DE2211418A1 - Verfahren zur Herstellung von reinem "intrinsic factor ' und/oder nicht intrinsic factor" aus Prapara ten, die beide Substanzen enthalten - Google Patents

Description

• "Verfahren zur Herstellung von reinem "intrinsic factor" und/ oder "nicht-intrinsic factor" aus Präparaten, die beide Substanzen enthalten"0 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von reinem "intrinsic factor", nachfolgend als IF-bezeichnet,und reinem "nicht-intrinsic factor", nachfolgend als NIF bezeichnet, aus Präparaten, die beide-Substanzen enthalten.
• IF ist eine Substanz, die in der Magenflüssigkeit, im Magen und in benachbarten Verdauungsorganen vorkommt und die die Absorption von Vitamin B12 im Darm des Menschen spezifisch stimuliert. Zur Zeit wird IP für ein Glycoprotein gehalten, das einen makromolekularen Komplex mit Vitamin B12 bildet und das ein Molekulargewicht von etwa 60 000 hat. Zur Zeit ist reines IF im Handel nicht erhältlich.
• Früher ist IF aus der Pylorusschleimhaut des Schweines unter Anwendung von Neutralsalz-Ausfällungen (vergl. US-Patentschrift 3 015 608) oder unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln (vergl. US-Patentschrift 2 770 570), durch Digerieren mit verschiedenen protedlytischen Enzymen (vergl.
• US-Patentschrift 3 434 927) oder unter Anwendung der Ionenaustausch-Chromatographie und Gel-Filtration (vergl. US-Patentschriften 3 434 92t, 3 008 877 und 2 937 120) hergestellt worden. Bei der Reinigung von IF stößt man auf große Schwierigkeiten bei der Entfernung einer makromotekularen Vitamin B12 bindenden Komponente, die als NIF bezeichnet wird und die keine IF-Aktivität besitzt. Die Untersuchungen der Erfinder zeigen, daß unter gewöhnlichen Bedingungen NIF vom Schwein ungefähr das gleiche Molekulargewicht besitzt und im gleichen pH-Gebiet isoélektrisch ist, wie IF vom Schwein. Dies macht es nahezu unmöglich, NIF von IF mit Hilfe der lonenaustausch-Chromatographie und der Gel-Filtration zu entfernen. Versuche haben gezeigt (Gräsbeck: Progress in Hematology, vol. VI, Ed. Moore & Brown, 1969)daß NIF vom Menschen, auch als Vitamin B12-Binder R bezeichnet, sich immunologisch wie Vitamin 312 bindende makromolekulare Komponenten in einer großen Zahl von Körperflüssigkeiten oder -geweben, z.B. Speichel, Galle, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit, Erythrocyten und Leukocyten, verhält. Nach einer Theorie von Simons (Soc. Scient. Fennica, Comment.Biol. 27 Fasc. 5, 1964) stammen alle diese R-Proteine aus Leukocyten. Untersuchungen der Erfinder haben gezeigt, daß auch NIF vom Schwein immunologisch identisch ist mit den Vitamin B12 bindenden makromolekularen Komponenten, die in Leukocyten vom Schwein enthalten sind. Die vorliegende Erfindung gründet sich auf diese Tatsache.
• Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das die Herstellung von IF - frei von NIF - und gewünschtenfalls die Herstellung von NIF - frei von IF - aus Präparaten, die diese beiden Substanzen enthalten, unter Anwendung von üblichen Arbeitstechniken der Proteinchemie ErrnoL. D;c ErT;ndung ist dadurch gekennzeichnet, daß zu einem und NIF-haltigen Präparat ein Antiserum, a's durch Immunisierung von Versuchstieren wie Kaninchen und Ziegen, mit homologem oder immunologisch entgegen reagierendem heterologem Material, das eine Vitamin 312 bindende makromolekulare'Komponente des R-Typs enthält aber kein IF enthält, erhalten-worden ist, in einer solchen Menge (gewöhnlich im Überschuß) gegeben wird, daß das gesamte NIF im IF-Präparat an die gebildeten Antikörper gebunden wird.
• Danach wird das IF von dem an Antikörper gebundenen NIF abgetrennt und isoliert. Falls gewünscht, tann das NIF durch Dissoziierung des Antigen-Antikörper-Eomplexes unter Anwendung einer Behandlung bei saurem pH oder mit Hilfe von denaturierenden oder protein-öffnenden Mitteln hergestellt werden.
• Das Antiserum, das durch die Immunisierung gebildetes Anti-R enthält, kann als solches verwendet werden. Für die Herstellung von hochgereinigtem IF ist es jedoch' nicht wünschenswert, daß andere Proteine als die Antikörper anwesend sind.
• Pür die Herstellung von hochgereinigtem IF ist es vorzuziehen, die Antikörper-haltige Immunoglobulinfraktion des Antiserums unter Anwendung allgemein bekannter Methoden zu reinigen, Die gereinigte Antikörperfraktion kann als solche verwendet werden oder gebunden an eine feste Phase, wie Cellulose, Sephadex # ode"kgarose".
• Ein für das vorliegende Verfahren speziell geeignetes Antigen-Material sind Leukocyten, die aus Schweineblut durch Zentrifugieren isoliert worden sind, das Zentrifugieren bewirkt, daß sich die leukocyten über den Erythrocyten ablagern. Die Leukocyten-Masse, oft als buffy coat" bezeichnet, wird im Anschluß an eine geeignete Wäsche und Homogenisierung verwendet und - wie nachfolgend beschrieben - den Tieren injiziert.
• Andere für die Immunisierung brauchbare MWterialien sind Körperflüssigkeiten und -gewebe, wie Speichel, Galle, Serum, Cerebrospinalflüssigkeit, Extrakte davon oder gereinigte Vitamin B12-bindende Substanzen vom R-Typ.
• Die Trennung des IF und des an Antikörper gebundenen NIF, die sich an die Zugabe des durch die Immunisierung erhaltenen Antiserums anschließt, wird nach allgemein bekannten Methoden, z.B. durch Gel-Filtration, durchgeführt, das sind Methoden, die IF vom Antigen-Antikorper-Komplex aufgrund ihrer unterschiedlichen Molekülgrößen abtrennen. Zu anderen Abtrennungsmethoden gehören die Ionenaustausch-Chromatographie und Ausfällung des Antigen-Antikörper-Komplexes durch Zugabe eines Antiserums gegen Immunoglobuline. Es können auch andere bliche Methoden aus der Proteinchemie angewendet werden.
• Die nachfolgenden Beispiele und die Figuren 1 bis 6 sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern, ohne es jedoch einzuschränken.
• BEISPIEL 1 Herstellung von Antiserum.
• Das Antigen wurde aus 1 Ltr. Schweineblut hergestellt. Das Blut wurde bei 2000 x g etwa 20 Minuten lang zentrifugiert, die Leukocyten-Masse (buffy coat") wurde abgenommen und in 10 ml einer 0,83 zeigen (Gew./Vol.) Ammoniumchloridlösung suspendiert, die die restlichen Erythrocyten hämolysierte. Die Probe wurde 20 Minuten lang bei 2000 x g zentrifugiert und die sedimentierten Leukocyten wurden gesammelt und erneut in der Ammoniumchloridlösung suspendiert, worauf sie nochmals abzentrifugiert wurden. Die Leukocyten wurden auf diese Weise insgesamt dreimal gewaschen, worauf sie in 2 ml physiologischer Natriumchloridlösung suspendiert und bei 200 eingefroren wurden. Die gefrorene Probe wurde in einem MSE-Beschallungsgerät 5 Minuten lang beschalltS wodurch die Probe schmolz und die Leukocyten zerfielen. Das beschallte Präparat wurde 10 Minuten lang bei 10 000 g zentrifugiert, der Niederschlag wurde verworfen und der Überstand verwendet. Die Vitamin B12-Bindungskapazität des Überstandes wurde bestimmt, wobei man die Methode von Gottlieb et al. (Blood 25:875-884, 1965) anwendete, die sich der Beschichtung von Kohle bedient, man fand, daß sie ungefähr 13 g 6e betrug. 20/ug nichtradioaktives Cyanocobalamin gab man zu der Flüssigkeit, um die Vitamin B12-Bindungskapazität abzusättigen, worauf die Plüssigkeit als das Antigen verwendet wurde.
• 0,1 ml dieses Antigen-Präparates wurden mit einem gleichen Volumen Preundschem Adjuvans (Difco Co., USA) vermischt und subkutan 15 Kaninchen injiziert. 2, 6,. 9 und 11 Wochen nach der ersten Injektion wurde eine entsprechende Injektion verabreicht. 12 Wochen nach-Beginn der Immunisierung wurden aus der Ohrvene 15 ml Blut entnommen, das Serum wurde durch Zentrifugieren gesammelt und in dem nachfolgend beschriebenen Versuch verwendet: BEISPIEL 2 Herstellung von IF und NIF.
• A. Das Ausgangsmaterial war ein Schweine-IP-Präparat, das ungefähr gleiche Mengen Vitamin B12-bindende Proteine und andere Proteine enthielt. Es wurde hergestellt wie von Aro et al. (Scand. J.clin. Lab.Invest 23: suppl. 108,28, 1969) beschrieben. Es war gemäß allen in dem Artikel beschriebenen Stufen bis zur und einschließlich der DEAE- Cellulosestufe gereinigt worden. Ungefähr 60 % des Präparates bestanden aus Vitamin B12-bindenden Proteinen. 40po1 des Präparates, das in gebundener Form 12 ng 57Co-Vitamin 312 enthielt, wurden mit 50/kl Antiserum vermischt, dann gab man 0,5 ml physiologische Salzlösung hinzu. Das Präparat wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, worauf es durch eine Sephadex G-150-Eolonne (mit den Abmessungen 2 x 35 cm) geschickt wurde. Die Kolonne wurde mit 0,1 m Natriumphosphat-Puffer von pH 7,4 äquilibriert. Das insgesamt ausgeschlossene Volumen (VO) de Kolonne war durch das Durchleiten von Blue Dextran 2000 (Pharmacia AB, Schweden) bestimmt worden. Nach dem Aufbringen der das Antiserum und das IF-Präparat enthaltenden Probe wurden 3 ml-Fraktionen gesammelt und ihre Radioaktivität wurde in einem Scintillationszähler ausgezählt. Der Antikörper-NIF-B12-Komplex wurde im Volumen VO eluiert und B12-IF ohne NIF wurde später eluiert. Die Vitamin B12-IF-Praktion wurde mit einem Eluierungsvolumen eluiert, das zu dem insgesamt ausgeschlossenen Volumen im Verhältnis von 1g8 steht (Ve/VO = 1,8). Ein solcher Wert ist bereits früher für IF gefunden worden. Zum Beweis, daß das in Zig. 1 dargestellte IF-Präparat tatsächlich IF ist, wurde ein von einem Patienten mit perniziöser Anämie erhaltenes spontan gebildetes Anti-IF-Immunserum zugegeben. Bei der Gel-Filtration wurde nur ein Peak eluiert. Er trat im Volumen VO aus, was zeigt, daß IF mit dem Antikörper reagiert hatte (Fig. S), Figur 2 demonstriert, wie das Ausgangspräparat, das sowohl IF als auch NIF in Form ihrer Vitamin B12-Eomplexe enthält, mit einem Anti-IF-Immunserum reagiert. Der IP-Antikörper-Komplex wird im Volumen VO eluiert, während NIF später, nicht an Antikörper gebunden, eluiert wird. Auf diese Weise erhaltener NIF wurde auf ähnliche Weise getestet, unter Verwendung von sowohl Anti-IF-Serum als auch Anti-Leukocyten-Serum. Das erstgenannte Experiment (Fig. 5) zeigte, daß NIF nicht mit Anti-IF-Antikörpern reagiert Das zweite Experiment zeigte, daß NIF mit Anti-ieukocyten-Immunserum reagierte (Fig. 6). Der IF-Antikörper-Komplex, der in dem in Fig.2 dargestellten Ansatz erhalten worden war, wurde unter Verwendung eines 0,1 m Glycin-Chlorwasserstoffsäure-Puffers von pH 2,75 dissoziiert,indeniman den Komplex durch eine Sephadex G-150-Kolonne schickte, die mit diesem sauren Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war. Der Antikörper wurde vom Antigen (d.i. IF) abgetrennt. Zu der isolierten IF-Fraktion wurde Anti-Leukocytenserum bei neutralem pH gegeben. Die Gel-Filtration der' Mischung (Fig. 4) zeigte, daß IP nicht mit dem Anti-Leukocytenserum reagierte.
• B. Das Ausgangsmaterial entsprach dem im früheren Beispiel verwendeten, es war jedoch kein Cyanocobalamin bei seiner Herstellung zugegeben worden. Eine isolierte Immunoglobulinfraktion wurde anstelle des nichtfraktionierten Immunseu?zms verwendet'.
• Das Immunoglobulin wurde wie folgt isoliert 26 ml Antiserum wurden 18 Stunden lang gegen 0,015 m Kaliumphosphat-Puffer von pH 8,0 dialysiert. 65 g feuchte DEAE-Cellulose, bestehend aus mikrogranularer DE-52 Whatman-Cellulose, die mit dem gerade erwähnten Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, wurden mit dem Serum vermischt.
• Dann gab man 13 ml 0,015 m Ealiumphosphat-Puffer von pH 8,0 hinzu und ruhrte die Mischung 2 Stunden lang bei +4°C unter Verwendung eines Nagnetruhrers. Dann gab man 26 ml des gleichen Puffers hinzu und trocknete die Cellulose durch Absaugen auf einem Bilchner-Trichter. Die Cellulose wurde in 46 ml des gleichen Puffers suspendiert und nochmals getrocknet. Beide Eluate wurden vereinigt und die DEAE-Cellulose-Behandlung wurde mit den Eluaten wiederholt. Nach dem Filtrieren durch einen Büchner-Trichter wurden die vereinigten Eluate durch Ultrasflltratron durch ein Viscing-Dialysegefäß auf ein Volumen von 6 ml konzentriert und bei 23 000 x g 15 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, unter Anwendung der Papierelektrophorese in Barbiturat-Puffer von pH 8,6 und einer Ionenstärke von 0,10 fand man, daß er die µ- Globulinfraktion enthielt. Die Ausbeute an t-Globulin betrug etwa 75 g. man fand, daß die KapazitBt des Präparates NIF-Protein eu binden,. etwa NIF-gebundenes Vitamin 312 pro ml betrug.
• 2 ml des IF-Konzentrates, das ein Vitamin B12-Bindungsvermögen von 7,5 µg/ml besaß, wurden mit 57Co-Cyanocobalamint das eine spezifische Aktivität von o,o%7/uci/ hatte, gesättigt. Das Präparat plus zugesetztem Oyanocobalamin wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, worauf man es zu 2 ml des t-Globulinpräparates gab, die entstandene Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
• Diese inkubierte Mischung wurde durch Sephadex G-150 unter Verwendung eines 0,1 m Natriumphosphat-Puffers von pH 7,4 filtriert, die Abmessungen der Kolonne betrugen 3 x 40 cm.
• 4 ml Fraktionen wurden gesammelt. Der NIF-Antikörper-Komplex wurde in der VO-Fraktion eluiert und der B12-IF-Komplex wurde mit einem Ve/VO-Wert von 1,8 eluiert. Die B12-IF-Fraktion wurde gesammelt und durch Ultrafiltration konzentriert. Ein /ug radioaktives Vitamin B12 - gebunden an diese Fraktion - wurde dann einem Patienten mit perniziöser Anämie verabreicht, wobei der Urinausscheidungstest nach Schilling zur Untersuchung der Vitamin B12-Absorption angewendet wurde. Erhielt der Patient die gleiche Dosis radioaktives Vitamin B12 ohne IF, so schied er im Verlauf von zwei aufeinanderfolgenden Tagen 3,5 % der oral verabreichten Radioaktivität in dem Urin aus. Wurde ein Standardpräparat aus Schweine-IF verabreicht, so stieg die Ausscheidung von Radioaktivität auf 12,1 % während 2 Tagen, und wenn das oben beschriebene Präparat verabreicht wurde, betrug die festgestellte Ausscheidung während 2 Tagen 17,8 .
• Das isolierte IF-Präparat war daher biologisch aktiv.
• C. Die t-Globulinfraktion von Kaninchen-Anti-Leukocytenserum wurde an Agarose gebunden (Sepharose 2 B, Pharmacia AB, Schweden), die mit Bromzyan aktiviert wurde, und das an Sepharose gebundene Immunoglobulin wurde verwendet, um NIF aus IS-Präparaten zu entfernen.
• Die Sepharose 2 B wurde-wie von Porath et al. (Nature 215: 491, 1967) beschrieben, aktiviert. Zu 5 ml Sepharose-Suspension (Sepharose wird in dieser Rorm vertrieben), gab man 5 ml Wasser und 4 ml Bromzyanlösung (enthaltend 25 mg Bromzyan pro Wasser) und der pH der Mischung wurde durch Zugabe von 2 m Natriumhydroxyd auf 11 eingestellt. Die Suspension wurde 6 Minuten lang mit einem Magnetruhrer gerührt und es wurde weiteres Natriumhydroxyd kontinuierlich zugegeben, so daß der pH bei 11 blieb. Die Umsetzung wurde gestoppt, indem man die Reaktionsmischung durch einen Glasfilter-Trichter filtrierte, worauf die Sepharose zuerst mit eiskaltem Wasser und dann mit 0,1 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen wurde. Die erhaltene aktivierte Sepharose wurde sofort für die nächste Stufe verwendet.
• Zu dem in einem Testrohr enthaltenen mit Bicarbonat gewaschenem Agarose-Polymerisat gab man 4 ml einer 0,1 m Natriumcarbonatlösung und 50 mg Kaninchen-g-Globulins das, wie in dem früheren Beispiel beschrieben wurde, hergestellt worden war. Das Rohr wurde 20 Stunden lang bei +4°C in einem hämatologischen Zellmischer geschüttelt. Das Polymerisat wurde durch Abzentrifugieren gesammelt und in eine Kolonne mit den Abmessungen von 1,1 x 1,5cm gepackt. Die Kolonne wurde auf folgende Weise gewaschen: Zuerst 48 Stunden lang bei einer Fließgeschwindigkeit von 8,0 ml/Stunde mit 0,1 m Natriumborat-Puffer mit einem pH von 8,5, der 0,1 m Natriumchlorid enthielt, dann 24 Stunden lang bei der gleichen Fließgeschwindigkeit mit 0,1 m Natriumacetat-Lösung mit einem pH von 4,1, die Natriumchlorid in einer Konzentration von 1 m enthielt, und schließlich 24 Stunden lang mit 0,01 m Natriumacetat-Puffer vom pH 4,1. Das gewaschene Polymerisat wurde anschließend verwendet.
• Etwa t5 % des µ-Globulins waren an die Agarose gebunden.
• Das IF-Präparat war das oben beschriebene Vitamin B12-freie DEAE-Cellulose-Präparat. Es wurden 0,1 ml dieser Fraktion genommen, was einer Vitamin B?2-Bindungskapazität von 4,3 µg/ml entsprach. Die Bindungskapazität wurde mit 57Co-Vitamin 312 das eine spezifische Aktii'ität von 2,3Ci/mg B12 hatte, abgesättigt. Das mit Vitamin B12 gesättigte Präparat gab man zu 3 ml γ-Globulin-Polymerisat-Suspension, die Mischung wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt, worauf sie durch ein Glasfilter-Trichter (Pyrex G 3) filtriert wurde. Die im Polymerisat und in dem Filtrat enthaltenen Radioaktivitäten wurden gemessen, das Polymerisat wurde mit 3 ml physiologischer Salzlösung in 1 ml Portionen gewaschen und die Radioaktivität des Filtrates wurde bestimmt. Etwa 40 % der zugefügten Radioaktivität waren an das t-Glubulin-Agarose-Polymerisat gebunden, 50 % fand man im Filtrat und 10 Vo wurden mit der Waschlösung eluiert. Diese Werte entsprechen ungefähr 6/ug NiF-B12-Protein im Polymerisat und 8/ug IF im Filtrat.
• Das NIF wurde vom Polymerisat getrennt durch Behandlung mit 0,1 m Glycin-Hydrochlorid-Puffer mit einem pH von 2,75.
• Dieses Verfahren bewirkte, daß etwa 80 % des gebundenen NIF vom Polymerisat abdissoziierten.

Claims (4)

P A T E N 2 A N 4 P R 8 H.E :

1. Verfahren zur Herstellung von keinem "intrinsic factorR (zip) und/oder "nicht-intrintic factor" (NIF) aus Präparaten, die IF und NIF enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß zu dem IF-NIF-Präparat ein Antiserum, das durch Immunisierung von Versuchstieren mit einem homologen oder geeigneten entgegen reagierenden heterologen Material, das eine Vitamin B12-bindende makromolekulare Komponente des R-2yps enthält, aber kein IF enthält, in einer solchen Menge - am geeignetsten im Überschuß - gegeben wird, das das gesamte in dem Präparat enthaltene NIF an den durch das Immunisierungsverfahren erzeugten Antikörper gebunden wirdt worauf IF von dem an Antikörper gebundenen NIF abgetrennt und gewünschtenfalls isoliert wird, und NIF gewünschtenfalls durch Dissoziierenung des abgetrennten Antigen-Antikörper-Komplexes isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum in Porin seiner gereinigten Antikörpertragenden Immunoglobulinfraktion verwendet wird, die als solche oder in einer an eine feste Phase oder an eine andere makromolekulare Substanz gebundenen Pormverwendet wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2 dadurch gekennzeichnet, daß IF von dem an Antikörper gebundenem NIP unter Anwendung von Verfahren der Proteinchemie, wie Gel-Filtration, Ionenaustausch-Chromatographie oder Ausfällung des Antigen-Antikörper-Komplexes durch Zugabe eines Antiserums gegen Immunoglobulin, abgetrennt wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Versüchstiere mit dem leukocytenreichen Präparat, das durch Zentrifugieren von Schweineblut erhalten worden ist, oder mit Körperflüssigkeiten oder -geweben, wie Speichel, Galle, Serum oder Cerebrospinalflüssigkeit oder Extrakten davon oder mit gereinig£En Vitamin 312-bindenden Substanzen vom R-Typ immunisiert werden.