및 수축은 구변세포 내 파괴 힘을 만들어내고 결국 꽃가루의 방출을 유도한다(Keijzer 1987).

최근 꽃밥 열개의 분자 조절의 이해에 대한 발전이 이루어졌으며, 이는 주로 자스몬산(jasmonic acid)(JA) 및 에틸렌의 영향의 발견과 관련되어 있다. 꽃밥 내 JA의 합성의 다양한 단계에 영향을 미치는 몇몇 돌연변이가 애기장대(Arabidopsis)에서 확인되었다. 상기 관찰된 표현형은 꽃밥 열개 지연의 결과를 가져왔다(Scott 등에 의해 리뷰됨, 2004). 이러한 현상에서 에틸렌 신호전달의 역할이 Rieu 등(2003)에 의해 강조되었으며, 그는 에틸렌에 무감각한(insensitive) 담배 식물 꽃밥 열개에서의 지연을 관찰하였다.

폴리갈락투로나아제(PGs)는 가수분해 효소의 큰 패밀리에 속한다(Torki 등, 2000; Markovic 및 Janecek, 2001). PGs 역할은 광범위한 식물 발달 프로그램과 관련된 것으로 나타났으며(Hadfield 및 Bennett에 의해 리뷰됨 1998), 그 중에서도 꽃밥 열개와 관련이 있는 것으로 나타났다: PGs의 역할은 옥수수, 담배, 유채(oilseed rape) 및 애기장대의 열개 영역에서 관찰되어 왔다(Dubald 등 1993; Sander 등 2001). 그러나 열개 과정에서 이들의 역할은 상세하게 연구된 바 없다.

[선행기술문헌]

[비특허문헌]

참고문헌

본 발명자들은 최근 토마토에서 비-열개 꽃밥을 수여하는 위치성 불임(positional sterility-2) 유전자를 상세하게 매핑하였다(Gorguet 등 2006). 본 발명은 상기 ps-2 유전자에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열뿐만 아니라 이러한 서열이 마커 보조된 재배 또는 유전자 변형(transgenic) 식물에서 사용되는 방법, 예를 들어 비-열개 꽃밥에 기인한 위치성 불임 표현형을 갖는 식물을 생산하고 그리고/또는 열매 숙성을 변경시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.

정의

상세한 설명에서 다르게 지시된 바 없으면 본 명세서에서 사용된 용어 및 정의는 유전학(Mendelian)에서 사용되는 것이며, M.W. Strickberger, Genetics, 2판(1976), 특히 113-122 및 164-177 페이지를 참고할 수 있다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, "유전자(gene)"는 일반적으로 생물체(즉, 토마토 식물)의 생물학적 특성을 결정하는 유전 인자를 의미하며, "대립 유전자(allele)"는 토마토 식물(2배체(diploid)) 내 유전자 쌍 내의 개별적인 유전자를 의미한다. 이러한 문맥에서 본 명세서에 사용된 용어 ps-2-유전자 또는 -대립 유전자는 DPG(Dehiscene Polygalacturonase)의 대립 유전자를 나타내며, 이는 본 발명의 위치성 불임 표현형을 생산하거나 또는 이에 기여할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 ps-2-유전자 또는 -대립 유전자는 따라서 위치성 불임 및/또는 비-열개 꽃밥의 본 발명의 표현형을 생산하거나 또는 기여할 수 있는 어떠한 (DPG-)기능성 대립 유전자의 상실을 나타낸다. DPG 유전자의 바람직한 예는 본 명세서에 기술된 TDPG(Tomato Dehiscene Polygalacturonase) 유전자이다. ps-2-유전자 또는 -대립 유전자의 바람직한 예는 특히 TDPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C를 갖는 본 명세서에서 기술된 토마토 ps-2-유전자이다.

폴리갈락투로나아제(EC 3.2.1.15)는 본 명세서에서 펙테이트(pectate) 및 다른 갈락튜로난(galacturonan) 내 1,4-알파-D-갈락토시듀로닉 결합(linkage)의 랜덤 가수분해를 촉매하는 효소로서 이해된다. 폴리갈락투로나아제는 또한 펙틴 디폴리머라제(depolymerases) 또는 펙티나제(pectinases)로서도 언급된다. 폴리갈락투로나아제의 활성은 이전에 기술된 환원(reducing) 당(sugar) 방출의 색도(colorimetric) 검출 방법에 의해 양적으로 결정되며(Parenicova 등, 1998, Eur. J. Biochem. 251:72-80) 여기서 폴리갈락투로나아제 활성의 1 단위는 30 ℃에서 50mM 소듐 아세테이트 완충제 내, pH 4.2의 0.25%(w/v) 기질 농도에서 모델 기질과 같이 폴리갈락투론산(Sigma)으로부터 1분당 1μmole의 환원 당 말단을 방출할 수 있는 효소의 양으로 정의된다.

식물이 상기 유전자의 동일한 대립유전자를 포함하는 경우 유전자에 대해 "동형접합체(homozygous)"로 불리며, 상기 유전자의 두 개의 상이한 대립유전자를 포함하는 경우 "이형접합체(heterozygous)"라고 불린다. 대문자의 사용은 우성(a형) 유전자를 나타내고 소문자는 열성 유전자를 나타낸다: "X,X"는 따라서 유전자 또는 특징 X에 대한 동형접합체 우성 유전자형을 나타낸다: "X,x" 및 "x,X"는 이형접합체 유전자형을 나타낸다: 그리고 "x,x"는 동형접합체 열성 유전자형을 나타낸다. 통상적으로 알려진 바와 같이, 동형접합체인 열성 유전자형만이 일반적으로 이에 상응하는 열성 표현형을 제공하며(즉, 특성 또는 특징 "x"를 나타내는 식물을 유도) 반면 이형접합체 및 동형접합체 우성 유전자형은 복수 대립유전자, 서프레서(suppressors), 공동우성(codominance) 등과 같은 다른 유전자 및/또는 인자가 또한 표현형의 결정에 역할을 하지 않는 한, 일반적으로 상응하는 우성 표현형을 제공한다(즉 특성 또는 특징 "X"를 나타내는 식물을 유도).

일반적인 규칙으로, 잡종(hybrid) 종자는 두 개의 상이한 부모 토마토 식물의 교배(crossing)에 의해 획득되며, 이는 가장 빈번하게 상이한 계통(line)에 속한다. 알려진 재배 기술 및 식물 번식 기술 그 자체로 이러한 잡종이 고도로 특이적으로 바라는 특성으로 제공될 수 있으며, 이는 상기 잡종을 "디자인"하는 것을 가능하게 하고, 즉 상기 잡종 식물에 미리 정해진 유전적 특성을 수여한다. 이는 일반적으로 교배되어 잡종 종자를 제공하는 두 개의 부모 계통(특성)의 적절한 선택에 의해 획득된다. 이들은 일반적으로 자식계통(inbred line)이며, 몇몇 대에 걸친 자가-수정(자가-수분)에 의해 획득되고, 이러한 자식계통은 일반적으로 경작자에 의해 다시 특이적으로 "디자인"되어 다른-일반적으로 미리 결정된-자식 부모 계통과 교배(crossed)되는 경우 그 디자인된 특성을 갖는 잡종 후손을 제공한다. 일반적으로, 이러한 부모 계통은 유전적으로 동형접합체이고 동일하여서(즉 근친교배의 결과로서) 이들은 안정하고 신뢰할 수 있는 방식으로, 유전적으로 균일한-비록 이형접합체일지라도- 잡종 계통 조합을 제공할 수 있으며, 부모 계통의 특성을 조합할 수 있다. 이를 수행함에 있어서, 그 목적은 한편으로는 부모 계통으로부터 특정한 특징을 가능한 순수하게 씨로 건네주는 반면, 다른 한편의 용도로는 그 중에서도 식물 및 열매의 성장과 관련된 향상된 특성 및 그에 따른 산물을 제공할 수 있는 잡종강세(heterosis) 또는 근친교배(inbred) 성장의 알려진 효과를 제조하는 것이다. 이러한 잡종강세 효과는 사용된 부모 계통이 특정한 유전적 특성에 대해 관련되어 있지 않는 경우/그 때문에 획득된다(즉, 부모 계통이 유전적으로 "멀리 떨어진 경우(lie far apart)"). 전통적인 재배 기술을 사용한 일반적인 식물, 특히 토마토 육종(breeding) 기술에 대한 나아간 설명을 위해, 잡종의 형성을 포함하며, 잘 알려진 교본을 참고할 수 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 "식물"은 전체 식물 또는 식물 세포, 식물프로토플라스트(plant protoplast), 토마토 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 조직의 배양 조직, 식물 캘리(calli), 식물 무리(clump), 및 식물 내에 온전한(intact) 식물 세포, 또는 배아, 화분, 밑씨, 열매(예를 들어 수확된 토마토), 꽃, 잎, 종자, 뿌리, 근단 등과 같이 식물의 부분과 같은 이들의 어떠한 부분 혹은 파생물을 포함한다.

식물학적 용어: 린네는 식물학 분류의 아버지로 생각된다. 최초에 근대의 토마토가 솔라눔(Solanum)으로서 분류되었지만, 이의 과학적인 이름은 수년동안 리코퍼시컴 에스쿨렌텀(Lycopersicon esculentum)이었다. 유사하게, 근대 토마토의 야생 품종(relatives)은 리코퍼시컴(Lycopersicon) 속 내에 리코퍼시컴 페넬리(L.pennellii), 리코퍼시컴 히르스툼(L. hirsutum), 리코퍼시컴 페루비아눔(L. peruvianum), 리코퍼시컴 칠렌스(L. chilense), 리코퍼시컴 파르비플로룸(L. parviflorum), 리코퍼시컴 크미엘레브스키(L.chmielewskii), 리코퍼시컴 치즈마니(L. cheesmanii), 리코퍼시컴 세라시포르메(L. cerasiforme), 및 리코퍼시컴 핌피넬리폴리움(L. pimpinellifolium)과 같이 분류되어 왔다. 지난 수년 간, 토마토 연구자 및 식물학자들 사이에 이들 종의 명칭을 재분류할지 여부에 대해 논쟁이 있어 왔다. 근대 토마토에 대해 새롭게 제안된 과학적 이름은 솔라눔 리코퍼시컴(Solanum Lycopersicon)이다. 유사하게, 야생종의 명칭이 바뀔 수 있다. 리코퍼시컴 페넬리(L.pennellii)는 솔라눔 페넬리(Solanum pennellii)가 될 수 있고, 리코퍼시컴 히르스툼(L. hirsutum)은 솔라눔 해브로체티스(S. habrochaites)가 될 수 있고, 리코퍼시컴 페루비아눔(L. peruvianum)은 솔라눔 페루비아눔(S. 'N peruvianumr') 및 솔라눔 칼레종 데 후아일레스(S, 'Callejon de Huayles')로 나누어질 수 있으며, 솔라눔 페루비아눔(S. peruvianum), 및 솔라눔 코르넬리오뮤엘러리(S. corneliomuelleri), 리코퍼시컴 파르비플로룸(L. parviflorum)은 솔라눔 네오리키(S. neorickii)가 될 수 있으며, 리코퍼시컴 크미엘레브스키(L.chmielewskii)는 솔라눔 크미엘레브스키(S. chmielewskii)가 될 수 있고, 리코퍼시컴 칠렌스(L. chilense)는 솔라눔 칠렌스(S. chilense)가 될 수 있으며, 리코퍼시컴 치즈마니(L. cheesmaniae)는 솔라눔 치즈마니(S. cheesmaniae) 또는 솔라 눔 갈라파젠스(S. galapagense)가 될 수 있고, 그리고 리코퍼시컴 핌피넬리폴리움(L. pimpinellifolium)은 솔라눔 핌피넬리폴리움(S. pimpinellifolium)이 될 수 있다(Solanacea Genome Network(2005) Spooner and Knapp; http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanum_nomenclature.html).

ps-2 또는 DPG 유전자 및 대립유전자(allele)을 포함하는 핵산 서열 또는 단편은 또한 서열번호(SEQ ID NO):1과 온화한(moderate), 또는 바람직하게는 엄격한(stringent) 결합 조건 하에서 "결합(hybridise)" 능력에 의해 정의될 수 있다. 엄격한 결합 조건은 본 명세서에서 적어도 약 25, 바람직하게는 약 50 핵산, 75 또는 100 그리고 가장 바람직하게는 약 200 이상의 핵산이, 약 1M 염, 바람직하게는 6 x SSC 또는 이에 필적할만한 이온 강도를 갖는 어떠한 다른 용액을 포함하는 용액 내에서 약 65℃의 온도, 및 약 0.1M 이하의 염, 바람직하게는 0.2 x SSC 또는 이에 필적할만한 이온 강도를 갖는 어떠한 다른 용액을 포함하는 65℃의 용액에서의 세척에서 결합할 수 있는 조건으로 정의된다. 바람직하게, 상기 결합은 하룻밤 동안, 즉 적어도 10 시간 동안 수행되며, 그리고 바람직하게는 세척은 적어도 한 시간 동안 적어도 두 번의 세척액 변경과 함께 수행한다. 이러한 조건은 통상적으로 약 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 특정한 서열의 결합을 가능하게 한다. 본 명세서에서 온화한 조건은 적어도 50 뉴클레오티드의 핵산 서열, 바람직하게는 약 200 이상의 뉴클레오티드가 약 1M 염, 바람직하게는 6 x SSC 또는 이에 필적하는 이온 강도를 갖는 어떠한 용액을 포함하는 용액 내 약 34℃의 온도, 및 약 1M 염, 바람직하게는 6 x SSC 또는 이에 필적하는 이온 강도를 갖는 어떠한 다른 용액을 포함하는 용액 내 실온에서의 세척에서 결합할 수 있는 조건으로 정의된다. 바람직하게, 상기 결합(hybridisation)은 하룻밤, 즉 적어도 10 시간 동안 수행되고 바람직하게 상기 세척은 세척 용액의 적어도 두 번의 교환과 함께 적어도 한 시간 동안 수행한다. 이러한 조건은 일반적으로 50% 까지의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 결합을 가능하게 한다. 당해 기술 분야의 숙련자는 이러한 결합 조건을 변경하여 동일성이 50% 내지 90%로 변화하는 서열을 특이적으로 확인할 수 있다.

본 발명은 신규 솔라눔 폴리갈락투로나아제의 뉴클레오티드 서열에 관한 것으로, 상기 뉴클레오티드 서열은 비-열개 꽃밥에 기인한 위치성 불임 표현형을 갖는 식물 제조를 위한 마커 보조된 재배, TILLING 또는 유전자 변형 식물에 사용될 수 있다.

도 1: ps-2ABL 및 야생형(Moneymaker) 꽃밥의 현미경 관찰.
a: 톨루이딘 블루로 염색된 늦은 꽃눈(FB), 이른 전-개화(PA)에서 꽃밥의 단면. 화살표는 WT 및ps-2ABL의 중격(septum) 세포에서 나타날 수 있는 결정을 나타낸다. s: 중격(septum); st:구변세포(stomium); p: 꽃가루(pollen)
b: 톨루이딘 블루로 염색된 개화에서 꽃밥의 단면. 화살표는 WT에서 꽃밥의 개방 및 ps-2ABL에서 닫혀있는 구변세포를 나타낸다.
c: SEM에 의해 관찰된 개화에서의 꽃밥 콘(anther cone)세로 단면. 화살표는 WT 내 꽃밥인 경우의 세로 개방 및 ps-2ABL에서 개방되지 않은 꽃밥을 나타낸다.
도 2: 후보 유전자에 대한 유전적 지도로부터 ps-2 유전자의 클로닝
a: 재조합 F2 집단 내에서 유전적 지도가 전개되었다(ps-2 ABL x S.pimpinellifolium; Gorguet 등, 2006). 흰색으로 나타낸 것은 각각의 마커 사이의 재조합 식물의 수이다.
b: 물리적 지도: 점선의 화살표는 BACs의 계산적 앵커링(anchoring)을 나타낸다. 실선의 화살표는 분자 마커에 의한 BACs의 앵커링(anchoring)을 나타낸다(S: SP6; T:T7).
c: BAC 클론 143M15 상 ORFs의 유전적 위치.
d: 후보 유전자 ORF4의 구조. 로마 숫자와 함께 색이 부여된 실린더는 엑손을 나타낸다. 추정 TATA 박스(box) 및 폴리A의 위치가 서열의 시작에서 도치된 푸른색 삼각형으로, 그리고 서열의 끝에서 초록색 마름모에 의해 지시된다.
도 3: ps-2ABL 및 품종 머니메이커(cv. Moneynaker)로부터의 후-개화에서의 꽃밥 콘의 RNA 상에서 수행됨 RT-PCR.
도 4: 머니메이커(WT) 및 꽃밥의 ps-2ABL에서 ORF4의 엑손 IV 및 VI 사이의 인트론 스플라이싱.
도 5: 20 속씨 식물 및 1 겉씨식물 PG aa서열에 대한 계통발생 나무. 상기 계통발생 나무는 3296 나무의 50% 다수결의 원칙 합의의 결과이다(나무의 무게를 이용). 상기 PG 서열은 분기군 A 및 B로서 정의되는 두 개의 주된 계통분기로 구분된다.
도 6: TFPG, ORF4 및 ps-2(ORF4의 돌연변이)의 Pfam GH28 도메인의 정렬. 색 코드는 TFPG 및 ORF4 사이의 비교에 대해서만 효과적이다: 반전(reverse) 색인 것은 동일한 아미노산이다. 회색인 것은 보존된 치환(conserved substitutions)이다. 굵게 밑줄쳐진 것은 Rao 등(1997)에 의해 정의된 바와 같은 폴리갈락투로나아제의 네 개의 보존된 도메인이다.
도 7: ORF4의 조직 특이적인 발현. 다양한 조직으로부터의 머니메이커의 cDNA를 양적인 PCR 분석에 공헌하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 머니메이커의 게노믹 DNA를 오염에 대한 대조구로써 사용하였다. 1: 잎 이탈 영역; 2: 꽃 이탈 영역; 3: 개화에서의 꽃밥; 4: 성숙 단계에서의 열매.
도 8: TDPG가 일부를 차지하는 토마토 내 꽃밥 열개 및 열매 성숙의 호르몬적인 조절의 단순화된 모델.

본 발명자들은 토마토에서 비-열개(non-dehiscent) 꽃밥을 수여하는 위치성 불임(Positional sterility)-2 유전자을 매핑하였다(Gorguet 등 2006). 본 발명자들은 위치 클로닝(positional cloning)에 의해 ps-2 유전자를 분리하였다. 후속적인 정의는 야생형 유전자가 신규한 폴리갈락투로나아제(PG)를 코딩하고 유전자의 코딩 서열 내 단일의 돌연변이가 비-열개 꽃밥에 의한 위치상 불임의 이러한 표현형에 책임이 있은 것을 나타낸다. 본 발명자들은 이러한 돌연변이는 유전자의 인트론 스플라이싱(intron splicing) 인식 지점(site)의 하나에 영향을 미쳐서, 엑손의 하나가 결여된 비정상 mRNA를 발생시키는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 나아가 이하에서 DPG(Dehiscence PG)로서 지시되는 이러한 신규 PG 유전자가 또한 열매의 성숙에서 발현되는 것을 발견하였다. 쟈스몬산 및 에틸렌은 DPG의 발현 조절에서 역할을 하고 DPG는 열매 숙성에 관련된다.

따라서, 일 견지로, 본 발명은 헥산 분자, 바람직하게는 폴리갈락투로나아제 활서을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 결정될 수 있는 폴리갈락투로나아제 활성 및 이러한 활성은 상기에서 정의된다. 폴리갈락투로나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: (a) SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열과 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 또는 100% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 55, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 또는 100% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 결합하는 상보적인 가닥의 뉴클레오티드 서열; (d) 유전적 코드의 축퇴(degeneracy)에 의해 뉴클레오티드 서열(c)의 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열.

본 발명의 바람직한 뉴클레오티드 서열은 솔라눔(Solanum) 속 내의 종으로부터 획득된 것이다. 보다 바람직하게, 상기 뉴클레오티드 서열은 솔라눔 리코퍼시컴(S. Lycopericum), 솔라눔 크미엘레브스키(S.chmielewskii), 솔라눔 해브로체티스(S. habrochaites), 솔라눔 핌피넬리폴리움(S. pimpinellifolium), 솔라눔 네오리키(S. neorickii), 및 솔라눔 페넬리(Solanum pennellii)를 포함하는 솔리눔 리코퍼시컴(Solanum Lycopericum) 집합체(complex) 내의 종으로부터 획득된 것이다. 택일적으로, 상기 뉴클레오티드 서열은 솔라눔 멜론지나(Solanum melongena)로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 뉴클레오티드 서열이 폴리갈락투로아나제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하지만 본 발명에는 특히 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및 삭제를 적어도 하나 포함하는, 유전자 조작 및 돌연변이 유발된 상기 뉴클레오티드 서열의 버젼을 포함하며, 이로부터 활성이 없는 폴리갈락투로나아제가 발현될 수 있는 대립 유전자가 포함된다.

본 발명의 나아간 바람직한 핵산 분자는 폴리갈락투로나아제 활성 또는 이의 불활성 대립 유전자를 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부를 포함하는 분자이다. 상기 핵산 분자는 바람직하게는 폴리갈락투로나아제 활성을 갖는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 불활성 대립 유전자로부터, 또는 보다 바람직하게 SEQ ID NO:1로부터 적어도 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40 또는 50 인접(contiguous) 뉴클레오티드를 포함한다. 상기 핵산 분자는 직접 함께 연결되거나 또는 다른 서열에 의해 분리될 수 있는 이러한 인접 뉴클레오티드의 하나 이상의 구간을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.

두번째 견지로 본 발명은 식물 내, 바람직하게는 솔라눔(Solanum) 속의 식물, 더욱 바람직하게는 솔라눔 리코퍼시컴(Solanum Lycopericum) 집합체(complex)의 식물 또는 솔라눔 멜론지나(Solanum melongena)의 식물 내에서 DPG 대립 유전자를 검출, 분리, 증폭 및/또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게는 식물의 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계 및 식물의 상기 핵산을, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있는, 폴리갈락투로나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 10 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 결합하는 단계(hybridising)의 적어도 한 단계를 포함한다:

(a) SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열과 적어도 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 또는 100% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열; (b) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 55, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 또는 100% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 결합하는 상보적인 가닥의 뉴클레오티드 서열; 및 (d) 유전적 코드의 축퇴(degeneracy)에 의해 뉴클레오티드 서열(c)의 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열. 적어도 10 인접 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 또한, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 삽입 및 삭제를 적어도 하나 포함하는, 유전자 조작 및 돌연변이 유발된 상기 뉴클레오티드 서열의 버젼을 포함하며, 이로부터 활성이 없는 폴리갈락투로나아제가 발현될 수 있는 대립 유전자를 포함하는, (a)-(d)에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 대립 유전자로부터 획득될 수 있는 것으로 이해된다. 보다 바람직하게 식물의 샘플링된 핵산과 결합을 위한 핵산 분자는 상기 정의된 뉴클레오티드 서열로부터 인접한 적어도 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40 또는 50 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 결합을 위한 핵산 분자가 딘일 가닥 분자인 경우에 이는 또한 상기 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열의 상보 가닥, 즉 반대 가닥을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.

식물, 바람직하게는 솔라눔(Solamun) 속의 식물에서 DPG 대립 유전자와 같은 특정한 핵산 서열의 검출, 분리, 증폭 및/또는 분석을 하기 위한 방법은 미리 정해진 서열, 즉 검출, 분리, 증폭 및/또는 분석될 샘플에 있는 핵산에 대한 결합을 위한 핵산 분자를 포함하는 핵산 분자의 서열 특이적 결합에 의존한다. 이러한 방법에서 결합을 위한 상기 핵산 분자는 따라서 DPG 대립 유전자, 바람직하게는 솔라눔(Solamun) DPG 대립 유전자에 결합할 수 있는 어떠한 핵산 분자일 수 있다. 상기 분자는 프로브(probe), 예를 들어 결합(hybridisation) 프로브이거나 또는 연장 혹은 증폭 반응에서 폴리머라아제에 의해 연장될 프라이머일 수 있다.

일반적으로 미리 결정된 서열을 포함하는 핵산의 서열 특이적 결합에 의존하는 특정한 뉴클레오티드 서열의 검출, 분리, 증폭 및/또는 분석 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Sambrooj and Russel, 2110, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3판, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York 참고). 보다 상세하게, 본 발명의 특정한 DPG 대립 유전자 서열의 검출, 분리, 증폭 및/또는 분석 방법은 PCR 증폭(미국 특허 번호 4,683,195; 및 4,683,202; PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992), 대립 유전자-특이적 PCR(Gibbs, 1989, Nucleic Acid Res. 17:12427-2448), ASO(Allele Specific Oligonucleotide Screening Methods: Salki 등, 1986, Nature 324: 163-166), OLA(Oligonucleotide Ligation Assays; 1988, Landegren 등, Science 241:107-1080) 또는 라이게이션 증폭 반응(Wu 등, 1989, Genomics 4:560-569; Barany, 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. 88:189-193)과 같은 리가아제-매개된 대립 유전자 검출 방법, DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)(Erlich, 제7장, ed., 1992, PCR Technology, Principles anad Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman and Co., New York ), TGGE(Temperature Gradient Gel Electrophoresis), SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis)(Orita 등, 1989, PRoc. NAt. Acad. Sci. 85: 2766-2770), 부조합된(mismatched) 염기쌍의 차별적 화학적 절단(Grompe 등, 1991, Am. J Hum. Genet. 48:212-222), 부조합된 염기쌍의 효소적 절단(cleavage)(Nelson 등, 1993, Nature Genetics 4:11-18), TaqMAn^TM 과 같은 시스템(Perkin Elmer), 형광물질의 촉매적 방출에 의존하는(Third Wave Technology at www.twt.com) 등온 증폭을 포함하는 인베이더 어세이(Invader Assay), 수천 개체 내 주어진 유전자좌(locus)에 대한 서열 정보를 생산하는 대량 병행 시퀀싱(massive parallel sequencing)(예를 들어 Roche/454 Life Science performed on a GS 20 Genome Sequencer)을 포함할 수 있으며, 임의로 3D 풀링(pooling) 계획(Keypoint^TM technology at www.keygene.com 참고) 등과 조합될 수 있다.

바람직한 본 발명의 방법은 ps-2-대립 유전자의 검출, 분리, 증폭 및/또는 분석을 위한 방법이며, 바람직하게 상기 ps-2-대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C, A 또는 T를 갖는 대립 유전자이며, 바람직하게 상기 대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C를 갖는다. 상기 위치는 SEQ ID NO:1의 위치 3772에서의 G에 대응한다. 택일적으로, DPG 대립 유전자에 특이적인 분자 마커가 개발될 수 있다. "분자 마커(molecular marker)"는 본 명세서에서 특정한 대립 유전자, 예를 들어 본 명세서에서 정의된 바와 같은 DPG 대립 유전자 또는 ps-2-대립 유전자의 존재 또는 부존재를 (직접 또는 간접적으로)지시하는 핵산 서열 또는 이들의 세트를 나타내는 것으로 이해된다. 분자 마커의 존재 또는 부존재는 예를 들어 RFLPs(Restriction Fragment Length Polymorphisms), RAPDs(Randomly Amplified Polymorphic DNAs), AP-PCR(Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction), DAF(DNA Amplification Fingerprinting), SCARs(Sequence Characterized Amplified Regions), 및 AFLPs(Amplified Fragment Length Polymorphisms)를 포함하는 다양한 분자 분석 또는 실험에서 확인될 수 있다. DPG 대립 유전자에 특이적인 분자 마커는 본 명세서에서 식물, 바람직하게는 상기에서 정의된 바와 같은 폴리갈락투로나아제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로부터 100, 50, 20, 10, 5 또는 2kb를 초과하지 않는 솔라눔(Solanum) 식물의 게놈(genome) 내에 존재하는 마커로서 이해된다.

본 발명의 세번째 견지는 상기 본 명세서에서 정의된 마커-보조된 재배에서의 결합을 위한 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 마커-보조된 재배는 ps-2-대립 유전자의 탐지를 포함한다. ps-2-대립 유전자는 본 명세서에서, 동형접합체가 비-열개 꽃밥에 기인하는 위치성 불임 표현형을 생산하는 식물, 바람직하게는 솔라눔(Solanum) 속의 식물, 더욱 바람직하게는 솔라눔 리코퍼시컴(Solanum Lycopersicum) 집합체(complex) 내 또는 솔라눔 메론지나(Solanum melongena) 식물 내의 DPG 대립 유전자로서 이해된다. ps-2-대립 유전자는 일반적으로 위치상 불임 및 비-열개 꽃밥을 억제하기에 불충분한 DPG 활성이 발현되는 대립 유전자에 대해 동형접합체인 식물로부터의 대립 유전자이다. 보다 바람직하게, 상기 마커-보조된 재배는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C, A 또는 T를 갖는 ps-2-대립 유전자의 검출을 포함하며, DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C를 갖는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 네번째 견지는 비-열개 꽃밥을 갖는 식물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 상기 식물은 솔라눔(Solanum) 속의 식물, 더욱 바람직하게는 솔라눔 리코퍼시컴(Solanum Lycopersicum) 집합체(complex), 또는 솔라눔 메론지나(Solanum melongena) 식물이다. 상기 식물은 바람직하게 위치성 불임의 표현형을 갖는다. 상기 방법은 바람직하게는 하기의 단계를 포함한다: (a) 제1식물을 ps-2-대립 유전자에 대해 동형접합체인 제2식물과 교배하는(crossing) 단계; (b) 상기 F1 세대 및 적어도 한(바람직하게는 적어도 두) 세대 나아간 세대를 제1 식물과 반복(recurrent) 부모로서 역교배하는(backcrossing) 단계; 및 (c) (b)단계에서 획득된 가장 먼 역교배된 세대를 적어도 한번(바람직하게 적어도 두번) 자가교배하는(selfing) 단계; 여기서 ps-2-대립 유전자에 대해 동형접합체인 식물을 선택하기 위해 단계 b) 및 c)의 적어도 하나에서 분자 마커가 사용된다. 바람직하게 상기 방법에서 상기 분자 마커는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 DPG 대립 유전자에 특이적인 마커이며, 더욱 바람직하게 상기 마커는 본 명세서에서 정의된 ps-2-대립 유전자에 특이적이다. 가장 바람직하게, 상기 분자 마커는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C, A 또는 T이거나 또는 이를 검출하며, DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C인 것이 가장 바람직하다.

다섯번째 견지에서 본 발명은 DPG-대립 유전자에서 돌연변이 또는 유전적 변경(modification)을 갖는 식물의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게 상기 식물은 솔라눔(Solanum) 식물, 더욱 바람직하게는 솔라눔 리코퍼시컴(Solanum Lycopersicum) 집합체(complex)의 식물, 또는 솔라눔 메론지나(Solanum melongena) 식물이다. 상기 돌연변이 또는 유전적 변경은 DPG 코딩 뉴클레오티드 서열/유전자의 유전자좌에 TILLING(Targeted Induced Local Lesions IN Genomes)기술을 이용하여 도입될 수 있다. TILLING 방법은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다(McCallum 등, 2000 Nat Biotechnol. 18(4):455-7; Stemple에 의해 리뷰됨, 2004, Nat Rev Genet. 5(2):145-50). 상기 TILLING 돌연변이 유발(mutagenesis) 기술은 ps-2-대립 유전자을 포함하는 DPG 유전자의 돌연변이된 변종의 발생 및/또는 확인, 그리고 궁극적으로 분리에 유용하다. TILLING은 또한 이러한 돌연변이 변종을 갖는 식물을 선택할 수 있도록 한다. TILLING은 고-밀도 돌연변이 유발과 고-처리량(high-throughput) 스크리닝 방법을 조합한다. TILLING에 후속되는 전형적인 단계들은 하기와 같다: (a) 돌연변이 유발, 예를 들어 에틸메탄술포네이트(EMS) 또는 N-에틸-N-니트로소우레아(ENU); (b) 돌연변이 유발된 종자로부터 식물의 성장, 및 임의로 상기 식물을 적어도 하나의 세대에 대해 역교배하는 단계; (c) 식물의 조직 샘플로부터 DNA를 제조하는 단계, 및 임의로 개체로부터 DNA를 모으는 단계(pooling); (d) 예를 들어 상기에서 정의된 바와 같은 프라이머를 이용하여 관심있는 영역, 즉 DPG 유전자의 PCR 증폭; (e) 돌연변이 PCR 생성물의 검출 (f) 돌연변이 개체의 확인(identification) 및 (f) 임의로 상기 돌연변이 PCR을 시퀀싱하는(sequencing) 단계. (e) 및 임의로 (f) 단계에서 돌연변이 PCR 생성물의 검출 방법은 먼저 변성(denaturation) 및 어닐링(annealing)에 의해 수행되어 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 형성하며 후속적으로 DHPLC(Denaturing High Performance Liquid Chromatography)에 의해 헤테로듀플렉스를 검출한다(McCallum 등, 2000, supra). 상기 방법은 돌연변이를 검출하기 위해 제한 효소 Cel-I와 조합된 겔 기초 시스템(gel based system)을 이용하여 더욱 고도의 처리량을 만들어낸다(Colbert 등, 2001, Plant Physiol. 126(2):480-4). 상기 표적 DPG 유전자에서 단일의 염기 돌연변이의 검출 또는 확인을 위해 TILLING의 방법에서 사용될 수 있는 다른 방법은 수천의 개체(individuals)에서 주어진 유전자좌의 서열 정보를 생산하기 위해 예를 들어 상술한 바와 같은 재시퀀싱(resequencing) DNA(예를 들어 Slade 등, 2005, Nat Biotechnol. 23(1):75-81참고) 또는 대량 병행 시퀀싱(massive parallel sequencing)(예를 들어 Roche/454 Life Science performed on a GS 20 Genome Sequencer)을 포함할 수 있으며, 임의로 3D 풀링(pooling)전략(예를 들어 Keypoint^TM technology at www.keygene.com 참고) 등과 조합될 수 있다. 돌연변이 유발(mutagenesis)은 방사선 또는 EMS(Methods in Molecular Biology: 내의 Lightner and Caspar, 1998, "Seed mutagenesis of Arabidopsis": Humana Press 내의: Arabidopsis Protocols(eds. J. M. Martinez-Zapater 및 J. Salinas), pp. 91-103. Totowa, New Jersey) 또는 ENU(Draper 등, 2004, Methods Cell Biol. 2004; 77:91-112)와 같은 화학적 돌연변이원에 의해 수행될 수 있다. DPG 대립 유전자에서 돌연변이로 식물을 제조하기 위한 바람직한 방법은 바람직하게는 적어도 하기의 단계를 포함한다: (a) 식물 종자의 돌연변이 유발 단계; (b) a)에서 획득한 돌연변이 유발된 종자의 식물을 재배하는 단계; (c) 임의로, b) 단계에서 획득한 식물을 적어도 한 세대동안 역교배하는 단계; 및 (d) b) 또는 c)에서 획득한 식물을 DPG-대립 유전자 내 돌연변이 존재에 대해 스크리닝하는 단계. 바람직하게 상기 식물은 솔라눔(Solanum) 식물, 더욱 바람직하게는 솔라눔 리코퍼시컴(Solanum Lycopersicum) 집합체(complex)의 식물, 또는 솔라눔 메론지나(Solanum melongena) 식물이다. 상기 DPG-대립 유전자 내 돌연변이는 바람직하게는 대립유전자가 ps-2-대립 유전자가 되도록 한다. 보다 바람직하게 상기 ps-2-대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C, A 또는 T를 갖는 대립 유전자이며, 가장 바람직하게 상기 대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C를 갖는다.

본 발명의 여섯번째 견지는 유전자 변형 식물, 바람직하게는 비-열개 꽃밥을 갖는 솔라눔(Solanum) 식물의 제조 방법에 관한 것이다. 비-열개 꽃밥을 갖는 유전자 변형 식물은 예를 들어 안티센스(antisense), 센스(sense) 억제 또는 RNAi(RNA 개입) 핵산 구성체(construct)를 식물로 도입하여 상기 DPG 유전자를 침묵(silencing)시키거나, 또는 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 DPG 유전자를 넉-아웃(knock-out)하는 방법을 포함하는 다양한 방법으로부터 획득될 수 있다. 상기 방법은 따라서 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 단편이 상기 정의된 바와 같은 DPG 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체로 식물 세포를 변형시키는 단계를 적어도 포함하며, 여기서 식물 세포 내 핵산 구성체의 존재는 DPG 활성의 발현을 위치상 불임 및 비-열개 꽃밥에 영향을 미치는 수준까지 감소시킨다. 비-열개 꽃밥을 갖는 식물은 당해 기술분야의 숙련자에게 알려진 방법에 따라 변형된 식물 세포 또는 이러한 변형된 세포를 포함하는 식물로부터 유래될 수 있다.

따라서 바람직한 구현으로 상기 핵산 구성체 내 뉴클레오티드 서열은 식물 세포, 예를 들어 솔라눔(Solanum) 세포 내에서의 발현을 위해 작동적으로(operably) 프로모터에 연결되어 있고, 상기 뉴클레오티드 서열의 발현은 RNA 개입(interference)에 의해 DPG 활성의 발현을 감소시킨다. 유전자 침묵을 위한 방법 및 핵산 구성체는 US20070130653, US20070074311 및 이에 인용된 참고문헌에 기술되어 있다. 본 발명은 따라서 식물 세포 내에 상기에서 정의된 바와 같은 DPG를 코딩하고 발현을 위해 작동적으로 프로모터에 결합된 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 단편을 포함하는 구성체인 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산 구성체 내에서 상기 단편은 바람직하게는 상기 정의된 DPG를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보적인 서열에 대해 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드로부터 30, 60, 100, 200 또는 500 인접한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 더욱 바람직하게 TDPG를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1이다.

다른 바람직한 구현으로, 비-열개 꽃밥을 갖는 유전자 변형 식물은 상동성 재조합(homologous recombination)에 의한 DPG 유전자의 넉-아웃(knock-out)에 의해 획득될 수 있다. 이러한 방법에서 상동성 재조합을 위한 바람직한 상기 핵산 구성체 및 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 DPG 활성의 발현을 위치상 불임 및 비-열개 꽃밥에 영향을 미치는 수준까지 감소시키는 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 코딩 및/또는 프로모터 서열의 완전한 삭제 또는 DPG 유전자를 불활성화 하기 위한 선택가능한 마커 또는 다른 서열의 삽입을 포함하는 가장 넓은 의미에서의 돌연변이일 수 있다. 상동성 재조합은 게놈에서 정의된 선택된 위치에 선택된 핵산의 도입을 가능하도록 한다. 식물에서 상동성 재조합의 수행 방법은 모델 식물(Offring 등, 1990 EMBO J. 9(10): 3077-84)뿐만 아니라 예를 들어 쌀(India and Terada, Curr Opin Biotechnol. 2004 April; 15(2):132-8)과 같은 곡물 식물에 대해서도 기술되어 왔다. 표적될 핵산은 따라서 바람직하게는 결함(deficient) DPG 대립 유전자, 예를 들어 ps-2-대립 유전자이며, 내재성(endogenous) DPG 유전자를 대체하는데 이용된다.

비-열개 꽃밥 및/또는 위치상 불임 표현형을 갖는 본 발명의 식물은 자가-수정을 피하거나 감소시킴에 의해 보다 비용-효율적인 잡종 식물의 생산을 가능하게 하는 장점이 있다. 잡종의 생산은 CMS와 같은 웅성 불임성(male sterility) 또는 위치상 불임성의 이용을 수반할 수 있다. 위치상 불임은 한편으로 바라지 않는 자가-수정을 감소 또는 억제하기 때문에 바람직한 반면 다른 한편으로 요구되는 경우 (수동으로) 개방하거나 파괴하여 자가-수정을 가능하게 할 수 있는 점에서 바람직하다. 상기 본 발명의 DPG 대립 유전자는 따라서 비-열개 꽃밥(웅성 부모의 표현형에 따름)에 기인한 위치상 불임성 표현형을 갖거나 갖지 않을 수 있는 잡종의 형성 동안 근친교배(inbreeding)를 억제하는 도구로서 사용될 수 있다. 나아가 상기 비-열개 꽃밥 및/또는 위치상 불임 표현형은 (자가)-수정을 피하거나 또는 감소시켜서 그에 따라 씨가 없는 표현형을 증가시키는 씨가 없는 열매의 생산에 있어서 유리하게 적용될 수 있다.

본 발명이 토마토 식물을 수단으로 예시하였으나 본 발명으나 DPG 핵산, ps-2-대립 유전자, 및 모든 상업적으로 중요한 작물, 예를 들어 국화과(Asteraceae)(상추, 치커리, 아티쵸크(globe artichoke), 해바라기, 야콘, 잇꽃 식용 작물 포함), 박과(Cucurbitaceae)(통상적으로 박 또는 조롱박으로 알려져 있고 오이, 호박(squash)((pumpkin) 포함), 수세미, 멜론 및 수박과 같은 작물을 포함), 배추속 식물(Brassica)(스웨덴 순무(swede), 순무, 콜라비(kohlrabi), 양배추, 방울다다기 양배추(brussels sprout), 콜리플라워, 브로콜리, 겨자씨 및 평지씨(oilseed rape)를 포함), 콩과 작물(건조 콩, 건조 누에콩, 건조 완두콩, 병아리콩(chickpea, garbanzo), 병아리콩(bengal gram) 건조 동부콩(cowpea), 동부콩(black-eyed pea, blackeye bean), 앙골라콩(pigeon pea), 투어(toor), 카잔콩(cajan pea), 콩코콩(ccongo bean), 렌틸(lentil), 밤바라 땅콩(groundnut), 지구콩(earth pea vetch) 살갈퀴, 일반 산갈퀴 루핀(Lupins), 대두, 피넛(peanut)을 포함), 명아주과(Chenopodiaceae)(시금치), 백합과(Liliaceae)(유니온스(unions), 리크(leek)), 산형과(Apiaceae)(당근), 곡식 작물(쌀, 보리, 밀, 귀리, 옥수수), 가지과(Solanceae)(토마토, 후추, 가지를 포함)의 (유전자 변형) 식물의 생산 방법으 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서 및 청구의 범위에서, 동사 "포함한다" 및 이의 동사 활용형은 상기 단어를 따르는 항목들을 포함하지만 특히 언급되지 않은 항목을 배제하지 않는 비제한적인 의미로 사용된다. 나아가, 문맥상 명확하게 하나의 요소만이 존재하는 것으로 요구되는 경우가 아닌 한, 부정관사(일 또는 하나의 ("a" 또는 "an"))와 관련하여 이는 하나 이상의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 상기 부정관사는 "적어도 하나"를 의미한다.

실시예

1. 실시예 1

1.1 재료 및 방법

1.1.1. 식물 재료

ps-2ABL(true Advanced Breeding Line 솔라눔 리코퍼시컴(S. lycopersicum), ps-2ABL에 대해 동형접합) 및 솔라눔 핌피넬리폴리움(S.pimpinellifolium) 사이 교배로부터 발달된 F2 재조합 서브(sub)-집단을 유전적 매핑을 위해 사용하였다. ps-2에 대해 분리하는 상기 집단은 ps-2 유전자좌 영역 내 146 F₂ 식물 재조합형으로 구성된다(Gorguet 등, 2006).

다른 176 ABLs, 이들 중 ps-2/ps-2인 8개를 사용하여 확인된 SNP 및 ps-2 유전자좌 사이의 관계를 실험하였다.

ps-2ABL 및 품종 머니메이커의 꽃밥을 사용하여 현미경 관찰하였다.

1.1.2 현미경

식물 재료를 4% 파라포름알데히드를 함유하는 0.1M 인산염 완충제(phosphate), pH 7.0 내에서 4℃에서 24시간 동안 고정하였다. SEM(scanning electron microscope)을 위한 샘플을 Dornelas 등(2000)에 기술된 바와 같이 처리하고, Orion Framegrabber(Matrox Electronic Systems, Unterhaching, Germany)을 이용하여 디지털 이미지를 획득하였다. 광현미경용 샘플을 Technovit 7100(Hereaus Kulzer, Wehrheim, Germany)에 삽입하고, 톨루엔 블루로 염색하고, 그리고 유패럴(Euparal)(Chroma-Gesellschaft, Kongen, Germany) 내에 고정하였다.

1.1.3 BAC 라이브러리 스크리닝 및 콘티그(contig) 구성

본 발명자들은 품종 어세션 Heinz 1706의 게노믹 DNA로부터 구성된 토마토 HindIIIBAC 라이브러리를 사용하였다. 상기 Heinz 라이브러리는 114.5kb의 평균 삽입 크기를 갖는 15 게놈이다(Budiman 등, 2000). 먼저 플레이트 풀(pools) 상에서, 그리고 개별적으로 BAC 라이브러리의 스크리닝을 PCR증폭에 의해 수행하였다. 포지티브(positive) BAC 클론의 플라스미드 DNA를 그 후 분리하고 이후의 분석에 사용하였다.

포지티브 BAC 클론의 BAC 말단 서열을 SGN 데이타베이스로부터 획득하였다(Mueller 등 2005). CAPS 또는 dCAPS 마커로의 BAC 말단 서열의 변환을 Gorgiet 등에 기술된 바와 같이 수행하였다(2006). BAC 말단 서열에서 유래된 PCR 마커의 상세 내용을 표 1(유전적 연관 지도에 사용된 PCR 마커)에 나타내었다.

마커 이름	용도	프라이머 서열	크기(bp)	제한 효소
BAC 말단 서열로부터 개발된 마커

BAC 143M15 서열로부터 개발된 마커

솔라눔 리코퍼시컴 내 ps-2ABL 대립 유전자 확인을 위해 개발된 마커

개별적인 BAC 클론의 지문(fingerprinting) 패턴이 기본적으로 Brugmans 등(2006)에 의해 기술된 바와 같이 Hind III/Taq I 효소 조합을 사용하여 발생시켰다.

1.1.4 BAC DNA 서열 및 분석

BAC 클론 143M15의 크기를 펄스 영역(pulse field) 젤 전기영동에 의해 추정하였다. BAC 클론 143M15를 Greenomics에 의한 샷건-서열 방법을 통해 서열분석하였다(The Netherlands). BAC 서열 상에서 확인된 후보 유전자 로부터 유래된 PCR 마커를 Gorguet 등(2006)에 기술된 바와 같이 개발하였다. 추정 유전자를 확인하기 위해, 최종 BAC DNA 서열을 SGN(Muller 등, 2005) 토마토 Unigene 데이타베이스에 대해, 그리고 TAIR로부터의 Arabidopsis 유전자 모델 데이타베이스에 대해(http://www.Arabidopsis.org; Huala 등, 2001) SGN(Muller 등, 2005)의 TBLASTX 인터페이스를 사용하여 유의수준 역치 1E-10으로 스캐닝하였다. 추정 ORF 서열에 기초한 PCR 마커를 개발하고 재조합 집단(population) 상에서 Gorguet 등(2006)에 기술된 바와 같이 스크린하였다. 이러한 PCR 마커의 상세 내용은 표 1에 나타내었다.

1.1.5 후보 유전자 분석 및 계통발생적(phylogenetic) 분석

머니메이커(Moneymaker) 및 ps-2ABL에서, 약 900bp의 생성물을 가져오는 몇몇 연속적인 오버래핑 프라이머 쌍을 이용하여 ORF4의 완전한 게노믹 DNA 서열, 뿐만 아니라 각각 프로모터 및 유전자 종결자(terminator)를 포함하는 업스트림 및 다운스트림 서열을 증폭하고 서열분석하였다. 머니메이커(Moneymaker) 및 ps-2ABL의 결과 DNA 서열을 DNAStar로 모았다. Softberry 유전자 찾기 소프트웨어를 사용하여 후보 유전자의 추정 엑손 및 인트론을 확인하였다.

알려진 조직 발현, 뿐만 아니라 후보 단백질과의 단백질 BLAST 서치의 베스트 히트(best hit)를 갖는 토마토 폴리갈락투로나아제 단백질 서열을 선택하여 계통발생적 분석을 수행하였다. 선택된 단백질 서열의 Pfam Glycosyl Hydrolase 28 도메인만이 분석에 사용되었다. 각 단백질 서열의 상기 Pfam GH28 도메인을 NCBI의 단백질 블라스트(Blast) 인터페이스로 확인하였다. Pfam GH28 도메인의 선택된 아미노산 서열을 ClustalW 멀티플(multiple) 서열 정렬 소프트웨어(Higgins 등, 1994)를 이용하여 정렬하였다.

PAUP 소프트웨어 패키지 버젼 4(Swofford 2002)를 사용하여 50% 주요-원칙(majority-rule) 일치 계통발생 나무를 최대 절약(parsimony)을 이용하여 구성하였다(1000 부트스트랩(bootstrap) 복제 및 250 추가 서열 복제). Cedar PG 단백질 서열을 사용하였고 외집단(outgroup)으로서 정의하였다.

상기 아미노산 서열 및 이들의 단백질 동정 번호는 하기와 같다: 키위 열매(AAC14453; Atkinson 및 Gardner, 1993), 포도 딸기(grape berry) 열매(AAK81876; Numan 등, 2001), 대두 꼬투리(pod)(AAL30418; Christiansen 등, 2002), 복숭아 열매(CAA54448; Lester 등, 1994), 사과 열매(AAA74452; Atkinson, 1994), 배 열매(BAC22688; Hiwasa 등, 2003), 애기장대(Arabidopsis) 열개 영역 ADPG1(CAA05525; Sander 등, 2001), 유채(oilseed rape) 열개 영역RDPG1(CAA65072;Petersen 등, 1996), 유채 꼬투리(CAA90272;Jenkins 등, 미공개), 순무(turnip) 장각(silique) 밸브(valve) 건조(CAD21651; Rodriguez-Gacio 등, 2004), 후추 열매(BAE47457; Ogasawara S 및 Nakajima T, 미공개), 토마토 열매 TFPG(CAA32235; Bird 등, 1988), 토마토 암술(AAC70951; Hong 및 Tucker, 2000), 토마토 이탈(abscission) 영역 TAPG1, 2, 4, 5(AAC28903, AAB09575, AAB09576, AAC28906; Hong 및 Tucker, 1998), 토마토 와운드(wound) 잎(AAD17250; Bergey 등, 1999) 및 토마토 종자(AAF61444; Sitrit 등, 1999).

1.1.6 총 RNA 분리, cDNA 합성 및 양적 PCR 분석:

RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 각 조직(꽃밥, 열매, 꽃 이탈(abscission) 영역 및 잎 이탈 영역)의 50 내지 100mg 사이를 RNA 분리 반응 당 사용하였다. DNase I 처리 후 샘플 당 총 RNA의 1μg만이 cDNA의 합성에 사용되었다(Boehringer Manheim). 제1가닥 cDNA 주형을 랜덤 헥사머를 프라이머로서 그리고 Multiscribe^TM 역전사효소(Applied Biosystems)를 이용하여 합성하였다. ORF4의 준(quasi) 완전 코딩 서열을 증폭하여, 제1엑손 상에 위치한 정방향 프라이머:

를 이용하여, 개시코돈의 다운-스트림 47 뉴클레오티드에서 시작하여, 마지막 엑손에 위치하는 역방향 프라이머:

를 이용하여 정지 코돈 업-스트림 100 뉴클레오티드에서 정지하는 인트론 스플라이싱을 연구하였다. ORF4의 준-완전 CDS를 표준 PCR 반응(55℃ 어닐링 온도 및 25 사이클)으로 증폭하였다.

실시간 실험을 iCycler MyiQ 검출 시스템(Bio-Rad)에서, SYBR 그린(green) PCR 마스터 믹스 키트(Applied Biosystems)를 이용하여 수행하였다. 프라이머 서열은 하기와 같다: 정방향 프라이머

, 역방향 프라이머 5'-

(ORF4); 및 정방향 프라이머 5'-

, 역방향 프라이머

-3'(β-액틴). ORF4 전사 수준의 상대적인 정량화를 2^-△CT식을 적용하여 내부 β-액틴 대조구로 계산하였다. PCR 생성물의 순도를 용융 곡선으로 확인하였다. 상기 반응은 이중으로(duplo) 이루어졌다. PCR 조절은 RNA 샘플이 DNA 오염이 없음을 보장하기 위해 추가의 역방향 전사효소의 결여에서 수행하였다.

2. 결과

2.1 ps-2 표현형의 현미경 관찰

야생형(Moneymaker) 및 돌연변이(ps-2ABL)의 꽃밥의 횡단면을 준비하고 톨루이딘 블루로 염색하여 돌연변이에서는 차단되는 꽃밥의 발달/열개가 어떠한 단계에 있는지 확인하였다. 개화기의 꽃밥 콘(cone)의 세로단면을 전자 현미경을 위해 준비하였다. 개화까지는 발단 단계의 차이가 시각화되지 않았다. 늦은 꽃눈에서, 돌연변이 및 야생형의 중격(septum) 세포에서 결정이 관찰되었고, 정상에서 화분 발달이 나타났다(도 1). 야생형에 비해 유사한 단계에서 돌연변이에서는 중격의 붕괴가 일어나지 않았다. 그러나 개화에서 돌연변이 구변세포(stomium)는 축퇴되지 않고 화분이 꽃밥에 남아있었다(도 1-b, c). 나아가, 내피(endothecial)의 두꺼워짐이 돌연변이에서 발생되지 않았고 따라서 구변세포 상의 파괴 힘을 창출하기 위해 개화 단계에서 표피세포가 단단함을 결여하였다.

2.2 물리적 매핑 및 후보 유전자 확인

본 발명자들은 이전에 ps-2 유전자좌를 크로모좀 4의 짧은 팔 상의 COS 유래 CAPS 마커 T0958 및 T0635에 의해 정의된 1.65cM 간격으로 매핑하였다(Gorguet 등, 2006). ps-2 유전자좌 영역에 대한 물리적 지도가 Heinz BAC 라이브러리를 이용하여 만들어졌다. 상기 라이브러리를 ps-2 유전자좌에 대해 가장 가까운 마커로 PCR 증폭에 의해 그리고 상기 마커의 서열을 이용하여 컴퓨터적인 방법으로 스크리닝하였다. 그 후 BAC 말단을 PCR 마커 내로 변환하고(도 2) 이러한 마커를 재조합 집단 내에서 스크리닝하여 포지티브 BACs를 유전적 맵에 고정한다(anchor). BAC 지문을 또한 동일한 콘티그(contig)로부터 BACs의 오버랩을 평가하고 BACs가 동일한 콘티그의 일부인지 확인하기 위해 비교한다. 상기 ps-2 유전자좌에 대해 가장 가까운 BAC 말단을 그 후 2 회전의 스크리닝을 위해 사용한다. 결국, 전체 콘티그는 COS유래된 CAPS 마커 T1070으로부터 BAC 말단 15N23-T까지 1.70cM(32 재조합형(recombinants))에 걸쳐있다(도 2). BAC 143M15는 ps-2 유전자좌에 걸쳐있고 이에 따라 서열분석되었다.

BAC 클론 143M15 내에 존재하는 유전자를 확인하기 위하, 상기 BAC DNA서열을 Tomato SGN Unigene 데이터베이스에 대해, BLASTN 인터페이스를 이용하여, 그리고 애기장대 유전자 모델 데이타베이스에 대해, TBLASTX 인터페이스를 이용하여 스캐닝하였다. 두 개의 토마토 코딩 서열 및 다섯개의 애기장대 유전자가 BAC 크론 서열에 맞았다(이들 중 두개는 두개의 토마토 코딩 서열과 맞았다; 표 2(애기장대 유전자 모델에 기초한 후보 유전자 확인)). 다섯개의 후보 유전자는 ORF1 내지 ORF5로 지칭되었다. 나아가, 여섯개의 유전자 레트로트랜스포존(retrotransposon) 패밀리를 또한 확인하였으며, 그러나 이들은 이후의 연구에서 고려하지 않았다. 다섯 개의 대응하는 애기장대 유전자의 위치는 그 영역에 대한 두 종 사이의 신터니(synteny)의 결여가 강조된 애기장대 게놈 내에 인접하지 않는다. 게다가 이들 중 어느 것도 애기장대에서 확인된 기능성 웅성 불임 유전자 중 하나에 상동하지 않는다(Gorguet 등에 나열됨, 2006).

유 전 자	토마토	애기장대
	Unigenes 어세션번호	어세션 번호	유전자 역할	Chr.	AGI 좌표(염기)	TBLASTX
	Unigenes 어세션번호	어세션 번호	유전자 역할	Chr.	AGI 좌표(염기)	E 값	점수
ORF1 ORF2 ORF3 ORF4 ORF5	U323899 U317249	AF014399 NM112785 AF326883 NM111676 AB017502	마그네슘-킬레이트 전사인자 B3 패밀리 리모린 패밀리 단백질 폴리갈락투로나아제 글리코실 하이드롤라제 패밀리 3	1 3 2 3 5	2696415-2700961 6548875-6551847 17477944-17480014 2541012-2543438 7107378-7111311	0 3E-21 9E-37 1E-79 0	214 105 110 108 276

높은 해상도의 지도에서 후보 유전자의 위치를 확인하기 위해, 본 발명자들은 추정 유전자 서열(또는 가까운 서열)을 PCR 마커로 변환하고 이들을 재조합 집단에 매핑하였다. 모든 후보 유전자를 다른 위치에 고해상도로 연관 지도 내에 매핑하였고 이에 따라 본 발명자들은 유전적 지도 내 이들의 위치에 기초하여 ps-2에 대한 후보를 용이하게 확인할 수 있었다. ORF4, 추정 폴리갈락투로나아제 유전자를 ps-2 유전자좌에 가장 가깝게 매핑하였다(도 2). 후속적으로 상기 추정 인트론 및 엑손을 Softberry의 FGENSH 소프트웨어를 이용하여 확인하였다. 상기 후보 유전자 ORF4는 1179 뉴클레오티드의 코딩 서열에 대해, 9개의 엑손 및 8개의 인트론으로 구성되어 있고 추정 개시코돈으로부터 정지 코돈까지 6716의 게노믹 거리에 걸쳐있다. 상기 PCR 마커 ORF4을 개발하기 위해 사용된 SNP는 두 번째 추정 인트론 내에 위치한다. 본 발명자들은 하나는 솔라눔 핌피넬리폴리움 대립 유전자[ORF4(1)] 내의 첫 번째 인트론 내 76bp의 삭제에 기초하고 다른 하나는 솔라눔 핌피넬리폴리움 대립 유전자[ORF4(2)] 내의 여섯번째 인트론 내 38bp의 삽입에 기초한 2개의 추가 PCR 마커를 매핑하였다. 상기 3개의 마커, ORF4(1), ORF4 및 ORF4(2)는 각각의 사이에 하나의 재조합의 간격에서 매핑하였고 적어도 두 개의 재조합이 재조합 집단 내에서 후보 유전자 ORF4내에서 발생한 것을 나타낸다(도 2). ORF(2)가 높은 해상도 지도 상의 ps-2 유전자좌와 함께 공동-분리(co-segregate)되었다.

2.3 ORF4 내의 돌연변이 및 분자 마커의 개발

ORF4가 ps-2 유전자에 대응한다는 가설을 강화하기 위해, 본 발명자들은 ps-2AL 내의 서열 변화를 조사하였다. ORF4의 추정 프로모터로부터 추정 종결자(terminator) 전체 9kb가 품종 머니메이커 및 ps-2ABL에서 서열분석되었다. 하나의 단일 돌연변이가 ORF4의 다섯번째 추정 엑손의 마지막 뉴클레오티드 상에서 관찰되었으며, 이 때 뉴클레오티드 구아닌은 시토신에 의해 대치되었다. 확인된 ORF4 내 SNP와 ps-2 특성 사이의 관련을 실험하기 위해, 본 발명자들은 그 SNP에 기초하여 솔라눔 리코퍼시컴 내의 ps-2ABL 대립 유전자 및 야생형 대립 유전자가 겔 상에서 용이하게 구분될 수 있는 것과 같은 방법으로 분자 마커를 개발하였다. 이러한 마커를 176 ABMs의 세트 상에서 실험하였고 이들 중 8개가 ps-2/ps-2였다. 이러한 7개의 기능적으로 웅성 불임인 식물은 다른 ABMs로부터 구별되는 동일한 마커 패턴을 나타내었으며, 이는 상기 SNP가 실험된 다른 ps-2 계통 내에 존재하는 것을 확인해준다. 상기 마커는 이제 용이하게 ps-2 특성을 현대 토마토 계총 내로 분자 보조된(assisted) 도입을 위해 사용될 수 있다.

2.4 택일적인 인트론 스플라이싱

ORF4의 ps-2ABL 대립 유전자 내 서열 돌연변이가 인트론 인식 스플라이스(splice) 지점 중 하나에 위치하기 때문에, 본 발명자들은 이러한 돌연변이가 유전자의 전(pre)-mRNA 스플라이싱에 영향을 미칠 수 있는 것으로 가정하였다. 이러한 가설을 입증하기 위해 본 발명자들은 ORF(1179에서 1032nt)의 준(quasi) 전체-길이 cDNA 클론의 증폭을 위한 프라이머를 디자인하였다: ORF4의 제 1 엑손 상에 정방향 프라이머를 그리고 마지막 엑손 상에 역방향 프라이머를 디자인하였다(표 3(야생형 서열(WT) 및 돌연변이 서열의 정렬 )). ps-2ABL 및 품종 머니메이커로부터 후(post)-개화에서 꽃밥 콘(cone)의 RNA로부터 만들어진 cDNA 상에서 RT-PCR을 수행하였다. 품종 머니메이커에 대해 관찰된 증폭된 생성물은 예상된 크기(1032bp)였으며, 이는 서열분석에 의해 확인되었다. ps-2ABL의 증폭된 생성물은 머니메이커 생성물 보다 현저하게 작았으며 이는 인트론 스플라이싱의 변경을 시사한다(도 3). ps-2ABL 상에서 증폭된 단편의 서열분석(sequencing)은 SNP가 존재하는 다섯번째 엑손이 상기 cDNA 서열 내에서 생략된 것을 나타낸다. 상기 전-mRNA 성숙 과정 중 이러한 엑손을 2개의 측면(flanking) 인트론과 함께 제거하였다(도 4). 이러한 엑손-인트론 스플라이스 접합(splice junction)의 야생형 5' 서열은 CAG/GTATCG였으며, 이는 솔라눔 투베로섬(Solanum tuberosum) 내에서 확인된 스플라이스 접합 서열 중 하나와 일치한다(Brown, 1986). ps-2ABL 대립 유전자 내에서 발견된 돌연변이는 하기의 서열을 유도하며: CAC/GTACG, 이는 인트론 스플라이싱 인식 지점의 리스트에 존재하지 않는다. 성숙 mRNA 내 다섯번째 엑손의 결여는 208 뉴클레오티드의 삭제를 나타내며, 이는 남은 코딩 서열 다운-스트림 상에 프레임-시프트(frame-shift)를 유발한다. 이러한 프레임-시프트는 새롭게 만들어진 정지 코돈에 기인하여 14aa 후에 번역의 미성숙 종결을 유발한다. 완전한 추정 돌연변이 단백질은 따라서 야생형 단백질에 대하여 392aa인 것에 비교하여 154aa 길이이며, 이는 비-기능적이다.

2.5 ORF4 서열 분석

ORF4의 추정 후보 단백질 서열로 NCBI의 단백질 데이타베이스 내 BLAST 서치는 몇몇 식물로부터의 PG 단백질 리스트의 결과를 가져왔다. 상기 확인된 단백질은 열매 성숙 및 장각(silique)/꼬투리(pod) 열개에서 역할을 갖는다. 이들 중, ADPG1 단백질은 애기장대의 장각의 열개 영역뿐만 아니라 꽃밥의 열개 영역에서 발현되는 것으로 나타났다(Sander 등, 2001). 가장 잘 맞는(best hits) BLAS의 Pfam GH28 도메인의 아미노산을 후보 단백질의 서열 및 확인된 기능을 갖는 이미 알려진 토마토 PG 단백질, 및 하나의 겉씨식물 PG(삼나무(cedar))과 함께 정렬(align)하였다. 참고된 PG 계통분기군의 하나에 후보 단백질을 배치할 수 있도록 하기 위해 계통발생적 분석을 최종 정렬에서 수행하였다. ORF4는 분기군 B의 PG로서 확인되었다(도 5). 분기군 B는 이전에 Hadfields 및 Bennett(1998)에 의해 특징된 바와 같이 열매 및 열개 영역에서 발현되는 PG를 코딩하는 모든 클로닝된 유전자로 구성되어 있다. 이는 또한 현재 계통발생 나무에서도 관찰된다. 열매에서 발현되는 것으로 알려진 유일한 토마토 PG인 TFPG 또한 동일한 분기군의 일부이다. ORF4 및 TFPG의 Pfam GH28 도메인의 정렬을 도 6에 나타내었다. ORF4 및 TFPG는 전체 단백질 서열 상에 59%의 유사성을 갖는다.

ORF4의 추정 유래 단백질은 Rao 등에 의해 나타난 바와 같은 PG 단백질에 특징적인 4개의 보존(conserved) 도메인을 포함한다(1996; 도 6). 제1 보존 도메인은 다섯번째 엑손 상에 위치되어 있으며, 이는 돌연변이 단백질에서는 생략되고, 다른 세 개의 도메인이 더욱 서열 상에 위치하고 있고 따라서 돌연변이 서열에서 프레임(framed)되지 않는다. 따라서 상기 돌연변이 단백질은 단백질 기능에서 중요한 역할을 하는 어떠한 네개의 보존 도메인을 포함하고 있지 않는다. ORF4의 개시 코돈 업-스트림 2000 뉴클레오티드의 분석은 개시 코돈에 대해 -667, -700 및 -1955 위치의 3개의 ERE(Ethylene Responsive Elements; AWTTCAAA)존재, -1632의 하나의 bZIP 단백질 결합 모티프(motif)(TGACG) 및 -1329의 하나의 G-박스(CACGTG)를 나타내었다. ORF4의 프로모터 서열 내 ERE 모티프, bZIP 단백질 결합 모티프 및 G-박스의 존재를 ORF4의 전사가 에틸렌 및 쟈스모네이트에 의해 촉진되는 것을 시사한다.

2.6 꽃밥 , 열매 및 다른 조직 내 ORF4의 발현

본 발명자들은 개화기에서 잎 및 꽃의 이탈 영역, 성숙 열매 및 꽃밥을 포함하는 몇몇 조직 내에서 ORF4 전사의 존재를 실험하였다. 이탈 영역 내에서 ORF4 전사가 검출되지 않았다(도 7). ORF4 전사의 존재가 꽃밥뿐만 아니라 열매에서 확인되었다. 꽃밥 및 열매 발달의 다양한 단계에 걸친 ORF4의 전사 수준의 발전을 연구하기 위해, 본 발명자들은 꽃밥의 4 개의 발달 단계: 꽃눈; 전-개화; 개화; 후-개화, 그리고 5 dap(day after pollination)에서 57dap(성숙 열매)까지의 열매의 8개의 발단 단계; 파괴(breaker) 단계에 상응하는 47dap(데이타를 나타내지 않음)에서 ORF4의 양적인 발현 분석을 수행하였다. 꽃밥에서, ORF4의 전사 수준을 머니메이커 및 ps-2ABL에 대해 실험하고, 머니메이커에 대해서만 열매에서 실험하였다. 37dap 이전에는 ORF4 전사가 검출되지 않았다. 37dap으로부터 ORF4 전사가 검출되었고 시간에 따라 현저하게 증가하여 최대 성숙 단계(57dap)에 도달하였다. 머니메이커의 꽃밥에서, ORF4 전사는 꽃눈 단계에서 이미 검출되었다. 전-개화에서 ORF4 전사의 수준은 꽃눈과 비숫하였다. ORF4 전사 축적은 개화에서 축적되어 후-개화에서 최대에 이르렀다. ps-2ABL의 꽃밥에서, 또한 꽃눈 단계를 제외하고 ORF4 전사가 검출되었다. 그러나 개화 및 후-개화에서 ps-2ABL 꽃밥 내의 이러한 전사 수준은 머니메이커 꽃밥보다 현저하게 낮았다.

3. 토의

ps-2 Advanced Breeding Line은 열개를 겪지 않는 꽃밥을 생산한다. 본 연구에서 본 발명자들은 ps-2ABL의 꽃밥 발달/열개가 최후의 단계에서 차단되는 것을 보여주었다. 구변세포(stomium)는 퇴화하지 않고 내피(endothecium) 벽은 두꺼워지지 않는다. 이러한 두가지 생리학적 변화의 결여에서, 꽃밥은 닫혀진 상태로 남고 표피 세포는 궁극적으로 중격을 파괴하여 화분을 방출할 수 있는 단단함이 결여된다.

이러한 표현형 돌연변이는 열성이며 하나의 단일 유전자좌의 조절 하에 있다. 이전의 연구에서 본 발명자들은 크로모좀 4의 짧은 팔 상의 ps-2 유전자를 상세하게 매핑하였다(Gorguet 등, 2006). 여기서 본 발명자들은 상기 ps-2유전자의 분리 및 기능적 특징을 보고하였다. 본 발명자들은 상기 ps-2 표현형은, 9개의 엑손으로 이루어진, 지금까지 알려지지 않은 폴리갈락투로나아제 유전자 내의 단일 뉴클레오티드 돌연변이의 결과인 것을 발견했다. 이러한 단일 뉴클레오티드 돌연변이는, 인트론 스플라이싱 인식 위치에 영향을 미치는, 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드 상에 위치하며, 이는 CAG/GTATCG에서 CAC/GTATCG(엑손 3'/인트론 5')로 변경되었다. 시토신 염기를 통해 식물 내 이러한 특정한 위치에서 인트론 스플라이스 위치의 11%가 충족되며, 엑손 3' 말단에서 "CAC" 조합은 식물 내 어떠한 스플라이스 위치에서 검출된 바 없다(Brown 1986). 상기 다섯번째 엑손은 두 개의 측면(flanking) 인트론과 함께 스플라이스 아웃(spliced out)된다. 스플라이스 위치 주변에 돌연변이를 갖는 애기장대 돌연변이의 분석은 식물 스플라이싱의 엑손 생략의 몇몇 예를 나타냈다(Brown 및 Simpson에 의해 리뷰됨, 1998). 이러한 돌연변이의 대부분은 인식 스플라이스 위치의 인트론 부분에 위치한다. 본 발명자들의 지식으로, 식물에서, 지금까지 인식 스플라이스 위치의 엑손 부분 돌연변이에 기인하여 엑손 생략을 나타내는 유일한 돌연변이는 애기장대(Arabidopsis) 내의 spy-1 돌연변이였으며(Jacobsen 등, 1996) 여기서 8개 엑손의 말단에서 상기 CAG/GTTTGA(엑손 3'/인트론 5') 인식 스플라이스 위치는 CAA/GTTTGA로 돌연변이되었다. PRF4의 돌연변이된 대립유전자 내에서 관찰된 상기 엑손 생략은 남은 서열에서 프레임-시프트를 유발하며, 14aa 더 이른 종결 코돈을 만드는 결과를 갖는다. 상기 완전한 돌연변이 단백질은 따라서 야생형이 392aa 길이인 것에 비교하여 154aa 길이이고, PGs의 특징적인 4개의 도메인 중 어느 것도 포함하지 않는다.

3.1 ps -2는 B 분기군의 PG

ps-2 표현형에 책임이 있는 분리된 유전자는 PG인 것으로 지금까지 알려져 있다. 본 발명자들은 열개 폴리갈락투로나아제(Dehiscence PolyGalacturonase)를 의미하는 두문자 DPG, 또는 토마토 유전자 경우에 있어서 토마토 열개 폴리갈락투로나아제(Tomato Dehiscence PolyGalacturonase)을 의미하는 TDPG를 제안한다. TDPG의 계통발생 분석은 Hadfield 및 Bennett(1998)에 의해 정의된 바와 같은 분기군 B의 PG와 근접한 유사성을 나타내었다. 여기서 분기군 B는 열매 PGs, 이중에서도 토마토 열매 PG, 뿐만 아니라 장각(silique) 또는 꼬투리(pod) 열개 PGs로 구성되어 있다. 다른 분기군 내에는 다른 토마토 PGs군이다. PG 유전자 패밀리의 차이는 속씨식물 종의 분리에 앞서 일어났다는 주장에 따르면(Hadfield 및 Bennett, 1998), TDPG는 여기서 다른 분기군으로부터의 토마토 PGs보다 다른 종으로부터의 동일한 분기군의 유전자와 더 밀접하게 관련된다. 다른 토마토 PGs의 대부분은 탈리(abscission)와 관련되어 있다(TAPG). 우리의 연구에서, TDPG의 발현은 꽃 및 잎 탈리 영역에서 검출되지 않앗다. 그러나, 꽃밥 조직에 추가로 본 발명자들은 열매에서의 TDPG의 mRNA 전사를 검출하였다.

3.2 꽃밥의 발달에 따라 증가하는 TDPG 전사 축적

본 발명자들은 꽃밥의 상이한 단계에서 TDPG 전사의 상대적인 수준은 측정하였다. TDPG 전사는 단계에 걸쳐 증가하여 후-개화에서 최대에 도달하며, 이때 꽃밥이 열개한다. TDPG 전사 축적의 증가는 중격 및 구변세포의 퇴화와 병행하며 뿐만 아니라 꽃밥 내에서 내피 세포 벽이 두꺼워 지는 것이 관찰된다. ps-2ABL 꽃밥 내 TDPG 전사 수준은 전-개화에서부터 검출되지만 상기 전사 수준은 개화 및 후-개화에서 머니메이커에 대해 매우 낮게 남아있다. 돌연변이 mRNA는 넌-센스(non-sense)로서 인식되며 NMD(Nonsense-mediated mRNA decay)에 의해 퇴화된다. NMD는 양 조절 메커니즘으로서 작용하여 비정상적인 전사를 제거한다(Lejeune 및 Maquat 2005).

3.2 에틸렌 및 자스모네이트(Jasmonate)의 조절 하에 TDPG가 있을 가능성

TDPG의 프로모터 영역 내에서 에틸렌 및 자스모네이트의 존재에에 반응하는 요소는 DPG 유전자의 전사가 두 호르몬에 의해 유도될 수 있음을 시사한다. 에틸렌은 이미 담배의 꽃밥 열개의 시점에 연관된 바 있다(Rieu 등, 2003). 더욱 최근에, 에틸렌은 꽃밥 열개와 꽃의 개화의 동시발생을 조절하는 것으로 나타났다(Wang 및 Kumar, 2006). 나아가, 많은 연구들이 이미 자스모네이트를 꽃밥 열개의 과정 및 시기에 있어서 주요 화합물로서 확인한 바 있다. JA 생합성 효소의 몇몇 돌연변이가 이러한 현상의 연구를 위해 확인되었다. Scott등(2004)은 에티렌 및 JA가 꽃밥 열개의 조절에서 과잉적으로 활동하는 것을 제안하였으며, 이는 수술 내에서 JA를 합성할 수 없는 dde-1과 같은 애기장대 돌연변이 또는 에틸렌 무감각 Tetr 돌연변이가 궁극적으로 꽃밥 열개를 왜 겪는지 그 이유를 설명할 것이다.

본 발명자들은 다른 돌연변이에서 열개가 지연된 것과 반대로 이번 연구에서 ps-2ABL의 꽃밥이 열개되지 않은 상태로 남아있는 것을 보여주며, 이는 DPG가 꽃밥 열개의 조절에서 에틸렌 및 JA의 다운-스트림으로 활동한하고 DPG가 이러한 과정의 주된 활동자라는 가설을 강화시킨다.

3.3 TDPG는 또한 토마토 열매 성숙에서도 작용:

지금까지 확인된 유일한 토마토 열매 폴리갈락투로나아제인 TFPG는 과일 연화 과정에 있어서의 주된 활동자로 특징화되어왔다. TFPG의 안티-센스(Anti-sense) 억제는 길어진 저장 기간과 함께 토마토 열매의 생산은 유도하지만 그 열매는 성숙을 격지 않으며, 이는 열매의 연화 과정에서 다른 인자 또한 관련된 역할을 하는 것을 나타낸다(Smith 등, 1988). DPGs는 열매 세포벽 퇴화(degradatin)에 공헌하여 이러한 인자 중 하나일 수 있다. TDPG 전사는 머니메이커 내 열매 발달의 늦은 단계에서 검출되었다(도 8). 최대 전사가 성숙 단계(57dap)에서 발견되었다. 유사하게 TFPG는 성숙단계에서만 검출되었고 녹숙(mature green) 또는 파괴(breaker) 단계에서 개시하였다(Thompson 등, 1999; Eriksson 등, 2004). 품종(cv.) AC 및 Liberto에서, TFPG의 수준은 또한 파괴 단계로부터 성숙 과일까지 시간에 따라 증가하는 것으로 나타났다(Thompson 등, 1999).

토마토에서 에틸렌에 의해 PG mRNA 축적의 조절이 오랜기간 불명확하게 남겨져 있었음에도 불구하고, 열매 성숙 과정에서 TFPG 축적이 에틸렌 의존성인 것이 실증되었다(Sitrit 및 Bennett, 1988). 이에 따라서 ERE 모티프가 TFPG의 프로모터 내에서 발견되었다(Montgomery 등, 1993). 에틸렌은 열매 성숙의 조절에서 중요한 식물 호르몬으로 나타났다(Giovannoni, 2004). 에틸렌의 생합성 경로에서 늦은 한정(late limiting) 효소에 대한 안티-센스(anti-sense) RNA의 발현은 토마토에서 열매의 성숙을 억제하고 그 결과로 TFPG의 생산을 하향조절한다(Oeller 등, 1991; Sirit 및 Bennett, 1998).

본 연구에 앞서 본 발명자들은 프로모터 서열 내 ERE 모티프의 존재에 기인하여 DPG가 에틸렌의 조절 하에 있음을 제시하였다. 토마토 열매에서 에틸렌의 억제는 TFPG 및 TDPG 모두를 억제하며 그에 따라 열매 성숙의 과정을 완전히 억제한다. 꽃밥 열개 및 열매 성숙에서 DPG의 호르몬 조절에 대한 단순화된 모델을 도 8에 나타내었다.

열매의 성숙 및 저장 기간에서 DPG의 역할이 TFPG보다 유사하게 중요한 것인지 여부는 명확하지 않다. 꽃밥의 수동 개방 후 ps-2ABL와 머니메이커 또는 다른 정상 토마토 계통 사이의 비교는 유전적 배경의 차이에 기인하여 신뢰할 수 없다. 정상 토마토 계통에서 안티-센스 RNA 또는 RNi에 의한 DPG의 넉아웃이 이러한 의문의 답이될 수 있다. 수동(hand) 수분에서 성숙 열매 단계 사이의 시간 및 열매의 저장 기간이 유전자 변형되지 않은 대조구와 비교되어 열매에 잇어서 DPG의 영향을 평가할 수 있다. 궁극적인 상태에서 꽃밥 열개의 조절이 종간에 보존되어 있는지 여부를 입증하기 위해 다른 식물 종에서 TDOG의 동형접합 넉아웃 또한 가치있는 관심 대상이다.

Pt WT: 야생형의 단백질 서열(머니메이커)

Pt MT: 돌연변이의 단밸직 서열(ps-2ABL)

-상기 뉴클레오티드 굵은 글씨체의 "G"는 돌연변이의 위치를 나타낸다

-보존 단백질 도메인(domain)은 밑줄친 굵은 글씨체 로 나타낸다

-인트론의 위치는 서열 위의 검정색 화살표로 나타낸다 ▼

-준(quasi)-완전 코딩 서열의 증폭에 사용되는 프라이머 서열의 위치는 회색으로 나타낸다

<110> Western Seed International B.V. <120> Novel polygalacturonases and their uses <130> P6015073PCT <150> EP 07113263.3 <151> 2007-07-26 <150> US 60/952,046 <151> 2007-07-26 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6877 <212> DNA <213> Solanium lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (4386) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 aataattagt agattccaaa gatataataa tatggagaaa ttcaatgaag aagaagatca 60 agctaaggtt acaacaatta atgtggatag ctttggagct aaaggtgatg gaagtataga 120 tgatacaaat gtaagtatta gttttctttt aaaaaaaaat tctctttcga actattatta 180 aaaacacgtg aatttcttat gaaaatttct cagacaaatc atcgtatatt gacttgttaa 240 aagcttttca gacagacacg cttccattca aaaaaaataa ttaaaattca catgttttta 300 atagtgaaac aatatatgta tactaccttg atttgattta atttatttgg cgatatttga 360 tttaagttaa aattaaaaat aaatgaagat tttaaaactt atgatgttaa ttagatgtcc 420 tataattttt caatggttgt aaaggcttaa atgtatatat aaaaatagga tgtatataaa 480 gttacattat tttaaaatat aaataaaata tttttattag tcatacatac aaaatgaaat 540 aaaagaagta tataaagtta cattatttta aaatataaat aaaatatttt tattagtcat 600 acatataaaa tgaaataaaa gaagtatatt attagatata aaagtttgtg aagaaatgct 660 ttttttttta aaaagaattt aatttgtatg caacgataag ttgataactg ataacatatg 720 tcacatcttt gcgggttgat ttgcattagt tattggtgtt aaaatcaaat aaatcaattt 780 atccggtctt ataattatta aattaaagta aatctaaaat aatatatatt tatcgatttg 840 attgttattg gtttcagttt gattagatta tttgattact aatcatatat aaaattaaaa 900 gaaataattt attaaaaacg tgaaaagagc ggtaacaatt tattcaaaat gaaaaatagt 960 tagaatgact aaaattaaat aattttcaat tacagaattt actatgaata aagcttcaaa 1020 atttactatt ttgacgtaga agaaagagac aataacattt tttgtcttaa aaaaatgatc 1080 ataacggtta tatacatgaa accaatataa gtcaaatgtt ctcaccttga ggattattgt 1140 ttttgcgtaa gtacaaatca taaattttaa tgaaaacaaa tataatatct ttaaaaatcg 1200 tctacaaaaa taatatatta tatatgtatg ataaaatata atatatgtat atgatttatc 1260 gatttgattc agttatttct ttgatatttt tctagcaaaa tcacaatcaa actaaatact 1320 attgattttt aaaaatccaa aatcaaatca aaccataatc caaattcaat ttgtatcaat 1380 tttatccaaa cgtgaacact cctagtcaca taacttaaaa attaattata agtaaccatc 1440 aataagaaat gaccgaacta gttaattaat ataagtatac acacacatta attaattaaa 1500 catctttttt cattcgatat tgatattgaa gctcaattgt ttcgactttg tcctgcgtaa 1560 ggcctcattt ggcaaaaaaa tactctttag caagaatttt ttttatatgc aaaactcaaa 1620 tctgagactc cgaattaaga taggagaatt aaacatctca tttcttggtg gaaaataaag 1680 attatgtcat acttagaagc caattattat catggtgaat atatgtagca ggttgggatt 1740 acttctacga cagaatttta tcagcatcat aagcaattta attagttttt tttaataaat 1800 taattaatat attaaaataa atttatctta atttcaggca tttcaaaaag catggaaaga 1860 agcttgttca tcttcacatg ttgtgaattt tgtggtgtcc cagaacaaga aatatcttct 1920 caaaccaatc aaattttatg ggccatgcaa atcttccatt acaatgcagg ttaggttgac 1980 atatcattat gtaaaaaaaa aactcgaagt aacgataaaa ttattctcgt cctaatcact 2040 ataaagtatg gatgttctga gtcatggtca agtaattaga tcttgaggct tgcatcaggg 2100 taggctgttt gtgtcatggt gtggctcttt ccaaaactta tatgaaagtg agatgctttg 2160 tgcatccgat tatcgattca aactaacaga ataaaagttt tttttatacg attaggttat 2220 tttaaaatat gataaataat cttattcgac gagttgaatt gcatcgtgta tgtggatcta 2280 tagtgtaatc taaacattta cgcgacttta ttgaatagta tccaaaaaat attaaatcag 2340 aaattgatat tgttatataa acggataagt ttcaaatctt gaatacacct ttgataatat 2400 gaaaaactta ttacattgtc tgcgcacgga tataagttaa ttaaactctg ctattattat 2460 atatatgtag agaaataagc tctatgtata gtgacaaagc tatatccgtt gaacgatgat 2520 tagttgaaca cttaggttaa aatataacct taattttata tattgcgaca cctttcgtga 2580 aatttttaaa tctcgtcacc acttttagtt acatttggaa ataaataata ggttggagtg 2640 tagaatatta ttttgacact tttgttcaat ttttttttat tgtagattta tggaacccta 2700 ttagcatctg atgatacttc agattacaag aaggatagta ggcactggct tatttttgat 2760 agtgttcaaa aattggttgt tggaggagct ggagttatca atggcaatgg caaaatttgg 2820 tggcaacatt cttgcaaaat taataaaaaa ttggtataaa tacatactta attttgaaag 2880 ggtcgagaat cttgaaacaa tcctaaagtt tataggtcac cgtcagttcg aatcgtgtgc 2940 aaataattac tattatttgc actaggatag actgtctaca ttatacgcca atcaagtgca 3000 accttcccaa accttgcata agtgcatgat gttttatgag ccggggccgg aaagcccttt 3060 tgtcctttac atacttaatt ttaaaaggag agtcttggag taatgataaa attgtctatg 3120 tgcatgtgat tataggttac tgtccgttca atccgtgtag gaacaattac taatacatgt 3180 tttagaatag actatctata ttacactcca atcaagtgca gttctttccg aaccttgcat 3240 aaacacatga tgttttatgc aacggggcgt gggcaaccct tttgcccttt gcaaacttta 3300 tttatttatt tatatatata ttcctatttg tttcgtttgt ttttatgata tataactaat 3360 tttgtctaat ttttattcgt attgtctact ttttttttta ttttgcagcc atgcaaggta 3420 gcacccacgg tacgtttatt tgatttgatt tcttattttt caaaagaaca aaacaattaa 3480 ttattacgtc atttttcttt aatatttttt ttgttgatag agatttttta ttttatttta 3540 ttggtgacat ttaaattttt tcaggccctg acattttaca agtgtaacaa cttgaaagtg 3600 aaggacctta aaatagaaaa tgcacaacaa atacatttgc taattgagaa gtgtgttggt 3660 gttgaagtta caaaattggt agtgacttct ccagaaaata gccctaatac tgatggaatc 3720 catataacta gcactcaaaa tattcaaatt tctgattcca ccattgccac aggtatcgat 3780 aaattaacga ttttaatttt tatatactta tagtaaaaaa taattatatt atcaagttgt 3840 atgtataaat taaaggtaaa catgctttta ataagtgaaa cttatgataa gttattagcc 3900 tgaaaatatg aaagattaaa attttcgaca attgatcatc atcgtctcat cgaccacttg 3960 gtctttgacg tagggctttt cctaattccc gaatgaactt gataagtcaa ctcaaagata 4020 aatatatgtt tagatcatga gtaacgtgtg ataccttagg taaatttcac ttcgatatac 4080 atataagaaa tgttggtgta taggaaaaca caatttagac aatagtgtca atgtggtttg 4140 atttaaaagg tgcgattggt ataaaggaaa acatttttca gaatcaactc attttcctca 4200 aaattaagga taatgaattc ccttcaaaaa ttgaggaaaa catttttcaa aactctcatc 4260 caatttgaaa ttatatattt tttaaagaaa acatcgattt cgaaaaatat attcaatttc 4320 aaaattttat atattcacca ccaccccacc ccacccgatc atgccttcac cccccccccc 4380 ccccanaaaa aaaatagatt ttttttttaa aaaaatattt ttaatttcaa aatttcattt 4440 ctccatccct accctttacc ccccccccct accaaccctc tacccccctc ccaaaaaaga 4500 aaattaagtt tgtcttaaaa aatattttcg acttcaaatt tttatttttt cacccttacc 4560 tcgacccccg ccccccaaca cccaccccac cccactccat ctttaaagat aaattttcat 4620 tttgtttttt taaaaatatt tttaacctca aatttttatt ttttctaccc ctacgtcccc 4680 ctctccagtc cccttaccat ccctccagcc ccaccaaaaa aatatacttt aatttttaaa 4740 aaatattttc aactttaaat ttttattttt tcactcctaa cctcccgcac ccacccaccc 4800 ccgccagccc cccacccccc aaaaaaaatt attttcaatt tcaaaaatta gtttgtactc 4860 tagtaaaaat aaaagatatt tctcaaaaat atttttcatt cataaattaa acactaaaaa 4920 atattttcta ctcatcaacc aaacatgaaa aaacaaatca taaatctact tattttctaa 4980 aaaaaaaaca ttttcctaat taccaaacac accgaaaatc ttgaaagtgt agttccaagc 5040 ggataattaa tgtcactata gtgagttgta ctattataga ttgttgaaat aatatttaca 5100 aatattaaat tatactaatt gtacccaaaa aaaatgacat taaatttttt tatttactaa 5160 ctatgtattt tggaaataat ttttgtggta ggtgatgatt gcatctcaat tgtggatgga 5220 tctcagaagg tcttagccac tggcattact tgtggaccag gtcatggaat taggtaaaaa 5280 caaaataatt tcattatatt agtattatta tgctagtatt atcttatttt ttattatatt 5340 attagtgtta tttctctaat ttttattatc tttactttca ttacttttct ttctttaata 5400 tctttatcat tttatttttg tatatctttt gaactgttct gaaaaaattg tttttttatc 5460 gtttatatga aacaatctcc taccccacca aggtaagaaa taagtttttg ggtcaaacct 5520 cacttgcatg attattttct ttatcatatt cagattattt tatcaaaatt tataatttaa 5580 ttatgtaatt tttttttatt attattattt gtgcttagta ttggaagttt gggaggtgga 5640 aattcagaag ctcatgtgtc tgatattcat gtaaatggag ctaagcttta tgaaactaca 5700 aatggactta ggattaagac ttggccggta aattaattaa ttaattattt ttattaattt 5760 acaaatattc tttataatta atatacatat aattatattc ttgaattatt ttgtataggg 5820 aggatttgga agtgcaagca atattaagta tcaaaatgtg gttatgaata atgtcaaaaa 5880 tccaataatt atagaccaaa attattgtga tcaagctgat ggtccatgca aagctgaggt 5940 aattgaaaat gaatttaact tatatatatt aactatacga aaaaataatc tactttgtta 6000 aagcagatat cttatcgtat tttttagata attaatccgt tccattatgg gttgttagtt 6060 aagctatctt tagatagcca aatatggtaa attttttaat aatgtcgaca tatgtatgtt 6120 ataaaaatat ataacttaaa ctcgaacaaa aatgaatttt atttatataa catacttaat 6180 gtatagaata tttttatacc attagtgcaa tttgctacat catttggaca atatagtgtt 6240 ttaacttata aacaaaaata atttctcccc ttcaactttc ttaaaattca ataaaatccc 6300 catacaaaat attgtataat caaatttacc ccactttgaa aatgtaacat ataacgacat 6360 attgtacatt ataaagttgt gacggaatat ctatgacgat aatattaatg acagagttaa 6420 tatggtcgat tcataatatg attcaatcac aaacttgtga taatttcatt gatctcttaa 6480 tcacaaaaat atatttatac atttatagac tgactcggca gttgaagtga aaaatgtgat 6540 ttatcaaaat atcaaaggca caagtgcaac aaatgatgca ataagtatca agtgcagcaa 6600 aaaaattcca tgtgaaggaa ttttgatgga gaatgtgaaa ttgttaggag gaaatggtga 6660 aactccaaat ggtatttggg gaaatatcaa taatcttacg tgcaaaaatg ttttaccaga 6720 atgtcaaaaa aactcaaaaa ttgtataatt aagtttgata gagttaatta atgtttaata 6780 ggatattgta tagttataca tatgacaaat taagtgttag aatacataat tagcaaatga 6840 tttgtgataa atgatattct ttgtacacat gaaataa 6877 <210> 2 <211> 319 <212> PRT <213> Solanium lycopersicum <400> 2 Cys Ser Ser Ser His Val Val Asn Phe Val Val Ser Gln Asn Lys Lys 1 5 10 15 Tyr Leu Leu Lys Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Pro Cys Lys Ser Ser Ile 20 25 30 Thr Met Gln Ile Tyr Gly Thr Leu Leu Ala Ser Asp Asp Thr Ser Asp 35 40 45 Tyr Lys Lys Asp Ser Arg His Trp Leu Ile Phe Asp Ser Val Gln Lys 50 55 60 Leu Val Val Gly Gly Ala Gly Val Ile Asn Gly Asn Gly Lys Ile Trp 65 70 75 80 Trp Gln His Ser Cys Lys Ile Asn Lys Lys Leu Pro Cys Lys Val Ala 85 90 95 Pro Thr Ala Leu Thr Phe Tyr Lys Cys Asn Asn Leu Lys Val Lys Asp 100 105 110 Leu Lys Ile Glu Asn Ala Gln Gln Ile His Leu Leu Ile Glu Lys Cys 115 120 125 Val Gly Val Glu Val Thr Lys Leu Val Val Thr Ser Pro Glu Asn Ser 130 135 140 Pro Asn Thr Asp Gly Ile His Ile Thr Ser Thr Gln Asn Ile Gln Ile 145 150 155 160 Ser Asp Ser Thr Ile Ala Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ser Ile Val Asp 165 170 175 Gly Ser Gln Lys Val Leu Ala Thr Gly Ile Thr Cys Gly Pro Gly His 180 185 190 Gly Ile Ser Ile Gly Ser Leu Gly Gly Gly Asn Ser Glu Ala His Val 195 200 205 Ser Asp Ile His Val Asn Gly Ala Lys Leu Tyr Glu Thr Thr Asn Gly 210 215 220 Leu Arg Ile Lys Thr Trp Pro Gly Gly Phe Gly Ser Ala Ser Asn Ile 225 230 235 240 Lys Tyr Gln Asn Val Val Met Asn Asn Val Lys Asn Pro Ile Ile Ile 245 250 255 Asp Gln Asn Tyr Cys Asp Gln Ala Asp Gly Pro Cys Lys Ala Glu Thr 260 265 270 Asp Ser Ala Val Glu Val Lys Asn Val Ile Tyr Gln Asn Ile Lys Gly 275 280 285 Thr Ser Ala Thr Asn Asp Ala Ile Ser Ile Lys Cys Ser Lys Lys Ile 290 295 300 Pro Cys Glu Gly Ile Leu Met Glu Asn Val Lys Leu Leu Gly Gly 305 310 315

Claims

(a) SEQ ID NO. 2의 아미노산 서열과 적어도 60% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(b) SEQ ID NO. 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 55% 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열;
(c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 결합하는(hybridise) 상보적인 가닥의 뉴클레오티드 서열; 및
(d) 유전적 코드의 축퇴(degeneracy)에 의해 뉴클레오티드 서열(c)의 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리갈락투로나아제를 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제 1항에 있어서, SEQ ID NO. 1로부터 적어도 26의 인접한(contiguous) 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
식물의 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계, 및
제 1항에서 정의된 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 10의 인접한 서열의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 상기 식물의 핵산을 결합하는 단계
를 포함하는 식물 내의 DPG 대립 유전자(allele)를 검출, 분리, 증폭 및/또는 분석하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 DPG 대립 유전자는 ps-2-대립 유전자인 방법.
제 4항에 있어서, 상기 ps-2-대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C, A 또는 T를 갖는 대립 유전자이며, 바람직하게 상기 대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C를 갖는 대립 유전자인 방법.
제 1항에서 정의된 바와 같은 뉴클레오티드 서열로부터 적어도 10의 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마커-보조된 재배(maker-assisted breeding)에서 핵산 분자의 용도.
제 6항에 있어서, 상기 마커-보조된 재배는 ps-2-대립 유전자의 검출을 포함하는 용도.
제 7항에 있어서, 상기 ps-2-대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C, A 또는 T를 갖는 대립 유전자이며, 바람직하게 상기 대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C를 갖는 대립 유전자인 용도.
a) 제1식물을 ps-2-대립 유전자에 대해 동형접합체인 제2식물과 교배하는(crossing) 단계;
b) 상기 F1 세대 및 적어도 두 세대 나아간 세대를 제1 식물과 반복(recurrent) 부모로서 역교배하는(backcrossing) 단계; 및
c) b)에서 획득된 가장 먼 역교배된 세대를 적어도 한 세대에 대해 자가교배하는(selfing) 단계;
를 포함하며, 여기서 ps-2-대립 유전자에 대해 동형접합체인 식물을 선택하기 위해 단계 b) 및 c)의 적어도 하나에서 분자 마커를 사용하는, 비-열개(non-dehiscent) 꽃밥을 갖는 식물의 제조 방법.
제 9항에 있어서, 상기 분자 마커는 DPG 대립 유전자에 대해 특이적이며, 제 1항에서 정의된 바와 같은 폴리갈락투로나아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 일부로부터 100kb를 초과하지 않으며 식물의 게놈(genome) 내에 존재하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 분자 마커는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C, A 또는 T를 갖거나 검출하며, 이 중 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C를 갖는 것이 가장 바람직한 방법.
a) 식물 집합체(complex)의 종자의 돌연변이 유발 단계(mutagenising);
b) a)에서 획득한 돌연변이 유발된 종자의 식물을 재배하는 단계;
c) 임의로, b) 단계에서 획득한 식물을 적어도 한 세대동안 역교배하는 단계; 및
d) b) 또는 c)에서 획득한 식물을 DPG-대립 유전자 내 돌연변이 존재에 대해 스크리닝하는 단계
를 포함하는 DPG-대립 유전자 내 돌연변이를 갖는 식물의 제조 방법.
제 12항에 있어서, 상기 DPG-대립 유전자 내 돌연변이는 상기 대립 유전자가 ps-2-대립 유전자가 되도록 하는 방법.
제 13항에 있어서, 상기 ps-2-대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C, A 또는 T를 갖는 대립 유전자이며, 바람직하게 상기 대립 유전자는 DPG 유전자의 다섯번째 엑손의 3' 말단의 마지막 뉴클레오티드로서 C를 갖는 대립 유전자인 방법.
제 1항에서 정의된 바와 같은 DPG를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 단편 또는 이의 상보(complement)를 포함하는 핵산 구성체(construct)로 식물 세포를 변형시키는 단계를 포함하며,
여기서 식물 세포 내 핵산 구성체의 존재는 DPG 활성의 발현을 위치상 불임 및 비-열개 꽃밥에 영향을 미치는 수준까지 감소시키는, 비-열개 꽃밥을 갖는 유전자 변형 식물의 제조방법.
제 15항에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 식물 세포 내에서의 발현을 위해 작동적으로(operably) 프로모터에 연결되어 있고, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열의 발현은 RNA 개입(interference)에 의해 DPG 활성의 발현을 감소시키는 방법.
제 15항에 있어서, 상기 핵산 구성체는 동형접합 재조합용 구성체이며, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은 DPG 활성의 발현을 위치상 불임 및 비-열개 꽃밥에 영향을 미치는 수준까지 감소시키는 돌연변이를 포함하는 방법.
식물 세포 내에서의 발현을 위해 작동적으로(operably) 프로모터에 연결된, 제 1항에서 정의된 DPG 코딩 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 단편, 또는 이의 상보를 포함하는 구성체 핵산.
제 18항에 있어서, 상기 단편은 제 1항에서 정의된 DPG를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보에 대해 적어도 60%의 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열로부터 30 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 구성체 핵산.