JP5719983B2 - 新規ポリガラクツロナーゼ及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明は、植物育種の分野に関し、特にトマト植物の育種に関する。本発明は、古典的植物遺伝学及び分子植物遺伝学の両方の分野に及び、新規ポリガラクツロナーゼの配列、及びマーカー補助育種又はトランスジェニック植物における、例えば非裂開葯に起因する位置不稔表現型を有する植物を作出するための、それらの使用に関する。
高等植物では、成熟花粉が裂開（ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ）によって葯から放出され、裂開は、タペータム、隔壁及び最終的には口辺細胞において、一連の細胞の崩壊が逐次的に生じることからなる。タペータムの縮退後、内被細胞が肥大し、木化線維の束が沈着して、細胞壁の肥厚化が生じる。引き続いて、葯室を取り囲む内被細胞及び葯隔細胞の脱水及び収縮が口辺細胞において破壊力を生み出し、最終的に花粉放出を導く（Ｋｅｉｊｚｅｒ １９８７）。
最近、葯の裂開の分子制御の理解において進捗があり、これは、ジャスモン酸（ＪＡ）及びエチレンの関与の発見に主に関する。葯でのＪＡの合成における多様な工程に影響を与えるいくつかの変異体が、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）で同定された。観察された表現型は、葯の裂開の遅延を生じた（Ｓｃｏｔｔら、２００４による総説）。この現象におけるエチレンシグナリングの役割は、エチレン非感受性タバコ植物の葯の裂開における遅延を観察したＲｉｅｕら（２００３）により強調された。
ポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）は、最大のヒドロラーゼファミリーの１つに属する（Ｔｏｒｋｉら、２０００；Ｍａｒｋｏｖｉｃ及びＪａｎｅｃｅｋ、２００１）。ＰＧ活性は、広範な植物発生プログラム（Ｈａｄｆｉｅｌｄ及びＢｅｎｎｅｔｔ １９９８による総説）、とりわけ葯の裂開に関連することが示されている：ＰＧの活性は、トウモロコシ、タバコ、アブラナ及びアラビドプシスの葯の裂開帯において観察されている（Ｄｕｂａｌｄら １９９３；Ｓａｎｄｅｒら ２００１）。しかし、裂開過程におけるそれらの役割は、これまで詳細に研究されてこなかった。
本発明者らは最近、トマトにおいて非裂開葯を生じる位置不稔性−２（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ−２）遺伝子を詳細にマッピングした（Ｇｏｒｇｕｅｔら ２００６）。本発明の目的は、ｐｓ−２遺伝子のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びにマーカー補助育種又はトランスジェニック植物において、例えば非裂開葯に起因する位置不稔表現型を有する植物を作出するため及び／又は果実の熟化を変化させるためにこれらの配列が使用される方法、を提供することである。
定義
本説明において、他に示さない限り、本明細書中で使用される用語及び定義は、（メンデル）遺伝学において使用される用語及び定義であり、これに関しては、Ｍ．Ｗ．Ｓｔｒｉｃｋｂｅｒｇｅｒ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第２版（１９７６）、特に１１３−１２２頁及び１６４−１７７頁が参照される。本明細書中で言及する場合、「遺伝子」は一般に、生物（即ち、トマト植物）の生物学的特徴を決定する遺伝性の因子を意味し、「対立遺伝子」は、（二倍体）トマト植物中に存在する遺伝子対中の個々の遺伝子である。この文脈では、本明細書中で使用する場合の用語ｐｓ−２遺伝子又はｐｓ−２対立遺伝子は、本発明の位置不稔表現型を生じる又はそれに寄与することができる、裂開ポリガラクツロナーゼ（Ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ：ＤＰＧ）の対立遺伝子をいうことが理解される。したがって、本明細書中で使用する場合、ｐｓ−２遺伝子又はｐｓ−２対立遺伝子は、位置不稔性及び／又は非裂開葯の本発明の表現型を生じる又はそれに寄与することができる、任意の（ＤＰＧ）機能喪失対立遺伝子をいう場合がある。ＤＰＧ遺伝子の好ましい例は、本明細書中に記載されるトマト裂開ポリガラクツロナーゼ（Ｔｏｍａｔｏ Ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ：ＴＤＰＧ）遺伝子である。ｐｓ−２遺伝子又はｐｓ−２対立遺伝子の好ましい例は、ＴＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣを有する、本明細書中に記載される特定のトマトｐｓ−２対立遺伝子である。
ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）は、本明細書中では、ペクチン酸塩及び他のガラクツロナン中の１，４−α−Ｄ−ガラクトシドロニック結合のランダムな加水分解を触媒する酵素として理解される。ポリガラクツロナーゼは、ペクチン解重合酵素即ちペクチナーゼとも呼ばれる。ポリガラクツロナーゼ活性は、以前に記載されたように（Ｐａｒｅｎｉｃｏｖａら、１９９８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５１：７２−８０）、還元糖放出の比色検出によって定量的に決定され、それにより、１単位のポリガラクツロナーゼ活性は、０．２５％（ｗ／ｖ）の基質濃度で、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．２）中３０℃で、モデル基質としてポリガラクツロン酸（Ｓｉｇｍａ）から１分当たり１μモルの還元糖末端を放出できる酵素の量として規定される。
植物は、その遺伝子の同じ対立遺伝子を含む場合、その遺伝子について「ホモ接合型」と呼ばれ、その遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を含む場合、その遺伝子について「ヘテロ接合型」と呼ばれる。大文字の使用は、優性遺伝子（遺伝子の優性型）を示し、小文字の使用は劣性遺伝子を示す。したがって、「Ｘ，Ｘ」は、遺伝子又は特性Ｘについてホモ接合型の優性遺伝子型を示し、「Ｘ，ｘ」及び「ｘ，Ｘ」はヘテロ接合型の遺伝子型を示し、「ｘ，ｘ」はホモ接合型の劣性遺伝子型を示す。一般に知られるように、他の遺伝子及び／又は因子（例えば、複数の対立遺伝子、サプレッサー、共優性など）が（また）表現型の決定に役割を果たさない限り、ホモ接合型の劣性遺伝子型のみが、対応する劣性表現型を一般に提供し（即ち、特性又は形質「ｘ」を示す植物を生じる）、一方、ヘテロ接合型及びホモ接合型の優性遺伝子型は、対応する優性表現型を一般に提供する（即ち、特性又は形質「Ｘ」を示す植物を生じる）であろう。
通則として、ハイブリッド種子は、最も頻繁には異なる系統に属する２つの異なる親トマト植物を交雑することによって得られる。自体公知の栽培技術及び植物育種技術を使用して、高度に特異的な所望の特性をこのようなハイブリッドに提供でき、それにより、ハイブリッドを「設計」する、即ち、ハイブリッド植物に所定の遺伝性の特徴を付与することが可能になる。これは通常、ハイブリッド種子を提供するために交雑される２つの親系統（の特性）を適切に選択することによって達成される。これらは通常、数世代にわたる自家受精（自家受粉）によって得られた自殖系統であり、このような自殖系統もまた通常、別の（通常は所定の）自殖親系統と交雑した場合に所望の特性を有するハイブリッド子孫を提供するように、育種家によって具体的に「設計」されたものであろう。概して、このような親系統は、遺伝的にホモ接合型且つ同一であり（即ち、同系交配の結果として）、その結果、安定且つ信頼性のある様式で、遺伝的に均一な（たとえへテロ接合型でも）ハイブリッド系統の組合せを提供でき、親系統の特性を組み合わせることができるであろう。その際、一方では、交雑により、親系統由来の特定の形質を可能な限り純粋に種子に入れることが目的であるが、他方では、雑種強勢又は自殖増殖の公知の効果が使用され、とりわけ植物及び果実の成長並びにそれによる収量の増加に関する、改善された特性を提供できる。この雑種強勢効果は、使用される親系統が特定の遺伝的特性に無関係である場合に／無関係であることに起因して（即ち、親系統が遺伝的に「離れて存在する」場合に）得られる。ハイブリッドの形成を含む古典的栽培技術を使用する、一般的及び特にトマトにおける植物育種技術のさらなる記載については、公知の手引書（その内容は、参照により本明細書中に組み込まれる）が参照される。
本明細書中で使用する場合、用語「植物」には、植物全体若しくは任意の部分又はそれらの誘導物、例えば、植物細胞、植物プロトプラスト、トマト植物を再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物細胞凝集塊、及び植物中のインタクトな植物細胞、又は植物の一部（例えば、胚、花粉、胚珠、果実（例えば、収穫されたトマト）、花、葉、種子、根、根端など）が含まれる。
植物学の用語法：Ｌｉｎｎａｅｕｓは、植物学的分類の父とみなされている。彼は、現代のトマトをソラナム属（Ｓｏｌａｎｕｍ）として最初に分類したが、長年にわたってその学名はリコペルシコン・エスクレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）であった。同様に、現代のトマトの野生の近縁種は、リコペルシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）属内に分類されてきた（例えば、リコペルシコン・ペンネリ（Ｌ．ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）、リコペルシコン・ヒルスタム（Ｌ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、リコペルシコン・ペルビアナム（Ｌ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）、リコペルシコン・チレンス（Ｌ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ）、リコペルシコン・パルビフロラム（Ｌ．ｐａｒｖｉｆｌｏｒｕｍ）、リコペルシコン・ケミエレウスキィ（Ｌ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）、リコペルシコン・チースマニー（Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ）、リコペルシコン・セラシフォルメ（Ｌ．ｃｅｒａｓｉｆｏｒｍｅ）及びリコペルシコン・ピンピネリフォリウム（Ｌ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ））。過去数年間にわたって、トマトの研究者及び植物学者の間には、これらの種の名称を再分類するかどうか論争があった。現代のトマトに対して新たに提案された学名は、ソラナム・リコペルシカム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である。同様に、野生種の名称も変更され得る。リコペルシコン・ペンネリはソラナム・ペンネリ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｐｅｎｎｅｌｌｉｉ）とし、リコペルシコン・ヒルスタムはソラナム・ハブロカイテス（Ｓ．ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）とし、リコペルシコン・ペルビアナムはソラナム・‘Ｎペルビアナム’（Ｓ．‘Ｎ ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍｒ’）及びソラナム・‘カレヨンデヒュアイレス’（Ｓ．‘Ｃａｌｌｅｊｏｎ ｄｅ Ｈｕａｙｌｅｓ’）、ソラナム・ペルビアナム（Ｓ．ｐｅｒｕｖｉａｎｕｍ）並びにソラナム・コルネリオムエレリ（Ｓ．ｃｏｒｎｅｌｉｏｍｕｅｌｌｅｒｉ）に分け、リコペルシコン・パルビフロラムはソラナム・ネオリッキイ（Ｓ．ｎｅｏｒｉｃｋｉｉ）とし、リコペルシコン・ケミエレウスキィはソラナム・ケミエレウスキィ（Ｓ．ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉｉ）とし、リコペルシコン・チレンスはソラナム・チレンス（Ｓ．ｃｈｉｌｅｎｓｅ）とし、リコペルシコン・チースマニエ（Ｌ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）はソラナム・チースマニエ（Ｓ．ｃｈｅｅｓｍａｎｉａｅ）又はソラナム・ガラパゲンセ（Ｓ．ｇａｌａｐａｇｅｎｓｅ）とし、リコペルシコン・ピンピネリフォリウムはソラナム・ピンピネリフォリウム（Ｓ．ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｉｕｍ）とすることができる（Ｓｏｌａｎａｃｅａ Ｇｅｎｏｍｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ（２００５）Ｓｐｏｏｎｅｒ及びＫｎａｐｐ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｈｅｌｐ／ａｂｏｕｔ／ｓｏｌａｎｕｍ＿ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｈｔｍｌ）。
ｐｓ−２又はＤＰＧの遺伝子及び対立遺伝子を含む核酸配列又は断片は、配列番号１と、好ましくは中程度の、又はより好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で「ハイブリダイズする」それらの能力によっても規定され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、本明細書中で、少なくとも約２５ヌクレオチド、好ましくは約５０ヌクレオチド、７５又は１００ヌクレオチド、最も好ましくは約２００ヌクレオチド以上の核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液中約６５℃の温度でハイブリダイズすることを可能にし、約０．１Ｍ以下の塩を含む溶液、好ましくは０．２×ＳＳＣ又は同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液中で６５℃で洗浄する条件として規定される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩（即ち、少なくとも１０時間）実施され、好ましくは、洗浄は、少なくとも２回洗浄溶液を交換して、少なくとも１時間実施される。これらの条件は、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを通常は可能にするであろう。中程度の条件は、本明細書で、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは約２００以上のヌクレオチドの核酸配列が、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液中約４５℃の温度でハイブリダイズすることを可能にし、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ又は同程度のイオン強度を有する任意の他の溶液中で室温で洗浄する条件として規定される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩（即ち、少なくとも１０時間）実施され、好ましくは、洗浄は、少なくとも２回洗浄溶液を交換して、少なくとも１時間実施される。これらの条件は、５０％までの配列同一性を有する配列の特異的ハイブリダイゼーションを通常は可能にするであろう。当業者は、５０％と９０％との間で同一性が変動する配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件を変更することができるであろう。
本発明者らは最近、トマトにおいて非裂開葯を生じる位置不稔性−２（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ−２）遺伝子を詳細にマッピングした（Ｇｏｒｇｕｅｔら２００６）。本発明者らは今回、ポジショナルクローニングによってｐｓ−２遺伝子を単離した。ｐｓ−２遺伝子の引き続く特徴付けにより、その野生型遺伝子が新規ポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）をコードすること、及び遺伝子のコード配列中の一塩基変異が、非裂開葯に起因する位置不稔性の表現型を担うことが明らかになった。本発明者らは、この変異が、この遺伝子のイントロンスプライシング認識部位の１つに影響を与え、エキソンの１つを欠く異常なｍＲＮＡを生じることを見出した。本発明者らは、この新規ＰＧ遺伝子（以下、裂開ＰＧ（ＤＰＧ）と呼ぶ）が、成熟中の果実においても発現されることをさらに見出した。ジャスモン酸及びエチレンは、ＤＰＧの発現の制御において役割を果たし、ＤＰＧは、果実の熟化の過程に関与する。
したがって、第１の態様において、本発明は、ポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、好ましくは単離された核酸分子に関する。ポリガラクツロナーゼ活性が決定され得、この活性は、本明細書中で上に規定される。ポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択され得る：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも５５、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び（ｄ）遺伝暗号の縮重により（ｃ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列。
本発明の好ましいヌクレオチド配列は、ソラナム属内の種由来である。より好ましくは、ヌクレオチド配列は、ソラナム・リコペルシカム複合体内の種（例えば、ソラナム・リコペルシカム、ソラナム・ケミエレウスキィ、ソラナム・ハブロカイテス、ソラナム・ピンピネリフォリウム、ソラナム・ネオリッキイ及びソラナム・ペンネリが含まれる）由来である。或いは、ヌクレオチド配列はソラナム・メロンゲーナ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）由来であってもよい。本発明の好ましいヌクレオチド配列はポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするが、１以上のヌクレオチドの置換、挿入及び欠失のうち少なくとも１つを含み、非活性のポリガラクツロナーゼが発現され得る、このヌクレオチド配列の操作及び変異誘発されたバージョンを含む対立遺伝子が、明白に本発明中に含まれる。
さらに好ましい本発明の核酸分子は、ポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその不活性な対立遺伝子の一部を含む分子である。核酸分子は好ましくは、ポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその不活性な対立遺伝子又はより好ましくは配列番号１の、連続する少なくとも１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０又は５０ヌクレオチドを含む。核酸分子は、このような連続ヌクレオチドが一続きではないものを含むこともでき、互いに直接連結されていても他の配列によって分離されていてもよいことが理解される。
第２の態様において、本発明は、植物、好ましくはソラナム属植物、より好ましくはソラナム・リコペルシカム複合体の植物、又はソラナム・メロンゲーナ植物において、ＤＰＧ対立遺伝子を検出、単離、増幅及び／又は分析する方法に関する。この方法は好ましくは、上記植物の核酸を含む試料を提供するステップと、この植物の核酸を、ポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の連続する少なくとも１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズさせるステップとを少なくとも含み、このヌクレオチド配列は、以下からなる群より選択され得る：（ａ）配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも５５、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；（ｃ）その相補鎖が（ａ）又は（ｂ）のヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び（ｄ）遺伝暗号の縮重により（ｃ）のヌクレオチド配列の配列と異なるヌクレオチド配列。連続する少なくとも１０ヌクレオチドのヌクレオチド配列は、（ａ）〜（ｄ）で規定したヌクレオチド配列の対立遺伝子からも取得でき、これには、１以上のヌクレオチドの置換、挿入及び欠失のうち少なくとも１つを含み、非活性のポリガラクツロナーゼが発現され得る、このヌクレオチド配列の操作及び変異誘発されたバージョンが含まれることが理解される。より好ましくは、サンプリングされた植物の核酸とのハイブリダイゼーションのための核酸分子は、先に規定したヌクレオチド配列の連続する少なくとも１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０又は５０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。ハイブリダイゼーションのための核酸分子が一本鎖分子である場合、これは、先に規定したヌクレオチド配列の相補鎖（即ち、反対側の鎖）もまた含み得ることが理解される。
植物、好ましくはソラナム属植物における特異的核酸配列（例えばＤＰＧ対立遺伝子）の検出、単離、増幅及び／又は分析のための方法は、検出、単離、増幅及び／又は分析すべき試料中の核酸に対する、所定の配列を含む核酸分子（即ち、ハイブリダイゼーションのための核酸分子）の配列特異的ハイブリダイゼーションに依存する。したがって、このような方法では、ハイブリダイゼーションのための核酸分子は、ＤＰＧ対立遺伝子、好ましくはソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）のＤＰＧ対立遺伝子とハイブリダイズできる任意の核酸分子であり得る。この分子は、プローブ（例えばハイブリダイゼーションプローブ）であってもよく、伸長即ち増幅反応においてポリメラーゼにより伸長されるプライマーであってもよい。
所定の配列を含む核酸分子の配列特異的ハイブリダイゼーションに依存する特異的ヌクレオチド配列の検出、単離、増幅及び／又は分析のための一般的方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、２００１、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。より具体的には、本発明の特異的ＤＧＰ対立遺伝子配列の検出、単離、増幅及び／又は分析のための方法には、ＰＣＲ増幅（米国特許第４，６８３，１９５号；及び同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．、１９９２）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｇｉｂｂｓ、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：１２４２７−２４４８）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドスクリーニング法（ＡＳＯ；Ｓａｌｋｉら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３−１６６）、リガーゼ媒介性の対立遺伝子検出法（例えば、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ；１９８８、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７−１０８０）又はライゲーション増幅反応（Ｗｕら、１９８９、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０−５６９；Ｂａｒａｎｙ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１８９−１９３））、変性勾配ゲル電気泳動（Ｅｒｌｉｃｈ編、１９９２、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの第７章）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、一本鎖コンフォメーション多型分析（Ｏｒｉｔａら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２７６６−２７７０）、ミスマッチ塩基対の示差的な化学的開裂（Ｇｒｏｍｐｅら、１９９１、Ａｍ．Ｊ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４８：２１２−２２２）、ミスマッチ塩基対の酵素的開裂（Ｎｅｌｓｏｎら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１１−１８）、ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）などの系、蛍光の触媒的放出に依存する等温増幅を含むインベーダーアッセイ（ｗｗｗ．ｔｗｔ．ｃｏｍにてＴｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、任意選択で３Ｄプーリングストラテジー（例えば、ｗｗｗ．ｋｅｙｇｅｎｅ．ｃｏｍでＫｅｙｐｏｉｎｔ（商標）技術を参照のこと）と組み合わせた、数千の個体における所定の遺伝子座について配列情報を生成する大量並列配列決定（例えば、ＧＳ ２０ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで実施されるＲｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのもの）などが含まれ得る。
本発明の好ましい方法は、ｐｓ−２対立遺伝子の検出、単離、増幅及び／又は分析のための方法であり、それにより好ましくは、ｐｓ−２対立遺伝子は、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣ、Ａ又はＴを有する対立遺伝子であり、好ましくは、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣを有する対立遺伝子である。この位置は、配列番号１の３７７２位のＧに対応する。或いは、ＤＰＧ対立遺伝子に特異的な分子マーカーが開発され得る。「分子マーカー」は、本明細書中で、特定の対立遺伝子（例えば、本明細書中で規定したＤＰＧ対立遺伝子又はｐｓ−２対立遺伝子）の存在又は非存在を（直接的又は間接的に）示す、核酸配列又はそれらのセットをいうことが理解される。分子マーカーの存在又は非存在は、広範な種々の分子アッセイ又は試験で検出でき、このアッセイ又は試験には、例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリント（ＤＡＦ）、配列特性化増幅領域（ＳＣＡＲ）及び増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）が含まれる。ＤＰＧ対立遺伝子に特異的な分子マーカーは、本明細書中で、植物、好ましくはソラナム（Ｓｏｌａｎｕｍ）植物のゲノム内に存在する、本明細書で上に規定したポリガラクツロナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその一部由来の、１００、５０、２０、１０、５又は２ｋｂ以下のマーカーとして理解される。このような分子マーカーは、ｐｓ−２対立遺伝子を含む特異的ＤＰＧ対立遺伝子の検出のために使用され得る。
第３の態様において、本発明は、マーカー補助育種における、本明細書中で上に規定したハイブリダイゼーションのための核酸分子の使用に関する。好ましくは、マーカー補助育種は、ｐｓ−２対立遺伝子の検出を含む。ｐｓ−２対立遺伝子は、植物、好ましくはソラナム属植物、より好ましくはソラナム・リコペルシカム複合体の植物、又はソラナム・メロンゲーナ植物のＤＰＧ対立遺伝子であって、ホモ接合型の場合には非裂開葯に起因する位置不稔性表現型を生じるものとして、本明細書中で理解される。ｐｓ−２対立遺伝子は通常、この対立遺伝子についてホモ接合型である植物において、位置不稔性及び非裂開葯を防止するには不十分なＤＰＧ活性しか発現されない対立遺伝子であろう。より好ましくは、マーカー補助育種は、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣ、Ａ又はＴを有するｐｓ−２対立遺伝子の検出を含み、このうち、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣが最も好ましい。
第４の態様において、本発明は、非裂開葯を有する植物を作出する方法に関する。好ましくは、この植物は、ソラナム属植物、より好ましくはソラナム・リコペルシカム複合体の植物、又はソラナム・メロンゲーナ植物である。この植物は、好ましくは、位置不稔性の表現型を有する。この方法は好ましくは、（ａ）第１の植物をｐｓ−２対立遺伝子についてホモ接合型である第２の植物と交雑するステップ；（ｂ）Ｆ１世代及びさらなる世代を、反復親である第１の植物と少なくとも１世代（好ましくは少なくとも２世代）にわたって戻し交雑するステップ；及び（ｃ）ｂ）で得られた最後の戻し交雑世代を、少なくとも１世代（好ましくは少なくとも２世代）にわたって自殖するステップを含み、ステップｂ）及びｃ）の少なくとも１つにおいて分子マーカーが使用して、ｐｓ−２対立遺伝子についてホモ接合型である植物を選択する。好ましくは、この方法では、分子マーカーは、本明細書中で規定するＤＰＧ対立遺伝子に特異的であり、より好ましくは、このマーカーは、本明細書中で規定するｐｓ−２対立遺伝子に特異的なマーカーである。最も好ましくは、この分子マーカーは、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣ、Ａ又はＴであるか又はこれらを検出し、そのうち、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣが最も好ましい。
第５の態様において、本発明は、ＤＰＧ対立遺伝子中に変異又は遺伝子改変を有する植物を作出する方法に関する。好ましくは、この植物は、ソラナム属植物、より好ましくはソラナム・リコペルシカム複合体の植物、又はソラナム・メロンゲーナ植物である。変異又は遺伝子改変は、ＴＩＬＬＩＮＧ（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｌｏｃａｌ Ｌｅｓｉｏｎｓ ＩＮ Ｇｅｎｏｍｅｓ）の技術を使用して、ＤＰＧをコードするヌクレオチド配列／遺伝子の遺伝子座中に導入され得る。ＴＩＬＬＩＮＧのための方法は当該分野で周知である（ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８（４）：４５５−７；Ｓｔｅｍｐｌｅ、２００４、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．５（２）：１４５−５０による総説）。ＴＩＬＬＩＮＧ変異誘発技術は、ｐｓ−２対立遺伝子を含むＤＰＧ遺伝子の変異誘発された改変体を生成及び／又は同定し、最終的に単離するために有用である。ＴＩＬＬＩＮＧは、このような変異体改変体を保有する植物の選択をも可能にする。ＴＩＬＬＩＮＧは、高密度変異誘発をハイスループットスクリーニング方法と組み合わせる。ＴＩＬＬＩＮＧにおいて典型的にたどられるステップは以下である：（ａ）メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）又はＮ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）などによる変異誘発；（ｂ）変異誘発した種子からの植物の成長、及び任意選択で、少なくとも１世代にわたる植物の戻し交雑；（ｃ）植物の組織試料からのＤＮＡの調製、及び任意選択で個体からのＤＮＡのプール；（ｄ）目的の領域（即ちＤＰＧ遺伝子）の、例えば先に規定したようなプライマーを使用した、ＰＣＲ増幅；（ｅ）変異体ＰＣＲ産物の検出；（ｆ）変異体個体の同定；及び（ｈ）任意選択で、変異体ＰＣＲの配列決定。最初に、この方法において、ステップ（ｅ）及び任意選択でステップ（ｆ）における変異体ＰＣＲ産物の検出を、変性及びヘテロ二重鎖を形成させるアニーリング、及び引き続くＤＨＰＬＣ（変性高速液体クロマトグラフィー）（ＭｃＣａｌｌｕｍら、２０００、上述）によるヘテロ二重鎖の検出によって実施した。この方法は、変異を同定するために制限酵素Ｃｅｌ−１をゲルベースのシステムと組み合わせて使用することにより、より高速にされた（Ｃｏｌｂｅｒｔら、２００１、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２６（２）：４８０−４）。ＴＩＬＬＩＮＧの方法において使用され得る、標的ＤＰＧ遺伝子中の一塩基変異の検出又は同定のための他の方法には、例えば、既に記載されているＤＮＡの再配列決定（例えば、Ｓｌａｄｅら、２００５、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（１）：７５−８１を参照のこと）、又は任意選択で３Ｄプーリングストラテジー（例えばｗｗｗ．ｋｅｙｇｅｎｅ．ｃｏｍのＫｅｙｐｏｉｎｔ（商標）技術を参照のこと）と組み合わせた、数千の個体における所定の遺伝子座について配列情報を生成する大量並列配列決定（例えば、ＧＳ ２０ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで実施されるＲｏｃｈｅ／４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのもの）が含まれる。変異誘発は、放射線又はＥＭＳなどの化学変異原によって実施され得る（Ｌｉｇｈｔｎｅｒ及びＣａｓｐａｒ、１９９８、「アラビドプシスの種子変異誘発（Ｓｅｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｐａｔｅｒ及びＪ．Ｓａｌｉｎａｓ編）、９１−１０３頁．Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）又はＥＮＵ（Ｄｒａｐｅｒら、２００４、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００４；７７：９１−１１２）。ＤＰＧ対立遺伝子中に変異を有する植物を作出するための好ましい方法は、好ましくは少なくとも、（ａ）植物の種子を変異誘発するステップ；（ｂ）ａ）で得られた変異誘発種子の植物を成長させるステップ；（ｃ）任意選択で、ｂ）で得られた植物を少なくとも１世代にわたって戻し交雑するステップ；及び（ｄ）ｂ）又はｃ）で得られた植物をＤＰＧ対立遺伝子中の変異の存在についてスクリーニングするステップを含む。好ましくは、この植物は、ソラナム属植物、より好ましくはソラナム・リコペルシカム複合体の植物、又はソラナム・メロンゲーナ植物である。好ましくは、ＤＰＧ対立遺伝子中の変異は、その対立遺伝子をｐｓ−２対立遺伝子にする。より好ましくは、このｐｓ−２対立遺伝子は、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣ、Ａ又はＴを有する対立遺伝子であり、最も好ましくはＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣを有する対立遺伝子である。
第６の態様において、本発明は、非裂開葯を有するトランスジェニック植物、好ましくはソラナム属植物を作出する方法に関する。非裂開葯を有するトランスジェニック植物は、アンチセンス、センス抑制又はＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）核酸構築物の植物中への導入による、又は相同組換えによるＤＰＧ遺伝子のノックアウトによる、ＤＰＧ遺伝子のサイレンシングなどを含む種々の形で得ることができる。したがってこの方法は、本明細書中で先に規定したＤＰＧをコードするヌクレオチド配列の少なくとも断片のヌクレオチド配列を含む核酸構築物で植物細胞を形質転換するステップを少なくとも含み、植物細胞におけるこの核酸構築物の存在は、位置不稔性及び非裂開葯をもたらすレベルまで、ＤＰＧ活性の発現を減少させる。非裂開葯を有する植物は、当業者に自体公知の方法により、形質転換された植物細胞又はこのような形質転換された細胞を含む植物から誘導され得る。
したがって、好ましい実施形態において、核酸構築物中のヌクレオチド配列は、植物細胞（例えば、ソラナム属細胞）中での発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、このヌクレオチド配列の発現は、ＲＮＡ干渉によりＤＰＧ活性の発現を減少させる。遺伝子サイレンシングのための方法及び核酸構築物は、米国公開公報第２００７０１３０６５３号、米国公開公報第２００７００７４３１１号及びそれらに引用された参考文献中に記載されている。したがって、本発明は、植物細胞中での発現のためのプロモーターに作動可能に連結された、本明細書中で先に規定したＤＰＧをコードするヌクレオチド配列の断片を少なくとも含む構築物である核酸分子に関する。この核酸構築物において、断片は好ましくは、本明細書中で先に規定したＤＰＧをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも６０、７０、８０、９０、９５又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列の、連続する３０、６０、１００、２００又は５００ヌクレオチドの配列或いはそれらの相補体を含み、より好ましくは、ＴＤＰＧをコードするヌクレオチド配列は配列番号１である。
別の好ましい実施形態において、非裂開葯を有するトランスジェニック植物は、相同組換えによるＤＰＧ遺伝子のノックアウトにより得ることができる。この方法では、核酸構築物は好ましくは、相同組換えのための構築物であり、このヌクレオチド配列は好ましくは、位置不稔性及び非裂開葯をもたらすレベルまで、ＤＰＧ活性の発現を減少させる変異を含む。この変異は、コード配列及び／又はプロモーター配列の完全な欠失、或いは選択マーカー又はＤＰＧ遺伝子を不活化する他の配列の挿入などを含む、最も広い意味での変異であり得る。相同組換えは、規定され選択された位置での、選択された核酸のゲノム中への導入を可能にする。植物において相同組換えを実施するための方法は、モデル植物（Ｏｆｆｒｉｎｇａら、１９９０ ＥＭＢＯ Ｊ．９（１０）：３０７７−８４）だけでなく、農作物、例えばイネ（Ｉｉｄａ及びＴｅｒａｄａ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４年４月；１５（２）：１３２−８）についても記載されている。したがって、標的化される核酸は好ましくは、内在性ＤＰＧ遺伝子を置換するために使用される欠損型ＤＰＧ対立遺伝子（例えば、ｐｓ−２対立遺伝子）である。
非裂開葯及び／又は位置不稔表現型を有する本発明の植物は、自家受精を回避又は減少させることにより、よりコスト効率のよいハイブリッド植物の作出を可能にするという利点を有する。ハイブリッドの作出は、ＣＭＳ、遺伝的不稔性又は位置不稔性などの雄性不稔の使用を含み得る。一方では望ましくない自家受精を減少又は防止するが、他方ではそのように求められる場合には葯の（手動での）開放又は損傷による自己受精が可能であるので、位置不稔性が好ましい。したがって、本発明のＤＰＧ対立遺伝子は、非裂開葯に起因した位置不稔表現型（雄性親の表現型に依存する）を有しても有さなくてもよいハイブリッドの作出の間に同系交配を防止するための道具として使用され得る。さらに、非裂開葯及び／又は位置不稔表現型は、（自家）受精を回避又は減少させ、それにより種子なし表現型を向上させることにおいて、種子なし果実の作出において有利に適用され得る。
本発明は、トマト植物によって例示されてきたが、本発明は、ＤＰＧ核酸、ｐｓ−２対立遺伝子、及びすべての市販の重要な農作物の（トランスジェニック）植物（例えば、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）（食用作物のレタス、チコリ、アーティチョーク、ヒマワリ、ヤーコン、ベニバナが含まれる）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）（一般にウリ類（ｇｏｕｒｄ）又はウリ科植物（ｃｕｃｕｒｂｉｔ）として知られ、キュウリ、カボチャ（ｓｑｕａｓｈ）（カボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ）を含む）、ヘチマ、メロン及びスイカなどの作物が含まれる）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）（スウェーデンカブ（ｓｗｅｄｅ）、カブ、カブカンラン、キャベツ、芽キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カラシ種子及びアブラナが含まれる）、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓ）作物（乾燥マメ、乾燥ソラマメ、乾燥エンドウ、ヒヨコマメ、ガルバンゾ、チャナダル、乾燥ササゲ（ｃｏｗｐｅａ）、ササゲ（ｂｌａｃｋ−ｅｙｅｄ ｐｅａ）、ササゲ（ｂｌａｃｋｅｙｅ ｂｅａｎ）、キマメ（ｐｉｇｅｏｎ ｐｅａ）、キマメ（ｔｏｏｒ）、キマメ（ｃａｊａｎ ｐｅａ）、キマメ（ｃｏｎｇｏ ｂｅａｎ）、レンティル、バンバララッカセイ（ｂａｍｂａｒａ ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ）、アースピー（ｅａｒｔｈ ｐｅａ）、ベッチ、コモンベッチ、ルピナス、ダイズ、ラッカセイが含まれる）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）（ホウレンソウ）、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）（タマネギ、セイヨウネギ）、セリ科（Ａｐｉａｃｅａｅ）（ニンジン）、穀類作物（イネ、オオムギ、コムギ、オートムギ、トウモロコシ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）（トマト、コショウ、ナスが含まれる）が含まれる）を作出するための方法を含むことが理解される。
本明細書及び特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその活用は、その非限定的な意味で使用され、この語の後に来る事項が含まれるが、具体的に言及されていない事項が排除されないことを意味する。さらに、不定冠詞「１つの（ａ又はａｎ）」による要素に対する言及は、要素が１つ及び１つだけ存在することを文脈が明確に要求しない限り、１より多い要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「１つの（ａ又はａｎ）」は通常、「少なくとも１つ」を意味する。
ｐｓ−２ＡＢＬ及び野生型（Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）の葯の顕微鏡観察を示す図である。ａ：トルイジンブルーで染色した、後期花芽（ＦＢ）、初期開花前（ＰＡ）の葯の断面。矢印は、ＷＴ及びｐｓ−２ＡＢＬの隔壁細胞中に見出され得る結晶をさす。ｓ：隔壁；ｓｔ：口辺細胞；ｐ：花粉。ｂ：トルイジンブルーで染色した開花時の葯の断面。矢印は、ＷＴにおける葯の開放及びｐｓ−２ＡＢＬにおける閉じたままの口辺細胞を示す。ｃ：ＳＥＭにより観察した開花時の葯円錐の縦断面。矢印は、ＷＴにおける葯の縦方向の開放及びｐｓ−２ＡＢＬにおける未開放の葯を示す。 遺伝子マップから候補遺伝子への、ｐｓ−２遺伝子のクローニングを示す図である。ａ：組換えＦ２集団において作成された遺伝子マップ（ｐｓ−２ＡＢＬ×ソラナム・ピンピネリフォリウム；Ｇｏｒｇｕｅｔら、２００６）。白字は、各マーカー間の組換え体植物の数である。ｂ：物理マップ：点線の矢印は、ＢＡＣのコンピュータアンカリングを示す。実線の矢印は、分子マーカーによるＢＡＣのアンカリングを示す（Ｓ：ＳＰ６；Ｔ：Ｔ７）。ｃ：ＢＡＣクローン１４３Ｍ１５上のＯＲＦの遺伝子位置。ｄ：候補遺伝子ＯＲＦ４の構造。ローマ数字を伴う着色円柱はエキソンを示す。推定ＴＡＴＡボックスの位置は配列の開始点に青の逆三角形で示され、ＰｏｌｙＡの位置は配列の終点に緑の菱形で示される。 ｐｓ−２ＡＢＬ及び栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒからの開花後の葯円錐由来のＲＮＡに対して実施したＲＴ−ＰＣＲを示す図である。 Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ（ＷＴ）及びｐｓ−２ＡＢＬの葯における、ＯＲＦ４のエキソンＩＶとエキソンＶＩとの間のイントロンスプライシングを示す図である。 ２０の被子植物及び１つの裸子植物のＰＧのアミノ酸配列についての系統樹を示す図である。この系統樹は、（樹の重みを使用する）３２９６の樹の５０％多数決合意の結果である。ＰＧ配列は、十分に特徴付けられたクレードＡ及びＢとして同定された２つの主要なクレードに分かれる。候補タンパク質（ＴＤＰＧ）はクレードＢの一部である。 ＴＦＰＧ、ＯＲＦ４及びｐｓ−２（ＯＲＦ４の変異体）のＰｆａｍ ＧＨ２８ドメインのアラインメントを示す図である。カラーコードは、ＴＦＰＧとＯＲＦ４との間の比較についてのみ有効である：反転した色は、同一のアミノ酸である。灰色は、保存的置換である。太い下線は、Ｒａｏら（１９９６）により規定されたポリガラクツロナーゼの４つの保存されたドメインである。 ＯＲＦ４の組織特異的発現を示す図である。多様な組織由来のＭｏｎｅｙｍａｋｅｒのｃＤＮＡを、定量的ＰＣＲ分析用のプライマーを使用するＰＣＲ増幅に供した。ＭｏｎｅｙｍａｋｅｒのゲノムＤＮＡを、汚染についてのコントロールとして使用した。１：葉離層帯；２：花離層帯；３：開花時の葯；４：成熟段階の果実。 ＴＤＰＧが関与する、トマトにおける葯の裂開及び果実成熟のホルモン制御に関する単純化されたモデルを示す図である。
（例１）
１．１ 材料及び方法
１．１．１ 植物材料
ｐｓ−２ＡＢＬ（真の高度育種系統（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌｉｎｅ）ソラナム・リコペルシカム、ｐｓ−２変異についてホモ接合型）とソラナム・ピンピネリフォリウムとの間の交雑から作製されたＦ２組換え体サブ集団を、遺伝子マッピングのために使用した。ｐｓ−２に関して分離しているこの集団は、ｐｓ−２遺伝子座領域における１４６のＦ２植物組換え体からなる（Ｇｏｒｇｕｅｔら、２００６）。
別の１７６のＡＢＬ（そのうち８つはｐｓ−２／ｐｓ−２である）を使用して、同定されたＳＮＰとｐｓ−２遺伝子座との間の関連を試験した。
ｐｓ−２ＡＢＬ及び栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒの葯を、顕微鏡観察に使用した。
１．１．２ 顕微鏡法
植物材料を、４％のパラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）中で４℃で２４時間固定した。走査型電子顕微鏡法のための試料を、Ｄｏｒｎｅｌａｓら（２０００）に記載されたように処理し、Ｏｒｉｏｎ Ｆｒａｍｅｇｒａｂｂｅｒ（Ｍａｔｒｏｘ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕｎｔｅｒｈａｃｈｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してデジタル画像を得た。光学顕微鏡法のための試料を、Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ ７１００（Ｈｅｒｅａｕｓ Ｋｕｌｚｅｒ、Ｗｅｈｒｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に包埋し、トルイジンブルーで染色し、Ｅｕｐａｒａｌ（Ｃｈｒｏｍａ−Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｋｏｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にマウントした。
１．１．３ ＢＡＣライブラリースクリーニング及びコンティグ構築
本発明者らは、栽培品種アクセッションＨｅｉｎｚ １７０６のゲノムＤＮＡから構築したトマトＨｉｎｄＩＩＩ ＢＡＣライブラリーを使用した。Ｈｅｉｎｚライブラリーは、１１４．５ｋｂの平均挿入物サイズを有する１５ゲノム相当物である（Ｂｕｄｉｍａｎら、２０００）。ＢＡＣライブラリーのスクリーニングを、最初に植物プールに対して、次いで個体に対して、ＰＣＲ増幅によって実施した。次いで、ポジティブＢＡＣクローンのプラスミドＤＮＡを単離し、さらなる分析に使用した。
ポジティブＢＡＣクローンのＢＡＣ末端配列を、ＳＧＮデータベースから得た（Ｍｕｅｌｌｅｒら ２００５）。ＣＡＰＳ又はｄＣＡＰＳマーカーへのＢＡＣ末端配列の変換を、Ｇｏｒｇｕｅｔら（２００６）に記載されたとおりに実施した。ＢＡＣ末端配列のＰＣＲマーカーの詳細を表１に示す。
個々のＢＡＣクローンのフィンガープリントパターンを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＴａｑＩ酵素の組合せを使用して、本質的にＢｒｕｇｍａｎｓら（２００６）に記載されたとおりに生成した。
１．１．４ ＢＡＣ ＤＮＡの配列決定及び分析
ＢＡＣクローン１４３Ｍ１５のサイズを、パルスフィールドゲル電気泳動によって推定した。ＢＡＣクローン１４３Ｍ１５を、Ｇｒｅｅｎｏｍｉｃｓ（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によるショットガン配列決定法を介して配列決定した。ＢＡＣ配列上に同定された候補遺伝子由来のＰＣＲマーカーを、Ｇｏｒｇｕｅｔら（２００６）によって記載されたとおりに生成した。推定遺伝子を同定するために、最終ＢＡＣ ＤＮＡ配列を、ＳＧＮからのトマトＵｎｉｇｅｎｅデータベース（Ｍｕｅｌｌｅｒら、２００５）及びＴＡＩＲからのアラビドプシス遺伝子モデルデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ；Ｈｕａｌａら、２００１）に対して、１Ｅ−１０の有意性閾値を用いて、ＳＧＮのＴＢＬＡＳＴＸインターフェース（Ｍｕｅｌｌｅｒら、２００５）を使用して走査した。Ｇｏｒｇｕｅｔら（２００６）に記載されたとおりに、推定ＯＲＦ配列に基づくＰＣＲマーカーを生成し、組換え体集団に対してスクリーニングした。これらのＰＣＲマーカーの詳細を表１に示す。
１．１．５ 候補遺伝子の分析及び系統学的分析
約９００ｂｐの産物を生じる数個の逐次重複プライマー対を使用して、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ及びｐｓ−２ＡＢＬにおいて、ＯＲＦ４の完全ゲノムＤＮＡ配列、並びにそれぞれプロモーター及び遺伝子ターミネーターを含む上流及び下流の配列を増幅し、配列決定した。Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ及びｐｓ−２ＡＢＬの得られたＤＮＡ配列を、ＤＮＡＳｔａｒでアセンブルした。Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ遺伝子発見ソフトウェアを使用して、候補遺伝子の推定エキソン及びイントロンを同定した。
既知の組織発現を有するトマトポリガラクツロナーゼタンパク質の配列、並びに候補タンパク質を用いたタンパク質ＢＬＡＳＴ検索のベストヒットを選択し、系統学的分析を実施した。選択したタンパク質配列のＰｆａｍ Ｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ２８ドメインのみを、分析に使用した。各タンパク質配列のＰｆａｍ ＧＨ２８ドメインを、ＮＣＢＩのタンパク質Ｂｌａｓｔインターフェースを用いて同定した。Ｐｆａｍ ＧＨ２８ドメインの選択したアミノ酸配列を、ＣｌｕｓｔａｌＷマルチ配列アラインメントソフトウェア（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９９４）を使用してアラインした。
ＰＡＵＰソフトウェアパッケージバージョン４（Ｓｗｏｆｆｏｒｄ ２００２）を使用して、最大節約（１０００のブートストラップ複製及び２５０の追加配列複製）を用いて５０％多数決合意系統樹を構築した。ヒマラヤスギＰＧタンパク質配列を使用し、アウトグループとして規定した。
アミノ酸配列及びそれらのタンパク質識別番号は以下のとおりであった：キウイ果実（ＡＡＣ１４４５３；Ａｔｋｉｎｓｏｎ及びＧａｒｄｎｅｒ、１９９３）、ブドウ果実（ＡＡＫ８１８７６；Ｎｕｎａｎら、２００１）、ダイズ鞘（ＡＡＬ３０４１８；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、２００２）、モモ果実（ＣＡＡ５４４４８；Ｌｅｓｔｅｒら、１９９４）、リンゴ果実（ＡＡＡ７４４５２；Ａｔｋｉｎｓｏｎ、１９９４）、洋ナシ果実（ＢＡＣ２２６８８：Ｈｉｗａｓａら、２００３）、アラビドプシス裂開帯ＡＤＰＧ１（ＣＡＡ０５５２５；Ｓａｎｄｅｒら、２００１）、アブラナ裂開帯ＲＤＰＧ１（ＣＡＡ６５０７２；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９６）、アブラナ鞘（ＣＡＡ９０２７２；Ｊｅｎｋｉｎｓら、未公開）、カブ長角果隔膜乾燥（ＣＡＤ２１６５１；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇａｃｉｏら、２００４）、ピーマン果実（ＢＡＥ４７４５７；Ｏｇａｓａｗａｒａ Ｓ及びＮａｋａｊｉｍａ Ｔ、未公開）、トマト果実ＴＦＰＧ（ＣＡＡ３２２３５；Ｂｉｒｄら、１９８８）、トマト雄ずい（ＡＡＣ７０９５１；Ｈｏｎｇ及びＴｕｃｋｅｒ、２０００）、トマト離層帯ＴＡＰＧ１、２、４、５（ＡＡＣ２８９０３、ＡＡＢ０９５７５、ＡＡＢ０９５７６、ＡＡＣ２８９０６；Ｈｏｎｇ及びＴｕｃｋｅｒ、１９９８）、トマト創傷葉（ＡＡＤ１７２５０；Ｂｅｒｇｅｙら、１９９９）及びトマト種子（ＡＡＦ６１４４４；Ｓｉｔｒｉｔら、１９９９）。
１．１．６ 総ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成及び定量的ＰＣＲ分析：
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離した。１回のＲＮＡ単離反応当たり、５０ｍｇと１００ｍｇとの間の各組織（葯、果実、花離層帯及び葉離層帯）を使用した。ＤＮａｓｅ Ｉ処理（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）後、ｃＤＮＡの合成のため、１試料当たり総ＲＮＡを１μｇだけ使用した。第１鎖のｃＤＮＡテンプレートを、プライマーとしてランダムヘキサマーを使用し、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ（商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成した。フォワードプライマー：ＴＡＧＣＴＣＣＡＡＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＡＴ（第１エキソン上に位置する、開始コドンの４７ヌクレオチド下流で開始する）及びリバースプライマー：ＴＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＧＧ（最後のエキソン上に位置する、終止コドンの１００ヌクレオチド上流で終わる）を使用して、ＯＲＦ４の準完全コード配列を増幅してイントロンスプライシングを研究した。ＯＲＦ４の準完全ＣＤＳを、標準的ＰＣＲ反応（５５℃のアニーリング温度及び３５サイクル）で増幅した。
リアルタイム実験を、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックスキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｉＣｙｃｌｅｒ ＭｙｉＱ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で実施した。プライマー配列は以下であった：フォワードプライマー５’−ＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＣＡＴＴＧＡＴＡ−３’、リバースプライマー５’−ＴＧＴＧＧＴＧＴＣＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＡ−３’（ＯＲＦ４）；及びフォワードプライマー５’−ＡＣＣＡＣＴＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＣＴＣＴＣ−３’、リバースプライマー５’−ＡＣＣＡＧＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣ−３’（β−アクチン）。ＯＲＦ４転写物レベルの相対的定量化を、２−ΔＣＴ式を適用することによって、内部β−アクチンコントロールを用いて計算した。ＰＣＲ産物の純度を、融解曲線を用いて確認した。反応は２連で実施した。ＲＮＡ試料がＤＮＡ汚染なしであることを確実にするために、ＰＣＲコントロールを逆転写酵素の添加なしに実施した。
２．結果
２．１ ｐｓ−２表現型の顕微鏡観察
野生型（Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）及び変異体（ｐｓ−２ＡＢＬ）の葯の横切片を調製し、トルイジンブルーで染色して、変異体における葯の発生／裂開が遮断される段階を同定した。開花時の葯円錐の縦切片を、電子顕微鏡法のために調製した。開花まで、発生段階には差異が見られなかった。後期花芽段階では、変異体及び野生型の隔壁細胞中で結晶が観察され、花粉の発生は正常に見えた（図１ａ）。変異体での隔壁の破壊は、野生型と同様の段階で生じた。しかし、開花時に、変異体の口辺細胞は縮退せず、花粉は葯中に留まった（図１ｂ、１ｃ）。さらに、内被肥厚化は変異体では起こらず、したがって、表皮細胞は、口辺細胞に対する破壊力を生み出すための硬さを開花段階で欠いていた。
２．２ 物理マッピング及び候補遺伝子の同定
本発明者らは、第４染色体短腕上のＣＯＳ由来のＣＡＰＳマーカーＴ０９５８及びＴ０６３５によって規定された１．６５ｃＭの間隔に、ｐｓ−２遺伝子座を以前にマッピングしている（Ｇｏｒｇｕｅｔら、２００６）。ｐｓ−２遺伝子座領域についての物理マップを、Ｈｅｉｎｚ ＢＡＣライブラリーを使用して構築した。このライブラリーを、ｐｓ−２遺伝子座に対して最も近いマーカーを使用したＰＣＲ増幅及びそれらのマーカーの配列を使用したコンピュータ手段によって、スクリーニングした。次いで、ポジティブなＢＡＣを、ＢＡＣ末端をＰＣＲマーカーに変換し（図２）、組換え体集団においてこれらのマーカーをスクリーニングすることによって、遺伝子マップにアンカリングした。同じコンティグ由来のＢＡＣの重複を評価し、ＢＡＣが同じコンティグの一部であるかどうかを確認するために、ＢＡＣフィンガープリントも比較した。次いで、ｐｓ−２遺伝子座に対して最も近いＢＡＣ末端を、第２ラウンドのスクリーニングに使用した。最終的に、コンティグ全体は、ＣＯＳ由来のＣＡＰＳマーカーＴ１０７０からＢＡＣ末端１５Ｎ２３−Ｔまで、１．７０ｃＭ（３２の組換え体）にわたった（図２）。ＢＡＣ １４３Ｍ１５はｐｓ−２遺伝子座にわたり、したがって配列決定された。
ＢＡＣクローン１４３Ｍ１５中に存在する遺伝子を同定するために、ＢＡＣ ＤＮＡ配列を、ＢＬＡＳＴＮインターフェースを使用してトマトＳＧＮ Ｕｎｉｇｅｎｅデータベースに対して走査し、ＴＢＬＡＳＴＸインターフェースを使用してアラビドプシス遺伝子モデルデータベースに対して走査した。２つのトマトコード配列及び５つのアラビドプシス遺伝子が、このＢＡＣクローン配列と一致した（そのうち２つは、２つのトマトコード配列に一致している；表２）。５つの候補遺伝子を、ＯＲＦ１〜ＯＲＦ５と命名した。さらに、レトロトランスポゾンファミリーの６つの遺伝子もまた同定したが、さらなる研究ではこれらは考慮しなかった。５つの対応するアラビドプシス遺伝子の位置は、アラビドプシスゲノム中で連続せず、このことは、その領域に関する２つの種間のシンテニーの非存在を強調した。さらに、そのなかには、アラビドプシスにおいて同定された機能的雄性不稔性遺伝子（Ｇｏｒｇｕｅｔら、２００６において列挙した）の１つに対して相同であったものは存在しなかった。
高解像度マップ中に候補遺伝子を位置付けるために、本発明者らは、推定遺伝子の配列（又は隣接配列）をＰＣＲマーカーに変換し、それらを組換え体集団においてマッピングした。すべての候補遺伝子が高解像度連鎖マップ中の異なる位置にマッピングされたので、本発明者らは、遺伝子マップ中のそれらの位置に基づいてｐｓ−２について最も可能性の高い候補を容易に同定できた。推定ポリガラクツロナーゼ遺伝子であるＯＲＦ４は、ｐｓ−２遺伝子座の最も近くにマッピングされた（図２）。引き続いて、推定イントロン及びエキソンを、ＳｏｆｔｂｅｒｒｙのＦＧＥＮＳＨソフトウェアを使用して同定した。候補遺伝子ＯＲＦ４は、９つのエキソン及び８つのイントロンからなり、１１７９ヌクレオチドのコード配列のために、推定開始コドンから推定終止コドンまで、６７１６ヌクレオチドのゲノム距離をカバーする。ＰＣＲマーカーＯＲＦ４を生成するために使用したＳＮＰは、第２推定イントロン中に位置した。本発明者らは、２つの追加のＰＣＲマーカーを、１つはソラナム・ピンピネリフォリウム対立遺伝子中の第１イントロン中の７６ｂｐの欠失に基づき［ＯＲＦ４（１）］、１つはソラナム・ピンピネリフォリウム対立遺伝子中の第６イントロン中の３８ｂｐの挿入に基づき［ＯＲＦ４（２）］、生成してマッピングした。３つのＰＣＲマーカー（ＯＲＦ４（１）、ＯＲＦ４及びＯＲＦ４（２））は、互いの間で１つの組換え体の間隔でマッピングされ、これは、少なくとも２回の組換えが、この組換え体集団において候補遺伝子ＯＲＦ４内で生じたことを示している（図２）。ＯＲＦ４（２）は、高解像度マップ上でｐｓ−２遺伝子座と同時分離した。
２．３ ＯＲＦ４中の変異及び分子マーカーの生成
ＯＲＦ４がｐｓ−２遺伝子に対応するという仮説を強固にするために、本発明者らは、ｐｓ−２ＡＢＬ対立遺伝子中の配列の変化について探索した。ＯＲＦ４の推定プロモーターから推定ターミネーターまでの全９ｋｂを、栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ及びｐｓ−２ＡＢＬについて配列決定した。１つの一塩基変異が、ＯＲＦ４の第５推定エキソンの最後のヌクレオチド上に同定され、ここで、ヌクレオチドグアニンはシトシンで置換されていた。ＯＲＦ４中の同定されたＳＮＰとｐｓ−２形質との間の関連を試験するために、本発明者らは、ソラナム・リコペルシカム中のｐｓ−２ＡＢＬ対立遺伝子と野生型対立遺伝子とがゲル上で容易に区別できるように、そのＳＮＰに基づく分子マーカーを生成した。このマーカーを、１７６のＡＢＬのセットに対して試験したところ、そのうち８つはｐｓ−２／ｐｓ−２であった。これら７つの機能的雄性不稔植物は、他のＡＢＬと異なる同じマーカーパターンを示し、試験した他のｐｓ−２系統中にこのＳＮＰが存在することが確認された。このマーカーは、現代のトマト系統へのｐｓ−２形質の分子補助導入のために、ここで容易に使用できる。
２．４ 選択的イントロンスプライシング
ＯＲＦ４のｐｓ−２ＡＢＬ対立遺伝子中の配列変異は、イントロン認識スプライス部位の１つの中に位置するので、本発明者らは、この変異が遺伝子のプレ−ｍＲＮＡスプライシングに影響を与え得ると仮定した。この仮説を確認するために、本発明者らは、ＯＲＦ４の準全長ｃＤＮＡクローン（１１７９ヌクレオチドのうち１０３２ヌクレオチド）を増幅するためのプライマーを設計した：フォワードプライマーをＯＲＦ４の第５エキソン上に設計し、リバースプライマーを最後のエキソン上に設計した（表３）。ＲＴ−ＰＣＲを、ｐｓ−２ＡＢＬ及び栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒから、開花後の葯円錐のＲＮＡから生成したｃＤＮＡに対して実施した。栽培品種Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒについて観察された増幅産物は予測されたサイズ（１０３２ｂｐ）のものであり、これは配列決定によって確認された。ｐｓ−２ＡＢＬの増幅産物は、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒの産物よりも顕著に小さく、このことは、イントロンスプライシングにおける変化を示唆した（図３）。ｐｓ−２ＡＢＬのｃＤＮＡに対して増幅された断片の配列決定により、ＳＮＰが存在する第５エキソンがｃＤＮＡ配列中でスキップされていたことが示された。このエキソンは、プレ−ｍＲＮＡ成熟過程の間に、２つの隣接イントロンと一緒に除去された（図４）。エキソン−イントロンスプライスジャンクションの野生型の５’配列はＣＡＧ／ＧＴＡＴＣＧであり、これは、ソラナム・ツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）において同定されたスプライスジャンクション配列の１つと同一である（Ｂｒｏｗｎ、１９８６）。ｐｓ−２ＡＢＬ対立遺伝子中に見出された変異は、以下の配列：ＣＡＣ／ＧＴＡＣＧを誘導するが、この配列は、イントロンスプライシング認識部位のリストには存在しない。成熟ｍＲＮＡ中の第５エキソンの非存在は、２０８ヌクレオチドの欠失に相当し、これは、下流の残りのコード配列に対するフレームシフトを誘導する。このフレームシフトは、新たなフレームの終止コドンに起因して、１４アミノ酸後に未熟な転写停止を引き起こす。したがって、完全な推定変異タンパク質は、野生型タンパク質の３９２アミノ酸と比較して１５４アミノ酸長であり、非機能的である可能性が高い。
２．５ ＯＲＦ４配列分析
ＮＣＢＩのタンパク質データベースにおけるＯＲＦ４の推定候補タンパク質配列を用いたＢＬＡＳＴ検索により、いくつかの植物由来のＰＧタンパク質のリストが得られた。同定されたタンパク質は、果実の熟化及び長角果／鞘の裂開において機能を有する。それらのうち、ＡＤＰＧ１タンパク質は、アラビドプシスの長角果の裂開帯並びに葯の裂開帯において発現されることが見出されている（Ｓａｎｄｅｒら、２００１）。ベストＢＬＡＳＴヒットのＰｆａｍ ＧＨ２８ドメインのアミノ酸を、候補タンパク質の配列及び同定された機能を有する既知のトマトＰＧタンパク質、並びに１つの裸子植物ＰＧ（ヒマラヤスギ）と一緒にアラインした。系統学的分析を、言及されたＰＧクレードの１つ中に候補タンパク質を位置付けるために、最終アラインメントに対して実施した。ＯＲＦ４は、クレードＢのＰＧと同定された（図５）。クレードＢは、Ｈａｄｆｉｅｌｄｓ及びＢｅｎｎｅｔｔ（１９９８）によって以前に特徴付けられた、果実及び裂開帯において発現されるＰＧをコードする、クローニングされたすべての遺伝子からなる。これは、本発明の系統樹においても観察された。ＴＦＰＧ（果実において発現することが知られる唯一のトマトＰＧ）も、同じクレードの一部であった。ＯＲＦ４及びＴＦＰＧのＰｆａｍ ＧＨ２８ドメインのアラインメントを図６に示す。ＯＲＦ４及びＴＦＰＧは、タンパク質配列全体に対して５９％の類似性を有する。
ＯＲＦ４の推定由来タンパク質は、Ｒａｏら（１９９６；図６）によって示された、ＰＧタンパク質に特徴的な４つの保存ドメインを含む。第１の保存ドメインは、変異体タンパク質においてスキップされる第５エキソン上に位置し、他の３つのドメインはさらにこの配列上に位置し、したがって、変異体配列においてインフレームではない。したがって、この変異体タンパク質は、タンパク質の機能において主要な役割を果たす４つの保存されたドメインをいずれも含まない。ＯＲＦ４の開始コドンの上流２０００ヌクレオチドの分析により、開始コドンに対して−６６７位、−７００位及び−１９５５位にある３つのエチレン応答性エレメント（ＥＲＥ；ＡＷＴＴＣＡＡＡ）、−１６３２位にある１つのｂＺＩＰタンパク質結合モチーフ（ＴＧＡＣＧ）、並びに−１３２９位にある１つのＧ−ボックス（ＣＡＣＧＴＧ）の存在が明らかとなった。ＯＲＦ４のプロモーター配列中のＥＲＥモチーフ、ｂＺＩＰタンパク質結合モチーフ及びＧ−ボックスの存在は、ＯＲＦ４の転写が、エチレン及びジャスモン酸エステルによって刺激されることを示唆する。
２．６ 葯、果実及び他の組織におけるＯＲＦ４の発現
本発明者らは、葉及び花の離層帯、成熟果実及び開花時の葯を含むいくつかの組織におけるＯＲＦ４転写物の存在を試験した。ＯＲＦ４転写物は、離層帯では検出されなかった（図７）。ＯＲＦ４転写物の存在は、葯並びに果実において確認された。葯及び果実の発生の異なる段階にわたるＯＲＦ４の転写レベルの発展を研究するために、本発明者らは、葯の４つの発生段階（花芽；開花前；開花時；開花後）、並びに５ｄａｐ（ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ：受粉後日数）から５７ｄａｐ（成熟果実）までの果実の８つの発生段階；ブレーカー段階に対応する４７ｄａｐで、ＯＲＦ４の定量的発現分析を実施した（データ示さず）。葯において、ＯＲＦ４の転写レベルを、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ及びｐｓ−２ＡＢＬに対して試験し、果実においてはＭｏｎｅｙｍａｋｅｒに対してのみ試験した。３７ｄａｐ前の果実では、ＯＲＦ４転写物は検出されなかった。３７ｄａｐからＯＲＦ４転写物が検出され、時間と共に顕著に増加し、成熟段階（５７ｄａｐ）で最大に達した。Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒの葯では、ＯＲＦ４転写物は、既に花芽段階で検出された。開花前の時点で、ＯＲＦ４転写物のレベルは花芽と類似していた。ＯＲＦ４転写物の蓄積は、開花時に増加し、開花後に最大に達した。ｐｓ−２ＡＢＬの葯でも、ＯＲＦ４転写物は、花芽段階以外で検出された。しかし、ｐｓ−２ＡＢＬの葯におけるこの転写物レベルは、開花時及び開花後のＭｏｎｅｙｍａｋｅｒの葯におけるレベルよりも顕著に低かった。
３．考察
ｐｓ−２高度育種系統は、裂開を受けない葯を生じる。この研究において、本発明者らは、ｐｓ−２ＡＢＬの葯の発生／裂開が最終段階で遮断されることを示した。口辺細胞は縮退せず、内被壁は肥厚しない。これら２つの生理学的変化がない場合、葯は閉じたままであり、表皮細胞は、口辺細胞を最終的に破壊して花粉を解放できる硬さを欠く。
この表現型の変異は劣性であり、単一の遺伝子座の制御下にある。以前の研究で、本発明者らは、４番染色体の短腕上にｐｓ−２遺伝子を詳細にマッピングした（Ｇｏｒｇｕｅｔら、２００６）。本明細書中で、本発明者らは、ｐｓ−２遺伝子の単離及び機能的特徴付けを報告する。本発明者らは、ｐｓ−２表現型が、今日まで未知であった９つのエキソンからなるポリガラクツロナーゼ遺伝子中の一塩基変異の結果であることを見出した。この一塩基変異は、第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチド上に位置し、イントロンスプライシング認識部位に影響を与え、このイントロンスプライシング部位はＣＡＧ／ＧＴＡＴＣＧからＣＡＣ／ＧＴＡＴＣＧ（エキソン３’／イントロン５’）に変化する。シトシン塩基には、植物中のこの特定の位置でイントロンスプライス部位の１１％において遭遇するが、エキソン３’末端での「ＣＡＣ」の組合せは、植物においていずれのスプライス部位でも検出されていなかった（Ｂｒｏｗｎ １９８６）。第５エキソンは、２つの隣接イントロンと一緒にスプライスアウトされる。スプライス部位周辺に変異を持つアラビドプシス変異体の分析により、植物スプライシングにおけるエキソンスキップのいくつかの例が明らかになっている（Ｂｒｏｗｎ及びＳｉｍｐｓｏｎ、１９９８による総説）。これらの変異のほとんどは、スプライス認識部位のイントロン部分に位置する。本発明者らの知るところによれば、植物において、今日まで、スプライス認識部位のエキソン部分中の変異に起因したエキソンスキップを示す唯一の変異体は、アラビドプシスにおけるｓｐｙ−１変異体であり（Ｊａｃｏｂｓｅｎら、１９９６）、この変異体では、第８エキソンの末端のＣＡＧ／ＧＴＴＴＧＡ（エキソン３’／イントロン５’）スプライス認識部位は、ＣＡＡ／ＧＴＴＴＧＡに変異していた。ＯＲＦ４の変異した対立遺伝子中で観察されたエキソンスキップは、配列の残りの部分のフレームシフトを誘導し、これは結果として、さらに１４アミノ酸早い終止コドンを生じた。したがって、完全変異体タンパク質は、野生型についての３９２アミノ酸長と比較して１５４アミノ酸長であり、ＰＧに特徴的な４つのドメインをいずれも含まない。
３．１ ｐｓ−２はクレードＢのＰＧである
ｐｓ−２表現型を担う単離された遺伝子は、今日まで未知であったＰＧである。本発明者らは、頭文字ＤＰＧ（裂開ポリガラクツロナーゼを示す）を提案し、又はトマト遺伝子の場合にはＴＤＰＧ（トマト裂開ポリガラクツロナーゼを示す）を提案する。ＴＤＰＧの系統学的分析により、Ｈａｄｆｉｅｌｄ及びＢｅｎｎｅｔｔ（１９９８）が規定したようなクレードＢのＰＧとの密接な類似性が明らかとなった。ここで、クレードＢは、果実ＰＧ（とりわけトマト果実ＰＧ）、並びに長角果又は鞘裂開ＰＧからなる。他のトマトＰＧは異なるクレード中にクラスター化する。ＰＧ遺伝子ファミリーの多様性が被子植物種の分離の前に生じたという主張（Ｈａｄｆｉｅｌｄ及びＢｅｎｎｅｔｔ、１９９８）に従えば、ＴＤＰＧはここで、他のクレード由来のトマトＰＧよりも、他の種由来の同じクレードの遺伝子に対してより密接に関連している。他のトマトＰＧのほとんどは、器官脱離（ＴＡＰＧ）に関連する。本発明者らの研究において、ＴＤＰＧの発現は、花及び葉の離層帯では検出されなかった。しかし、葯組織に加えて、本発明者らは、果実においてＴＤＰＧのｍＲＮＡ転写物を検出した。
３．２ ＴＤＰＧ転写物の蓄積は、葯の発生と共に増加する
本発明者らは、葯において異なる段階でＴＤＰＧ転写物の相対レベルを測定した。ＴＤＰＧ転写物は、花芽段階でＭｏｎｅｙｍａｋｅｒの葯において既に検出されている。この転写物レベルは段階とともに増加して開花後に最大に達し、このとき葯が裂開する。ＴＤＰＧ転写物蓄積のこの増加は、葯において観察された隔壁及び口辺細胞の縮退並びに内被細胞壁の肥厚化と平行である。ｐｓ−２ＡＢＬの葯におけるＴＤＰＧ転写物レベルは、開花前から検出され続けたが、この転写物レベルは、開花時及び開花後では、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒと比較して非常に低いままであった。変異体ｍＲＮＡは、ナンセンスとして認識され、ナンセンス媒介ｍＲＮＡ崩壊（ＮＭＤ）によって分解される可能性が非常に高い。ＮＭＤは、品質制御機構として機能して、異常な転写物を排除する（Ｌｅｊｅｕｎｅ及びＭａｑｕａｔ ２００５）。
３．３ ＴＤＰＧは、エチレン及びジャスモン酸エステルの制御下にある可能性が高い：
ＴＤＰＧのプロモーター領域におけるエチレン及びジャスモン酸エステル応答性エレメントの存在は、ＤＰＧ遺伝子の転写が両方のホルモンによって誘導され得ることを示唆している。エチレンは既に、タバコにおける葯の裂開のタイミングに関与している（Ｒｉｅｕら、２００３）。より最近、ペチュニアにおいて、エチレンが葯の裂開と開花との同期を調節していることが示された（Ｗａｎｇ及びＫｕｍａｒ、２００６）。さらに、多くの研究が、葯の裂開の過程及びタイミングにおける重要な化合物としてジャスモン酸エステルを既に同定している。ＪＡ生合成酵素におけるいくつかの変異体が、この現象の研究のために同定されている。Ｓｃｏｔｔら（２００４）は、エチレン及びＪＡが葯の裂開の制御において重複して作用し得ることを示唆しており、これは、雄しべ内でＪＡを合成できないｄｄｅ−１などのアラビドプシス変異体、又はエチレン非感受性Ｔｅｔｒ変異体が、なぜ最終的に葯の裂開を受けるかを説明するであろう。
本研究において、本発明者らは、他の変異体において裂開が遅延するのとは対照的に、ｐｓ−２ＡＢＬの葯が裂開しないままであることを示しており、これは、ＤＰＧが葯の裂開の制御においてエチレン及びＪＡの下流で作用し、ＤＰＧがこの過程の主役であるという仮説を強化している。
３．４ ＴＤＰＧは、トマト果実の熟化においても役割を果たし得る：
今日までに同定された唯一のトマト果実ポリガラクツロナーゼであるＴＦＰＧは、果実軟化の過程における主役の１つとして特徴付けられている。ＴＦＰＧのアンチセンス抑制は、より長い保存寿命を有するトマト果実の作出を導いているが、この果実は成熟し、これは、他の役者もまた果実軟化の過程において関連のある役割を果たしていることを示している（Ｓｍｉｔｈら、１９８８）。ＤＰＧは、果実の細胞壁の分解に寄与することによって、充分にこれらの役者の１つたり得る。ＴＤＰＧ転写物は、Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒにおいて果実発生の後期段階で検出された（図８）。最大の転写物は、成熟段階（５７ｄａｐ）で見出された。同様に、ＴＦＰＧは、緑熟段階又はブレーカー段階から始まる熟化段階でのみ検出されてきた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９９；Ｅｒｉｋｓｓｏｎら、２００４）。ＴＦＰＧのレベルは、栽培品種ＡＣ及びＬｉｂｅｒｔｏにおいて、ブレーカー段階から成熟果実まで時間と共に増加することも見出されている（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９９）。
トマトにおいて、エチレンによるＰＧ ｍＲＮＡ蓄積の調節は長い間不明のままであったが、ＴＦＰＧ蓄積は、果実熟化の過程においてエチレン依存的であったことが実証されている（Ｓｉｔｒｉｔ及びＢｅｎｎｅｔｔ、１９９８）。一致して、ＥＲＥモチーフが、ＴＦＰＧのプロモーター中で見出されている（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、１９９３）。エチレンは、果実熟化の制御における主要な植物ホルモンとして示されている（Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉ、２００４による総説）。エチレンの生合成経路中の律速酵素に対するアンチセンスＲＮＡの発現は、トマトにおいて果実の熟化を阻害し、結果としてＴＦＰＧの産生をダウンレギュレートする（Ｏｅｌｌｅｒら、１９９１；Ｓｉｔｒｉｔ及びＢｅｎｎｅｔｔ、１９９８）。
この研究の初期に、本発明者らは、プロモーター配列中のＥＲＥモチーフの存在に起因して、ＤＰＧがエチレンの制御下にあることを示唆した。トマト果実におけるエチレンの抑制は、ＴＦＰＧ及びＴＤＰＧの両方を阻害する可能性が高く、したがって、果実熟化の過程を完全に防止する。葯の裂開及び果実成熟におけるＤＰＧのホルモン制御に関する単純化されたモデルを図８中に示す。
果実の成熟及び保存寿命におけるＤＰＧの役割がＴＦＰＧと同様に重要であるかどうかは明らかではない。葯の手動による開放後のｐｓ−２ＡＢＬとＭｏｎｅｙｍａｋｅｒ又は任意の正常トマト系統との間の比較は、遺伝的背景の差異に起因して信頼性がない。正常なトマト系統におけるアンチセンスＲＮＡ又はＲＮＡｉによるＤＰＧのノックアウトは、この問題に答え得るであろう。人工授粉から成熟果実段階までの時間及び果実保存寿命が測定され、果実におけるＤＰＧの影響を評価するために、形質転換されていないコントロールに対して比較され得るであろう。他の植物種におけるＴＤＰＧホモログのノックアウトも、その最終段階における葯の裂開の制御が種間で保存されているかどうかを確認するための、価値ある興味の対象である。



− 太字のヌクレオチド「Ｇ」は、変異の位置を示す。
− 保存されたタンパク質ドメインは、下線付き太字で示す。
− イントロンの位置は、配列の上の黒い矢印で示す。
− 準完全コード配列を増幅するために使用したプライマー配列の位置は、灰色で示す。
（参考文献）

Claims (14)

  1. （ａ）位置不稔性及び／又は非裂開葯をもたらす裂開ポリガラクツロナーゼ（Ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌｙｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅ）（ＤＰＧ）の機能欠失対立遺伝子（ｐｓ−２対立遺伝子）をコードするヌクレオチド配列であって；裂開ポリガラクツロナーゼが、ＤＰＧ活性を有するポリペプチドのＰｆａｍ ＧＨ２８ドメインである、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドである、ヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって；該ヌクレオチド配列が、位置不稔性及び／又は非裂開葯をもたらす裂開ポリガラクツロナーゼ（ＤＰＧ）の機能欠失対立遺伝子（ｐｓ−２対立遺伝子）をコードするヌクレオチド配列であり；裂開ポリガラクツロナーゼがＤＰＧ活性を有するポリペプチドである；ヌクレオチド配列、及び
    （ｃ）配列番号４５で表されるヌクレオチド配列
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  2. 植物においてＤＰＧ対立遺伝子を検出、単離、増幅及び／又は分析する方法であって、植物の核酸を含む試料を提供するステップと、前記植物の核酸を、請求項１に記載のヌクレオチド配列の連続する少なくとも２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリダイズさせるステップとを含む方法。
  3. マーカー補助育種における、請求項１に記載のヌクレオチド配列の連続する少なくとも２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む核酸分子の使用。
  4. マーカー補助育種が位置不稔性及び／又は非裂開葯をもたらすＤＰＧの機能欠失対立遺伝子（ｐｓ−２対立遺伝子）の検出を含む、請求項３に記載の使用。
  5. ＤＰＧ対立遺伝子中に変異を有する植物を作出する方法であって、
    ａ）植物複合体の種子を変異誘発するステップ；
    ｂ）ａ）で得られた変異誘発種子の植物を成長させるステップ；
    及び
    ｃ）ｂ）で得られた植物をＤＰＧ対立遺伝子中の変異の存在についてスクリーニングするステップ
    を含む方法（ここで該ＤＰＧ対立遺伝子は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する位置不稔性及び／又は非裂開葯をもたらすＤＰＧの機能欠失対立遺伝子（ｐｓ−２対立遺伝子）をコードするヌクレオチド配列であり、裂開ポリガラクツロナーゼがＤＰＧ活性を有するポリペプチドである）。
  6. 請求項５に記載の方法であって、
    ａ）植物複合体の種子を変異誘発するステップ；
    ｂ）ａ）で得られた変異誘発種子の植物を成長させるステップ；
    ｃ）ｂ）で得られた植物を少なくとも１世代にわたって戻し交雑するステップ；及び
    ｄ）ｂ）又はｃ）で得られた植物をＤＰＧ対立遺伝子中の変異の存在についてスクリーニングするステップ
    を含む方法（ここで該ＤＰＧ対立遺伝子は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する位置不稔性及び／又は非裂開葯をもたらすＤＰＧの機能欠失対立遺伝子（ｐｓ−２対立遺伝子）をコードするヌクレオチド配列であり、裂開ポリガラクツロナーゼがＤＰＧ活性を有するポリペプチドである）。
  7. ＤＰＧ−対立遺伝子中の変異が、前記対立遺伝子をｐｓ−２対立遺伝子にする、請求項５又は６に記載の方法。
  8. ｐｓ−２対立遺伝子が、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣ、Ａ又はＴを有する対立遺伝子である、請求項２又は７に記載の方法。
  9. 対立遺伝子が、ＤＰＧ遺伝子の第５エキソンの３’末端の最後のヌクレオチドとしてＣを有する、請求項８に記載の方法。
  10. 非裂開葯を有するトランスジェニック植物を作出する方法であって、請求項１に記載のヌクレオチド配列の連続する少なくとも２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む核酸構築物又はその相補体で植物細胞を形質転換するステップを含み、植物細胞における前記核酸構築物の存在は、位置不稔性及び非裂開葯をもたらすレベルまで、ＤＰＧ活性の発現を減少させる、方法。
  11. 前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中での発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、前記ヌクレオチド配列の発現が、ＲＮＡ干渉によりＤＰＧ活性の発現を減少させる、請求項１０に記載の方法。
  12. 核酸構築物が相同組換えのための構築物であり、前記ヌクレオチド配列が、位置不稔性及び非裂開葯をもたらすレベルまで、ＤＰＧ活性の発現を減少させる変異を含む請求項１０に記載の方法。
  13. 植物細胞中での発現のためのプロモーターに作動可能に連結された、請求項１に記載のヌクレオチド配列の連続する少なくとも２０ヌクレオチドの断片又はその相補体を含む核酸構築物。
  14. 前記断片が、請求項１に記載のヌクレオチド配列の連続する３０ヌクレオチドの配列又はその相補体を含む、請求項１３に記載の核酸構築物。
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