CN113151328B

CN113151328B - 大豆种皮吸水性调控基因GsPG031及其编码蛋白和应用

Info

Publication number: CN113151328B
Application number: CN202110453372.XA
Authority: CN
Inventors: 王飞飞; 潘相文; 赵超越
Original assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Current assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date: 2021-04-26
Filing date: 2021-04-26
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2041-04-26
Also published as: CN113151328A

Abstract

大豆种皮吸水性调控基因GsPG031及其编码蛋白和应用，涉及基因工程领域，具体涉及一种种皮吸水性调控基因GsPG031及其编码蛋白和应用。通过研究大豆种皮的透水能力，对揭示种子硬度分子机制具有重要意义，进而可据此选择和定向改良栽培品种。该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。该基因通过提高大豆种皮外围栅栏细胞和骨硬化层的结实性来降低大豆种皮吸水性，进而提高大豆种子硬实性。本发明应用于大豆种子硬实性品种改良领域。

Description

大豆种皮吸水性调控基因GsPG031及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种种皮吸水性调控基因GsPG031及其编码蛋白和应用。

背景技术

硬实(hard seededness)，即种皮(有时也包括果皮)，坚硬而很难吸胀萌发的种子特性，较“非硬实”来讲，是一种自适应性性状，可以保护种子在自然条件下免受病菌、旱涝、腌渍的侵害以顺利度过休眠期而适时萌发。然而硬实特性常给农业耕作带来不便，如硬实种子抗病却常伴随着不易发芽，而现在种子的硬实特性已通过人工选择大大降低，这却使栽培品种耐贮藏性有很大程度的退化，每年全世界都会因存储过程中种子变质而导致巨大的经济损失。同时种子作为粮食是重要的营养物质提供者，如水稻、小麦、玉米和大豆等是中国人食物的主要来源，种子硬度直接影响着食品的品质，如主要食品对小麦籽粒硬度从软到硬的要求依次为糕点、饼干、馒头、面条、饺子、面包，不同品质的小麦有不同食品加工的适应性，适合做面包的小麦，对糕点、饼干来说是不适合的。由此可见，种子硬度决定了粮食储存的质量、食品加工的品质，因此解析种子硬度分子机制并将其应用到实际生产中是十分必要的。

大豆是集粮油、饲料和工业用途于一体的重要作物。在目前进口大豆占主导的背景下，加强自产大豆产业链效能以加强国产大豆竞争力是很必要的，而种子硬度所影响的大豆的储存和加工是大豆产业链中非常重要的环节。鉴别各品种的种子硬实性，以正确指导储存和加工方式，可提高自产大豆的利用率；定向改良种子硬度以适于不同的大豆用途，可提高自产大豆的品质。可见，对目标基因的研究是大豆在种子硬度性状上进行品种鉴定和育种材料改良创新的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆种皮吸水性调控基因GsPG031及其编码蛋白和应用。通过研究大豆种皮的透水能力，对揭示种子硬度分子机制具有重要意义，进而可据此选择和定向改良栽培品种。

本发明大豆种皮吸水性调控基因GsPG031的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明大豆种皮吸水性调控基因GsPG031所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明大豆种皮吸水性调控基因GsPG031在调控大豆种子硬实性中的应用。

进一步的，所述大豆种皮吸水性调控基因GsPG031通过降低大豆种皮吸水性而提高大豆种子硬实性。

进一步的，所述大豆种皮吸水性调控基因GsPG031通过提高大豆种皮外围栅栏细胞和骨硬化层的结实性来降低大豆种皮吸水性。

本发明的有益效果：

本发明利用PCR方法从野生大豆中克隆出大豆种皮吸水性调控基因GsPG031。本发明通过遗传转化手段，将GsPG031基因在大豆中过量表达，发现与野生型相比，GsPG031基因的过表达转基因大豆的种皮呈现不易吸水表型，显微观察发现吸水后转基因大豆的种皮外围栅栏细胞和骨硬化层更结实，不易水解。

在种子吸胀过程中，GsPG031基因产生一种功能性的聚半乳糖醛酸酶，可将种皮中的果胶分解成半乳糖苷衍生物并在种皮外层栅栏组织处积累；PG031可能结合Glyma.05G026300.1和Glyma.20G148200.1，使得这些半乳糖苷衍生物、PG031和这2个互作蛋白在细胞壁中形成一个固定的网络，进而增加GsPG031过表达种子中的种皮外层的栅栏细胞结构网络的稳定性，给予细胞壁更多的结构完整性或更大的灵活性，使其不太容易开裂，因此吸水性较低。这些结果将增强我们对种子吸收能力及种子硬实性的分子机制的理解。

大豆种子的硬实性与大豆储存和加工紧密相关，本发明中的大豆种皮吸水性调控基因GsPG031的克隆和功能分析，不仅对揭示种子硬度分子机制具有重要的学术价值，更重要的是可据此选择和定向改良栽培品种以其更有益于种子储存。

附图说明

图1为GsPG031基因过表达转基因大豆转录水平表达分析

图2为GsPG031基因过表达转基因大豆T₀代种子吸水表型图

图3为GsPG031基因过表达转基因大豆T₂代种子吸水表型图

图4为GsPG031基因过表达转基因大豆T₂代种子吸水含量测定统计图

图5为GsPG031基因过表达转基因大豆T₂代种子吸水率测定统计图

图6为GsPG031基因过表达转基因大豆T₂代种子硬实性种子测定图

图7为GsPG031基因过表达转基因大豆T₂代种皮的显微观察结果图

图8为GsPG031蛋白的原核表达

图9为GsPG031蛋白的Pull-down结果图

图10为GsPG031基因的结合蛋白鉴定

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：大豆种皮吸水性调控基因GsPG031基因的克隆

一、以野生大豆品种H4为实验材料，按照Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册，提取叶片总RNA；

二、采用DNaseⅠ处理步骤一所提取的总RNA；

三、取1μg步骤二处理后的总RNA用于cDNA的合成，cDNA的合成操作按照购买自BDBiosciences Clontech公司的BD SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的使用手册进行，获得cDNA；

四、以步骤三获得的cDNA为模板，参照TaKaRa公司的

HS DNAPolymerase操作说明书，用正向引物F1与反向引物R1扩增GsPG031基因。PCR反应条件如下：98℃预变性5min；98℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共38循环；72℃终延伸10min。最后，将PCR产物在ABI3130测序仪(ABI公司)上进行测序，测序结果表明，大豆种皮吸水性调控基因GsPG031基因由1167个碱基组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示。

正向引物F1：5'-ATGA AGTTCACTATAATCACAATAT-3'

反向引物R1：5'-CTAGGCTGCACAAGTAGGAG-3'

实施例2：大豆GsPG031基因过表达转基因水稻的获得

一、载体构建：以野生大豆品种H4的cDNA为模板，参照TaKaRa公司的

HS DNA Polymerase操作说明书，以正向引物F2与反向引物R2为扩增引物，扩增GsPG031基因的编码区，并将扩增片段克隆进入植物表达载体pMDC1001G中，形成一个CaMV 35S启动子驱动的GsPG031融合体质粒，表示为pGMDC-GsPG031。

所述植物表达载体pMDC1001G于申请日前在以下文章中公开过：Kong FJ et al.,2010.Two Coordinately Regulated Homologs of FLOWERING LOCUS T Are Involved inthe Control of Photoperiodic Flowering in Soybean.Plant Physiology.

正向引物F2：5′-CTCTAGAGCATGAAGTTCACTATAATCACAA-3′

反向引物R2：5′-CGAGCTCGCTAGGCTGCACAAGTAGGAG-3′

二、目的载体转化农杆菌EHA101，农杆菌介导的大豆子叶节转化法将上述步骤一中所构建的融合载体pGMDC-GsPG031转入大豆种皮高渗透性栽培品种吉林1号(JL1)中，对T₀代转基因苗以粗提的DNA为模板，按照全式金公司的EasyTaq DNA Polymerase说明书，用CaMV 35S启动子-Bar基因引物(F3和R3)进行扩增，获得转基因阳性苗。

正向引物F3：5′-CCTGTGCCTCCAGGGAC-3′

反向引物R3：5′-GCGGTCTGCACCATCGTC-3′

实施例3：GsPG031基因过表达转基因大豆分子鉴定：

一、以待鉴定GsPG031基因过表达转基因水稻和其对照为材料，用购买自Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册提取叶片总RNA；

二、采用DNaseⅠ处理步骤一提取的总RNA；

四、以获得的cDNA为模板通过GsPG031基因正向引物F4与反向引物R4，大豆内参β-tubulin基因(Glyma.05G157300.1)正向引物F5与反向引物R5，对转基因大豆和野生型对照JL1的cDNA进行PCR扩增，对扩增产物进行半定量分析。

正向引物F4：5'-CTGTATCTCATTGGGTGATGGTAAC-3'

反向引物R4：5'-TTCAACGGCCTCTTCATTATC-3'

正向引物F5：5'-TCTTGGACAACGAAGCCATCT-3'

反向引物R5：5'-TGGTGAGGGACGAAATGATCT-3'

GsPG031基因过表达转基因水稻分子鉴定结果如图1，以4株具有代表性的能稳定遗传的PG031基因过表达转基因大豆(TG1，TG4，TG8，TG13)为例。与对照JL1相比，GsPG031基因在转基因大豆中明显超表达。以上结果证明本实验所获得的转基因材料确实是GsPG031基因过量表达的，表示为GsPG031-OE。

实施例4：大豆GsPG031基因过表达转基因大豆吸水表型调查

将T₀代GsPG031-OE与对照JL1种子，放入9cm培养皿中，并同时加入20ml水，观察T₀代GsPG031-OE与对照JL1种子的吸水性。将T₀代GsPG031-OE进行扩繁到T₂代，其中转基因品系T₂-TG1-6和T₂-TG4-5的收获种子数比和T₂-TG8和T₂-TG13的多，被用于后续的3次种子吸水性重复试验。于是分别将50粒GsPG031-OE(T₂-TG1-6和T₂-TG4-5)和对照JL1种子，放入9cm培养皿中，并同时加入25ml ddH₂O，观察T₂代GsPG031-OE与对照JL1种子的吸水性表型，并测定吸水后6h、12h和24h的平均吸水量和吸水率。

如图2所示，T₀代GsPG031基因过表达转基因大豆与对照JL1(野生型，标为WT)相比，种子呈现“硬实”表型，种子不吸胀，种皮渗水能力差。图3显示T₂代GsPG031基因过表达转基因大豆(T₂-TG1-6和T₂-TG4-5)与WT相比，吸水后6h，对照种子几乎全部吸水开始膨胀，而GsPG031-OE种子有一些明显未吸水膨胀；吸水后12h及24h，WT种子全部吸胀，而GsPG031-OE种子中仍然有一些明显未吸水膨胀。图4显示T₂代转基因种子在吸水后6h、12h及24h的单粒种子吸水量显著低于非转基因植株(p<0.05)。图5显示T₂代转基因种子在吸水后6h和12h的吸水率也显著低于非转基因种子，而吸水24h后，转基因种子和WT的种子吸水率没有显著变化。图6显示与WT相比，吸水后6h的转基因种子有一定的“硬粒”，硬粒率能达到18％左右，吸水后12h的转基因种子硬粒率约为8％左右，吸水后24h的T₂-TG1-6转基因种子硬粒率约为6.5％左右，T₂-TG4-5转基因种子硬粒率约为1％，而WT种子在吸水后6h有约1％的硬粒率，吸水12h后WT则没有硬粒。这些结果均表示GsPG031的导入使得转基因种子变硬，且不易吸水膨胀。

实施例7：GsPG031基因过表达转基因大豆种皮结构的显微观察

一、透射电镜植物样品制备步骤

分别将50粒GsPG031-OE(T₂-TG1-6和T₂-TG4-5)和对照JL1种子，放入9cm培养皿中，并同时加入25ml ddH₂O。分别取吸水后3h、6h、9h、12h和24h的种子。

分别将转基因种子和对照JL1种子进行取材：修成1×3mm的长方形。(注意横切和纵切面)。

二、固定

1.前固定：2.5％戊二醛，磷酸缓冲液配制固定2小时或过夜。

2.漂洗：用0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)漂洗，每15分钟漂洗一次，共漂洗三次。

3.后固定：1％四氧化铵水固定液固定2-3小时。

4.漂洗：用0.1M磷酸缓冲液(pH6.8)漂洗，15分钟三次。

三、脱水

固定组织通过分级乙醇系列脱水，分别用50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇和100％乙醇脱水15-20分，接着100％乙醇脱水10分钟，二次，时间间隔为30分钟。接着，使用乙醇丙酮混合液(100％乙醇：100％丙酮＝1:1)洗脱10分钟。以上操作均在4℃冰箱内进行。最后一次洗脱是在室温条件下进行的，使用100％丙酮对固定材料进行5-10分钟的洗脱。

四、浸透及包埋

将样品嵌入丙烯酸树脂(丙烯酸类树脂)(London Resin Co.Ltd.；Basingstoke,England)，步骤如下：

纯丙酮+树脂包埋液(1:1)室温，过夜

纯丙酮+树脂包埋液(1:2)室温，过夜

纯丙酮+树脂包埋液(1:3)室温，过夜

六、聚合

使得包埋液逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂所填充，经加温逐渐聚合成坚硬固体。

七、修块

首先粗修把多余树脂磨掉，然后在双筒镜下把端面修平，使组织面暴露，然后再修成四面锥体。顶端面可修成长方形或梯形。

八、切片

使用Leica Ultracut UC7超薄切片设备对固定组织进行切片(约为50-60nm)，并将样品制作成复膜铜网。

九、醋酸铀-枸橼酸铅双染色

用镊子轻轻夹住复膜铜网的边缘，膜面朝下蘸取已配置好的醋酸铀-枸橼酸铅溶液，进行染色。染毕，冲洗以除去载网上多余染液，载网清洗后置于培养皿的滤纸上干燥。

十、透射电镜观察、拍片。

将欲观察的铜网膜面朝上放入样品架中，送入JEM-1230透射电子显微镜(日本东京)的镜筒中进行观察。

如图7所示为GsPG031基因过表达转基因大豆与对照JL1种子在吸水后的种皮亚显微结构观察结果，发现对照JL1种子的种皮在吸水6h后栅栏层palisade layer(PL)，柱状细胞osteosclereidlayer(OL)开始分离，薄壁细胞parenchyma(P)已经分解；而转基因种子(TG1-6和TG4-5)在吸水6h后，种子的栅栏层PL,柱状细胞OL，P结构完整，在吸水12h后P和OL开始破损，24h后P完全破损。

当GsPG031-OE和对照种子浸入水中时，它们都开始膨胀，但在吸水后3小时和6小时时，它们的种皮结构并无显著差异。然而，在吸收后9小时，JL1种皮的外层的栅栏层PL和柱状细胞OL开始水解，并而GsPG031-OE的外层的PL和OL保持相对完整。在接下来的12小时和24小时内，与转基因种子层相比，转基因种子层的OL水解相对缓慢。这些结果表明，GsPG031的转入使得种子吸水萌发期间种子覆盖层渗透性的降低，吸水性降低。

实施例8：GsPG031互作蛋白的筛选

一、载体构建：经SignalP-4.1预测分析GsPG031蛋白有一段20aa信号肽，它为单次跨膜的分泌蛋白。预想在原核细胞中表达，信号肽要去掉，否则不表达。于是设计去掉信号肽的引物F6和R6：

正向引物F6：5'-TACGGTCGACGGGGATCTTGACATAT-3'

反向引物R6：5'-TAGCGCGGCCGCGGCTGCACAAGTAGG-3'

将此PCR产物克隆，并用SalI和NotI双酶切连入pGEX-6P-1载体中，形成融合GST蛋白的GsPG031原核表达载体，表示为GST-GsPG031。

二、原核蛋白纯化：挑选GST-GsPG031转化于BL21菌株的单克隆，大量菌液利用IPTG诱导表达原核蛋白，超声破碎菌体，利用GST-beads纯化蛋白。此蛋白是一个包涵体蛋白，需要进一步蛋白质复性。将纯化好的蛋白加入到50ml的离心管内(加入20％PEG 4000至终浓度为0.2％和50mM GSSG至终浓度1mM及100mM GSSH至终浓度2mMh)，离心管放置4℃，静置12h。取出静置后的蛋白，透析于TE缓冲液3天。透析期间TE缓冲液更换2次。最终，获得GST-GsPG031条带单一的原核蛋白进行体外实验。

三、采用Lysis蛋白提取液分别提取了吸水后6h的转基因种子(标为TG)与非转基因种子JL1(标为WT)的细胞总蛋白。

四、Pull Down：以步骤三中的蛋白提取液作为“Prey protein sample”，纯化获得的GsPG031蛋白(或GST蛋白)作为“Bait”，利用Pierce GST Pull-down试剂盒进行PullDown试验，对互作蛋白“Prey protein”进行捕获。

如图8所示，目的蛋白在大肠杆菌中经IPTG(0.5mM，18℃3h)诱导后，在66KD处表达，与预期大小符合。接着分别收集菌体上清及沉淀，结果显示目的蛋白在包涵体中表达，不是可溶蛋白，于是对其进行复性，复性后获得可溶性蛋白，并用于Pull-down试验。如图9所示，GST Pull-down捕获到蛋白如箭头所示。通过将对①②③特异蛋白进行质谱检测(其中①②③特异蛋白按顺序由上至下排列)，发现它们分别是Glyma.05G026300.1、Glyma.20G148200.1和Glyma.03g239700.1。

实施例9：GsPG031互作蛋白的确认

一、载体构建：以对照大豆品种JL1的cDNA为模板，参照TaKaRa公司的

HS DNA Polymerase操作说明书，以正向引物F7与反向引物R7为扩增引物，扩增Glyma.03g239700.1基因的编码区；以正向引物F8与反向引物R8为扩增引物，扩增Glyma.05G026300.1基因的编码区；以正向引物F8与反向引物R8为扩增引物，扩增Glyma.20G148200.1基因的编码区。并分别将这3个扩增片段连入植物表达载体pGBKT7中(所述载体pGBKT7购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)，获得3个载体，分别表示为pGBKT7-Glyma.03g239700.1、pGBKT7-Glyma.05G026300.1和pGBKT7-Glyma.20G148200.1。

正向引物F7：5'-CATGCCATGGCATGATGCATTGGCAAAGTTGAAGAGG-3'

反向引物R7：5'-CGGGATCCCGTCATGCATTGGCAAAGTTGAAGAGG-3'

正向引物F8：5'-CATGCCATGGCATG ATGGCAGCGGCACCAGCAGC-3'

反向引物R8：5'-AACTGCAGAACCAATGCATTGGTTAAGCAGCAACAGCTTGCTTCTGA-3'

正向引物F9：5'-CATGCCATGGCATG ATGGCAGCGGCACCAGCAGC-3'

反向引物R9：5'-AACTGCAGAACCAATGCATTGGTTAAGCAGCAACAGCTTGCTTCTGA-3'

以野生型大豆和对照大豆品种JL1的cDNA为模板，参照TaKaRa公司的

HS DNA Polymerase操作说明书，以正向引物F10与反向引物R10为扩增引物，扩增GsPG031和GmPG031基因的编码区，并分别将GsPG031和GmPG031基因连入植物表达载体pGAD7中(所述载体pGAD7购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)，获得2个载体，分别表示为pGAD7-GsPG031和pGAD7-GmPG031。

正向引物F10：5'-TCCCCCGGGGGAATGA AGTTCACTATAATCACAATAT-3'

反向引物R10：5'-CGAGCTCG CTAGGCTGCACAAGTAGGAG-3'

二、酵母双杂试验：根据Clotech Yeastmaker^TM Yeast Transformation试剂盒，将pGBKT7-Glyma.03g239700.1、pGBKT7-Glyma.05G026300.1和pGBKT7-Glyma.20G148200.1分别和pGAD7-GsPG031和pGAD7-GmPG031按“两两组合”的方式转化酿酒酵母，并接种于氨基酸缺陷型检测培养基(SD-Trp^--Leu^--His^-)上，置于30℃的恒温箱中培养，于培养后的第2-3天观察菌斑。

如图10所示，通过酵母双杂结果发现GsPG031可能结合Glyma.05G026300.1和Glyma.20G148200.1，而不结合Glyma.03g239700.1。同时，GsPG031与Glyma.05G026300.1和Glyma.20G148200.1结合能力比GmPG031强。

结合实验结果，当转基因种子浸水后，GsPG031基因会产生一种功能性的聚半乳糖醛酸酶(PG)，分解种皮中的果胶成半乳糖苷衍生物，并在栅栏细胞的外层积累；同时它可能结合Glyma.05G026300.1和Glyma.20G148200.1，使得这些半乳糖苷衍生物、PG和互作蛋白在细胞壁中形成一个固定的网络，进而增加GsPG031过表达种子中的种皮外层的栅栏细胞和柱状细胞层结构的稳定性，给予细胞壁更多的结构完整性或更大的灵活性，使其不太容易开裂，因此吸水性较低。这些结果将增强对种子吸收能力及种子硬实性的分子机制的理解。

序列表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120>大豆种皮吸水性调控基因GsPG031及其编码蛋白和应用

<160> 22

<210> 1

<211> 1167

<212> DNA

<213> 大豆属（Glycine）

<220>

<223>大豆种皮吸水性调控基因GsPG031

<400> 1

atgaagttca ctataatcac aatatttttt tctttatttc tagtcgactt tggttttgca 60

caaggggatc ttgacatatc aagatttgga ggaaaaccga attcagatat aagccaggct 120

ttcttaagtg cctggactca agcatgtgca tcaacaactg ctgtcaaaat tgtgattcca 180

gctggcacat atcaaatggg tgcagttgat gtaaaaggtc cttgcaaggc tcctattgag 240

gttcaagttg atggaacaat tcaagcacct acaaacgtag ttaaccttaa gggggcagac 300

caatggttaa aggttcaaca tgttaactct ttcaccctgt cagggaaagg agtttttgat 360

ggtcaaggtc caactgcttg gaaacaaaat gattgtacaa caaacaagaa ctgcaagatg 420

ctttgcatga atttcggttt taatttcctc aataattcaa ttgtccgtga ccttacttcc 480

aaggatagca aaaactttca tgtgaatgtt ttggggtgca acaatatgac atttgatggg 540

tttaaaatta gtgccccagc agagagtccc aacaccgatg ggatccacat tggaagatcc 600

acagatgtga aggttcttaa tacaaacatt gctactggag atgactgtat ctcattgggt 660

gatggtaaca aaaatataac tgtccaaaat gtgaactgtg gacctggtca tggcattagt 720

gttggaagcc ttgggaggta cgataatgaa gaggccgttg aaggtcttct agttaagaat 780

tgcactttga acaatacaga taacggtctg aggattaaga cttggcctag cacgccatta 840

acaattacag ttactgatat gcattttgaa gatattacca tggaaaatgt ttcgaaccct 900

gtgatcatag accaagagta ttgtccatgg aaccagtgct ccaaaaagaa tccgtcaaaa 960

atcaagataa gcaaggtttc cttcaaaaac attaagggca cttcaggaac taaagaagga 1020

gtgattttta tttgtagtag tgttgcacca tgtgagggtg tagagatgac tgatgttgat 1080

ctcacattca atggagctgc aacaacagct aaatgtgcta acgtcaagcc cgtaataaca 1140

ggaaaagctc ctacttgtgc agcctag 1167

<210> 2

<211> 388

<212> PRT

<213>大豆属（Glycine）

<220>

<223>大豆种皮吸水性调控基因GsPG031编码蛋白

<400> 2

Met Lys Phe Thr Ile Ile Thr Ile Phe Phe Ser Leu Phe Leu Val

5 10 15

Asp Phe Gly Phe Ala Gln Gly Asp Leu Asp Ile Ser Arg Phe Gly

20 25 30

Gly Lys Pro Asn Ser Asp Ile Ser Gln Ala Phe Leu Ser Ala Trp

35 40 45

Thr Gln Ala Cys Ala Ser Thr Thr Ala Val Lys Ile Val Ile Pro

50 55 60

Ala Gly Thr Tyr Gln Met Gly Ala Val Asp Val Lys Gly Pro Cys

65 70 75

Lys Ala Pro Ile Glu Val Gln Val Asp Gly Thr Ile Gln Ala Pro

80 85 90

Thr Asn Val Val Asn Leu Lys Gly Ala Asp Gln Trp Leu Lys Val

95 100 105

Gln His Val Asn Ser Phe Thr Leu Ser Gly Lys Gly Val Phe Asp

110 115 120

Gly Gln Gly Pro Thr Ala Trp Lys Gln Asn Asp Cys Thr Thr Asn

125 130 135

Lys Asn Cys Lys Met Leu Cys Met Asn Phe Gly Phe Asn Phe Leu

140 145 150

Asn Asn Ser Ile Val Arg Asp Leu Thr Ser Lys Asp Ser Lys Asn

155 160 165

Phe His Val Asn Val Leu Gly Cys Asn Asn Met Thr Phe Asp Gly

170 175 180

Phe Lys Ile Ser Ala Pro Ala Glu Ser Pro Asn Thr Asp Gly Ile

185 190 195

His Ile Gly Arg Ser Thr Asp Val Lys Val Leu Asn Thr Asn Ile

200 205 210

Ala Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ser Leu Gly Asp Gly Asn Lys Asn

215 220 225

Ile Thr Val Gln Asn Val Asn Cys Gly Pro Gly His Gly Ile Ser

230 235 240

Val Gly Ser Leu Gly Arg Tyr Asp Asn Glu Glu Ala Val Glu Gly

245 250 255

Leu Leu Val Lys Asn Cys Thr Leu Asn Asn Thr Asp Asn Gly Leu

260 265 270

Arg Ile Lys Thr Trp Pro Ser Thr Pro Leu Thr Ile Thr Val Thr

275 280 285

Asp Met His Phe Glu Asp Ile Thr Met Glu Asn Val Ser Asn Pro

290 295 300

Val Ile Ile Asp Gln Glu Tyr Cys Pro Trp Asn Gln Cys Ser Lys

305 310 315

Lys Asn Pro Ser Lys Ile Lys Ile Ser Lys Val Ser Phe Lys Asn

320 325 330

Ile Lys Gly Thr Ser Gly Thr Lys Glu Gly Val Ile Phe Ile Cys

335 340 345

Ser Ser Val Ala Pro Cys Glu Gly Val Glu Met Thr Asp Val Asp

350 355 360

Leu Thr Phe Asn Gly Ala Ala Thr Thr Ala Lys Cys Ala Asn Val

365 370 375

Lys Pro Val Ile Thr Gly Lys Ala Pro Thr Cys Ala Ala *

380 385 388

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F1

<400> 3

ATGAAGTTCACTATAATCACAATAT 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R1

<400> 4

CTAGGCTGCACAAGTAGGAG 20

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F2

<400> 5

CTCTAGAGCATGAAGTTCACTATAATCACAA 31

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R2

<400> 6

CGAGCTCGCTAGGCTGCACAAGTAGGAG 28

<210>7

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F3

<400> 7

CCTGTGCCTCCAGGGAC 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R3

<400> 8

GCGGTCTGCACCATCGTC 18

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F4

<400> 9

CTGTATCTCATTGGGTGATGGTAAC 25

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R4

<400> 10

TTCAACGGCCTCTTCATTATC 21

<210>11

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F5

<400> 11

TCTTGGACAACGAAGCCATCT 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R5

<400> 12

TGGTGAGGGACGAAATGATCT 21

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F6

<400> 13

TACGGTCGACGGGGATCTTGACATAT 26

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R6

<400> 14

TAGCGCGGCCGCGGCTGCACAAGTAGG 27

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F7

<400> 15

CATGCCATGGCATGATGCATTGGCAAAGTTGAAGAGG 37

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R7

<400> 16

CGGGATCCCGTCATGCATTGGCAAAGTTGAAGAGG 35

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F8

<400> 17

CATGCCATGGCATGATGGCAGCGGCACCAGCAGC 34

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R8

<400> 18

AACTGCAGAACCAATGCATTGGTTAAGCAGCAACAGCTTGCTTCTGA 47

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F9

<400> 19

CATGCCATGGCATGATGGCAGCGGCACCAGCAGC 34

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R9

<400> 20

AACTGCAGAACCAATGCATTGGTTAAGCAGCAACAGCTTGCTTCTGA 47

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物F10

<400> 21

TCCCCCGGGGGAATGAAGTTCACTATAATCACAATAT 37

<210> 22

<211> 28

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物R10

<400> 22

CGAGCTCGCTAGGCTGCACAAGTAGGAG 28

Claims

1.大豆种皮吸水性调控基因GsPG031在调控大豆种子硬实性中的应用；所述基因GsPG031的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；所述基因GsPG031编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述大豆种皮吸水性调控基因GsPG031通过降低大豆种皮吸水性而提高大豆种子硬实性。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述大豆种皮吸水性调控基因GsPG031通过提高大豆种皮外围栅栏细胞和骨硬化层的结实性来降低大豆种皮吸水性。