KR100583306B1 - 오제스키병 바이러스에 대한 단일클론 항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 상기 단일클론 항체들을 이용한 오제스키병 바이러스 중화 항체의 스크린 및 쥐이항체를 검출하는 방법과 키트 - Google Patents

오제스키병 바이러스에 대한 단일클론 항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 상기 단일클론 항체들을 이용한 오제스키병 바이러스 중화 항체의 스크린 및 쥐이항체를 검출하는 방법과 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 오제스키병 바이러스에 대한 단일클론 항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 상기 단일클론 항체들을 이용한 오제스키병 바이러스 항체 검출법과 오제스키병 바이러스의 gE ( gI 으로 명명하기도 함)에 대한 항체를 특이적으로 감별하여 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 오제스키병 바이러스에 대한 항체유무 및 항체 역가를 진단하는 방법과 백신에서 주로 gE 유전자를 결손시켜 사용 한다는 사실을 이용하여 자연상태의 감염에서만 항체가 나타나는 gE 단백질을 특이적으로 검출할 수 가 있어서, 외부 유래의 감염과 백신접종에 의한 항체를 감별검사 할 수 있는 방법 및 그에 유용한 검출 키트를 제공하는 효과가 있다.
오제스키병 바이러스 , 항체 역가, 항오제스키병 바이러스 단일클론항체 퍼록시데이즈 콘쥬게이트, 오제스키병 바이러스 gE 항체감별, 항오제스키병 바이러스 gE 단일클론항체 퍼록시데이즈 콘쥬게이트, ELISA, 진단키트.

Description

오제스키병 바이러스에 대한 단일클론 항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 상기 단일클론 항체들을 이용한 오제스키병 바이러스 중화 항체의 스크린 및 쥐이 항체를 검출하는 방법과 키트{ Hybridoma cell lines and Monoclonal antibodies for Aujeszky's disease virus(ADV), differential diagnostic methods and kit for screening neutralization antibody and gE antibody against ADV using these monoclonal antibodies}
도 1는 오제스키병 바이러스에 대한 단일클론 항체를 이용하여 형광 항체법으로 오제스키병 바이러스를 검출한 사진으로, (A)는 ADV 감염 PK-15 세포주에 대한 단클론 항체 2-11C-85의 반응을, (B)는 ADV 감염 PK-15 세포주에 대한 단클론 항체 2-4F-136의 반응을, (C)는 ADV에 감염시키지 않은 PK-15 세포주에 대한 단클론 항체 12-4F-136의 반응을 나타낸 것이고,
도 2는 오제스키병 바이러스 항원단백질과 단일클론항체를 이용하여 오제스키병 바이러스 항체 스크린 키트와 gE 항체 감별 키트 진단방법을 간략하게 도식화한 것이고,
도 3은 웨스턴 블럿팅에 의해 본 발명의 단일클론 항체의 생화학적 성상을 규명한 사진으로, 오제스키병 바이러스에 단일클론항체 ADV 2-11C-85 반응(1래인)과 단일클론항체 ADV-gE- 12-4F-136의 반응(2래인)을 나타낸 것이다.
본 발명은 오제스키병 바이러스에 대한 단일클론 항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 상기 단일클론 항체들을 이용한 오제스키병 바이러스 중화 항체 스크린 방법과 오제스키병 바이러스의 gE(gI)에 대한 항체를 특이적으로 감별하여 검출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오제스키병 바이러스에 대한 항체유무 및 항체 역가를 진단하는 방법과 백신에서 주로 gE 유전자를 결손 시켜 사용 한다는 사실을 이용하여 자연상태의 감염에서만 항체가 나타나는 gE 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 방법을 사용하여 감염과 백신접종에 의한 항체를 감별검사 할 수 있는 방법 및 그에 유용한 진단키트에 관한 것이다.
오제스키병(Aujeszky's Disease)은 가성관견병(Psudorabies)으로도 불리며 Alphaherpesvirus에 속하는 오제스키병 바이러스(Aujeszky's Disease Virus;ADV)의 감염에 의하여 발생하는 질병이다. ADV는 중추신경계에 주로 감염되며 호흡기 등 다른 장기에 감염되어 증상을 나타낸다. 돼지에서 주로 발생하여 감염 후 회복되어 바이러스를 배설하므로 감염개체가 있으면 지속적으로 전파가 일어나게 된다. 이 질병의 예방과 근절을 위해서는 예방접종과 더불어 잠복감염 개체를 검색하여 제거하는 방법이 주로 사용된다. 예방백신은 전세계적으로 백신접종 개체를 감별할 수 있는 바이러스의 gE 유전자 결손 백신이 사용되고 있다.
국내에서 오제스키병은 1987년 경남 양산군에서 처음 발생한 이후 매년 방역 당국의 전국적인 역학조사 및 방역활동에도 불구하고 경기도 및 충청남도 일부지역에서 계속 발생되고 있어 이들 지역은 상재화된 것으로 추정되고 있으며 전국적으로 전파될 위험성을 안고 있다. 오제스키병은 제1종 법정전염병이며 국제수역사무국이 정하는 List B 질병으로 정부에서도 2003년까지 청정화를 목표로 방역사업을 실행하고 있다. 국내에서는 오제스키병의 근절을 위해서 유전자 결손 (gE deleted modified virus) 바이러스(양산주) 백신 접종을 허용하고 있다. 이 질병의 효율적인 방역을 위해서는 감염동물의 검색과 중화항체의 존재여부를 검사하여 예방접졸 프로그램을 시행하는 것이 중요하며 이는 우리나라에 유행하고 있는 오제스키병 바이러스에 대한 중화항체 검사와 gE 항체 감별 검사를 통하여 가능하다.
일반적으로 항체를 감별하기 위해서는 항원, 항체의 반응을 이용한 면역 측정법을 사용하는 데, 이는 측정하고자 하는 물질을 항원으로 하여 이에대한 특정항체를 만들어서 항원에 결합할 수 있도록 하고 이 결합체를 인지하여 기기를 써서 측정할 수 있는 여러 가지 표지를 사용하여 항원 항체의 결합여부와 결합정도를 측정함으로써 측정하고자 하는 생체물질을 정성, 정량하는 방법으로 알려져 있다.
이제까지 쓰이고 있는 생체물질의 면역측정 방법으로는 사용되는 표지의 종류에 따라 구분할 수 있는데, 방사성 동위원소를 표지로 이용하는 방사성 면역측정법(RIA)과 비방사성 동위원소, 예를 들면 효소나 형광물질을 표지로 이용하는 효소면역측정법(ELISA)과 형광면역측정법(FEIA)이 포함되는 비방사성 면역측정법을 들 수 있다.
이중 널리 쓰이고 있는 면역 측정방법은 방사성 면역측정법인데 이 방법은 정확하고 예민도가 높으며 측정이 간편하고 쉬우며 속도도 빠르다. 또한 측정할 수 있는 감마측정기와 베타측정기 등 기기의 가격도 그리 비싸지 않다는 여러 가지 장점을 가지고 있다.
그러나, 방사성 동위원소를 이용한 면역측정법의 가장 큰 단점은 인체에 해로운 방사성 폐기물이 많이 나온다는 것이며 방사성 동위원소의 사용량과 종류가 규정에 의해 제한되어 있는 불편함이 있다.
이러한 문제로 현재는 효소면역측정법이 활발히 사용되고 있다.
이러한 효소면역측정법(ELISA)은 표지 형식에 의해 직접 표지와 간접 표지가 있는데, 직접 면역측정법은 가교제에 의해 항체 또는 항체의 단편에 직접 표지를 하는 방식이고, 간접 표지는 항체에 부착소(hapten)을 결합시키고, 이것을 인식하는 표지 성분을 사용하여, 측정하는 방법이 있다.
직접 표지에 사용되는 가교제는 N,N'-오르토페닐렌디말레이미드, 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산산·N-숙신이미드에스테르, 6-말레이미도헥산산·N-숙신이미드에스테르, 4,4'-디티오피리딘 등이 공지되어 있으며, 간접표지에 사용되는 헵틴은 비오틴, 디니트로페니르 피리독살 또는 플루오레사민 등이 공지되어 있으며, 이중 비오틴은 아비딘이나 스트렙트아비딘를 인식리간드로 사용하는 것이 공지되어 있다.
표지에 사용되는 효소는 일반적으로 서양고추냉이퍼옥시다아제가 주로 사용되고 있는데, 이는 많은 기질과 반응할 수 있고, 과옥소산법에 의해 용이하게 항체에 결합시킬 수 있기 때문이다.
표지된 효소를 확인하기 위해 서양고추냉이퍼옥시다아제는 기질용액으로서 과산화수소(H2O2)를 사용하고, 발색제로서 2,2'-아지노-디-[3-에틸벤조티아졸린설폰산] 암모늄염(ABTS), 5-아미노살리실산, 오르토페닐렌디아민, 4-아미노안티피린, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 등을 사용하고, 알카리포스파타아제의 경우에는 기질로서 오르토니트로페닐포스페이트, 파라니트로페닐인산 등을 사용하고, β-D-갈락토시다아제를 사용하는 경우에는 기질로서 플루오레세인-디-(β-D-갈락토피라노시드), 4-메틸운베리페닐-β-D-갈락토피라노시드 등을 사용하는 것이 알려져 있다.
이와 같은 예방프로그램을 효율적으로 진행시키기 위해 투여하는 백신은 미리 돼지에게 오제스키병 바이러스 항체가 있는지 혹은 그 역가가 어느 정도인지와 야외감염여부를 확인한 후 투여하여야 그 효과를 거둘 수 있다. 오제스키병의 혈청학적 진단은 바이러스 중화시험(VN), 효소면역항체분석법(이하; ELISA)가 주로 사용되며, 국제수역사무국 (OIE)의 표준 진단법으로 규정되어 있으며 백신접종 개체의 식별을 위하여는 gE 항체를 감별할 수 있는 키트를 주로 사용하고 있다. 그러나 바이러스 중화시험은 세포배양 등 복잡한 검사단계와 비용으로 인하여 방역현장에서 사용하기가 어렵고 대량의 시료를 검사하는데 한계가 있다.
오제스키병 예방백신은 전세계적으로 gE 유전자 결손 바이러스 백신을 사용하고 있어 백신접종에 의하여는 gE 단백질에 대한 항체가 생성되지 않는다. 따라서 gE 항체가 돼지의 혈청에 존재하는 경우 야외바이러스의 감염에 의한 항체로 판정 할 수 있다.
이에 본 발명의 목적은 오제스키병 바이러스와 오제스키병 바이러스 gE에 대해 특이적인 단일클론 항체와 이를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 오제스키병 바이러스와 오제스키병 바이러스 gE에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 오제스키병 바이러스 항체 스크린과 gE 항원을 검출할 수 있는 방법과 키트를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 오제스키 바이러스에 대한 특이적인 면역반응성을 가지고 면역 글로블린 아형이 lgG2a인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCLRF-BP-00086)를 제공한다.
또한, 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 오제스키 바이러스의 gE 부위에 대한 특이적인 면역반응성을 가지고 면역 글로블린 아형이 lgG2a인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCLRF-BP-00087)를 제공한다.
그리고, 또 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 수탁번호가 KCLRF-BP-00086와 KCLRF-BP-00087인 상기 하이브리도마 세포주들에 의해 생산되는 모노클로날 항체들을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 모노클로날 항체를 검체 시료의 혈청과 접촉시켜서 오제스키병 바이러스 중화 항체의 스크린 및 gE 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 플레이트에 코팅된 오제스키병 바이러스 항원과 상기 항원에 대한 특이적인 면역반응성을 가진 상기 모노클로날 항체 및 상기 모노클로날 항체는 효소로 표지된 콘쥬게이션으로 이루어진 것을 특징으로 하는 오제스키병 바이러스 중화 항체의 스크린 및 gE 항체를 검출하는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 검출하는 방법은 효소면역항체분석법(ELISA) 또는 방사선면역 분석법(RIA)을 사용할 수 있으며, 효소면역항체분석법을 사용하는 것이 바람직 하다.
본 발명에서 선발된 세포주는 2003년 7월 9일자로 한국세포주은행에 "미생물에 관한 부다페스트 조약"하에 기탁하여 KCLRF-BP-00086과 KCLRF-BP-00087의 수탁번호를 부여 받았다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시 예를 들어 상세히 설명하고자 한다. 그러나 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 항원의 제작 및 면역
항원으로, 농림부 국립수의과학검역원에서 분양받은 오제스키병 바이러스(ADV, 양산주)를 돼지신장세포(Porcine Kidney 15)에 접종하고 탄산가스 배양기에서 2-3일 동안 배양하였다. 세포변성효과(Cytophatic Effect, CPE)가 90-100%에 도달하면 세포 배양을 중지하고, 세포는 배양액을 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 수확하였다. 수확된 세포는 TBST(Tris-Buffered saline Triton X-100)로 현탁하고 얼음에 1시간 방치하여 불활화 시키고 6000 rpm에서 10분간 원심하여 상층액을 수확하였다. 이때, 바이러스 불활화의 확인은 상층액을 10배 계단희석하 여 돼지신장세포에 접종한 다음, 탄산가스 배양기에서 4일간 배양하면서 오제스키병 바이러스의 특이한 세포 변성효과의 유무로 확인하였다.
제조된 항원단백질을 불완전 항원보조원(Incomplete adjuvant, Gibco BRL사 )와 1:1로 잘 혼합한 다음, 마우스(Balb/C , 바이오제노믹스, 한국)의 뒷다리 발바닥에 100 ㎕씩 주사하였다. 면역 후 15일에 서혜임파절을 채취하여 세포융합에 사용하였다.
실시예 2 : 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포주 작성
모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 코헬 G 와 밀스테인 C(Kohler G and Milstein C.,Nature 256, 495∼497, 1975)의 방법에 의하여 획득하였으며, 이하 그 과정을 간략히 기술하면 다음과 같다.
세포융합 4-5일 전에 골수종세포(myeloma cell)인 SP2/O-Ag14 한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC(Korean Collection for Type Culture, Korea)를 10% 우태아혈청을 첨가한 DMEM 배지(GIBCO BRL, USA)에서 5% 탄산가스가 공급되는 배양기에서 37 로 배양하였다.
상기 실시예 1의 과정을 마친 마우스에서 서혜임파절을 적출하고 DMEM 배지에서 넣은 다음, 적출한 서혜임파절에서 임파세포(lymphocyte)를 분리하였다.
그런 다음, 배양된 골수종 세포와 혼합하고 1ml PEG1500을 서서히 첨가하여 임파세포와 골수종 세포가 융합되도록 유도하였다. 융합이 완료된 세포는 하이포잔 틴(5×10-3M), 아미노프테린(2×10-3M), 티미딘(8×10-4M)(HAT)이 첨가된 DMEM 선택 배지에 적당히 희석한 후 96 웰(well) 조직배양 플레이트에 융합된 세포를 분주하였다.
실시예 3 : 오제스키병 바이러스 단백질에 특이하게 반응하는 모노클로날항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 선발
상기 실시예 1에서 사용한 면역항원인 불활화된 오제스키병 바이러스 상층액과 불활화된 gE(gI) 유전자가 결손된 유전자 재조합 오제스키병 바이러스 상층액(강원대 백신주), 그리고 대조항원으로 1% 트리톤 엑스 100 (Triton X-100, Bio-RAD )으로 처리한 돼지신장세포 단백질을 엘라이자(ELISA)용 마이크로 플레이트에 흡착시켜 고정시킨 후, 상기 실시예 2에서 배양된 융합세포들의 배양 상층액을 각각 1시간동안 반응을 시켰다. 그런 다음, 인산 완충액으로 4회 세척하고, 항마우스 HRP 콘쥬게이트 (KPL사, USA )를 반응하였다.
인산 완충액으로 다시 4회 세척을 하고 TMB(3',3',5',5'-Tetramethyl benzidine, Moss사) 발색제를 첨가하여 10분간 발색반응을 시키고, 반응정지액 (0.5M 황산)를 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후 판독기(ELISA Reader, EMAX, Molecular device, USA)를 이용하여 450㎚에서 측정하였고, 오제스키병 바이러스 항원과 대조항원간에 흡광도 비율이 2 이상인 융합세포를 선정하여 클로닝하였다( 표 1 참조).
그런다음, 상기의 선정방법을 3회 반복하여, 오제스키병 바이러스의 항원단백질에 특이적으로 반응하고, 항원-항체 반응이 가장 우수한 하이브리도마 세포주를 선정하였다.
이의 결과, 하기 표 1과 같이 오제스키병 바이러스의 항원단백질에 특이적으로 반응하며 차단경쟁 ELISA (Blocking ELISA)에서 경쟁반응이 가장 우수한 하이브리도마 세포주를 2-11C-85이라 명명하였다.
그리고, gE 항원에 가장 우수한 반응성을 나타낸 세포주를 2-4F-136이라 명명하였다.
클론명 목적 항원 형광 어세이 아형(Isotype) 차단경쟁 ELISA
gE 유전 결실 바이러스항원 전체 바이러스항원
8C-130 gE ++ lgG2b - +
8C-125 gE + lgG2b - ++
8C-116 gE + lgG2a - ++
2-4F-136 gE ++ lgG2a - ++
DH-4 바이러스단백질 + lgG1 + ++
2-11C-85 바이러스단백질 ++ lgG2a ++ +++
A32-58 바이러스단백질 + lgG1 + ++
A26-131 바이러스단백질 ++ lgM + +
상기 선발된 세포주는 2003년 7월 9일자로 한국세포주은행에 "미생물에 관한 부다페스트 조약"하에 기탁하여 각각 KCLRF-BP-00086, KCLRF-BP-00087의 수탁번호를 부여 받았다.
한편, 선택된 상기 세포주들이 생산한 항체들을, 형광항체면역법으로, 오제스키병 바이러스 감염 돼지신장세포와 비감염 돼지신장세포와 반응시켰는데, 도 1 의 (A)는 ADV 감염 PK-15 세포주에 모노클로날 항체 ADV 2-11C-85(2-11C-85 세포주에서 생산한 모노클로날항체)를 반응시켜 그 결과를 나타낸 것이고, (B)는 ADV 감염 PK-15 세포주에 모노클로날 항체 ADV gE 2-4F-136(2-4F-136 세포주에서 생산한 모노클로날항체)의 반응을 나타낸 것이며, (C)는 ADV에 감염시키지 않은 PK-15 세포주에 대한 모노클로날 항체 ADV gE 2-4F-136의 반응을 나타내었다.
그 결과, 도 1의 A와 B와 같이 본 발명의 항체들은 오제스키병 바이러스에 감염된 PK-15 세포주와 특이하게 반응하는 반면, 오제스키병 바이러스에 감염되지 않은 세포주에는 반응하지 않는 것으로 보아 모노클로날 항체임을 알 수 있었다.
그리고, 실시예 1의 불활화된 항원을 전기영동하여 분리한 후, ADV 2-11-C-85 항체와 ADV gE 2-4F-136 항체를 사용하여, 웨스턴 블랏(western blot)을 실시한 결과, 도 2와 같이 불활화된 항원에 모두 특이적으로 반응하는 것을 알 수가 있었다.
실시예 4 : 오제스키병 바이러스의 중화항체를 검사하는 ELISA 검사법 및 gE 항체 감별검사하는 ELISA 검사법
상기 실시예 3에서 선발된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 1 X 106 세포/㎖ 배양하여 프리스텐(pristane, sigma사 )으로 감작(priming)한 Balb/c 마우스 복강내에 주입한 후 복수(ascites)가 생성되면 채취하였다. 수확한 복수는1,000×g로 10분간 원심하여 수확한 상층액을 정제에 사용하였다.
복수(ascites)에서 모노클로날 항체의 정제는 면역친화 크로마토그래피 (immunoaffinity chromatography)를 사용하였다.
복수(ascites)의 모노클로날 항체는 친화 컬럼에 적용하여 정제하였다. 이때 사용된 친화컬럼에는 프로테인 A가 콘쥬게이션되어 있는 아가로즈 겔(Affi-prep protein A gel, Bio-RAD)이 충진된 것을 사용하였다.
프로테인 A-아가로스 겔에 부착된 모노클로날 항체는 용출 완충액(Affi-prep MAPSII elution buffer, Bio-RAD)을 이용하여 순수한 모노클로날 항체를 분리 하고, 이를 다시 증류수에 투석하였다. 투석된 모노클로날 항체는 동결건조기를 이용하여 농축한 다음 퍼옥시다아제 콘쥬게이션에 사용하였다.
먼저, 활성화된 퍼옥시다제 (Peroxidase, Roche Molecular Biochemicals사)를 0.5 ㎖의 증류수에 녹이고 항체는 4㎎을 소디움 카보네이트 완충액(100mM Sodium Carbonate buffer, PH9.8) 1㎖에 녹인 후, 0.3㎖의 항체와 0.1ml의 활성화된 퍼옥시다제를 첨가하고 혼합하여 실온에서 2시간 반응 시킨 후, 40㎕ 트리에탄올아민 용액 (2M Triethanolamine solution, pH8.0)을 첨가하고 혼합하였다. 그리고 50㎕ 소디움 보로하이드라이드 용액(200mM sodium borohydride solution)을 첨가하고 혼합하여 2-8 ℃에서 30분간 반응시킨 후 10㎕ 글라이신 용액(1M Glycine solution, pH7.0)을 첨가하여 안정화 시킨 다음, 인산 완충액(PH7.4)에 투석하여 퍼옥시다아제 콘쥬게이션을 완성하였다.
한편, 실시예 1에서 사용한 불활화된 오제스키병 바이러스 항원을 적정 희석하여 효소면역측정용 마이크로플레이트에 100㎕씩 분주한 다음 4∼12시간 흡착시켰 다. 흡착이 끝난 항원을 플레이트에서 버린 후 트윈 20(Tween-20, Bio-RAD)이 0.05% 첨가된 10mM 인산완충액(pH 7.2 )으로 1회 세척하고, 10% 소혈청알부민을 첨가한 10mM 인산완충액으로 항원이 흡착된 플레이트에 100㎕씩 분주하고 37 ℃에서 2시간동안 반응시켰다. 그런 다음, 검체 시료의 혈청을 혈청희석완충액(트윈20이 1% 첨가된 10mM 인산완충액)으로 희석용 플레이트에서 1/2배 희석하고, 이를 100㎕씩 취하여 알부민으로 차단반응이 끝난 플레이트로 분주하고 37 ℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응 후 1% 트윈20이 첨가된 인산 완충세척액으로 3회 이상 세척하였다.
그런 다음, 항오제스키병 바이러스 모노클로날 항체 퍼옥시다제 콘쥬게이트과 항오제스키병 바이러스 gE 모노클로날 항체 퍼옥시다제 콘쥬게이트를 1% 트윈20이 첨가된 인산완충액으로 1/1000 희석하여 100㎕씩 각각 첨가하여 37 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 1% 트윈20이 첨가된 인산 완충세척액으로 3회 이상 세척한 후 남은 용액을 전부 제거하였다. 그리고 발색제인 TMB (3',3',5',5'-Tetramethylbenzidine, Moss 사 )용액을 100㎕씩 첨가하고 10분 동안 발색 반응을 유지시키고, 정지액(0.5M 황산)을 50㎕씩 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 판독기( ELISA Reader, Molecular Device)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
결과의 판정은 가검혈청의 경쟁률 (%PC)이 40 이상일 때 양성, 40 미만일 때 음성으로 판정하였으며, 검체 혈청의 경쟁률은 하기 식1로 산출하였다.
[식 1]
검체혈청의 경쟁률(%PC) =
[(음성대조평균흡광도-검체혈청흡광도)/(음성대조평균흡광도-양성대조평균 흡광도)] X 100
실시예 5 : ADV 2-11C-85 및 ADV gE 2-4F-136의 차단경쟁 ELISA에서 민감도 및 특이도 측정
실시예 3에서 선발된 모노클로날 항체, 즉 ADV 2-11C-85 및 ADV gE 2-4F-136의 민감도를 측정하기 위하여 강원도 가축위생시험소에서 분양 받거나 도축장에서 채취된 혈청에 대해서 실시예 1의 오제스키병 바이러스(양산주)를 사용하여 바이러스 중화시험을 실시하고 중화항체 양성인 혈청그룹을 구성하고 이들 중화항체 양성혈청과의 경쟁반응을 검사하였다.
바이러스 중화시험의 판정은 국제수역사무국(OIE)의 표준매뉴얼에 따라 중화항체가 2배 이상의 역가를 나타내는 혈청을 선택하였다.
중화항체 양성 혈청그룹에 대한 상기 모노클로날 항체의 경쟁능력을 확인하기 위하여 실시예 4에 따라 차단경쟁 ELISA로 검사하고 민감도를 측정하였다. 경쟁능력은 실시예 4의 %PC 값을 계산하여 능력 유무를 결정하였다.
그 결과, 모노클로날 항체 ADV 2-11C-85는 바이러스 중화시험 양성그룹 100개 시료에서 모두 경쟁반응을 나타내어 중화항체 양성인 시료에 대하여 100%의 민감도를 나타내었다. 모노클로날 항체 ADV gE 2-4F-136은 바이러스 중화시험 양성그룹 1,222개의 시료 중 1,173개의 시료에서 경쟁반응을 나타내어 중화항체 양성인 시료에 대하여 96.0%의 민감도를 나타내었다. 따라서 이들 모노클로날항체는 우리 나라 돼지에서 높은 빈도로 나타나는 오제스키병 바이러스에 대한 중화항체 및 gE항체와 특이적으로 동일한 항원결정부위에 대하여 경쟁반응을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
모노클로날 항체 검사 시료수 차단경쟁 ELISA 검사 결과 민감도(%)(3)
양성(1) 음성(2)
ADV 2-11C-85 100 100 0 100
ADV gE 2-4F-136 1,222 1,173 49 96.0
(1)양성 : 시료와의 경쟁률(%PC) 40% 이상
(2)음성 : 시료와의 경쟁률(%PC) 40% 미만
(3)민감도(%) =
[차단경쟁ELISA검사양성시료수/바이러스중화시험 양성시료수]×100
한편, 본 발명의 모노클로날 항체에 대한 특이성을 측정하기 위하여, 강원도 가축위생시험소에서 분양 받거나 도축장에서 채취된 혈청에 대해서 실시예 1의 오제스키병 바이러스(양산주)를 사용하여 바이러스 중화시험을 실시하고 중화항체 음성인 혈청그룹을 구성하고 이들 혈청과의 경쟁반응을 검사하였다. 바이러스 중화시험의 판정은 국제수역사무국(OIE)의 표준매뉴얼에 따라 중화항체가 2배 미만의 역가를 나타내는 혈청을 선택하였다.
중화항체 음성 혈청그룹에 대한 상기 모노클로날 항체들의 경쟁여부을 확인하기 위하여 실시예 4에 따라 차단경쟁 ELISA로 검사하고 특이도를 측정하였다. 경쟁여부는 실시예 4의 %PC 값을 계산하여 결정하였다.
표 3에서와 같이, ADV 2-11C-85는 바이러스 중화시험 음성그룹 95개 시료 중 2개의 시료에서 경쟁반응을 나타내어 중화항체 음성인 시료에 대하여 97.9%의 특이도를 나타내었다. ADV gE 2-4F-136은 바이러스 중화시험 음성그룹 492개의 시료 중 3개의 시료에서 경쟁반응을 나타내어 중화항체 음성인 시료에 대하여 99.4%의 특이도를 나타내었다. 이들 모노클로날 항체들은 오제스키병 바이러스 중화시험 음성혈청과 경쟁반응이 거의 없어 높은 특이도를 가지고 있음을 알 수 있었다.
모노클로날항체 검사시료수 차단경쟁 검사 결과 특이도(%)(3)
양성(1) 음성(2)
ADV 2-11C-85 95 2 93 97.9
ADV gE 2-4F-136 492 3 489 99.4
(1)양성 : 시료와의 경쟁률(%PC) 40% 이상
(2)음성 : 시료와의 경쟁률(%PC) 40% 미만
(3)특이도(%) =
[차단경쟁ELISA검사음성시료수/바이러스중화시험 음성시료수]×100
실시예 6 : 진단 키트의 유효성 평가
실시예 4의 방법을 사용하여 진단키트를 구성하고 우리나라의 농장에서 채취된 여러그룹의 혈청을 사용하여 키트 판정기준의 유효성을 평가하였다. 혈청은 강원도 가축위생시험소, 도축장에서 분양 받거나 채취된 혈청을 바이러스 중화시험으로 검사하고 혈청그룹을 감염지역 양성농가 혈청(1 그룹 : 66개), 예방접종 실시 농가 혈청(2 그룹 : 56개), 비발생지역 음성농가 혈청(3 그룹 : 184개)으로 나누어 구성하여 검사하였다.
시료 그룹 1에 대한 바이러스 중화시험의 경우, 양성 59개, 음성 7개이었으며, 이에 대해 중화항체검사키트와 gE 항체감별키트는 동일한 결과를 나타내었다.
2 그룹에 대한 바이러스 중화시험의 경우 양성 31개, 음성 25개였으며 이에 대해 중화 항체 검사키트의 경우 양성 33개, 음성 23개로 중화시험 검사결과와 거의 일치하였다.
또한 gE 항체감별 키트의 경우 56개 모두 음성으로 판정되었는데, 이는 gE 결손 백신 접종 group의 혈청에서 자연감염항체와 백신접종항체를 명확하게 감별하고 있음을 알 수 있었다.
3 그룹에 대한 바이러스 중화시험의 경우 184두가 모두 음성이었으며, 이에 대해 중화항체검사키트와 gE 항체감별키트는 동일한 결과를 나타내었다.
이에 따른 결과는 표 4에 나타내었다.
시료 그룹 바이러스중화시험(1) 시료수 ADV 2-11C-85 중화항체검사키트 ADV gE 2-4F-136 gE 항체감별키트
양성(2) 음성(3) 양성 음성
1 그룹(4) 양성 59 59 0 59 0
음성 7 0 7 0 7
2 그룹(5) 양성 31 31 0 0 31
음성 25 2 23 0 25
3 그룹(6) 양성 0 0 0 0 0
음성 184 0 184 0 184
(1) 바이러스 중화시험 : OIE 표준 메뉴얼의 판정기준
(2) 양성: 경쟁율 40%이상, (3) 음성: 경쟁율 40% 이하
(4) 1 그룹: 돼지오제스키병 바이러스 발생지역 혈청(66개)
(5) 2 그룹: 돼지오제스키병 바이러스 gE 결손백신 접종지역 혈청(56개)
(6) 3 그룹: 돼지오제스키병 바이러스 비발생지역 혈청(184개)
이상, 상기 실시 예를 통하여 설명한 바와 같은 방법으로 제작된 오제스키병 바이러스 항체 스크린 키트와 오제스키병 바이러스 gE 항체 감별 키트는 각각 항체와 그 역가를 검출할 수 있고, 감염에 의한 항체와 백신접종에 의한 항체를 신속하고 정확하게 감별할 수 있었다. 이와 같은 키트는 대한민국에서는 개발하여 상업화에 성공한 기업이 없어, 전량 수입진단키트에 의존하고 있는 실정이다. 이에, 본 발명은 진단키트의 수입대체효과와 그 동안 독점적인 수입진단키트에 경쟁하여 대폭적인 가격인하 효과까지 수반되어 오제스키병의 근절에 수반되는 비용을 대폭 절감시킬 수 있다. 또한 전세계적으로 오제스키병 바이러스에 대한 gE 항체 감별 키트를 개발한 회사는 3개사 정도로 개발된 원료와 완제품은 오제스키병이 발생하고 있는 유럽, 미국, 동남아 등 세계시장에 수출을 추진할 수 있어 대한민국의 동물 질병 진단키트에 대한 기술력을 선양하고 외화를 획득하는데 일조 할 수 있는 효과가 있다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 오제스키 바이러스의 gE 부위에 대한 특이적인 면역반응성을 가지고 면역 글로블린 아형이 lgG2a인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주(KCLRF-BP-00087).
  3. 삭제
  4. 제 2항의 하이브리도마 세포주에 의해 생산되는 모노클로날항체.
  5. 제 4항의 모노클로날 항체를 검체 시료의 혈청에 접촉시켜서 오제스키병 바이러스의 gE 항체를 검출하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 검출하는 방법은 효소면역항체분석법(ELISA) 또는 방사선면역 분석법(RIA)임을 특징으로 하는 오제스키병 바이러스의 gE 항체를 검출하는 방법.
  7. 플레이트에 코팅된 오제스키병 바이러스 항원과 상기 항원에 대한 특이적인 면역반응성을 가진 제 4항의 모노클로날 항체 및 상기 모노클로날 항체는 효소로 표지된 콘쥬데이션을 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 오제스키병 바이러스의 gE(gⅠ) 항체를 검출하는 키트.
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